專利名稱：：用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的方法和組合物的制作方法1．導(dǎo)言本發(fā)明涉及與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)同種型(isoform)的鑒定，以及它們在篩選、診斷、預(yù)后、治療和藥物開發(fā)方面的用途。2．發(fā)明背景類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種多系統(tǒng)性疾病，其中免疫異常特征性地導(dǎo)致對稱性關(guān)節(jié)炎癥、關(guān)節(jié)磨損和關(guān)節(jié)外并發(fā)癥。這是最為常見的和致殘性自身免疫關(guān)節(jié)炎，且已充分定義了遺傳易感性。它大約影響1-3％的人口。隨著年齡的增加發(fā)病率增加，在30-55歲之間發(fā)病率最高。類風(fēng)濕因子，即針對免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的抗體存在于75％的RA患者中。類風(fēng)溫因子可為IgM、IgG或IgA。據(jù)信，天然存在的類風(fēng)濕因子在機(jī)體異源抗原的清除中起重要作用。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，各種類風(fēng)濕因子由滑膜漿細(xì)胞產(chǎn)生，其具有形成免疫復(fù)合物、活化補(bǔ)體以及參與炎性反應(yīng)的能力，提示其參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。RA中類風(fēng)濕因子與IG半乳糖基化降低共存，是嚴(yán)重疾病的指征?；そM織是RA中炎癥的主要靶點(diǎn)，存在CD4+T淋巴細(xì)胞、活化的B-淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及多形核淋巴細(xì)胞的慢性滑膜浸潤。HLAⅡ型表達(dá)的增加且?guī)缀蹩梢娪谒屑?xì)胞類型，表明它們處于活性狀態(tài)。慢性疾病的特征在于軟骨及骨的磨損，以及滑膜過度生長。RA診斷一直困難。不能由病史、檢查及早期疾病的研究得出疾病模式。目前沒有用于RA的診斷性試驗(yàn)，美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)院定義了RA分類的標(biāo)準(zhǔn)(Medicine(編)Axford,J.,BlackwellScience,1996,3.18-3.22)。這些標(biāo)準(zhǔn)僅僅是觀察性標(biāo)志，這些標(biāo)志的綜合可視為RA的指征?；加蠷A的成年人中75％呈IgM類風(fēng)濕因子陽性。在疾病早期可能不存在這種現(xiàn)象。在診斷中可使用類風(fēng)濕因子的水平進(jìn)行預(yù)后，但其波動無助于疾病的監(jiān)測。在30％患者中存在抗核抗體。通常使用凝集試驗(yàn)測量IgM類風(fēng)溫因子。這包括膠乳試驗(yàn)(其中用IgG包被的顆粒凝集)以及綿羊-細(xì)胞凝集試驗(yàn)(SCAT或瓦-羅試驗(yàn))，其中綿羊紅細(xì)胞凝集。至少有70％的通過其他標(biāo)準(zhǔn)診斷為RA患者的類風(fēng)濕因子膠乳凝集試驗(yàn)呈陽性。在其他風(fēng)濕性疾病、病毒性感染、慢性炎性疾病、腫瘤或化療中，類風(fēng)濕因子也呈陽性，且明顯地在4％健康個體中也呈陽性。RA的藥物治療致力于(1)緩解疼痛(止痛)；(2)一旦炎性事件被引發(fā)即對其加以糾正(抗炎癥藥)；以及(3)糾正導(dǎo)致炎癥的免疫學(xué)事件(疾病糾正藥物)。3．發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選、診斷和預(yù)后、用于監(jiān)測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療有效性和用于藥物開發(fā)的方法和組合物。發(fā)明的第一方面提供了用于類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎診斷的方法，包括通過雙向電泳(two-dimentionalelectrophoresis)對樣品(如血漿、血清或滑液)進(jìn)行分析，以檢測至少一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)的水平，例如選自此處所公開的RADF組中的一種。這些方法也適用于篩選、預(yù)后、監(jiān)測治療效果和藥物開發(fā)。發(fā)明的第二方面提供了用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的方法，包括檢測樣品(如血漿、血清或滑液)中至少一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白同種型(RPI)的水平，例如選自此處所公開的RPI組中的一種。這些方法也適用于篩選、預(yù)后、監(jiān)測治療效果和藥物開發(fā)。發(fā)明的第三方面是提供了能夠與一種RPI，例如此處公開的一種RPI，免疫特異性結(jié)合的單克隆抗體和多克隆抗體發(fā)明的第四方面是提供了一種制品，該制品包含一種已分離的RPI，即一種不合與RPI有明顯不同表觀分子量或等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)同種型的RPI。發(fā)明的第五方面提供了用于治療或防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括施用能降低至少一種RADF水平(或者至少一種RPI的水平或活性)的化合物，與RA患者血清相比，所述RADF或RPI在RA患者的滑液中以增高的水平存在。優(yōu)選地，施用的化合物為抗體、反義寡核苷酸、核酶或能夠形成三螺旋的寡核苷酸。發(fā)明的第六方面提供了用于治療或防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括施用能增高至少一種RADF水平(或者至少一種RPI的水平或活性)的化合物，與RA患者血清相比，所述RADF或RPI在RA患者的滑液中以降低的水平存在。優(yōu)選地，施用的化合物為RPI、編碼RPI的核酸(如，作為一種表達(dá)載體的一部分的核酸)或能夠表達(dá)且分泌一種或多種RPI的細(xì)胞。4．附圖簡述圖1是由正常人血清的雙向電泳得到的圖像，圖像顯示鑒定出了14個界點(diǎn)特征，標(biāo)記為PL1-PL16。5．發(fā)明詳述以下詳細(xì)敘述的發(fā)明包括用于受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎篩選、診斷、預(yù)后的方法和組合物，以及用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療效果監(jiān)測的方法和用于藥物開發(fā)的方法以及用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。優(yōu)選地，受試者是哺乳動物，更優(yōu)選為人，最優(yōu)選地，受試者是成年人。為了公開清楚而不以任何方式限制，本發(fā)明將以血清及滑液樣品的分析為例進(jìn)行描述。但是，作為一個本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，此處所述的鑒定和技術(shù)可以應(yīng)用于其它類型的病人樣品，包括體液(例如血漿、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)吸出物)、組織樣品或其勻漿。5.1．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)在本發(fā)明的一個方面中，雙向電泳用于分析受試者血清以測量一個或多個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)的豐度，可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選和診斷、決定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的預(yù)后、監(jiān)測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的效果或者用于藥物的開發(fā)。此處所用的雙向電泳是指一項(xiàng)包括等電聚焦和隨后的變性電泳在內(nèi)的技術(shù)。它可以產(chǎn)生包含多個已分離的蛋白質(zhì)的雙向膠(2D-gel)。優(yōu)選地，變性電泳步驟使用十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。特別優(yōu)選的是美國申請第08/980,574和WO98/23950中所描述的高度準(zhǔn)確和自動化的方法及設(shè)備(“優(yōu)選技術(shù)”)，此處完整引述作為參考。簡要的說，優(yōu)選的技術(shù)提供了足夠的、計(jì)算機(jī)輔助的方法和設(shè)備以用于生物樣品中生物分子的鑒定、選擇和特征描述。根據(jù)生物分子的電泳遷移率和等電點(diǎn)在雙向膠中分離它們，可以得到一個雙向圖譜(array)。由此圖譜可以產(chǎn)生一個計(jì)算機(jī)形成的數(shù)字圖形，代表雙向圖譜中檢測的多種生物分子的特性、表觀分子量、等電點(diǎn)和相對豐度，因而能夠允許將來自多個生物樣品的圖形進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的比較，以及計(jì)算機(jī)輔助的已分離目標(biāo)蛋白質(zhì)的切割。此處所用的術(shù)語“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)”指的是在生物樣品經(jīng)雙向電泳后可檢出的特征(例如雙向膠中的一個點(diǎn))，它不同地存在于一個樣品和另外的與其相關(guān)樣品中，例如(1)在一個患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中與在一個沒有患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中相比；或者(2)在一個取自患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者滑液中與在一個取自未患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中相比。如此處所用，當(dāng)用于檢測特征(或同種型)的方法(例如雙向電泳或免疫分析方法)顯示所檢測特征(或蛋白質(zhì)同種型)在第一個樣品中與在第二個樣品中的相對豐度不同時(shí)，則此處所用的術(shù)語特征(或蛋白質(zhì)同種型)相對于第二個樣品而言，“不同地存在于”第一個樣品中。如果所測量的特征在第一個樣品中的豐度高于在第二個樣品中的量，則相對于第二個樣品，特征或同種型在第一個樣品中是“升高”的；相反的，如果所測量的特征在第一個樣品中的豐度低于在第二個樣品中的量，則相對于第二個樣品，特征或同種型在第一個樣品中是“降低”的。優(yōu)選的，特征在兩個樣品中的相對豐度是通過兩個步驟來確定的。首先，參照一個適當(dāng)?shù)谋尘皡?shù)將依賴于樣品中所發(fā)現(xiàn)特征而得到的信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，例如，參照分析樣品中的總蛋白質(zhì)(例如上樣到膠上的總蛋白質(zhì))，參照一個穩(wěn)定的特征，也就是已知的在所比較的樣品中含量相似的一個特征，例如一個或多個“表達(dá)參考特征”(ERF)，例如下面公開的“表達(dá)參考特征”，或者參照來源于樣品中所有蛋白質(zhì)的能檢測到的總信號。其次，一個或一組樣品中已標(biāo)準(zhǔn)化的特征的信號與另外一個或一組樣品中同一特征的已標(biāo)準(zhǔn)化的信號相比較，用以鑒定那些相對于第二個樣品(或樣品組)“不同地存在于”第一個樣品(或樣品組)中的特征。通過兩組樣品的比較之一已鑒定出此處公開的RADF。第一組RADF包括以下特征(a)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清相比，在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者滑液中不同地存在的RADF；以及(b)與無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清相比，在未患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者滑液中并非不同地存在的RADF。無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者可包括已知無疾病或病癥的正常受試者，或患有非RA的關(guān)節(jié)疾病或病癥的受試者，包括但不限于痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎或滑膜炎(例如，創(chuàng)傷性滑膜炎)。第二組RADF是那些與無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清相比，在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中不同地存在的RADF。通過優(yōu)選技術(shù)的方法和裝置已鑒定了四組RADF。第一組由這樣的RADF組成，所述RADF在患有RA的受試者中相對于血清而言在滑液中增加，而在未患有RA的受試者中相對于血清而言在滑液中不增加。這些RADF可以用表觀分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)表述如下表Ⅰ在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中在滑液中相對于血清而言增加的RADF<tablesid="table2"num="002"><table>名稱增加倍數(shù)pIMW(kd)RADF-79.95.8626,217RADF-88.25.7958,161RADF-95.06.1757,613RADF-103.75.4339,842RADF-113.45.9852,631RADF-123.37.0672,543</table></tables>第二組由這樣的RADF組成，所述RADF在患有RA的受試者中相對于血清而言在滑液中降低，而在未患有RA的受試者中相對于血清而言在滑液中不降低。這些RADF可以用表觀分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)表述如下表Ⅱ在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，在滑液中相對于血清而言降低的RADF<tablesid="table3"num="003"><table>名稱降低倍數(shù)pIMW(kd)RADF-1337.54.9253,578RADF-1424.66.276,789RADF-1512.64.5663,737RADF-1611.95.3624,124RADF-1710.15.96158,868RADF-189.09.5214,953RADF-195.35.1131,608RADF-203.75.1260,216RADF-212.94.9532,321RADF-223.06.9527,812</table></tables>第三組由這樣的RADF組成，與不患有RA的受試者血清相比，所述RADF在患有RA的受試者的血清中增加，這些RADF可以用表觀分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)表述如下表Ⅲ相對于非RA血清而言在RA血清中增加的RADF第四組由這樣的RADF組成，與不患有RA的受試者血清相比，所述RADF在患有RA的受試者的血清中降低。這些RADF可以用表觀分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)表述如下表Ⅳ相對于非RA血清而言在RA血清中降低的RADF對于在第一和第二組中任何指定的RADF來說，將患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者滑液中測量的信號與患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中測量的信號加以比較，所得到的比值依賴于所用的特定分析規(guī)程和檢測技術(shù)。因而，本發(fā)明構(gòu)思了作為診斷領(lǐng)域的傳統(tǒng)做法，對于第一和第二組中的各個RADF，每一個實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)所使用的分析規(guī)程和檢測技術(shù)，建立有或者無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中滑液相對于血清中每一個RADF比值的參考范圍。優(yōu)選的，在每批分析的試驗(yàn)樣品中均應(yīng)包括至少一對來自已知患有RA的受試者的滑液與血清樣品的對照，或者至少一對來自已知未患有RA的受試者的滑液與血清樣品的對照(更優(yōu)選地，至少包括這兩類對照對中的一個)。類似地，對于在第三和第四組中任何指定的RADF來說，將患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中測量的信號與未患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中測量的信號加以比較，所得到的比值依賴于所用的特定分析規(guī)程和檢測技術(shù)。因而，本發(fā)明構(gòu)思了作為診斷領(lǐng)域的傳統(tǒng)做法，對于第三和第四組中的各個RADF，每一個實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)所使用的分析規(guī)程和檢測技術(shù)，建立有或者無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中每一個RADF比值的參考范圍。優(yōu)選的，在每批分析的試驗(yàn)樣品中均應(yīng)包括至少一個來自已知患有RA的受試者的血清樣品陽性對照，或者至少一個來自未患有RA的受試者的血清樣品陰性對照(更優(yōu)選地，至少包括一個陽性對照和至少一個陰性對照)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，參照一個或多個在相同雙向膠中檢測的一個或多個表達(dá)參考特征，將與RADF相關(guān)的信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然知道，利用優(yōu)選技術(shù)通過比較不同樣品可容易的確定這種ERF。用于此目的之合適的ERF包括(但不限于)下表中所列的那些表Ⅴ以舉例方式，表Ⅵ顯示，表Ⅰ和表Ⅱ中鑒定的RADF水平被標(biāo)準(zhǔn)化為ERF-1和ERF-3；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，RADF的水平可相對于任何希望的ERF被標(biāo)準(zhǔn)化。表Ⅵ中的值是各個RADF相對于目標(biāo)ERF的比值，其中正比值表明相對于ERF之RADF水平增加，負(fù)比值表明相對于ERF之RADF水平降低。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，RADF/ERF比值可以其自身的權(quán)重用做診斷參數(shù)。表Ⅵ在RA滑液中RADF與ERF的比值<tablesid="table7"num="007"><table>RADF#標(biāo)準(zhǔn)化至ERF-1標(biāo)準(zhǔn)化至ERF-3RADF-1-22.2-26.0RADF-2-96.6-124.6RADF-3-59.4-71.3RADF-1338.131.8RADF-4-23.0-27.6RADF-1425.221.9RADF-5-6.4-7.3RADF-1513.211.1RADF-1612.39.9RADF-6-10.3-12.2RADF-1710.28.4RADF-7-2.3-2.8RADF-189.27.6RADF-8-7.3-9.2RADF-195.54.6RADF-9-4.8-5.6RADF-203.83.3RADF-10-3.7-4.4RADF-11-3.5-4.7RADF-12-2.5-3.1RADF-222.72.3</table></tables>類似地，表Ⅶ顯示，表Ⅲ和表Ⅳ中鑒定的RADF水平被標(biāo)準(zhǔn)化為ERF-1和ERF-3；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，RADF的水平可相對于任何希望的ERF來表示。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，RADF/ERF比值可以其自身的權(quán)重用做診斷參數(shù)。表Ⅶ在RA血清中RADF與ERF的比值<tablesid="table8"num="008"><table>RADF#標(biāo)準(zhǔn)化至ERF-1標(biāo)準(zhǔn)化至ERF-3RADF-32-13.4-9.5RADF-235.67.3RADF-244.45.3RADF-163.54.0RADF-33-1.4-1.3RADF-34-2.9-2.5RADF-252.93.2RADF-262.62.8RADF-35-4.0-3.7RADF-272.42.6RADF-36-3.0-2.6RADF-28-2.22.8RADF-37-4.2-3.5</table></tables>作為熟練的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易理解，一個給定特征或蛋白質(zhì)同種型的測量分子量和等電點(diǎn)，會根據(jù)雙向電泳和界點(diǎn)匹配的每一步驟中所用的具體規(guī)程而在一定范圍內(nèi)變動。此處所用的術(shù)語“分子量”和“等電點(diǎn)”分別定義為準(zhǔn)確依照在下文第六節(jié)列出的實(shí)驗(yàn)規(guī)程(“參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程”)測定的特征或蛋白質(zhì)同種型的表觀分子量和等電點(diǎn)。當(dāng)按照參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程，樣品以雙份平行或更多數(shù)目平行測定時(shí)，測得的RADF或RPI的平均等電點(diǎn)的偏差小于±1％；測得的RADF或RPI的平均分子量的偏差通常小于±5％。在熟練技術(shù)人員希望背離參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程的地方，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，用以比較使用(a)參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程和(b)變化的實(shí)驗(yàn)規(guī)程檢測到的每一個RADF或蛋白質(zhì)同種型的分子量和等電點(diǎn)。RADF可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)現(xiàn)、預(yù)后、診斷或監(jiān)測或是藥物開發(fā)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，受試者的滑液和血清通過雙向電泳分析，以定量檢測選自RADF-1到RADF-12中的一個或多個RADF，其中一個RADF在受試者滑液中相對于血清的豐度增加，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，受試者的滑液和血清通過雙向電泳分析，以定量檢測選自RADF-13到RADF-22中的一個或多個RADF，其中一個RADF在受試者滑液中相對于血清的豐度降低，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，受試者的滑液和血清通過雙向電泳分析，以定量檢測選自RADF-1到RADF-22中的一個或多個RADF，其中相對于表達(dá)參考特征(ERF)的一個或多個RADF的比值，表明類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎的存在；ERF-1和ERF-3為用于此目的之優(yōu)選ERF。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，患有RA的受試者的血清通過雙向電泳分析，以定量檢測選自RADF-13、RADF-16以及RADF-22至RADF-31中的一個或多個RADF，其中相對于受試者或無RA受試者血清(如，對照樣品或以前測定的參考范圍)，在受試者血清中RADF豐度的增加，表明類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，受試者的滑液通過雙向電泳分析，以定量檢測選自RADF-32至RADF-40中的一個或多個RADF，其中相對于受試者或無RA受試者血清(如，對照樣品或以前測定的參考范圍)，在受試者血清中RADF豐度的降低，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，受試者的血清通過雙向電泳分析，以定量檢測選自RADF-13、RADF-16以及RADF-22至RADF-40中的一個或多個RADF，其中相對于ERF的一個或多個RADF比值，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在；ERF-1和ERF-3為用于此目的之優(yōu)選ERF。5.2．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)本發(fā)明的另一方面是分析受試者血清，以定量檢測一個或多個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)，這些RPI可以用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選或診斷、決定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的預(yù)后、監(jiān)測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的效果或藥物開發(fā)。此處所用的術(shù)語“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型”包括(1)與來自無RA的受試者血清相比，不同地存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清中的蛋白質(zhì)同種型，和(2)一種蛋白質(zhì)同種型，(a)其與來自RA的受試者血清相比，不同地存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者滑液中，以及(b)其與來自無RA的受試者血清相比，并非不同地存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者滑液中。本領(lǐng)域公知，單基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可能表達(dá)成變體(同種型)，這種不同是不同的翻譯后修飾的結(jié)果(例如糖基化、磷酸化或乙酰化)，以至于具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)可以有不同的等電點(diǎn)、分子量或兩者皆不同；和/或，這種不同源于它們的氨基酸組成不同(例如另外的mRNA剪接或有限的蛋白質(zhì)降解的結(jié)果)。因此蛋白質(zhì)同種型的不同地存在并不需要編碼該目的蛋白質(zhì)的基因的不同表達(dá)。使用優(yōu)選技術(shù)部分中的方法和設(shè)備，通過RADF的部分氨基酸測序，已鑒定出了四組RPI。第一組由這樣的RPI組成，其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中，相對于血清而言滑液中RPI增加，但是在無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者中，相對于血清而言滑液中的RPI不增加。這些RPI的分子量、等電點(diǎn)和部分氨基酸序列列于表Ⅷ，如下表Ⅷ在滑液中RP的增加<tablesid="table9"num="010"><table>RPIRADF同源性蛋白質(zhì)部分氨基酸序列pIMW(kd)CSTSSLLEACTFRFDEFFSEGCAPGSKKPVEEYANCHLAREDPQTFYYAVAVVKDCHIAQVPSHTVVARELDIWELLNQAQEHFGKSAGWNIPIGLLYCDLPEPRRPI-2RADF-2IgGκ輕鏈SGTASVVCLLNNFYPRFSGSGSGTDFTLTISREIVLTQSPATLSLSPGER7.4225,049RPI-3RADF-3(α-1-抗胰蛋白酶WERPFEVKSVLGQLGITKLSITGTYDLKSPLFMGKFLENEDRQINDYVEKKQINDYVEKLGMFNIQHCKGKWERPFEVKTDTSHHDQDHPTFNKLQHLENELTHDIITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLYHSEAFTVNFGDTEEAK4.9254,948RPI-4RADF-4維生素D結(jié)合蛋白YTFELSRFEDCCQEKHLSLLTTLSNRVCSQYAAYGEKRTHLPEVFLSK5.153,241RPI-5RADF-6血漿銅藍(lán)蛋白前體EYTDASFTNRDDEEFIESNKQSEDSTFYLGERALYLQYTDETFRLISVDTEHSNIYLQNGPDRQYTDSTFRMYYSAVDPTKGAYPLSIEPIGVRNNEGTYYSPNYNPQSR5.14137,225RPI-6RADF-8Igα--1&2鏈c區(qū)WLQGSQELPRYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILR5.7958,161RPI-7RADF-9Igα-1&2鏈c區(qū)WLQGSQELPR6.1757,613RPI-8RADF-10觸珠蛋白前體VGYVSGWGRYVMLPVADQDQCIR5.4339,842RPI-9RADF-11β-2-糖蛋白1前體(載脂蛋白H)VCPFAGILENGAVRATVVYQGEREHSSLAFWKTCPKPDDLPFSTVVPLK5.9852,631RPI-10RADF-11新VAA(I/L)EHFGR5.9852,631RPI-11RADF-12轉(zhuǎn)鐵蛋白DYELLCLDGTR7.0672,543</table></tables>第二組由這樣的RPI組成，其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中，相對于血清而言滑液中RPI降低，但是在無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者中，相對于血清而言滑液中的RPI不降低。這些RPI的分子量、等電點(diǎn)和部分氨基酸序列列于表Ⅸ，如下表Ⅸ<tablesid="table10"num="011"><table>RPIRADF同源性蛋白質(zhì)部分氨基酸序列pIMw(kd)RPI-12RADF-13α-1-抗胰蛋白酶DTEEEDFHVDQVTTVKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSITGTYDLKLGMFNIQHCKSVLGQLGITKFLENEDRFLENEDRRWERPFEVKGKWERPFEVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKLYHSEAFTVNFGDTEEAKK4.9253,578RPI-13RADF-14轉(zhuǎn)鐵蛋白前體DSGFQMNQLRWCALSHHERSASDLTWDNLKEGYYGYTGAFRSCHTGLGRSCHTAVGRAPNHAVVTRDCHLAQVPSHTVVAR6.276,789RPI-14RADF-14IgM鏈LICQATGFSPRVSVFVPPRDGFFGNPRQIQVSWLRQVGSGVTTDQVQAEAKFTCTVTHTDLPSPLKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRGFPSVLRVQHPNGNKNVPLPVIAELPPKDVMQGTDEHVVCXYVTSAPMPEPQAPGRESDWLSOSMFTCR6.276,789RPI-15RADF-15α-1-抗胰凝乳蛋白酶前體DSLEFRADLSGITGAREOLSLLDRITLLSALVETRWEMPFDPQDTHQSRLYGSEAFATDFQDSAAAKAVLDVFEEGTEASAATAVK4.5663,737RPI-16RADF-16載脂蛋白A-1前體LSPLGEEMRVQPYLDDFQKDLATVYVLKAHVDALRAELQEGARWQEEMELYRVSFLSALEEYTK5.3624,124RPI-17RADF-16新DSGAD(I/L)S5.3624,124RPI-18RADF-17補(bǔ)體因子H前體QMSKYPSGERMDGASNVTCINSRCGKDGWSAQPTCIKGNTAKCTSTGWIPAPRIDVHLVPDR5.96158,868</table></tables><tablesid="table11"num="012"><table>RPIRADF同源性蛋白質(zhì)部分氨基酸序列pIMW(kd)EFDHNSNIRRPYFPVAVGKSLGNVIMVCRLYSTCEGGFRHGGLYHENMREIMENYNIALRTDCLSLPSFENAIPMGEKRPI-19RADF-17銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶DRSASHLDHKASINSLLSDKRQIEAMGFPAFVKVFAEVLPSHKVAKCYIQVTGMTCASCVANIER5.96158,868RPI-20PADF-17新NV(I/L)DAPHAR5.96158,868RPI-21RADF-18血紅蛋白α鏈VGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVK9.5214,953RPI-22RADF-19血漿銅藍(lán)蛋白前體GAYPLSIEPIGVRALYLQYTDETFRGSLHANGRYTVNQCRQYTDSTFRDNEDFQESNRQSEDSTFYLGERDLYSGLIGPLIVCRVDKDNEDFQESNRNNEGTYYSPNYNPOSR5.1131.608RPI-23RADF-20Igα-1&2鏈c區(qū)QEPSQGTTTFAVTSILRYLTWASRSAVQGPPERWLQGSQELPRDASGATFTWTPSSGK5.1260,216RPI-24RADF-22補(bǔ)體C3C前體HQQTVTPPKSSLSVPYVIVPLKLPYSVVRDSITTWEILAVSMSDKSEFPESWLWNVEDLKTLDPERVVPEGIRNEQVEIRAVLYNYRRHQQTVTIPPKAAVYHHFISDGVRVELLHNPAFCSLATTKSNLDEDILAEENIVSR6.9527,812</table></tables>第三組包括這樣的RPI，與在無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者的血清中相比，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者的血清中RPI增加。這些RPI的分子量、等電點(diǎn)和部分氨基酸序列列于表Ⅹ，如下表Ⅹ第四組包括這樣的RPI，與無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者的血清中相比，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者的血清中RPI降低。這些RPI的分子量、等電點(diǎn)和部分氨基酸序列列于表Ⅺ，如下表Ⅺ<tablesid="table14"num="016"><table>RPIRADF同源蛋白質(zhì)部分氨基酸序列pIMW(kd)KGEWVALNPLRGEWVALNPLRKRPI-36RADF-35觸珠蛋白相關(guān)蛋白前體VGYVSGWGQSDNFKNYAEVGRVVLHPNYHQVDIGLIK5.9334,471RPI-37RADF-36Igα--1&2鏈c區(qū)WLQGSQELPRQEPSQGTTTFAVTSILRYLTWASRSAVQGPPER6.0957,613RPI-38RADF-37補(bǔ)體因子H前體EIMENYNIALRIDVHLVPDREFDHNSNIRRPYFPVAVGKSLGNVIMVCRSCDIPVFMNARTDCLSLPSFENAIPMGEK5.41183,864</table></tables>在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，分析受試者滑液和血清，以定量檢測選自RPI-1到RPI-11中的一個或多個RPI，其中一個或多個這類RPI在滑液中相對于血清的豐度增加，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，分析受試者的滑液和血清，以定量檢測選自RPI-12到RpI-24中的一個或多個RpI，其中一個或多個這類RPI在滑液中相對于血清的豐度降低，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，分析受試者的血清，以定量檢測選自RPI-12、RPI-16、RPI-17和RPI-24至RPI-32中的一個或多個RPI，其中一個或多個這類RPI在受試者血清中豐度的增加，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，分析受試者的血清，以定量檢測選自RPI-33到RPI-38中的一個或多個RPI，其中一個或多個這類RPI在受試者血清中豐度的降低，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。優(yōu)選地，RPI的豐度被標(biāo)準(zhǔn)化至一種表達(dá)參考蛋白質(zhì)同種型(ERPI)。使用優(yōu)選技術(shù)部分的方法和裝置，通過上述ERF的部分氨基酸序列測定鑒定了ERPI。這些ERPI的部分氨基酸序列以及它們與之同源的已知蛋白質(zhì)示于表Ⅺb。表Ⅺb<tablesid="table15"num="017"><table>ERPI-#ERF-#同源蛋白質(zhì)部分氨基酸序列ERPI-1ERF-4Zn-α-2-糖蛋白前體EDIFMETLKERPI-2ERF-6免疫球蛋白重鏈γ(中間體區(qū)段)EEQYNSTYRERPI-3ERF-8α-2-HS-糖蛋白前體LDGKFSVVYAK</table></tables>如上所示，此處所述的RPI包括以前未知的蛋白質(zhì)和已知蛋白質(zhì)的同種型，以前并不知道這些同種型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。對于每一個RPI，本發(fā)明另外提供了包括分離的RPI或其片段的制品，以及進(jìn)一步提供了能結(jié)合所述RPI或所述片段的抗體，或能與所述RPI及所述片段結(jié)合的抗體。此處所述“分離的”RPI是指這樣的RPI，如雙向電泳鑒定的，它不包含與RPI的那些同種型有顯著不同分子量和等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)同種型。此處所述“顯著不同的”等電點(diǎn)或分子量是指按照參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程操作，在雙向電泳中能夠和RPI分離開的污染的蛋白質(zhì)同種型之等電點(diǎn)或分子量。在一個實(shí)施方案中，提供了一種分離的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括具有在表Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ或表Ⅺ中鑒定的針對RPI氨基酸序列的肽，所述蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量在表Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ或表Ⅺ中鑒定出的相應(yīng)RPI分子量和等電點(diǎn)的10％變化范圍以內(nèi)(優(yōu)選地，是在5％變化范圍以內(nèi)，更優(yōu)選地，是在1％變化范圍以內(nèi))。本發(fā)明的RPI可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何方法加以分析。在一個實(shí)施方案中，RPI由于其分子量和等電點(diǎn)而在雙向膠中得到分離，通過對膠染色而顯現(xiàn)出來。另外，RPI可以用分析方法測定，例如免疫分析方法，從而用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)現(xiàn)、預(yù)后、診斷或監(jiān)測，或者用于藥物開發(fā)。在一個實(shí)施方案中，在能夠發(fā)生免疫特異性結(jié)合的條件下，將來自要檢測的受試者之樣品與一種抗-RPI抗體接觸，然后檢測或測量任何被抗體免疫特異性結(jié)合的量。優(yōu)選的，抗-RPI抗體優(yōu)先結(jié)合RPI，而不是同-蛋白質(zhì)的其它同種型。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-RPI抗體與RPI的親和力和與同一蛋白質(zhì)的其它同種型的親和力相比，至少高出2倍；更優(yōu)選的，至少高出5倍；最優(yōu)選的，至少高出10倍。在另一實(shí)施方案中，如下進(jìn)行免疫分析鑒定在能夠發(fā)生免疫特異性結(jié)合的條件下，通過將來自例如待測受試者的樣品與多種抗-RPI抗體接觸，同時(shí)檢測或測量任何被針對多重RPI的多種抗體免疫特異性結(jié)合的量。優(yōu)選的，各個抗-RPI抗體結(jié)合不同的RPI，且任選地固定于固相支持物。例如，抗體可以以雙向圖譜(array)排列被固定，其中圖譜中各個位置被特異性結(jié)合單一RPI的抗體占據(jù)，且其中圖譜中具有特異于一個或多個RPI的抗體。優(yōu)選地，各個抗-RPI抗體優(yōu)先結(jié)合RPI，而不是同一蛋白質(zhì)的其它同種型。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-RPI抗體與RPI的親和力和與同一蛋白質(zhì)的其它同種型的親和力相比，至少高出2倍；更優(yōu)選的，至少高出5倍；最優(yōu)選的，至少高出10倍。在一個實(shí)施方案中，組織切片中的抗體結(jié)合可用于檢測異常的RPI定位或RPI的異常水平(例如高、中、低、缺失)。在一個特定的實(shí)施方案中，針對RPI的抗體可用于分析患者組織或血清樣品中RPI的存在情況，其中異常的RPI水平可以提示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在。此處所用的“異常水平”是指相對于來源于身體一部分或無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者的類似樣品中的水平或標(biāo)準(zhǔn)水平，水平的上升或下降?？梢允褂玫拿庖叻治龇椒òǖ幌抻诟偁幒头歉偁幏治鱿到y(tǒng)，使用的技術(shù)例如Western印跡、放射免疫分析、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、夾心式免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、凝集分析、補(bǔ)體固定分析、免疫放射量度分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析等等，此處僅指出其中的一些。如果可能，RPI可以用一種兩步法的夾心分析進(jìn)行測定。此處，RPI代表蛋白質(zhì)的一種特定糖基化形式(glycoform)。第一步，可用一種抗-RPI抗體(該抗體任選地固定于固相)捕捉RPI；第二步，可用一種直接或間接標(biāo)記的凝集素檢測捕捉到的RPI。任何優(yōu)先結(jié)合RPI而不是與下列蛋白質(zhì)結(jié)合的凝集素都可以用于此目的(a)、具有與RPI相同核心蛋白質(zhì)的其它糖基化形式；或是(b)、具有共同的抗體識別的抗原決定簇的其它同種型。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，選用的凝集素與RPI的親和力和與具有與RPI相同核心蛋白質(zhì)的其它糖基化形式的親和力相比，至少高出2倍，更優(yōu)選的，至少高出5倍；仍然更優(yōu)選的，至少高出10倍。適用于測定給定RPI的凝集素可以用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行鑒定，例如檢測列于下列參考文獻(xiàn)第158-159頁表Ⅰ列舉的一個或多個凝集素Sumar等，凝集素可作為疾病相關(guān)的糖基化形式的指示劑，摘自GabiusH-J&GabiusS(編)，1993，凝集素與糖生物學(xué)，第158-174頁。(此處全文引入作為參考文獻(xiàn))如果需要，將應(yīng)用編碼RPI基因、相關(guān)基因和相關(guān)的核酸序列及亞序列(包括互補(bǔ)序列)進(jìn)行雜交分析。編碼RPI的核苷酸或含有大約至少8個核苷酸的亞序列(或其互補(bǔ)序列)可以用作雜交探針。雜交分析可用于(尤其是經(jīng)過手術(shù)或治療后復(fù)發(fā)的)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中伴隨的RPI基因表達(dá)的異常改變之檢測、預(yù)后、診斷，或用于監(jiān)測病情和病況。特別是，這種雜交分析的進(jìn)行可通過如下方法，包括在雜交能夠發(fā)生的條件下，將含有核酸的樣品與核酸探針接觸，所述探針能與編碼RPI的DNA或RNA雜交，并檢測或測定任何產(chǎn)生的雜交結(jié)果。本發(fā)明也提供了包含置于一個或多個容器中的抗-RPI抗體的診斷試劑盒。此外，這樣的試劑盒可任選的包含以下一種或多種內(nèi)容(1)、用于診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測、藥物開發(fā)或這些應(yīng)用任一組合應(yīng)用的抗-RPI抗體的使用說明；(2)、許可證書。也就是一種管理藥品或生物制品生產(chǎn)、使用和銷售的政府部門認(rèn)可形式的通知，它表明了與用于人類的生產(chǎn)、使用或銷售有關(guān)的部門的認(rèn)可。(3)、標(biāo)記的針對抗體的結(jié)合配基。(4)、固相，(例如試劑紙條)，其上固定有抗-RPI抗體。如果沒有提供抗體的標(biāo)記結(jié)合配基，那么抗-RPI抗體本身可以用一示蹤標(biāo)記物標(biāo)記，例如化學(xué)發(fā)光的、酶的、熒光的或放射性的基團(tuán)。本發(fā)明也提供了一種試劑盒，包含分裝于一個或多個容器中的能與編碼不同RPI的RNA雜交的核酸探針。在一個特定的實(shí)施方案中，試劑盒包含分裝于一個或多個容器中的一對引物(例如每個的長度為6-30個核苷酸，更優(yōu)選的，為10-20個核苷酸)，這些引物在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下能引發(fā)編碼一種RPI的核酸(至少是其中一部分)的擴(kuò)增，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如參見Innis等，1990,PCR操作規(guī)程(PCRProtocol)，學(xué)院出版公司，圣地亞哥，加利福尼亞)、使用Qβ復(fù)制酶的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見EP320,308)、環(huán)式探針反應(yīng)或本領(lǐng)域已知的其他方法。本發(fā)明同樣提供了允許用于多個RPI或各自編碼一種RPI的多個核酸檢測的試劑盒。試劑盒可進(jìn)一步任選的包含預(yù)先定量過的一種分離的RPI蛋白質(zhì)或編碼RPI的核酸，例如用作標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ铡?.3．在臨床研究中的應(yīng)用本發(fā)明的診斷方法和組合物可以有助于指導(dǎo)或監(jiān)測臨床研究，例如，測試用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的藥物。在一個實(shí)施方案中，可以測試候選分子恢復(fù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者RADF或RPI水平趨向于非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中所見水平的能力，或在治療過的患者中保持RADF或RPI水平達(dá)到或接近非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者或血清水平的能力?？梢苑治鲆粋€或多個RADF或RPI的水平。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于臨床研究篩選候選者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎個體的鑒定，隨后，這些個體可以包括于或排除于研究中或單獨(dú)用于治療或分析。5.4．RPI的純化在某些特定方面，本發(fā)明提供了已分離的RPI，優(yōu)選的，人類RPI及其片段和衍生物，其包含抗原決定簇(也就是能被抗體識別)或者說是具有功能活性的，以及編碼前述的核酸。此處所用的“具有功能活性的”RPI是指那些表現(xiàn)出具有一個或多個與全長RPI(野生型)相關(guān)的已知的功能活性的材料，例如與RPI底物或結(jié)合配基結(jié)合、抗原性(與抗靶抗體結(jié)合)、免疫原性等。在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種RPI的片段，包含至少6個氨基酸、10個氨基酸、50個氨基酸或至少75個氨基酸。也提供了片段或包含片段的缺失RPI某些或全部區(qū)域的蛋白質(zhì)，還提供了編碼前述物質(zhì)的核酸。一旦鑒定出表達(dá)RPI基因序列的重組核酸，就可以對其基因產(chǎn)物進(jìn)行分析。這可以通過建立于產(chǎn)物物理或功能性質(zhì)之上的分析來完成，包括產(chǎn)物放射性標(biāo)記后的凝膠電泳分析、免疫分析等。一旦鑒定出RPI，它就可以用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離和純化，包括層析(例如離子交換層析、親和層析和分子篩柱層析)、離心、溶解度差異或其它用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。另外，一旦鑒定出由重組核酸產(chǎn)生的RPI，那么RPI的整個氨基酸序列就能從重組體中包含的嵌合基因的核苷酸序列推導(dǎo)出來，因此，相應(yīng)蛋白質(zhì)可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法進(jìn)行合成(例如參見Hunkapille等，1984，自然(Nature),310:105-111)在另一個實(shí)施方案中，天然RPI可以從天然來源用前述的標(biāo)準(zhǔn)方法純化(例如免疫親和純化)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，RPI用美國申請第08/980,574和WO98/23950中優(yōu)選技術(shù)所述的方法進(jìn)行分離，在此引入作為參考。進(jìn)行“制備級”操作時(shí)，根據(jù)Westermeier,1993，實(shí)踐中的電泳技術(shù)(VCH,Weinheim,德國)，第197-209頁(此處全文引入以作參考)描述的方法，等電聚焦步驟中優(yōu)選“窄范圍”的“聚集膠”，其pH范圍為2個pH單位或更少。這種方法上的修改允許在膠上加載更大量的目標(biāo)蛋白質(zhì)，因而可以增加可從膠上回收的分離RPI的量。當(dāng)以此方式進(jìn)行制備級操作時(shí)，優(yōu)選的技術(shù)在一次操作一般可提供近100ng及可高達(dá)1000ng分離的RPI。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解聚集膠可用于使用凝膠等電聚焦的任何分離策略。在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法或天然蛋白質(zhì)純化方法得到的RPI包括(但不局限于)，那些含有RPI全部或部分氨基酸序列的成分，以及其片段、其它衍生物、和類似物、包括其同源蛋白質(zhì)。5.5．針對RPI的抗體的生產(chǎn)依照發(fā)明，RPI及其片段、其它衍生物或類似物可以用作免疫原，用以生產(chǎn)可免疫特異性結(jié)合這種免疫原的抗體。這些蛋白質(zhì)、片段、衍生物或類似物可用任何傳統(tǒng)的方法加以分離，包括本申請前一部分?jǐn)⑹龅姆椒?。產(chǎn)生的抗體包括但不局限于多克隆、單克隆、嵌合的、單鏈的、Fab片段以及Fab表達(dá)文庫。在一特定的實(shí)施方案中，生產(chǎn)了針對人RPI的抗體。在另一個實(shí)施方案中，生產(chǎn)了針對RPI結(jié)構(gòu)域的抗體。在一個特定的實(shí)施方案中，RPI的親水片段用作免疫原，用于抗體的生產(chǎn)。1.1本領(lǐng)域已知的多種方法可用于針對RPI或其衍生物、類似物的多克隆抗體生產(chǎn)。在一個特定的實(shí)施方案中，可以獲得針對RPI的一個表位或其亞序列的兔多克隆抗體。多種宿主動物可以通過注射天然的RPI或合成的RPI或其衍生物(例如片段)來免疫，從而生產(chǎn)抗體。這些宿主動物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、馬、山羊等。多種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，這依賴于宿主動物的物種，這些佐劑包括但不局限于完全或不完全福氏佐劑、礦物膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、多聚醇類(pluronicpolyols)、多聚陰離子類、肽類、油乳劑類、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在的有用的人類佐劑，如BCG(卡芥苗)以及小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。為了制備針對RPI序列或其類似物的單克隆抗體，可以采用任何能夠用連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系來產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。例如最初由Kohler和Milstein發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)(1975，自然，256:495-497)以及三方雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫(ImmunologyToday),4:72)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cote等，1985，摘自單克隆抗體和癌癥治療(MonoclonalAntibodiesandCancertherapy),AlanR.Liss公司，第77-96頁)(此處以上文獻(xiàn)引入用作參考)。在發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，單克隆抗體可以在PCT/US90/02545(此處引入用作參考)中描述的無菌動物中產(chǎn)生。根據(jù)發(fā)明，可使用人抗體或可由使用人雜交瘤獲得(Cote等，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),80:2026-2030)，或體外用EBV病毒轉(zhuǎn)化人類B細(xì)胞獲得(Cole等，1985，摘自單克隆抗體和癌癥治療，AlanR.Liss公司，第77-96頁)。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明，可以使用通過將特異識別RPI的鼠抗體分子的基因與具有合適生物活性的人抗體基因剪接，形成嵌合抗體(Morrison等，1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)，81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314452-454)的技術(shù)，這種抗體也在此發(fā)明范圍之內(nèi)。(此處引入以上每一個文獻(xiàn)作為參考)。根據(jù)發(fā)明，用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4946,778，此處引入用作參考)可以經(jīng)調(diào)整以用于生產(chǎn)RPI特異性單鏈抗體。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫的技術(shù)(Huse等，1989，科學(xué)(Science),246:1275-1281)以快速方便的鑒定對RPI、衍生物或類似物具有理想特異性的單克隆Fab片段?？梢允褂靡阎募夹g(shù)生產(chǎn)含有分子獨(dú)特型的抗體片段。例如這些片段包括但不局限于抗體分子經(jīng)胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab’)2片段；還原F(ab’)2片段的二硫鍵后產(chǎn)生的Fab’片段、抗體分子經(jīng)木瓜蛋白酶和還原劑處理產(chǎn)生的Fab片段，以及Fv片段。在抗體的生產(chǎn)過程中，目標(biāo)抗體的篩選可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來完成，例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)。例如，為了選擇能夠識別RPI特定結(jié)構(gòu)域的抗體，我們可以分析產(chǎn)生的雜交瘤，其產(chǎn)物能夠與包含這樣的結(jié)構(gòu)域的RPI片段結(jié)合。為了選擇能夠特異性結(jié)合第一個RPI同系物而不特異性結(jié)合不同的RPI同系物的抗體，我們可以在第一個RPI同系物結(jié)合呈陽性而缺乏與第二個RPI同系物結(jié)合能力的基礎(chǔ)上來進(jìn)行篩選。類似的，為了選擇能夠特異性結(jié)合RPI而不特異性結(jié)合同一蛋白質(zhì)的不同同種型(例如，與RPI具有相同核心肽的不同糖基化形式)的抗體，我們可以在RPI結(jié)合陽性而缺乏與不同同種型(例如糖基化形式)結(jié)合能力的基礎(chǔ)上來進(jìn)行篩選。此外，已發(fā)展了用于制備“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)，81,6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312，604-608；Takeda等，1985，自然，314,452-454)，方法是通過剪接來自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和來自具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子的基因。一個嵌合抗體是一個其中不同部分來自不同動物種類的分子，如那些具有來自小鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)的分子(見，例如，Cabilly等的美國專利4,816,567；和Boss等的美國專利4,816,397，此處全文引用作為參考。)此外，還開發(fā)了用于制備人源化抗體的技術(shù)(見，例如，Queen的美國專利5,585,089；和Winter的美國專利5,225,539，此處全文引用作為參考。)。一個免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由這樣的“框架區(qū)”組成，該框架區(qū)由三個稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)間斷?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍已被詳細(xì)定義(見，“目的免疫球蛋白的蛋白質(zhì)序列，Kabat,E.等，美國健康與人力服務(wù)部(1983))。簡言之，人源化抗體是來自非人種類的抗體分子，具有一個或多個來自非人類的CDR以及來自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)。此外，可使用描述的用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778；Bird,1988，科學(xué)，242,423-426；Huston，等，1988，美國國家科學(xué)院院報(bào)，85,5879-5883；Ward等，1989，自然，334,544-546)。通過一個氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段形成了單鏈抗體，產(chǎn)生了單鏈多肽。識別特定表位的抗體片段可通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，這類片段包括但不限于，F(xiàn)(ab’)2片段(其可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生)，以及Fab片段(其可通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生)。或者，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，科學(xué)，246,1275-1281)，從而迅速且方便地鑒定具有期望特異性的單克隆Fab片段?？贵w標(biāo)記及其應(yīng)用此處描述了用于可檢測性標(biāo)記分子的方法，所述的分子能特異性識別RPI(或RPI的保守性變體或肽片段)之一種或多種RPI表位。此處所用的標(biāo)記及檢測方法可以是例如，在Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)中所述，此處完整引入作為參考。一種方法中，RPI特異性抗體或擬肽可通過將其連接于一種酶被標(biāo)記，這種標(biāo)記的分子可用于酶免疫分析，如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)。結(jié)合于抗體的酶將與適當(dāng)?shù)牡孜锓磻?yīng)，優(yōu)選地一種發(fā)色底物，反應(yīng)以這樣的方式進(jìn)行從而產(chǎn)生可被例如分光光度計(jì)法、熒光光度計(jì)法或可視法檢測的化學(xué)基團(tuán)。可被用于可檢測地標(biāo)記抗體、其衍生物和類似物的酶包括但不限于，蘋果酸脫氫酶、鏈球菌核酸酶、Δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿脂酶。檢測可通過發(fā)色法完成，其中利用針對酶的發(fā)色底物。檢測也可通過與類似制備的標(biāo)準(zhǔn)相比的可視底物酶反應(yīng)程度來完成。為用于檢測方法，優(yōu)選用放射性同位素，包括但不限于125I、131I或99mTc標(biāo)記分子。利用放射免疫分析(RIA)或放射性探針，這種肽和抗體可通過體內(nèi)分析檢測。放射性同位素可通過如下方法檢測，如使用γ-計(jì)數(shù)器或液閃計(jì)數(shù)器或通過放射自顯影方法。也可以用熒光化合物標(biāo)記抗體、其衍生物或類似物以及肽。當(dāng)熒光標(biāo)記的肽暴露于適當(dāng)波長的光線，由于其熒光可檢測到它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物是異硫氰酸胍、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻青蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺。也可以用生物素標(biāo)記抗體、其衍生物或類似物以及肽。生物素標(biāo)記的肽可接觸一種抗生物素蛋白偶聯(lián)的可檢測標(biāo)記，如熒光標(biāo)記偶聯(lián)的抗生物素蛋白。因?yàn)榭股锼氐鞍着c生物素有高親和力，抗生物素蛋白偶聯(lián)的可檢測標(biāo)記可與生物素標(biāo)記的肽結(jié)合，由此檢測所述肽。也可用發(fā)射熒光的技術(shù)如152Eu或其他鑭系元素可檢測地標(biāo)記抗體、其衍生物或類似物以及肽。利用諸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)這些金屬螯合基團(tuán)可將這些金屬結(jié)合于抗體、其衍生物或類似物以及肽。也可通過偶聯(lián)于化學(xué)發(fā)光化合物可檢測地標(biāo)記抗體、其衍生物或類似物以及肽?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記的肽的存在可通過檢測在化學(xué)反應(yīng)過程中增加的發(fā)光物的量測定。特別有用的化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記化合物的例子有魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。類似地，可使用生物發(fā)光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體、其衍生物或類似物以及肽。生物發(fā)光物是見于生物系統(tǒng)中的一種化學(xué)發(fā)光物，其中一種催化蛋白質(zhì)增加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。本發(fā)明的生物發(fā)光蛋白質(zhì)通過檢測發(fā)光物的存在測定。重要的用于標(biāo)記的生物發(fā)光化合物有螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。測定可特異性結(jié)合RPI的標(biāo)記的抗體可用于檢測多種樣品中RPI的存在，包括體液(如血漿、尿、腦脊液、關(guān)節(jié)吸出物)、組織樣品或其勻漿。這種標(biāo)記的抗體還可用于顯示在各個細(xì)胞中或其上的RPI的定位。測定可特異性結(jié)合RPI的標(biāo)記的抗體可以用診斷有效劑量施用于患者，以檢測RPI的存在。診斷有效量是指足以靶定在其表面含有RPI的診斷細(xì)胞分子的量，使得采用本領(lǐng)域可得的方法能檢測細(xì)胞。還提供了針對RPI的結(jié)構(gòu)域的抗體。前述抗體可以用于本領(lǐng)域已知的與本發(fā)明RPI的定位和活性相關(guān)的方法，例如這些蛋白質(zhì)的顯像、在適當(dāng)生理樣品中RPI水平的測定和用在診斷方法中等等。5.6．編碼RPI的DNA的分離下面將以舉例的方式，不加任何限制的闡述用于RPI基因克隆的特定的實(shí)施方案。本發(fā)明的核苷酸序列(包括DNA和RNA)以及包含編碼RPI或其片段、其類似物的序列，可以用本領(lǐng)域已知的方法合成，例如使用傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法和重疊寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。這些序列同樣也可用作來自任何物種的RPI基因的克隆和鑒定，例如用于篩選cDNA文庫、基因組文庫或表達(dá)文庫。包含本發(fā)明中RPI編碼序列的核苷酸序列可用于與其它蛋白質(zhì)基因的互補(bǔ)序列選擇性形成二聚體分子。依賴于不同的應(yīng)用，不同的序列同一性可以通過不同的雜交條件來實(shí)現(xiàn)。為了獲得高度的選擇性，可以使用相對苛刻的條件來形成二聚體，例如低鹽或高溫條件。此處所用的“高度嚴(yán)格條件”是指與濾膜上結(jié)合的DNA進(jìn)行的雜交是在0.5MNaHPO4、7％SDS、1mMEDTA、65℃；在0.1×SSC/0.1％SDS、68℃下清洗。(AusubelF.M.等編，1989，分子生物學(xué)通用操作規(guī)程(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，第一卷，Green出版聯(lián)合公司和JohnWiley&sons公司，紐約，第2.10.3頁；此處完整引入作為參考)。對于某些應(yīng)用，需要不甚嚴(yán)格的雜交條件。此處所用的“中度嚴(yán)格的條件”是指在0.2×SSC/0.1％SDS、42℃條件下清洗(Ausubel等，同上)。雜交條件也可以通過增加甲酰胺的量以使雜交二聚體去穩(wěn)定而變得嚴(yán)格。因而特定的雜交條件可以容易的操縱，一般應(yīng)當(dāng)根據(jù)所預(yù)期的結(jié)果來選擇。例如，傳統(tǒng)的雜交溫度在50％甲酰胺存在下是對于與RPI基因片段有95-100％同源性的探針為42℃；90-95％同源性的為37℃；70-90％同源性的為32℃。在基因組文庫的制備中可以產(chǎn)生DNA片段，其中有些編碼RPI的一部分或全部。DNA可能用多種限制性內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)切開。另外，可以在錳存在下使用DNA酶將DNA打碎，或者用物理方法將DNA剪切，例如用超聲波。隨后DNA片段可以根據(jù)大小用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行分離，包括但不局限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳、柱層析和蔗糖梯度離心。然后DNA片段可插入到適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不局限于質(zhì)粒、粘粒、λ或T4噬菌體和酵母人工染色體(YAC)(參見，例如，Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約；GloverD.M.(編)，1985,DNA克隆實(shí)驗(yàn)方法(DNACloningAPracticalApproach),MRL出版有限公司，牛津，英國，第Ⅰ、Ⅱ卷；AusubelF.M.等編，1989，分子生物學(xué)通用操作規(guī)程，第一卷，Green出版聯(lián)合公司和JohnWiley&sons公司，紐約)。基因組文庫可以通過將核酸與標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交來篩選(Benton和Davis,1979，科學(xué)，196:180；Grunstein和Hogness,1975，美國國家科學(xué)院院報(bào)，72:3961)。基因組文庫可以用相應(yīng)于RPI的任一肽的氨基酸序列之標(biāo)記的簡并性寡核苷酸探針，使用本領(lǐng)域熟知的最適方法進(jìn)行篩選。所用的探針優(yōu)選的至少10個核苷酸(更優(yōu)選的，15個核苷酸，仍舊更優(yōu)選的，20個核苷酸)。如前述表Ⅷ-表Ⅺ所示，此處公開的一些RPI對應(yīng)于先前已鑒定的一些蛋白質(zhì)，其編碼基因的序列也已公開。要篩選這樣的基因，可以使用任何與這些基因和其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的探針，優(yōu)選的，探針長度為10核苷酸或更長，更優(yōu)選的，15核苷酸或更長。使用國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的檢索數(shù)據(jù)庫(其網(wǎng)址為http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以通過下述檢索號獲得這些RPI的基因序列，此處引入每個基因的序列以作參考。表ⅫRPI相關(guān)蛋白質(zhì)的基因序列對于RPI-10、RPI-17和RPI-20，其各自的一組簡并性探針列于下面a)RPI-10的探針5′-ACGACCTTTATGTTCTATAGCAGCAAC-3′GTGGGCCGGGGTTAATTTCCGCCCb)RPI-17的探針5′-ACGAGCATGAGGAGCATCTATAAGATT-3′GTGGGGGCGGGTTTTAATCCCCGCc)PRI-20的探針5′-AGATATATCAGCACCAGAATC-3′GCTCGGGGGCTGTAATTTCGCCC文庫中，含有編碼RPI或其片段的目的DNA插入序列之克隆可以和一個或多個簡并性寡核苷酸探針(或其互補(bǔ)序列)雜交。這種寡核苷酸探針與基因組文庫的雜交可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。例如與前面所述的系列簡并性寡核苷酸探針(或其互補(bǔ)序列)雜交(或與這樣的系列中的任何成員或其互補(bǔ)序列雜交)。這種雜交可以在前面所述的高度嚴(yán)格或中度嚴(yán)格的條件下進(jìn)行，或可在2×SSC,1.0％SDS,50℃的反應(yīng)和清洗條件下進(jìn)行。另一方面，編碼RPI部分或全部多肽的核苷酸序列或RPI衍生多肽的核苷酸序列之克隆可以通過篩選表達(dá)文庫獲得。例如相關(guān)來源的DNA分離后，制備隨機(jī)片段，然后連接入一個表達(dá)載體(例如噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒和粘粒)以致于載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后而使載體中的插入片段能被宿主表達(dá)。多種篩選分析可用于選擇表達(dá)的RPI或RPI衍生多肽。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多種抗RPI抗體通過本領(lǐng)域已知的方法可用于鑒定目標(biāo)克隆，參見，例如Harlow和Lane,1998，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約，附錄Ⅳ。將文庫中的克隆或噬菌斑與這些抗體接觸從而鑒定那些結(jié)合的克隆。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)Olsvick等，第二十九屆ICAAC，休斯頓，得克薩斯，1989的文獻(xiàn)(此處引入用作參考)，含有編碼RPI或RPI衍生多肽的序列之克隆或噬菌斑可以用DYNA珠來鑒定。抗RPI抗體交聯(lián)于甲苯磺?；腄YNA珠M280上，這些抗體包被珠可用于吸附至表達(dá)RPI和RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑。表達(dá)RPI或RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑可通過這種與珠的結(jié)合而得到鑒定。另外，抗RPI抗體可以非特異性地固定化于適當(dāng)?shù)闹С治锷?，例如硅質(zhì)或硅藻土(CelsiteTM)基質(zhì)。這些材料可用于吸附表達(dá)RPI蛋白或RPI衍生多肽的細(xì)菌克隆。另一方面，PCR擴(kuò)增可用于產(chǎn)生編碼來源于基因組DNA中的部分和全部RPI的基本上純的DNA。簡并的或其它的對應(yīng)于已知RPI序列的寡核苷酸引物可用作引物。PCR可以使用Perkin-ElmerCetus的PCR擴(kuò)增儀和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶以及Taq聚合酶(GeneAMPTM)來進(jìn)行。可以選擇合成數(shù)個不同的簡并性引物用于PCR反應(yīng)。也可以改變引發(fā)PCR雜交反應(yīng)的雜交條件的嚴(yán)格程度，以適應(yīng)簡并性引物和DNA序列中相應(yīng)序列的更高的或更低的核苷酸序列相似性。成功地?cái)U(kuò)增編碼RPI的序列的一個片段后，這一片段可以進(jìn)行分子克隆和測序，并用作探針分離完整的基因組克隆。進(jìn)而允許鑒定基因的完整核苷酸序列，及對其表達(dá)進(jìn)行分析，生產(chǎn)用于如下所述的用于功能研究的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。RPI基因也可以通過核酸雜交后體外翻譯來篩選mRNA的方法進(jìn)行鑒定。在此方法中，片段用于通過雜交分離互補(bǔ)的mRNA。這樣的DNA片段可能代表著另一物種可用的純化的RPIDNA(例如小鼠或人)。對分離的mRNA之分離產(chǎn)物的體外翻譯產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀分析或功能分析(例如體外聚集能力、受體結(jié)合能力)可以鑒定目標(biāo)mRNA，因而可鑒定包含目標(biāo)序列的互補(bǔ)DNA片段。另外，特異性mRNA可能通過從細(xì)胞分離出的多核糖體與固定化的特異性針對RPI的抗體之吸附來選擇。使用選擇的mRNA(來自吸附的多核糖體)作為模板，可以合成放射性標(biāo)記的RPI的cDNA片段。放射性標(biāo)記的mRNA或cDNA能用作探針，鑒定來自其它基因組DNA片段的RPI的DNA片段。分離RPI基因組DNA的替代方法包括但不局限于，從一已知的序列化學(xué)合成基因序列本身，或制造針對編碼RPI之mRNA的cDNA。例如用于RPI基因cDNA克隆的RNA可以從表達(dá)RPI的細(xì)胞中分離出來。其他方法也是可能的并也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。任何真核細(xì)胞潛在的可以作為RPI基因分子克隆的來源。編碼RPI的核酸序列可以從以下材料分離脊椎動物、哺乳動物、人、豬、牛、貓、鳥、馬、犬、以及其它靈長類動物來源、昆蟲、植物等等。DNA可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從克隆的DNA(例如DNA文庫)獲得，可以通過化學(xué)合成、cDNA克隆或基因組DNA或其片段克隆，或純化自目標(biāo)細(xì)胞。(參見，例如Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約；GloverD.M.(編)，1985,DNA克隆實(shí)驗(yàn)方法(DNACloning:APracticalApproach),MRL出版有限公司，牛津，英國，第Ⅰ、Ⅱ卷)。來源于基因組DNA的克隆除了包含編碼區(qū)域以外，還可能包含調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子DNA序列。來源于cDNA的克隆可能只包含外顯子序列。不管來源如何，RPI基因應(yīng)當(dāng)通過分子克隆插入到一個適當(dāng)?shù)妮d體中以便進(jìn)行擴(kuò)增。已分離的和已鑒定的基因或cDNA可隨后插入到一個合適的克隆載體中。本領(lǐng)域大量的已知的載體宿主系統(tǒng)可用于此目的?？赡艿妮d體包括但不局限于，質(zhì)?；蛐揎椀牟《?，但是，載體系統(tǒng)必須和使用的宿主細(xì)胞相適應(yīng)。這樣的載體包括但不局限于，噬菌體例如λ噬菌體衍生物，或質(zhì)粒例如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物或Bluescript載體(Stratagene)?？梢酝ㄟ^將DNA片段連接入含互補(bǔ)粘性末端的克隆載體來完成這種插入過程。但是，如果克隆載體中不合用于切開DNA的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)，那么DNA分子末端可被酶促修飾。另外，任何目的位點(diǎn)可以通過向DNA末端連入核苷酸序列(連接子)產(chǎn)生。這些連接子可包含編碼限制性內(nèi)切酶識別序列的特定化學(xué)合成寡核苷酸。在一個替代方法中，切開的載體和RPI基因可能通過同源多聚尾來修飾。重組分子可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電轉(zhuǎn)化等手段引入宿主細(xì)胞，以使基因序列產(chǎn)生許多拷貝。在一個特定的實(shí)施方案中，用摻-分離的RPI基因、cDNA或合成DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可以產(chǎn)生基因的多個拷貝。因而通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從其中分離重組DNA分子，可以獲得大量的基因，需要時(shí)，可以從分離的重組DNA中回收插入基因。本發(fā)明提供的RPI序列包含那些編碼與天然RPI中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列基本上相同的核苷酸序列，以及那些編碼具有同等功能氨基酸的序列和編碼其他目標(biāo)衍生物或類似物的序列。5.7．編碼RPI的DNA的表達(dá)編碼RPI或具有活性功能類似物、片段或其它衍生物的核苷酸序列可以插入一個適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即含有插入蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體。這些必需轉(zhuǎn)錄和翻譯信號可以由天然RPI基因提供，或者由RPI基因側(cè)翼區(qū)域提供。表達(dá)編碼蛋白質(zhì)序列可以選擇多種宿主載體的表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括但不局限于，用病毒感染哺乳動物細(xì)胞的系統(tǒng)(如，痘病毒、腺病毒等等)；病毒感染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒)；微生物如帶有酵母載體的酵母、噬菌體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA。載體的表達(dá)元件的特異性和強(qiáng)度各不相同。依賴于所使用的宿主載體系統(tǒng)，可以使用若干適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一個。在一個特定的實(shí)施方案中，表達(dá)了人的RPI基因或編碼人RPI功能活性區(qū)的序列。在另外一個實(shí)施方案中，表達(dá)了包含RPI結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)片段。前面所述的用于將DNA片段插入到載體的任何方法可以用于構(gòu)建含有嵌合基因的表達(dá)載體，這一嵌合基因包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號和蛋白質(zhì)編碼序列。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組體(遺傳重組)。編碼RPI或肽片段的核酸序列的表達(dá)可能受到第二核酸序列的調(diào)節(jié)，因此RPI或肽在用重組的DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，RPI基因的表達(dá)可以由本領(lǐng)域已知的任何啟動子或增強(qiáng)子元件調(diào)節(jié)。可以用于調(diào)節(jié)RPI基因表達(dá)的啟動子包括但不局限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，自然，290:304-310)，包含與魯斯氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)序列中的啟動子(Yamamoto等人，1980，細(xì)胞，22:787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:1441-1445)，金屬硫蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，1982，自然，296:39-42)；原核表達(dá)載體，例如β-半乳糖苷酶啟動子(VillaKmaroff等人，1978，美國國家科學(xué)院院報(bào)，75:3727-3731)，或tac啟動子(DeBoer等人，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:21-25)；亦參見“重組細(xì)菌中的有用蛋白質(zhì)”，科學(xué)美國人(ScientificAmerican)1980，242:74-94)；植物表達(dá)載體，包括胭脂堿合成酶啟動子區(qū)域(HerrerraEstrella等人，自然，303:209-213)；花椰菜花葉病毒35S的RNA啟動子(Gardner等人，1981，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，9:2871)，光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(HerrerraEstrella等人，1984，自然，310:115-120)；來自酵母或其它真菌的啟動子元件，例如Gal4啟動子、ADC(乙醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子以及下述動物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，它們表現(xiàn)出組織特異性并已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因調(diào)控區(qū)；(Swift等人，1984，細(xì)胞(Cell)，38:639-646；Omitz等人，1986，冷泉港癥狀定量生物學(xué)(ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.)，50:399-09；MacDonald，1987，肝病學(xué)(Hepatology)，7:425-515)；在胰腺β-細(xì)胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)(Hanahan,1985，自然，315:15-122)，在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因調(diào)控區(qū)(Grosschedl等人，1984，細(xì)胞，38:647-658；Adames等人，1985，自然，318:533-538；Alexander等人，1987，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.),7:1436-1444)，在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的鼠乳腺腫瘤病毒調(diào)控區(qū)(Leder等人，1986，細(xì)胞，45:485-495)，在肝臟中有活性的白蛋白基因調(diào)控區(qū)(Pinkert等人，1987，基因與進(jìn)展(GenesandDevel.)，1:268-276)，在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因調(diào)控區(qū)(Krumlauf等人，1985，分子細(xì)胞生物學(xué)，5:1639-1648；Hammer等人，1987，科學(xué)，235:53-58)；在肝臟中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)(Kelsey等人，1987，基因與進(jìn)展，1:161-171)，在脊髓細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因調(diào)控區(qū)(Mogram等人，1985，自然，315:338-340；Kollias等人，1986，細(xì)胞，46:89-94)；在腦少突細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因調(diào)控區(qū)(Readhead等人，1987，細(xì)胞，48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因的調(diào)控區(qū)(Sani,1985，自然，314:283-286)以及在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因調(diào)控區(qū)(Mason等人，1986，科學(xué)，234:1372-1378)。在一個特定的實(shí)施方案中，所用的載體包含與RPI編碼核酸有效連接的啟動子、一個和多個復(fù)制起點(diǎn)、以及任選地包含一個或多個選擇標(biāo)志(例如抗生素抗性基因)。在一個特定的實(shí)施方案中，通過將RPI編碼基因亞克隆入三個pGEX載體(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體；Smith和Johnson,1988，基因(Gene)，7:31-40)的每一個載體的EcoRI限制性位點(diǎn)中，構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體，這可以允許從正確閱讀框架的亞克隆來表達(dá)RPI產(chǎn)物。包含RPI基因插入物的表達(dá)載體可以通過三種通用方法驗(yàn)證(a)核酸雜交，(b)有或無“標(biāo)志”基因功能，以及(c)插入序列的表達(dá)。第一種方法中，我們可以利用核酸雜交檢測表達(dá)載體中RPI基因插入物的存在，所用的探針包含與插入的RPI基因同源的序列。第二種方法中，可以利用載體中RPI基因插入造成某一特定“標(biāo)志”基因功能的存在或缺失，對重組載體/宿主系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和篩選(例如胸苷激酶活性，抗生素抗性，轉(zhuǎn)化表型，桿狀病毒包涵體形成等等。)。例如如果RPI基因插入點(diǎn)位于載體的標(biāo)志基因序列內(nèi)，那么通過標(biāo)志基因功能缺失可判定重組子中包含RPI基因插入序列。第三種方法中，可以通過檢測重組體表達(dá)的RPI基因產(chǎn)物來驗(yàn)證重組表達(dá)載體。例如此分析可在RPI基因產(chǎn)物在體外分析系統(tǒng)中的物理或功能特性(例如與抗RPI抗體結(jié)合)的基礎(chǔ)上進(jìn)行。一旦鑒定并且分離出某一特定重組DNA分子，就可利用本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行擴(kuò)增。一旦建立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，就可對重組表達(dá)載體進(jìn)行擴(kuò)增和大量制備。如前所述，可用的表達(dá)載體包括但不局限于如下的載體或其衍生物人類或動物病毒如痘病毒和腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如λ)；質(zhì)粒和粘粒DNA載體等等。另外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)，或以特定的理想方式修飾、加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。從某些啟動子開始的表達(dá)在某些誘導(dǎo)劑存在下可以提高，因而可以控制遺傳工程化的RPI的表達(dá)。進(jìn)一步講，不同的宿主細(xì)胞具有不同的特征性、特異性的用于翻譯和翻譯后加工和修飾的機(jī)制(例如蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化)?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)來保證表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行所希望的加工與修飾。例如在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可用于生產(chǎn)非糖基化的核心蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在酵母中的表達(dá)可產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物；在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)可以用于保證外源蛋白質(zhì)的“天然”糖基化。此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可能影響加工反應(yīng)的程度。為了長期高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如可以構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)不同表達(dá)能力或途徑的基因蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。不是使用含有病毒復(fù)制起始位點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可以用由適當(dāng)表達(dá)調(diào)控元件控制的DNA(例如啟動子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等等)以及選擇標(biāo)志進(jìn)行轉(zhuǎn)化。引入外源DNA后，工程化細(xì)胞可在加富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)移至一種選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)志可產(chǎn)生對選擇壓力的抗性，因而可使細(xì)胞穩(wěn)定的將質(zhì)粒整合入宿主染色體，而生長形成菌落，菌落進(jìn)而可以進(jìn)行克隆和增殖成細(xì)胞系。這種方法在形成表達(dá)不同的表達(dá)的或途徑基因蛋白質(zhì)的工程細(xì)胞系方面具有許多優(yōu)點(diǎn)。這種工程化細(xì)胞系在篩選和評價(jià)那些能影響不同表達(dá)能力的或途徑基因蛋白質(zhì)內(nèi)源活性的化合物上特別有用。許多選擇系統(tǒng)可以使用，包括但不局限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，細(xì)胞，11:223)，次黃鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski,1962，美國國家科學(xué)院院報(bào)，48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，細(xì)胞，22:817)基因可以分別在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中使用?？勾x物抗性也可以用作選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，賦予氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，1980，美國國家科學(xué)院院報(bào)，77:3567；O’Hore等人，1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:1527)；gpt，賦予對霉酚酸的抗性(Mulligun和Berg,1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:2072)；neo，賦予對氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Boil.),150:1)以及hygro，賦予對潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因，30:147)。在另一個實(shí)施方案中，RPI、片段、類似物或衍生物可表達(dá)為一個融合的、嵌合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(包含通過肽鍵與外源蛋白質(zhì)序列(不同的蛋白質(zhì))相連的蛋白質(zhì)、片段、類似物、衍生物)?？赏ㄟ^將諸個編碼目標(biāo)氨基酸序列的適當(dāng)核酸序列用本領(lǐng)域已知的方法以正確的編碼框架相互連接起來，得到這種嵌合產(chǎn)物，然后用本領(lǐng)域公知的方法對嵌合產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)。另外，這種嵌合產(chǎn)物可以用蛋白質(zhì)合成技術(shù)生產(chǎn)，例如使用多肽合成儀。cDNA和基因組序列都能進(jìn)行克隆和表達(dá)。5.8RPI的治療用途本發(fā)明通過施用治療性化合物，提供對多種疾病和紊亂的治療或預(yù)防。所述化合物包括但不限于，RPI及其類似物和衍生物(包括片段)(如，如此處所述)；其抗體(如此處所述)；編碼RPI、其類似物、或衍生物的核酸(如此處所述)；RPI基因反義核酸，以及RPI基因的激動劑和拮抗劑。如此處所述，本發(fā)明的一個重要特征在于參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的RPI基因的鑒定。可通過施用一種治療性化合物治療或防止關(guān)節(jié)炎，所述化合物可促進(jìn)在RA患者的滑液中相對于血清而言下降的RPI的功能或表達(dá)。也可通過施用治療性化合物治療或防止關(guān)節(jié)炎，所述化合物可減低在RA患者的滑液中相對于血清而言增加的RPI的功能或表達(dá)。總之，施用與患者相同種的來源或種間反應(yīng)性(對于抗體的情況)的產(chǎn)物是優(yōu)選的。由此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將人RPI、其衍生物或類似物，或者核酸、或針對人RPI的抗體施用于人類患者用于治療或預(yù)防。5.8.1類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療和預(yù)防通過施用促進(jìn)(即增加或提供)一種或多種RPI(或一種或多種RADF水平)的水平或功能的化合物，從而治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述RPI或RADF在患有RA的受試者的滑液中相對于血清而言降低了。這類化合物的例子包括但不限于RPI及其衍生物、或有功能活性的片段，特別是有如體外分析或動物模型中所示的活性；以及編碼RPI或其有功能活性衍生物的核酸或其片段(如用于基因治療)。其他可用的化合物如RPI的激動劑的鑒定可利用體外分析。也可通過施用一種化合物治療或防止關(guān)節(jié)炎，所述化合物抑制(即降低)一種或多種RPI的水平或功能(或一種或多種RADF的水平)，從而治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述RPI或RADF在患有RA的患者滑液中相對于血清而言顯示增加的豐度。這類化合物的例子包括但不限于RPI反義寡核苷酸、核酶或針對RPI的抗體。其他可用的化合物如RPI的拮抗劑的鑒定可利用體外分析。在特定實(shí)施方案中，與RA患者血清相比，當(dāng)鑒定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相對于正常或期望值而言缺失或降低時(shí)，可治療性(包括預(yù)防性)施用促進(jìn)一種或多種RPI(或一種或多種RADF水平)的水平或功能的化合物。在另一實(shí)施方案中，與RA患者血清相比，當(dāng)鑒定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相對于正?；蚱谕刀栽黾訒r(shí)，可治療性(包括預(yù)防性)施用抑制一種或多種RPI(或RADF水平)的水平或功能的化合物。由于這類化合物的施用導(dǎo)致的RPI功能或水平(或RADF水平)的改變可方便的檢測，如通過獲得患者組織樣品(如，從活檢組織)并體外分析其RNA或蛋白質(zhì)水平，或表達(dá)RPIRNA或蛋白質(zhì)的活性。優(yōu)選的技術(shù)也可采用，以檢測施用化合物之前以及之后的RPI或RADF的水平。可如此利用多種本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于激酶分析、免疫分析，以檢測和/或顯示RPI(如，Western雜交、免疫沉淀隨后是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫組化等)和/或雜交分析，以通過檢測和/或顯示編碼RPI的mRNA(如，Northern分析、點(diǎn)雜交、原位雜交等)來檢測RPI表達(dá)。本發(fā)明化合物包括但不限于任何化合物，如可將RA患者的RPI或RADF圖形向正常水平恢復(fù)的小有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、核酸等，前提是這類化合物不是非甾體抗炎劑(NSAID)(如，強(qiáng)的松、布洛芬、非諾布芬、酮洛芬、氟布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、阿斯匹林、水楊酰水楊酸、diflunisal、萘普生、炎痛喜、替諾昔康、保泰松、羥布宗)、金鹽、D-青霉胺、抗瘧疾藥，如羥氯喹或柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、氨甲蝶呤、類皮質(zhì)酮、抗CD4單克隆抗體或抗CDw52抗體。5.8.2基因治療在一個特定實(shí)施方案中，通過基因治療方法施用包含編碼RPI或其功能衍生物的核酸序列，以促進(jìn)RPI功能?；蛑委熓侵竿ㄟ^向受試者施用表達(dá)的或可表達(dá)的核酸進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的這個實(shí)施方案中，核酸產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過促進(jìn)RPI功能介導(dǎo)治療作用。任何本領(lǐng)域可得的基因治療方法均可根據(jù)本發(fā)明使用。示范性方法如下述。關(guān)于基因治療方法的一般性綜述，見Goldspiel等，1993，臨床藥理(ClinicalPharmacy)12:488-508；Wu和Wu,1991，生物治療(Biotherapy)3:87-95；Tolstoshev,1993，藥物毒理年鑒(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32:573-596；Mulligan,1993，科學(xué)(Science)260:926-932；Morgan和Anderson,1993，生物化學(xué)年鑒(Ann.Rev.Biochem.)62:191-217；1993,5,TIBTECH11(5):155-215)。本領(lǐng)域周知的可用的重組DNA技術(shù)的方法如Ausubel等，(編)，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，JohnWiley&Sons,NY；和Kriegler,1990，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室手冊，Stockton出版社，NY。在優(yōu)選的方面，化合物包含編碼RPI蛋白質(zhì)的核酸，所述核酸是在合適宿主中表達(dá)RPI或其片段或其嵌合蛋白質(zhì)之表達(dá)載體的一部分。特別是，這類核酸具有與RPI編碼區(qū)有效連接的啟動子，所述啟動子為組成型或誘導(dǎo)型的，以及任選的是組織特異性的。在另一實(shí)施方案中，使用核酸分子，其中RPI編碼序列及任何其他期望序列的側(cè)翼為促進(jìn)在基因組希望的位點(diǎn)同源重組的區(qū)域，由此提供RPI核酸的染色體內(nèi)表達(dá)。(Koller和Smithies,1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)。核酸向患者的遞送可以直接的方式，其中患者直接接觸核酸或攜帶核酸的載體；或可以是間接的方式，其中，細(xì)胞首先體外用核酸轉(zhuǎn)化，然后移植入患者。這兩種途徑分別已知為體內(nèi)或離體基因治療。在一個特定實(shí)施方案中，體內(nèi)直接施用核酸，其中核酸表達(dá)產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可通過多種本領(lǐng)域已知的方法中任一種完成，如通過將其構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分，且通過如下方法施用進(jìn)行感染使其成為細(xì)胞內(nèi)的，例如，通過缺陷型或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體(見，美國專利4,980,286)；或裸DNA直接注射，或使用微顆粒轟擊(如，基因槍；Biolistic,Dupont)；或用脂類、細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，包封于脂質(zhì)體、微顆?；蛭⒛z囊；或通過將其以與已知能進(jìn)入核的肽鍵連的形式施用；通過將其以與經(jīng)歷受體介導(dǎo)的胞飲作用的配體鍵連的形式施用(見，如Wu和Wu，生物化學(xué)雜志，262:4429-4432)(其可用于靶定于特異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)等等。在另一實(shí)施方案中，可形成核酸配體復(fù)合物，其中，配體包括一種融合性病毒肽以破壞核內(nèi)體，使得核酸免受溶酶體降解。在另一實(shí)施方案中，通過靶定一個特定受體，可體內(nèi)靶定核酸用于細(xì)胞特異性攝入和表達(dá)(見，如，PCT公開文本W(wǎng)O92/06180，1992年，4月16日，(Wu等)；WO92/22635,1992年12月23日，(Wilson等)；WO92/203161992年11月26,(Findeis等)；W093/141881993年，7月22,(CIarke等),WO93/202211993年10月14，(Young))。或者，可通過同源重組將核酸細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入并摻入宿主細(xì)胞DNA用于表達(dá)(Koller和Smithies,1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342:435-438)。在一特定實(shí)施方案中，使用一種含有編碼RPI的核酸的病毒載體。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見Miller等，1993，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)217:581-599)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)過修飾，刪除了對于包裝病毒基因組及整合入宿主細(xì)胞DNA而言非必需的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。待用于基因治療的編碼RPI之核酸被克隆入載體，這有助于基因向患者的遞送。更具體地關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的報(bào)道參見Boesen等，1994，生物治療6:291-302，其中描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdrI基因向造血干細(xì)胞遞送，以使干細(xì)胞更加耐受化療。其它闡明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的使用的文獻(xiàn)有Clowes等，1994，臨床研究雜志(臨床研究雜志)93:644-651；Kiem等，1994，血液(Blood)83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993，人類基因治療(HumanGeneTherapy)4:129-141；以及Grossman和Wilson,1993，遺傳學(xué)與發(fā)育的當(dāng)代觀點(diǎn)(Curr.Opin.inGeneticsandDevel.)3:110-114)。腺病毒是可用于基因治療的其它病毒載體。對于將基因遞送至呼吸上皮細(xì)胞腺病毒是特別有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸性上皮細(xì)胞，并由此產(chǎn)生溫和性疾病。基于腺病毒的遞送系統(tǒng)之其它靶點(diǎn)是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有可感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。Kozarsky和Wilson,1993，遺傳學(xué)與發(fā)育的當(dāng)代觀點(diǎn)，3499-503提供了基于腺病毒基因治療的觀點(diǎn)。Bout等，1994，人類基因治療53-10證實(shí)，腺病毒載體用于將基因轉(zhuǎn)移入恒河猴的呼吸性上皮細(xì)胞。其它在基因治療中使用腺病毒的例子見于Rosenfeld等，1991，科學(xué)252:431-434；Rosenfeld等，1992，細(xì)胞68:143-155；Mastrangeli等，1993，臨床研究雜志91:225-234；PCT公開文本W(wǎng)O94/12649；和Wang等，1995，基因治療2:775-783。腺伴隨病毒(AAV)以被建議用于基因治療(Walsh等，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美國專利5,436,146)?；蛑委煹牧硪煌緩缴婕巴ㄟ^如下方法將基因轉(zhuǎn)移入組織培養(yǎng)的細(xì)胞，包括電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或病毒感染。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將一種選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。然后將細(xì)胞置于選擇性條件下，以分離那些已攝入并表達(dá)轉(zhuǎn)移入的基因的細(xì)胞。然后，將那些細(xì)胞遞送至患者。在這個實(shí)施方案中，將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，然后體內(nèi)施用所得的重組細(xì)胞。這種導(dǎo)入可通過本領(lǐng)域已知的任何一種方法進(jìn)行，包括但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒載體或噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)體融合等。本領(lǐng)域已知多種用于將異源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)(見，入，Loeffler和Behr,1993，酶學(xué)方法，217:599-618；Cohen等，1993，酶學(xué)方法，618-644；Cline,1985，藥物治療(Pharmac.Ther.)29:69-92)且可依本發(fā)明使用，只要受體細(xì)胞的必要發(fā)育及生理功能不被破壞。技術(shù)應(yīng)使核酸向細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移，使得核酸被細(xì)胞表達(dá)，且優(yōu)選地可被其細(xì)胞后代遺傳和表達(dá)。通過本領(lǐng)域已知的多種方法所得重組細(xì)胞可被遞送至患者。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，例如皮下注射上皮細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，可作為皮膚移植物將重組皮膚細(xì)胞移植至患者。優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)施用重組血細(xì)胞(如，造血干細(xì)胞或先祖細(xì)胞)。構(gòu)思施用的細(xì)胞量取決于期望的作用、患者的狀況等，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員決定?？蓪?dǎo)入核酸用于基因治療的細(xì)胞包括任何希望的可得的細(xì)胞類型，包括但不限于，上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；多種干細(xì)胞或先祖細(xì)胞，特別是造血于細(xì)胞或先祖細(xì)胞，如獲自脊髓、臍帶血、外周血、胎肝等。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是患者自體的。在一個實(shí)施方案中，重組細(xì)胞用于基因治療，將編碼RPI的核酸導(dǎo)入細(xì)胞，使得其能被細(xì)胞或其后代表達(dá)，然后將重組細(xì)胞體內(nèi)施用用以治療。在一特定實(shí)施方案中，采用造血干細(xì)胞及先祖細(xì)胞。任何能被分離和體外維持的干細(xì)胞和/或先祖細(xì)胞可有效地根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案施用(見，如PCT公開文本W(wǎng)O94/08598,1994年4月28日；Stemple和Anderson,1992，細(xì)胞，71:973-985；Rheinwald,1980，細(xì)胞生物學(xué)方法(Meth.CellBio.)21A:229；以及Pittelkow和cott,1986,MayoClinicProc.,61:771)。在一特定實(shí)施方案中，用于基因治療的待導(dǎo)入的核酸包含與編碼區(qū)有效連接的誘導(dǎo)型啟動子，使得可通過適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在與否控制核酸的表達(dá)。5.8.3RPI的抑制以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎1.1.1在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過施用拮抗(抑制)RPI水平和/或RPI功能的化合物治療或預(yù)防RA，其中所述RPI與患有RA的患者血清中相比，在滑液中的水平升高。可采用的化合物包括但不限于抗RPI抗體(及含有其結(jié)合區(qū)的片段和衍生物)、RPI反義或核酶核酸、和用于通過同源重組“敲除”內(nèi)源性RPI功能的編碼無功能RPI的核酸(見，如，Capecchi,1989，科學(xué)，244:1288-1292)。在一特定實(shí)施方案中，作為RPI拮抗劑，采用含有RPI基因的部分之核酸，其中的核苷酸編碼側(cè)翼(5′和3′)為不同基因序列的RPI，以促進(jìn)通過同源重組的RPI失活作用。(也參見Koller和Smithies,1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)?？赏ㄟ^已知的方便的體外檢測鑒定抑制RPI功能的其它化合物，如基于其抑制RPI與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的能力、或抑制任何已知RPI功能的能力，優(yōu)選地在體外檢測，或在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測，盡管也可利用遺傳檢測。也可采用優(yōu)選技術(shù)，用于檢測在化合物施用之前和之后的RPI水平。優(yōu)選地，利用適當(dāng)?shù)伢w外或體內(nèi)檢測以測定特定化合物的作用，以及是否化合物的施用顯示受影響的組織的治療。在特定實(shí)施方案中，與患有RA的患者的血清相比，當(dāng)滑液中檢測的RPI水平或RPI功能的增加(如，高于正常水平或希望的水平)時(shí)，治療性施用(包括預(yù)防性)抑制RPI功能的化合物?？赏ㄟ^如下方法方便的檢測RPI水平或功能的增加，例如，通過定量蛋白質(zhì)和/或RNA、通過獲得患者滑液及血清樣品，以及體外檢測其RNA或蛋白質(zhì)水平、編碼RPI的表達(dá)的RNA之結(jié)構(gòu)和/或活性、或RPI本身?？扇绱瞬捎帽绢I(lǐng)域的許多標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于檢測和/或顯示RPI的激酶檢測、免疫檢測(如，Western印跡、免疫沉淀隨后是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫組化等)和/或雜交檢測，以通過分別檢測和/或顯示檢測編碼RPI的mRNA(如，Northern印跡、點(diǎn)雜交、原位雜交等)檢測RPI的表達(dá)等等。5.8.4RPI的反義調(diào)控1.1.1在特定實(shí)施方案中，通過采用RPI反義核酸抑制RPI功能。本發(fā)明提供了治療或預(yù)防用途的核酸，包括至少與基因或編碼RPI的cDNA或其部分反義的6個核苷酸。如此處所用，RPI的“反義”核酸是指依照一些序列互補(bǔ)性可與編碼RPI的RNA(優(yōu)選地mRNA)的部分雜交的核酸。反義核酸可與編碼RPI之mRNA的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)互補(bǔ)。這種反義核酸具有如可抑制RPI功能的化合物的用途，且可用于治療或防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的反義核酸可以是單鏈或雙鏈的寡核苷酸、RNA或DNA或其修飾或衍生的部分，其可被直接施用于細(xì)胞，或者其可通過外源性導(dǎo)入序列在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明還提供含有在藥學(xué)可接受載體中的有效量的本發(fā)明之RPI反義核酸的藥物組合物，如下述。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在原核或真核細(xì)胞中抑制RPI核酸序列表達(dá)的方法，包括向細(xì)胞提供含有本發(fā)明RPI反義核酸的有效量的組合物。RPI反義核酸及其用途如下述。RPI反義核酸RPI反義核酸是至少6個核苷酸，且優(yōu)選為寡核苷酸(從6個至約50個寡核苷酸)。在一特定方面，寡核苷酸至少為10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少100個核苷酸、或至少200核苷酸。寡核苷酸可為DNA或RNA、或其嵌合混合物、或衍生物或修飾變體、單鏈或雙鏈。寡核苷酸可以在堿基部分、糖基部分或磷酸骨架上被修飾。寡核苷酸可包含其它附加的基團(tuán)如肽，或促進(jìn)跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑(見，如，Letsinger等，1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:6553-6556；Lemaitre等，1987，美國國家科學(xué)院院報(bào)，84:648-652；PCT公開文本W(wǎng)O88/09810，公開日12月15日，1988)或促進(jìn)跨越血腦屏障的試劑(見如，PCT公開文本W(wǎng)O89/10134，公開于4月25日，1988)、雜交引發(fā)的切割劑(參見如，Krol等，1988，生物技藝，6:958-976)或嵌入劑(參見如，Zon,1988，藥物研究(Pharrn.Res.)5:539-549)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，提供了RPI反義寡核苷酸，優(yōu)選為單鏈DNA。寡核苷酸可通過用本領(lǐng)域周知的取代基在其結(jié)構(gòu)上的任何位置加以修飾。RPI反義寡核苷酸可包括至少一種選自以下的修飾的堿基，包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N-6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N-6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2,6二氨基嘌呤。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一種修飾的糖基部分，如選自阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖的糖基。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一種修飾的磷酸骨架，其選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲乙二縮醛或其類似物。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸是α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特定的雙鏈雜合體，其中與通常的β單位相反，各鏈彼此相互平行。(Gautier等，1987，核酸研究(Nucl.AcidsRes.),15:6625-6641)。寡核苷酸可與其它分子偶聯(lián)，如肽、雜交引發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交引發(fā)的切割劑等。可通過本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成本發(fā)明的寡核苷酸，如通過使用自動DNA合成儀(如可從Biosearch、AppliedBiosystems，等購得的)。例如，可通過Stein等，(1988，核酸研究16:3209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可通過采用受控孔的玻璃聚合物支持物制備甲基磷酸酯寡核苷酸(Sarin等，1988，美國國家科學(xué)院院報(bào)85:7448-7451)等。在一個特定實(shí)施方案中，通過外源序列的轉(zhuǎn)錄于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的RPI反義核酸。例如，可體內(nèi)導(dǎo)入載體使得其被細(xì)胞攝入，在細(xì)胞內(nèi)載體或其部分被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸(RNA)。這類載體含有編碼RPI反義核酸的序列。這類載體可為游離的或整合入染色體，只要其可被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生目標(biāo)反義RNA。這類載體可通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。載體可為質(zhì)粒、病毒或其它本領(lǐng)域用于在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的材料。編碼RPI反義核酸的序列之表達(dá)可由本領(lǐng)域周知的在哺乳動物(優(yōu)選為人)細(xì)胞中起作用的啟動子控制。這類啟動子可為誘導(dǎo)型或組成型。這類啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)域(Bernoist和Chambon,1981，自然290:304-310)、包含于勞氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)的啟動子(Yamamoto等，1980，細(xì)胞，22:787-797)，皰疹胸腺嘧啶啟動子(Wagner等，1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:1441-1445)，金屬硫蛋白基因調(diào)控序列(Brinster等，1982，自然，296:39-42)等。本發(fā)明的反義核酸包括與RPI基因(優(yōu)選人RPI基因)的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)的序列。盡管絕對互補(bǔ)是優(yōu)選的，但不是必需的。一個“與至少RNA的一部分互補(bǔ)”的序列在此是指一個具有足夠互補(bǔ)性、能夠與RNA雜交形成穩(wěn)定雙螺旋的序列；對于雙鏈RPI反義核酸，可如此測試雙鏈DNA的一個單鏈，或可檢測三鏈形成。雜交的能力取決于互補(bǔ)性的程度以及反義核酸的長度。通常，雜交的核酸越長，可能含有的與編碼RPI的RNA的錯配堿基越多，但仍形成穩(wěn)定雙螺旋(或三螺旋，有時(shí)如此)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過采用標(biāo)準(zhǔn)步驟測定雜交復(fù)合物的熔點(diǎn)以確定錯配的可接受的程度。5.8.5RPI反義核酸的治療用途當(dāng)患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者滑液中目標(biāo)RPI過量表達(dá)時(shí)，可施用RPI反義核酸治療(或防止)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在優(yōu)選實(shí)施方案中，采用單鏈DNA反義RPI寡核苷酸。表達(dá)或過量表達(dá)編碼RPI的RNA的細(xì)胞類型可通過多種本領(lǐng)域周知的方法鑒定。這些細(xì)胞類型包括但不限于，白細(xì)胞(如，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)和駐留細(xì)胞(如滑膜細(xì)胞)。這類方法包括但不限于，與RPI特異性核酸雜交(如，通過Northern雜交、點(diǎn)雜交、原位雜交)、觀察待體外翻譯RPI的細(xì)胞翻譯RNA的能力、免疫檢測等。在優(yōu)選的方面，可在治療前通過例如免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交的方法檢測患者原代組織的RPI表達(dá)。本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)可接受載體中的有效量的RPI反義核酸，其可施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。在治療RA中有效的RPI反義核酸的量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。如可能，在試驗(yàn)及用于人類之前，希望體外測定待治療的腫瘤類型的反義細(xì)胞毒性，隨后在有用的動物模型系統(tǒng)中測試。在一個特定實(shí)施方案中，通過脂質(zhì)體、微顆?；蛭⒛z囊施用含有RPI反義核酸的藥物組合物。在多個本發(fā)明的實(shí)施方案中，可采用這類組合物實(shí)現(xiàn)RPI反義核酸的緩釋。在一特定實(shí)施方案中，可希望利用脂質(zhì)體通過抗體靶定特定的可鑒別的腫瘤抗原(Leonetti等，1990，美國國家科學(xué)院院報(bào)，87:2448-2451；Renneisen等，1990，生物化學(xué)雜志，265:16337-16342)。5.8.6抑制性核酶及三股螺旋途徑在另一實(shí)施方案中，可通過與周知的降低RPI基因表達(dá)的水平之基因“敲除”、核酶和/或三股螺旋方法一起使用RPI基因序列，從而降低RPI基因的表達(dá)水平和/或RPI基因產(chǎn)物的活性，緩解RA癥狀。在表現(xiàn)出可調(diào)節(jié)RPI基因的活性、表達(dá)或合成的能力之化合物(包括緩解RA癥狀的能力的化合物)中包括核酶和三股螺旋分子?？稍O(shè)計(jì)這類分子用于降低或抑制(如希望，不損害)突變靶基因活性。用于制備和使用這類分子的技術(shù)為本領(lǐng)域周知。設(shè)計(jì)催化性切割RPI基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子可用于防止靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，因此防止RPI基因產(chǎn)物的表達(dá)。(參見如，PCT國際公開文本W(wǎng)O90/11364，公開于10月4日，1990；Sarver等，1990，科學(xué)，247:1222-1225)。核酶是能催化RNA特異性切割的酶性RNA分子(綜述見Rossi,1994，當(dāng)代生物學(xué)(CurrentBiology)4,469-471)。核酶作用的機(jī)理包括核酶分子與互補(bǔ)性靶RNA的序列特異性雜交，隨后是內(nèi)切核酸切割事件。核酶分子的組成必須包括一個或多個與靶基因mRNA互補(bǔ)的序列，且必須包括周知的負(fù)責(zé)mRNA切割的催化序列。對于這樣的序列，參見如，美國專利5,093,246，此處引入作為參考。當(dāng)在特異性識別序列位點(diǎn)切割mRNA的核酶可被用于破壞編碼RPI的mRNA時(shí)，優(yōu)選使用錘頭核酶。錘頭核酶通過切割這種位點(diǎn)的mRNA，該位點(diǎn)由與靶mRNA形成互補(bǔ)性堿基對的側(cè)翼區(qū)標(biāo)明。僅僅需要的是靶mRNA具有如下兩個堿基序列5’-UG-3’。錘頭核酶的構(gòu)建和制備為本領(lǐng)域周知，完整的描述見Myers,1995，分子生物學(xué)和生物技術(shù)簡明手冊，VCHPublishers,NewYork，(尤其見圖4,833頁)和見于Haseloff與Gerlach,1988，自然，334,585-591，此處完整引入作為參考。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)核酶使得切割識別位點(diǎn)位于編碼RPI的mRNA之5’端，即增加效率并最小化非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的胞內(nèi)積累。本發(fā)明的核酶還包括RNA內(nèi)切核酸酶(以下稱為Cech型核酶)，諸如天然存在于嗜熱四膜蟲(Tetrahymenatherrnophila)(稱為IVS，或L-19IVSRNA)以及已被ThomasCech及其同事充分描述了的那些(Zaug，等，1984，科學(xué)，224,574-578；Zaug和Cech,1986，科學(xué)，231,470-475；Zaug，等，1986，自然，324,429-433；公開的國際專利申請WO88/04300(UniversityPatentsInc.；Been和Cech，1986，細(xì)胞，47，207-216)。Cech型核酶具有8堿基對活性位點(diǎn)，其與靶RNA序列雜交，其后發(fā)生靶RNA的切割。本發(fā)明涵蓋了那些靶定在編碼RPI基因中存在的8堿基對活性位點(diǎn)序列的Cech型核酶。至于在反義方法中，核酶可由修飾的寡核苷酸(例如，用于增加穩(wěn)定性、靶定等)組成，且應(yīng)被遞送至體內(nèi)表達(dá)RPI的細(xì)胞中。優(yōu)選的遞送方法包括使用編碼在強(qiáng)組成型polⅢ或polⅡ啟動子控制下的核酶之DNA構(gòu)建體，使得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可產(chǎn)生足夠量的核酶，以破壞編碼RPI的內(nèi)源RNA并抑制翻譯。因?yàn)楹嗣溉缤戳x分子一樣是催化性的，為達(dá)到效率需要較低地細(xì)胞內(nèi)濃度?？赏ㄟ^使用靶定同源重組滅活或“敲除”RPI基因或其啟動子，降低內(nèi)源性RPI表達(dá)(如，參見Smithies，等，1985，自然，317:230-234；Thomas和Capecchi，1987，細(xì)胞，51:503-512；Thompson等，1989，細(xì)胞，5313-321；此處全文引入作為參考)。例如，可使用一種突變、非功能性RPI基因(或完整的不相關(guān)DNA序列)，其側(cè)翼為與內(nèi)源RPI基因同源的DNA(可為編碼RPI的基因之編碼區(qū)或調(diào)控區(qū))，帶有或不帶有選擇性標(biāo)記和/或隱性選擇性標(biāo)記，用這樣的序列轉(zhuǎn)染體內(nèi)表達(dá)靶基因的細(xì)胞。通過靶定同源重組將DNA構(gòu)建體插入，造成靶基因的滅活。這種方法特別適合于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其中對ES(胚發(fā)生干)細(xì)胞的修飾可用于產(chǎn)生具有失活靶基因的動物子代(如見，Thomas和Capecchi,1987以及Thompson,1989，出處同上)。然而，這種方法可經(jīng)修改以適用于人類，只要重組DNA構(gòu)建體直接施用或利用病毒載體體內(nèi)靶定于需要的位點(diǎn)。另外，可通過靶定互補(bǔ)于RPI基因調(diào)控區(qū)(即，RPI基因啟動子和/或增強(qiáng)子)的脫氧核糖核苷酸序列降低內(nèi)源性RPI基因表達(dá)，以形成在體內(nèi)靶細(xì)胞中防止RPI基因轉(zhuǎn)錄的三股螺旋結(jié)構(gòu)(一般參見，Helene,1991，抗腫瘤藥物研究(AnticancerDrugRes.),6(6),569-584；Helene,等，1992，紐約科學(xué)院年鑒(Ann.N.Y.Acad.Sci.),660,27-36；以及Maher,1992，生物檢測(Bioassays),14(12),807-815)。待用于三股螺旋形成以抑制轉(zhuǎn)錄的核酸分子應(yīng)為單鏈，且由脫氧核苷酸組成。這些寡核苷酸的堿基組成必須經(jīng)設(shè)計(jì)以促進(jìn)通過Hoogsteen堿基配對法則的三股螺旋形成，這一般需要將存在于雙螺旋一個鏈上的嘌呤或嘧啶之相當(dāng)大的延伸。核苷酸序列可是基于嘧啶的，這樣會在所得三股螺旋的三個結(jié)合鏈之間形成TAT和CGC*三聯(lián)體。富含嘧啶的分子提供了同與之處于平行方向的雙螺旋單鏈上之富含嘌呤區(qū)互補(bǔ)的堿基。此外，可選擇富含嘌呤的核酸分子，例如，含有G殘基的延伸。這些分子與富含GC對的DNA雙螺旋形成三股螺旋，其中嘌呤殘基的大部分位于靶雙螺旋的單鏈，導(dǎo)致在三螺旋的三個鏈之間的GGC三聯(lián)體。另外，通過產(chǎn)生所謂“改變角度(switchback)”的核酸分子，可增加能被靶定三螺旋形成的潛在序列。改變角度的分子可以交替的5′-3′和3′-5′方式合成，使得其與雙螺旋的第一鏈破基配對，然后與另一鏈配對，消除了對于待存在于雙螺旋的一個鏈上之嘌呤或嘧啶的相當(dāng)大延伸片段的必要性。在其中此處所述的反義、核酶和/或三股螺旋分子用于抑制突變基因表達(dá)的情況中，可能這些技術(shù)非常有效降低或抑制由正常RPI基因等位基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄(三螺旋)和/或翻譯(反義、核酶)，這就增加了這種可能性，其中存在的正常RPI基因產(chǎn)物可能低于正常表型所需的濃度。在這種情況下，為保證維持基本正常的RPI基因活性水平，因此可通過基因治療方法，將編碼并表達(dá)顯示正常RPI基因活性的RPI基因多肽導(dǎo)入細(xì)胞，采用不含有易于受到反義、核酶或三螺旋處理攻擊的序列。此外，當(dāng)RPI基因編碼胞外蛋白質(zhì)時(shí)，可優(yōu)選與正常RPI基因蛋白質(zhì)一起施用，以維持靶基因活性的必要水平?？赏ㄟ^上述本領(lǐng)域關(guān)于DNA和RNA分子合成的任一方法制備本發(fā)明的反義RNA和DNA、核酶及三螺旋分子。這包括本領(lǐng)域周知的化學(xué)合成寡脫氧核糖核苷酸以及寡核糖核苷技術(shù)，諸如固相氨基磷酸(phosphoramidite)化學(xué)合成。此外RNA分子可通過體外和體內(nèi)的編碼反義RNA分子之DNA序列轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生。這類DNA序列可被摻入多種整合了適當(dāng)RNA聚合酶啟動子(如T7或SP6聚合酶啟動子)的載體。此外，可組成型地或誘導(dǎo)型地(取決于采用的啟動子)合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體，可被穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞系。5.9治療或預(yù)防實(shí)用性的證實(shí)本發(fā)明化合物在用于人類之前，優(yōu)選地體外測試，然后體內(nèi)用于希望的治療或預(yù)防活性。例如，可使用體外檢測測定是否有施用特定化合物的顯示，包括體外細(xì)胞培養(yǎng)檢測，其中，患者組織樣品在培養(yǎng)液中生長，并接觸或者以其它方法施用化合物，然后觀察這類化合物對組織細(xì)胞的作用?？蓽y試待測化合物之恢復(fù)患有RA的患者中RADF或RPI水平，使之趨向于未患有RA的受試者中所見的水平的能力，或者檢測在RA的試驗(yàn)動物模型中產(chǎn)生類似改變的能力(如，大鼠中非特異性關(guān)節(jié)炎)。能恢復(fù)所述水平的化合物可用做先導(dǎo)藥物，用于進(jìn)一步的藥物發(fā)現(xiàn)，或治療性使用?？赏ㄟ^優(yōu)選技術(shù)、免疫分析、凝膠電泳及隨后的顯現(xiàn)、或任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法檢測RADF和RPI的表達(dá)。這類分析可用于篩選侯選藥物或用于臨床監(jiān)測或藥物開發(fā)，其中RADF或RPI的豐度可用做臨床疾病的代用標(biāo)記。在多種特定實(shí)施方案中，可用參與患者疾病的各種細(xì)胞類型之代表性細(xì)胞進(jìn)行體外檢測，以測定是否該化合物對這種細(xì)胞類型具有希望的作用。在于人中測試之前可在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ拖到y(tǒng)中檢測用于治療的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔等。對于體內(nèi)檢測，在施用于人之前，可采用任一本領(lǐng)域知曉的動物模型系統(tǒng)。5.10治療/預(yù)防性施用和組合物本發(fā)明提供了通過向受試者施用有效量的本發(fā)明化合物治療(和預(yù)防)的方法。在一優(yōu)選方面，本發(fā)明的化合物是基本上純的(即，基本上不合有限制其作用或產(chǎn)生不希望地副作用的物質(zhì))。受試者優(yōu)選為動物，包括但不限于如牛、豬、馬、雞、貓、狗等，優(yōu)選為哺乳動物，最優(yōu)選為人。在一特定實(shí)施方案中，非人哺乳動物是受試者。當(dāng)化合物含有如上述核酸時(shí)可采用用于施用的制劑和方法。其它合適的制劑和施用路線可選自下述。已知多種遞送系統(tǒng)且可用于施用本發(fā)明的化合物，如脂質(zhì)體包封、微顆粒、微膠囊、能表達(dá)化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞(參見如，Wu和Wu,1987，生物化學(xué)雜志，262:4429-4432)，構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸等等。導(dǎo)入的方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、腦膜外和口內(nèi)途徑。可通過任一方便途徑施用化合物，例如通過輸注或大劑量注射、通過上皮或黏膜襯的吸收(如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)，以及可通過與其它生物活性劑一起施用。施用可為系統(tǒng)性或局部地。此外，通過任一適當(dāng)?shù)耐緩綄⒈景l(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是有利的，包括心室內(nèi)或鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可借助例如結(jié)合至儲液槽的心室內(nèi)導(dǎo)管，如Ommaya儲液槽。也可采用肺部施用，如通過利用吸入器或噴霧器，以及帶有氣溶膠劑的制劑。在一特定實(shí)施方案中，可希望將本發(fā)明的藥物組合物局部施用于需要治療的部位。這可通過例如(不是以限制的方式)手術(shù)中的局部輸注、局部涂用(例如與手術(shù)后的創(chuàng)口包扎一起)、注射、利用導(dǎo)管、利用栓劑或利用植入物的方法，所述植入物為多孔的或非多孔的、或膠凝材料，包括膜，如sialastic膜，或纖維。在一個實(shí)施方案中，可通過在惡性腫瘤或瘤性或前瘤性組織的位點(diǎn)(或原發(fā)位點(diǎn))直接注射進(jìn)行施用。在另一實(shí)施方案中，化合物可以如下形式遞送在囊泡中，特別是在脂質(zhì)體(見Langer，科學(xué)，249:1527-1533(1990)；Treat等，脂質(zhì)體在感染性疾病與癌癥治療中，Lopez-Berestein和Fidler(編),Liss，紐約，PP.353-365(1989)；Lopez-Berestein，出處同上，pp.317-327；通常見出處同上)。在另一實(shí)施方案中，可在受控釋放系統(tǒng)中遞送化合物。在一個實(shí)施方案中，可采用泵(見Langer，出處同上；Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等，外科(Surgery)88:507(1980)；Saudek等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，321574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可采用聚合物材料(見，受控釋放的醫(yī)療應(yīng)用,Langer和Wise(編),CRCPress.,BocaRaton,Florida(1974)；受控藥物生物利用度，藥品設(shè)計(jì)與性能，Smolen和Ball(編),Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macrornol.Chem.23:61(1983)；還參見Levy等，科學(xué)，228:190(1985)；During等，神經(jīng)科學(xué)年鑒(Ann.Neurol.)25:351(1989)；Howard等，神經(jīng)外科學(xué)雜志(J.Neurosurg.)71:105(1989))。在另一實(shí)施方案中，可將受控釋放系統(tǒng)置于治療靶點(diǎn)(即腦)附近，這樣只需要系統(tǒng)性給藥劑量的一部分。(參見如，Goodson，受控釋放的醫(yī)療應(yīng)用，出處同前，vol.2,pp.115-138(1984))。其它受控釋放系統(tǒng)在Langer(科學(xué)，249:1527-1533(1990))的綜述中討論。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明化合物為編碼蛋白質(zhì)的核酸時(shí)，可體內(nèi)施用核酸促進(jìn)其編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)，這可通過將核酸構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分，且通過如下方法施用使其成為細(xì)胞內(nèi)的，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體(見，美國專利4,980,286)；直接注射，或使用微顆粒轟擊(如，基因槍；Biolistic,Dupont)；或用脂類、細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，或通過將其以與已知能進(jìn)入核的同型盒樣肽鍵連的形式施用(見如，Joliot等，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)，88:1864-1868)等?；蛘?，可通過同源重組將核酸細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入并摻入宿主細(xì)胞DNA用于表達(dá)。本發(fā)明還提供了藥物組合物。這類組合物包括治療有效量的化合物，以及藥學(xué)可接受的載體。在一特定實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)可接受的”是指由聯(lián)邦政府或州政府管理部門批準(zhǔn)或列在美國藥典或其它普遍承認(rèn)的用于動物(尤其是人)的藥典中。術(shù)語“載體”是指稀釋劑、佐劑、賦形劑或治療時(shí)一起使用的溶媒載體。這類藥學(xué)載體可為無菌液體，如水或油類，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)藥物組合物為靜脈內(nèi)施用時(shí)水為優(yōu)選的載體。生理鹽水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用做液體載體，特別是用于注射溶液。適合的藥學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、脫脂牛奶、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。如需要。組合物可還含有少量保濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以為溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等形式。組合物也可被制為如栓劑，帶有傳統(tǒng)的結(jié)合劑和載體如三甘油三酯?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體，如口服級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的例子描述于雷明頓制藥科學(xué)(＂Remington′sPharmaceuticalSciences＂，)E.W.Martin。這類組合物含有治療有效量的化合物(優(yōu)選以純化的形式)，還含有合適量的載體，以提供用于恰當(dāng)施用于患者的形式。制劑應(yīng)與施用模式相適應(yīng)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，依照常規(guī)方法制備組合物，以作為適于靜脈內(nèi)施用于人類的藥物組合物。一般，用于靜脈內(nèi)施用的組合物為無菌等滲水性緩沖液。如需要，組合物也可含有助溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因，以在注射部位緩解疼痛。通常，以單位劑量的單獨(dú)或混合在一起的形式提供各個組分，例如，以在密封容器(如安瓿或標(biāo)明活性劑的量的量筒)中的凍干粉或無水濃縮物形式。當(dāng)組合物待通過輸注給藥時(shí)，可將其分散于含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶中。當(dāng)組合物通過注射給藥時(shí)，可提供用于注射的無菌水或鹽水的安瓿，使得在給藥前組分可被混合。本發(fā)明化合物可被配制為中性或鹽形式。藥學(xué)可接受的鹽包括與游離氨基形成的那些，如衍生于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及與游離羥基形成的那些，如衍生于鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基醇、組氨酸、脯氨酸等。在治療RA中有效的本發(fā)明化合物的量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測定。此外，可任選地利用體外檢測以幫助確定最優(yōu)劑量范圍。在制劑中采用的精確劑量取決于給藥途徑以及疾病或紊亂的嚴(yán)重程度，且應(yīng)當(dāng)根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷和各個患者的情況決定。但是，用于靜脈內(nèi)給藥的適當(dāng)劑量范圍一般在每千克體重約20-500微克活性化合物。用于鼻內(nèi)給藥的適當(dāng)劑量范圍一般在每千克體重0.01pg至1mg。有效的劑量也可從來自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量效應(yīng)曲線外推得知。一般栓劑含有范圍在0.5％-10％(重量)的活性成分；口服制劑優(yōu)選含有10％-95％的活性成分。本發(fā)明還提供了含有填充有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分之一個或多個容器的藥物包裝或試劑盒。任選地，與這類容器結(jié)合的還有以管理藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府部門頒布的許可通告，該通告反映出就用于人類施用而言得到管理藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府部門準(zhǔn)許。6.實(shí)施例患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血清及滑液中的蛋白質(zhì)使用下面的參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者和未患有RA的患者(即痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎、外傷性滑膜炎患者)之血清和滑液中的蛋白質(zhì)，用等電聚焦和隨后的SDS-PAGE進(jìn)行分離，每個樣品重復(fù)一次。6.1.樣品制備一收到血清樣品即進(jìn)行蛋白質(zhì)分析(使用PierceBCACat#23225)。將相當(dāng)于總蛋白為300μg的血清按體積分為若干等份，每一份加入相同體積的10％(W/V)SDS(Fluka71729)、2.3％(W/V)二硫蘇糖醇(BDH443852A)。樣品在95℃加熱5分鐘，然后冷卻至20℃，然后向樣品中加入125μl下述緩沖液8M尿素(BDH452043w)4％CHAPS(SigmaC3023)65mM二硫蘇糖醇(DTT)2％(V/V)Resolytes3.5-10(BDH443382×)此混合液渦旋混合后，在15℃、13000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用等電聚焦分析。6.2．等電聚焦在臨床研究中的應(yīng)用本發(fā)明的診斷方法和組合物可以有助于指導(dǎo)或監(jiān)測臨床研究，例如，測試用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的藥物。在一個實(shí)施方案中，可以測試候選分子恢復(fù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者RADF或RPI水平趨向于非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中所見水平的能力，或在治療過的患者中保持RADF或RPI水平達(dá)到或接近非類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者或血清水平的能力?？梢苑治鲆粋€或多個RADF或RPI的水平。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于臨床研究篩選候選者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎個體的鑒定，隨后，這些個體可以包括于或排除于研究中或單獨(dú)用于治療或分析。RPI的純化在某些特定方面，本發(fā)明提供了已分離的RPI，優(yōu)選的，人類RPI及其片段和衍生物，其包含抗原決定簇(也就是能被抗體識別)或者說是具有功能活性的，以及編碼前述的核酸。此處所用的“具有功能活性的”RPI是指那些表現(xiàn)出具有一個或多個與全長RPI(野生型)相關(guān)的已知的功能活性的材料，例如與RPI底物或結(jié)合配基結(jié)合、抗原性(與抗靶抗體結(jié)合)、免疫原性等。在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種RPI的片段，包含至少6個氨基酸、10個氨基酸、50個氨基酸或至少75個氨基酸。也提供了片段或包含片段的缺失RPI某些或全部區(qū)域的蛋白質(zhì)，還提供了編碼前述物質(zhì)的核酸。一旦鑒定出表達(dá)RPI基因序列的重組核酸，就可以對其基因產(chǎn)物進(jìn)行分析。這可以通過建立于產(chǎn)物物理或功能性質(zhì)之上的分析來完成，包括產(chǎn)物放射性標(biāo)記后的凝膠電泳分析、免疫分析等。一旦鑒定出RPI，它就可以用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離和純化，包括層析(例如離子交換層析、親和層析和分子篩柱層析)、離心、溶解度差異或其它用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。另外，一旦鑒定出由重組核酸產(chǎn)生的RPI，那么RPI的整個氨基酸序列就能從重組體中包含的嵌合基因的核苷酸序列推導(dǎo)出來，因此，相應(yīng)蛋白質(zhì)可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法進(jìn)行合成(例如參見Hunkapille等，1984，自然(Nature),310105-111)在另一個實(shí)施方案中，天然RPI可以從天然來源用前述的標(biāo)準(zhǔn)方法純化(例如免疫親和純化)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，RPI用美國申請第08/980,574和W098/23950優(yōu)選技術(shù)中所述的方法進(jìn)行分離，在此引入作為參考。進(jìn)行“制備級”操作時(shí)，根據(jù)Westermeier,1993，實(shí)踐中的電泳技術(shù)(VCH,Weinheim，德國)，第197-209頁(此處全文引入以作參考)描述的方法，等電聚焦步驟中優(yōu)選“窄范圍”的“聚集膠”，其pH范圍為2個pH單位或更少。這種方法上的修改允許在膠上加載更大量的目標(biāo)蛋白質(zhì)，因而可以增加可從膠上回收的分離RPI的量。當(dāng)以此方式進(jìn)行制備級操作時(shí)，優(yōu)選的技術(shù)在一次操作一般可提供近100ng及可高達(dá)1000ng分離的RPI。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解聚集膠可用于使用凝膠等電聚焦的任何分離策略。在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法或天然蛋白質(zhì)純化方法得到的RPI包括(但不局限于)，那些含有RPI全部或部分氨基酸序列的成分，以及其片段、其它衍生物、和類似物、包括其同源蛋白質(zhì)。針對RPI的抗體的生產(chǎn)依照發(fā)明，RPI及其片段、其它衍生物或類似物可以用作免疫原，用以生產(chǎn)可免疫特異性結(jié)合這種免疫原的抗體。這些蛋白質(zhì)、片段、衍生物或類似物可用任何傳統(tǒng)的方法加以分離，包括本申請前一部分?jǐn)⑹龅姆椒ā．a(chǎn)生的抗體包括但不局限于多克隆、單克隆、嵌合的、單鏈的、Fab片段以及Fab表達(dá)文庫。在一特定的實(shí)施方案中，生產(chǎn)了針對人RPI的抗體。在另一個實(shí)施方案中，生產(chǎn)了針對RPI結(jié)構(gòu)域的抗體。在一個特定的實(shí)施方案中，RPI的親水片段用作免疫原，用于抗體的生產(chǎn)。本領(lǐng)域已知的多種方法可用于針對RPI或其衍生物、類似物的多克隆抗體生產(chǎn)。在一個特定的實(shí)施方案中，可以獲得針對RPI的一個表位或其亞序列的兔多克隆抗體。多種宿主動物可以通過注射天然的RPI或合成的RPI或其衍生物(例如片段)來免疫，從而生產(chǎn)抗體。這些宿主動物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、馬、山羊等。多種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，這依賴于宿主動物的物種，這些佐劑包括但不局限于完全或不完全福氏佐劑、礦物膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、多聚醇類(pluronicpolyols)、多聚陰離子類、肽類、油乳劑類、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在的有用的人類佐劑，如BCG(卡芥苗)以及小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。為了制備針對RPI序列或其類似物的單克隆抗體，可以采用任何能夠用連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系來產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。例如最初由Kohler和Milstein發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)(1975，自然，256:495-497)以及三方雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫(ImmunologyToday)，4:72)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cote等，1985，摘自單克隆抗體和癌癥治療(MonoclonalAntibodiesandCancertherapy),AlanR.Liss公司，第77-96頁)(此處以上文獻(xiàn)引入用作參考)。在發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，單克隆抗體可以在PCT/US90/02545(此處引入用作參考)中描述的無菌動物中產(chǎn)生。根據(jù)發(fā)明，可使用人抗體或可由使用人雜交瘤獲得(Cote等，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),80:2026-2030)，或體外用EBV病毒轉(zhuǎn)化人類B細(xì)胞獲得(Cole等，1985，摘自單克隆抗體和癌癥治療，AlanR.Liss公司，第77-96頁)。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明，可以使用通過將特異識別RPI的鼠抗體分子的基因與具有合適生物活性的人抗體基因剪接，形成嵌合抗體(Morrison等，1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)，81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314:452-454)的技術(shù)，這種抗體也在此發(fā)明范圍之內(nèi)。(此處引入以上每一個文獻(xiàn)作為參考)。根據(jù)發(fā)明，用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778，此處引入用作參考)可以經(jīng)調(diào)整以用于生產(chǎn)RPI特異性單鏈抗體。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫的技術(shù)(Huse等，1989，科學(xué)(Science),246:1275-1281)以快速方便的鑒定對RPI、衍生物或類似物具有理想特異性的單克隆Fab片段。可以使用已知的技術(shù)生產(chǎn)含有分子獨(dú)特型的抗體片段。例如這些片段包括但不局限于抗體分子經(jīng)胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab’)2片段；還原F(ab’)2片段的二硫鍵后產(chǎn)生的Fab’片段、抗體分子經(jīng)木瓜蛋白酶和還原劑處理產(chǎn)生的Fab片段，以及Fv片段。在抗體的生產(chǎn)過程中，目標(biāo)抗體的篩選可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來完成，例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)。例如，為了選擇能夠識別RPI特定結(jié)構(gòu)域的抗體，我們可以分析產(chǎn)生的雜交瘤，其產(chǎn)物能夠與包含這樣的結(jié)構(gòu)域的RPI片段結(jié)合。為了選擇能夠特異性結(jié)合第一個RPI同系物而不特異性結(jié)合不同的RPI同系物的抗體，我們可以在第一個RPI同系物結(jié)合呈陽性而缺乏與第二個RPI同系物結(jié)合能力的基礎(chǔ)上來進(jìn)行篩選。類似的，為了選擇能夠特異性結(jié)合RPI而不特異性結(jié)合同一蛋白質(zhì)的不同同種型(例如，與RPI具有相同核心肽的不同糖基化形式glycoform)的抗體，我們可以在RPI結(jié)合陽性而缺乏與不同同種型(例如糖基化形式)結(jié)合能力的基礎(chǔ)上來進(jìn)行篩選。還提供了針對RPI的結(jié)構(gòu)域的抗體。前述抗體可以用于本領(lǐng)域已知的與本發(fā)明RPI的定位和活性相關(guān)的方法，例如這些蛋白質(zhì)的顯像、在適當(dāng)生理樣品中RPI水平的測定和用在診斷方法中等等。編碼RPI的DNA的分離下面將以舉例的方式，不加任何限制的闡述用于RPI基因克隆的特定的實(shí)施方案。本發(fā)明的核苷酸序列(包括DNA和RNA)以及包含編碼RPI或其片段、其類似物的序列，可以用本領(lǐng)域已知的方法合成，例如使用傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法和重疊寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。這些序列同樣也可用作來自任何物種的RPI基因的克隆和鑒定，例如用于篩選cDNA文庫、基因組文庫或表達(dá)文庫。包含本發(fā)明中RPI編碼序列的核苷酸序列可用于與其它蛋白質(zhì)基因的互補(bǔ)序列選擇性形成二聚體分子。依賴于不同的應(yīng)用，不同的序列同源性可以通過不同的雜交條件來實(shí)現(xiàn)。為了獲得高度的選擇性，可以使用相對苛刻的條件來形成二聚體，例如低鹽或高溫條件。此處所用的“高度嚴(yán)格條件”是指與濾膜上結(jié)合的DNA進(jìn)行的雜交是在0.5MNaHPO4、7％SDS、1mMEDTA、65℃；在0.1×SSC/0.1％SDS、68℃下清洗。(AusubelF.M.等編，1989，分子生物學(xué)通用操作規(guī)程(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，第一卷，Green出版聯(lián)合公司和JohnWiley&sons公司，紐約，第2.10.3頁；此處完整引入作為參考)。對于某些應(yīng)用，需要不甚嚴(yán)格的雜交條件。此處所用的“中度嚴(yán)格的條件”是指在0.2×SSC/0.1％SDS、42℃條件下清洗(Ausubel等，同上)。雜交條件也可以通過增加甲酰胺的量以使雜交二聚體去穩(wěn)定而變得嚴(yán)格。因而特定的雜交條件可以容易的操縱，一般應(yīng)當(dāng)根據(jù)所預(yù)期的結(jié)果來選擇。例如，傳統(tǒng)的雜交溫度在50％甲酰胺存在下是對于與RPI基因片段有95-100％同源性的探針為42℃；90-95％同源性的為37℃；70-90％同源性的為32℃。在基因組文庫的制備中可以產(chǎn)生DNA片段，其中有些編碼RPI的一部分或全部。DNA可能用多種限制性內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)切開。另外，可以在錳存在下使用DNA酶將DNA打碎，或者用物理方法將DNA剪切，例如用超聲波。隨后DNA片段可以根據(jù)大小用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行分離，包括但不局限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳、柱層析和蔗糖梯度離心。然后DNA片段可插入到適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不局限于質(zhì)粒、粘粒、λ或T4噬菌體和酵母人工染色體(YAC)(參見，例如，Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約；GloverD.M.(編)，1985,DNA克隆實(shí)驗(yàn)方法(DNACloning:APracticalApproach),MRL出版有限公司，牛津，英國，第Ⅰ、Ⅱ卷；AusubelF.M.等編，1989，分子生物學(xué)通用操作規(guī)程，第一卷，Green出版聯(lián)合公司和JohnWiley&sons公司，紐約)?；蚪M文庫可以通過將核酸與標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交來篩選(Benton和Davis,1979，科學(xué)，196:180；Grunstein和Hogness,1975，美國國家科學(xué)院院報(bào)，72:3961)?；蚪M文庫可以用相應(yīng)于RPI的任一肽的氨基酸序列之標(biāo)記的簡并性寡核苷酸探針，使用本領(lǐng)域熟知的最適方法進(jìn)行篩選。所用的探針優(yōu)選的至少10個核苷酸，更優(yōu)選的，15個核苷酸，仍舊更優(yōu)選的，20個核苷酸。如前述表Ⅷ-表Ⅺ所示，此處公開的一些RPI對應(yīng)于先前已鑒定的一些蛋白質(zhì)，其編碼基因的序列也已公開。要篩選這樣的基因，可以使用任何與這些基因和其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的探針，優(yōu)選的，探針長度為10核苷酸或更長，更優(yōu)選的，15核苷酸或更長。使用國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的檢索數(shù)據(jù)庫(其網(wǎng)址為http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以通過下述檢索號獲得這些RPI的基因序列，此處引入每個基因的序列以作參考。RPI相關(guān)蛋白質(zhì)的基因序列RADF#RPI檢索號RADF-1RPI-1T40090,T40068RADF-3RPI-3AA551927,AA260531,W97741,N99366,T70526,T40177,T40060,T40034,T39910,T39894RADF-4RPI-4T41010,T40102,T40058,T39954RADF-6RPI-5AA269874RADF-8RPI-6Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-9RPI-7Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-10RPI-8Z21022,Z19947RADF-11RPI-9T41063,T41020,T41005,T40881,T40190,T40139,T40125,T40114,T40096,T39908RADF-12RPI-11T40090,T40068RADF-13RPI-12AA551927,AA260531,W97741,N99366,T70526,T40177,T40060,T40034,T39910,T39894RADF-14RPI-13T40090,T40068RADF-15RPI-15T40940,T40002RADF-16RPI-16T73244,T71043,T71032,T40181,T40116RADF-18RPI-21N99641,N99445,N99528,Z20485,Z20465RADF-19RPI-22AA269874RADF-20RPI-23Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-22RPI-24T1952,H73939,Z20894,T40182,T40167,T40158RADF-23RPI-25AA614684,AA523377,AA715907,AA580429,AA630254,AA617854,AA580356RADF-24RPI-26AA268201,T64416,T62149,T40186RADF-25RPI-27Z21017,Z20888,Z19984,Z19971,T41056,T40108RADF-26RPI-28T1952,H73939,Z20894,T40182,T40167,T40158RADF-26RPI-29Z21017,Z20888,Z19984,Z19971,T41056,T40108RADF-26RPI-30T64707RADF-27RPI-31Z20858,AA503766,H51308,H03365RADF-32RPI-33T40090,T40068RADF-33RPI-34T40090,T40068RADF-35RPI-36221022,Z19947RADF-36RPI-37Z20858,AA503766,H51308,H03365對于每個RPI-10、RPI-17和RPI-20，提供了如下簡并性探針(a)RPI-10的探針5’-ACGACCTTTATGTTCTATAGCAGCAAC-3′GTGGGCCGGGGTTAATTTCCGCCC(b)RPI-17的探針5’-ACGAGCATGAGGAGCATCTATAAGATT-3′GTGGGGGCGGGTTTTAA-TCCCCGC(C)RPI-20的探針5’-AGATATATCAGCACCAGAATC-3′GCTCGGGGGCTGTAATTTCGCCC文庫中，含有編碼RPI或其片段的目的DNA插入序列之克隆可以和一個或多個簡并性寡核苷酸探針(或其互補(bǔ)序列)雜交。這種寡核苷酸探針與基因組文庫的雜交可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。例如與前面所述的系列簡并性寡核苷酸探針(或其互補(bǔ)序列)雜交(或與這樣的系列中的任何成員或其互補(bǔ)序列雜交)。這種雜交可以在前面所述的高度嚴(yán)格或中度嚴(yán)格的條件下進(jìn)行，或可在2×SSC,1.0％SDS,50℃的反應(yīng)和清洗條件下進(jìn)行。另一方面，編碼RPI部分或全部多肽的核苷酸序列或RPI衍生多肽的核苷酸序列之克隆可以通過篩選表達(dá)文庫獲得。例如相關(guān)來源的DNA分離后，制備隨機(jī)片段，然后連接入一個表達(dá)載體(例如噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒和粘粒)以致于載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后而使載體中的插入片段能被宿主表達(dá)。多種篩選分析可用于選擇表達(dá)的RPI或RPI衍生多肽。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多種抗RPI抗體通過本領(lǐng)域已知的方法可用于鑒定目標(biāo)克隆，參見，例如Harlow和Lane,1998，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(Antibodies:ALaboratoryManual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約，附錄Ⅳ。將文庫中的克隆或噬菌斑與這些抗體接觸從而鑒定的結(jié)合的克隆。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)Olsvick等，第二十九屆ICAAC，休斯頓，得克薩斯，1989的文獻(xiàn)(此處引入用作參考)，含有編碼RPI或RPI衍生多肽的序列之克隆或噬菌斑可以用DYNA珠來鑒定?？筊PI抗體交聯(lián)于甲苯磺酰化的DYNA珠M280上，這些抗體包被珠可用于吸附至表達(dá)RPI和RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑。表達(dá)RPI或RPI衍生多肽的克隆或噬菌斑可通過這種與珠的結(jié)合而得到鑒定。另外，抗RPI抗體可以非特異性的固定化于適當(dāng)?shù)闹С治锷?，例如硅質(zhì)或硅藻土(CelsiteTM)基質(zhì)。這些材料可用于吸附如前述表達(dá)RPI或RPI衍生多肽的細(xì)菌克隆。另一方面，PCR擴(kuò)增可用于產(chǎn)生編碼來源于基因組DNA中的部分和全部RPI的基本上純的DNA。簡并的或其它的對應(yīng)于已知RPI序列的寡核苷酸引物可用作引物。PCR可以使用Perkin-ElmerCetus的PCR擴(kuò)增儀和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，以下Taq聚合酶(GeneAMPTM)來進(jìn)行?？梢赃x擇合成數(shù)個不同的簡并性引物用于PCR反應(yīng)。也可以改變引發(fā)PCR雜交反應(yīng)的雜交條件的嚴(yán)格程度，以適應(yīng)簡并性引物和DNA序列中相應(yīng)序列的更高的或更低的核苷酸序列相似性。成功地?cái)U(kuò)增編碼RPI的序列的一個片段后，這一片段可以進(jìn)行分子克隆和測序，并用作探針分離完整的基因組克隆。進(jìn)而允許鑒定基因的完整核苷酸序列，及對其表達(dá)進(jìn)行分析，生產(chǎn)用于如下所述的用于功能研究的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。RPI基因也可以通過核酸雜交后體外翻譯來篩選mRNA的方法進(jìn)行鑒定。在此方法中，片段用于通過雜交分離互補(bǔ)的mRNA。這樣的DNA片段可能代表著另一物種可用的純化的RPIDNA(例如小鼠或人)。對分離的mRNA之分離產(chǎn)物的體外翻譯產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀分析或功能分析(例如體外聚集能力、受體結(jié)合能力)可以鑒定目標(biāo)mRNA，因而可鑒定包含目標(biāo)序列的互補(bǔ)DNA片段。另外，特異性mRNA可能通過從細(xì)胞分離出的多核糖體與固定化的特異性針對RPI的抗體之吸附來選擇。使用選擇的mRNA(來自吸附的多核糖體)作為模板可以合成放射性標(biāo)記的RPI的cDNA片段。放射性標(biāo)記的mRNA或cDNA能用作探針，鑒定來自其它基因組DNA片段的RPI的DNA片段。分離RPI基因組DNA的替代方法包括但不局限于，從一已知的序列化學(xué)合成基因序列本身，或制造針對編碼RPI之mRNA的cDNA。例如用于RPI基因cDNA克隆的RNA可以從表達(dá)RPI的細(xì)胞中分離出來。其他方法也是可能的并也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。任何真核細(xì)胞潛在的可以作為RPI基因分子克隆的來源。編碼RPI的核酸序列可以從以下材料分離脊椎動物、哺乳動物、人、豬、牛、貓、鳥、馬、犬、以及其它靈長類動物來源、昆蟲、植物等等。DNA可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從克隆的DNA(例如DNA文庫)獲得，可以通過化學(xué)合成、cDNA克隆或基因組DNA或其片段克隆，或純化自目標(biāo)細(xì)胞。(參見，例如Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約；GloverD.M.(編)，1985,DNA克隆實(shí)驗(yàn)方法(DNACloning:APracticalApproach),MRL出版有限公司，牛津，英國，第Ⅰ、Ⅱ卷)。來源于基因組DNA的克隆除了包含編碼區(qū)域以外，還可能包含調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子DNA序列。來源于cDNA的克隆可能只包含外顯子序列。不管來源如何，RPI基因應(yīng)當(dāng)通過分子克隆插入到一個適當(dāng)?shù)妮d體中以便進(jìn)行擴(kuò)增。已分離的和已鑒定的基因或cDNA可隨后插入到一個合適的克隆載體中。本領(lǐng)域大量的已知的載體宿主系統(tǒng)可用于此目的?？赡艿妮d體包括但不局限于，質(zhì)粒或修飾的病毒，但是，載體系統(tǒng)必須和使用的宿主細(xì)胞相適應(yīng)。這樣的載體包括但不局限于，噬菌體例如λ噬菌體衍生物，或質(zhì)粒例如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物或Bluescript載體(Stratagene)?？梢酝ㄟ^將DNA片段連接入含互補(bǔ)粘性末端的克隆載體來完成這種插入過程。但是，如果克隆載體中不含用于切開DNA的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)，那么DNA分子末端可被酶促修飾。另外，任何目的位點(diǎn)可以通過向DNA末端連入核苷酸序列(連接子)產(chǎn)生。這些連接子可包含編碼限制性內(nèi)切酶識別序列的特定化學(xué)合成寡核苷酸。在一個替代方法中，切開的載體和RPI基因可能通過同源多聚尾來修飾。重組分子可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電轉(zhuǎn)化等手段引入宿主細(xì)胞，以使基因序列產(chǎn)生許多拷貝。在一個特定的實(shí)施方案中，用摻入分離的RPI基因、cDNA或合成DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可以產(chǎn)生基因的多個拷貝。因而通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從其中分離重組DNA分子，可以獲得大量的基因，需要時(shí)，可以從分離的重組DNA中回收插入基因。本發(fā)明提供的RPI序列包含那些編碼與天然RPI中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列基本上相同的核苷酸序列，以及那些編碼具有同等功能氨基酸的序列和編碼其他目標(biāo)衍生物或類似物的序列。編碼RPI的DNA的表達(dá)編碼RPI或具有活性功能類似物、片段或其它衍生物的核苷酸序列可以插入一個適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即含有插入蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體。這些必需轉(zhuǎn)錄和翻譯信號可以由天然RPI基因提供，或者由RPI基因兩側(cè)區(qū)域提供。表達(dá)編碼蛋白質(zhì)序列可以選擇多種宿主載體的表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括但不局限于，用病毒感染哺乳動物細(xì)胞的系統(tǒng)(如，痘病毒、腺病毒等等)；病毒感染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒)；微生物如帶有酵母載體的酵母、噬菌體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA。載體的表達(dá)元件的特異性和強(qiáng)度各不相同。依賴于所使用的宿主載體系統(tǒng)，可以使用若干適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一個。在一個特定的實(shí)施方案中，表達(dá)了人的RPI基因或編碼人RPI功能活性區(qū)的序列。在另外一個實(shí)施方案中，表達(dá)了包含RPI結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)片段。前面所述的用于將DNA片段插入到載體的任何方法可以用于構(gòu)建含有嵌合基因的表達(dá)載體，這一嵌合基因包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號和蛋白質(zhì)編碼序列。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組體(遺傳重組)。編碼RPI或肽片段的核酸序列的表達(dá)可能受到第二核酸序列的調(diào)節(jié)，因此RPI或肽在用重組的DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，RPI基因的表達(dá)可以由本領(lǐng)域已知的任何啟動子或增強(qiáng)子元件調(diào)節(jié)?？梢杂糜谡{(diào)節(jié)RPI基因表達(dá)的啟動子包括但不局限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon,1981，自然，290:304-310)，包含與魯斯氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)序列中的啟動子(Yamamoto等人，1980，細(xì)胞，22:787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:1441-1445)，金屬硫蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，1982，自然，296:39-42)；原核表達(dá)載體，例如β-半乳糖苷酶啟動子(VllaKmaroff等人，1978，美國國家科學(xué)院院報(bào)，75:3727-3731)，或tac啟動子(DeBoer等人，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:21-25)；亦參見“重組細(xì)菌中的有用蛋白質(zhì)”，科學(xué)美國人(ScientificAmerican)1980,242:74-94)；植物表達(dá)載體，包括胭脂堿合成酶啟動子區(qū)域(HerrerraEstrella等人，自然，303:209-213)；花椰菜花葉病毒35S的RNA啟動子(Gardner等人，1981，核酸研究(Nucl.AcidsRes.),9:2871)，光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(HerrerraEstrella等人，1984，自然，310:115-120)；來自酵母或其它真菌的啟動子元件，例如Gal4啟動子、ADC(乙醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子以及下述動物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，它們表現(xiàn)出組織特異性并已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因調(diào)控區(qū)；(Swift等人，1984，細(xì)胞(Cell),38:639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港癥狀定量生物學(xué)(ColdSpringHarborSymp.Quant.Bio1.),50:399-409；MacDonald，1987，肝病學(xué)(Hepatology),7:425-515)；在胰腺β-細(xì)胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)(Hanahan,1985，自然，315:115-122)，在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因調(diào)控區(qū)(Grosschedl等人，1984，細(xì)胞，38:647-658；Adames等人，1985，自然，318:533-538；Alexander等人，1987，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.),7:1436-1444)，在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的鼠乳腺腫瘤病毒調(diào)控區(qū)(Leder等人，1986，細(xì)胞，45:485-495)，在肝臟中有活性的白蛋白基因調(diào)控區(qū)(Pinkert等人，1987，基因與進(jìn)展(GenesandDevel.),1:268-276)，在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因調(diào)控區(qū)(Krumlauf等人，1985，分子細(xì)胞生物學(xué)，5:1639-1648；Hammer等人，1987，科學(xué)，235:53-58)；在肝臟中有活性的α-1抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)(Kelsey等人，1987，基因與進(jìn)展，1:161-171)，在脊髓細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因調(diào)控區(qū)(Mogram等人，1985，自然，315:338-340；Kollias等人，1986，細(xì)胞，46:89-94)；在腦少突細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因調(diào)控區(qū)(Readhead等人，1987，細(xì)胞，48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因的調(diào)控區(qū)(Sani,1985，自然，314:283-286)以及在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因調(diào)控區(qū)(Mason等人，1986，科學(xué)，234:1372-1378)。在一個特定的實(shí)施方案中，所用的載體包含與RPI編碼核酸有效連接的啟動子、一個和多個復(fù)制起點(diǎn)、以及任選地包含一個或多個選擇標(biāo)志(例如抗生素抗性基因)。在一個特定的實(shí)施方案中，通過將RPI編碼基因亞克隆入三個pGEX載體(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體；Smith和Johnson,1988，基因(Gene),7:31-40)的每一個載體的EcoRⅠ限制性位點(diǎn)中，構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體，這可以允許從正確閱讀框架的亞克隆來表達(dá)RPI產(chǎn)物。包含RPI基因插入物的表達(dá)載體可以通過三種通用方法驗(yàn)證(a)核酸雜交，(b)有或無“標(biāo)志”基因功能，以及(c)插入序列的表達(dá)。第一種方法中，我們可以利用核酸雜交檢測表達(dá)載體中RPI基因插入物的存在，所用的探針包含與插入的RPI基因同源的序列。第二種方法中，可以利用載體中RPI基因插入造成某一特定“標(biāo)志”基因功能的存在或缺失，對重組載體/宿主系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和篩選(例如胸苷激酶活性，抗生素抗性，轉(zhuǎn)化表型，桿狀病毒包涵體形成等等。)。例如如果RPI基因插入點(diǎn)位于載體的標(biāo)志基因序列內(nèi)，那么通過標(biāo)志基因功能缺失可判定重組子中包含RPI基因插入序列。第三種方法中，可以通過檢測重組體表達(dá)的RPI基因產(chǎn)物來驗(yàn)證重組表達(dá)載體。例如此分析可在RPI基因產(chǎn)物在體外分析系統(tǒng)中的物理或功能特性(例如與抗RPI抗體結(jié)合)的基礎(chǔ)上進(jìn)行。一旦鑒定并且分離出某一特定重組DNA分子，就可利用本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行擴(kuò)增。一旦建立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，就可對重組表達(dá)載體進(jìn)行擴(kuò)增和大量制備。如前所述，可用的表達(dá)載體包括但不局限于如下的載體或其衍生物人類或動物病毒如痘病毒和腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如λ)；質(zhì)粒和粘粒DNA載體等等。另外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)，或以特定的理想方式修飾、加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。從一定啟動子開始的表達(dá)在某些誘導(dǎo)劑存在下可以提高，因而可以控制遺傳工程化的RPI的表達(dá)。進(jìn)一步講，不同的宿主細(xì)胞具有不同的特征性、特異性的用于翻譯和翻譯后加工和修飾機(jī)制(例如蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化)。可以選擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)來保證表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行所希望的加工與修飾。例如在細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可用于生產(chǎn)非糖基化的核心蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在酵母中的表達(dá)可產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物；在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)可以用于保證外源蛋白質(zhì)的“天然”糖基化。此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可能影響加工反應(yīng)的程度。為了長期高產(chǎn)量生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如可以構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)不同表達(dá)能力或途徑的基因蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。不是使用含有病毒復(fù)制起始位點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可以用由適當(dāng)表達(dá)調(diào)控元件控制的DNA(例如啟動子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等等)以及選擇標(biāo)志進(jìn)行轉(zhuǎn)化。引入外源DNA后，工程化細(xì)胞可在加富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)移至一種選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)志可產(chǎn)生對選擇壓力的抗性，因而可使細(xì)胞穩(wěn)定的將質(zhì)粒整合入宿主染色體，而生長形成菌落，菌落進(jìn)而可以進(jìn)行克隆和增殖成細(xì)胞系。這種方法在形成表達(dá)不同地表達(dá)的或途徑基因蛋白質(zhì)的工程細(xì)胞系方面具有許多優(yōu)點(diǎn)。這種工程化細(xì)胞系在篩選和評價(jià)那些能影響不同表達(dá)能力的或途徑基因蛋白質(zhì)內(nèi)源活性的化合物上特別有用。許多選擇系統(tǒng)可以使用，包括但不局限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，細(xì)胞，11223)，次黃鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski,1962，美國國家科學(xué)院院報(bào)，48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，細(xì)胞，22:817)基因可以分別在tl-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中使用。抗代謝物抗性也可以用作選擇下列基因的基礎(chǔ)ddfr，賦予氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，1980，美國國家科學(xué)院院報(bào)，77:3567；O’Hore等人，1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:1527)；gpt，賦予對霉酚酸的抗性(Mulligun和Berg,1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:2072)；neo，賦予對氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物學(xué)雜志(J.Mo1.Boil.),150:1)以及hygro，賦予對潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因，30:147)。在另一個實(shí)施方案中，RPI、片段、類似物或衍生物可表達(dá)為一個融合的、嵌合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(包含通過肽鍵與外源蛋白質(zhì)序列(不同的蛋白質(zhì))相連的蛋白質(zhì)、片段、類似物、衍生物)?？赏ㄟ^將諸個編碼目標(biāo)氨基酸序列的適當(dāng)核酸序列用本領(lǐng)域已知的方法以正確的編碼框架相互連接起來，得到這種嵌合產(chǎn)物，然后用本領(lǐng)域公知的方法對嵌合產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)。另外，這種嵌合產(chǎn)物可以用蛋白質(zhì)合成技術(shù)生產(chǎn)，例如使用多肽合成儀。cDNA和基因組序列都能進(jìn)行克隆和表達(dá)。RPI的治療用途本發(fā)明通過施用治療性化合物，提供對多種疾病和紊亂的治療或預(yù)防。所述化合物包括但不限于，RPI及其類似物和衍生物(包括片段)(如，如此處所述)；其抗體(如此處所述)；編碼RPI、其類似物、或衍生物的核酸(如此處所述)；RPI基因反義核酸，以及RPI基因的激動劑和拮抗劑。如此處所述，本發(fā)明的一個重要特征在于參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的RPI基因的鑒定?？赏ㄟ^施用一種治療性化合物治療或防止關(guān)節(jié)炎，所述化合物可促進(jìn)在RA患者的滑液中相對于血清而言下降的RPI的功能或表達(dá)。也可通過施用治療性化合物治療或防止關(guān)節(jié)炎，所述化合物可減低在RA患者的滑液中相對于血清而言增加的RPI的功能或表達(dá)?？傊?，施用與患者相同種的來源或種間反應(yīng)性(對于抗體的情況)的產(chǎn)物是優(yōu)選的。由此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案種，將人RPI、其衍生物或類似物，或者核酸、或針對人RPI的抗體施用于人類患者用于治療或預(yù)防。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療和預(yù)防通過施用促進(jìn)(即增加或提供)一種或多種RPI(或一種或多種RADF水平)的水平或功能的化合物從而治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述RPI或RADF在患有RA的受試者的滑液中相對于血清而言降低了。這類化合物的例子包括但不限于RPI及其衍生物、或有功能活性的片段，特別是有如體外分析或動物模型中所示的活性；以及編碼RPI或其有功能活性衍生物的核酸或其片段(如用于基因治療)。其他可用的化合物如RPI的激動劑的鑒定可利用體外分析。也可通過施用一種化合物治療或防止關(guān)節(jié)炎，所述化合物抑制(即降低)一種或多種RPI的水平或功能(或一種或多種RADF的水平)，從而治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述RPI或RADF在患有RA的患者滑液中相對于血清而言顯示增加的豐度。這類化合物的例子包括但不限于RPI反義寡核苷酸、核酶或針對RPI的抗體。其他可用的化合物如RPI的拮抗劑的鑒定可利用體外分析。在特定實(shí)施方案中，與RA患者血清相比，當(dāng)鑒定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相對于正?；蚱谕刀匀笔Щ蚪档蜁r(shí)，可治療性(包括預(yù)防性)施用促進(jìn)一種或多種RPI(或一種或多種RADF水平)的水平或功能的化合物。在另一實(shí)施方案中，與RA患者血清相比，當(dāng)鑒定的RA患者滑液中RPI水平或功能(或者RADF水平)相對于正?；蚱谕刀栽黾訒r(shí)，可治療性(包括預(yù)防性)施用抑制一種或多種RPI(或RADF水平)的水平或功能的化合物。由于這類化合物的施用導(dǎo)致的RPI功能或水平(或RADF水平)的改變可方便的檢測，如通過獲得患者組織樣品(如，從活檢組織)并體外分析其RNA或蛋白質(zhì)水平，或表達(dá)RPIRNA或蛋白質(zhì)的活性。優(yōu)選的技術(shù)也可采用，以檢測施用化合物之前以及之后的RPI或RADF的水平?？扇绱死枚喾N本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于激酶分析、免疫分析，以檢測和/或顯示RPI(如，Western雜交、免疫沉淀隨后是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫組化等)和/或雜交分析，以通過檢測和/或顯示編碼RPI的mRNA(如，Northern分析、點(diǎn)雜交、原位雜交等)來檢測RPI表達(dá)。本發(fā)明化合物包括但不限于任何化合物，如可將RA患者的RPI或RADF圖形向正常水平恢復(fù)的小有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、核酸等，前提是這類化合物不是非甾體抗炎劑(NSAID)(如，強(qiáng)的松、布洛芬、非諾布芬、酮洛芬、氟布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、阿斯匹林、水楊酰水楊酸、diflunisal、萘普生、炎痛喜、替諾昔康、保泰松、羥布宗)、金鹽、D-青霉胺、抗瘧疾藥，如羥氯喹或柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、氨甲蝶呤、類皮質(zhì)酮、抗CD4單克隆抗體或抗CDw52抗體?；蛑委熢谝粋€特定實(shí)施方案中，通過基因治療方法施用包含編碼RPI或其功能衍生物的核酸序列，以促進(jìn)RPI功能?；蛑委熓侵竿ㄟ^向受試者施用表達(dá)的或可表達(dá)的核酸進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的這個實(shí)施方案中，核酸產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過促進(jìn)RPI功能介導(dǎo)治療作用。本發(fā)明的這個實(shí)施方案中，核酸產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過促進(jìn)RPI功能介導(dǎo)治療作用。任何本領(lǐng)域周知的基因治療可根據(jù)本發(fā)明使用。示范性例子如下。關(guān)于基因治療方法的一般性綜述，見Goldspiel等，1993，臨床藥理(ClinicalPharmacy)12:488-508；Wu和Wu,1991，生物治療(Biotherapy)3:87-95；Tolstoshev,1993，藥物毒理年鑒(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32:573-596；Mulligan,1993，科學(xué)(Science)260:926-932；Morgan和Anderson,1993，生物化學(xué)年鑒(Ann.Rev.Biochem.)62:191-217；1993,5,TIBTECH11(5):155-215)。本領(lǐng)域周知的可用的重組DNA技術(shù)的方法如Ausubel等，(編)，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，JohnWiley&Sons,NY；和Kriegler,1990，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室手冊，Stockton出版社，NY。在優(yōu)選的方面，化合物包含編碼RPI蛋白質(zhì)的核酸，所述核酸是在合適宿主中表達(dá)RPI或其片段或其嵌合蛋白質(zhì)之表達(dá)載體的一部分。特別是，這類核酸具有與RPI編碼區(qū)有效連接的啟動子，所述啟動子為組成型或誘導(dǎo)型的，以及任選的是組織特異性的。在另一實(shí)施方案中，使用核酸分子，其中RPI編碼序列合任何其他期望序列的側(cè)翼為促進(jìn)在基因組希望的位點(diǎn)同源重組的區(qū)域，由此提供RPI核酸的染色體內(nèi)表達(dá)。(Koller和Smithies,1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)。核酸向患者的遞送可以直接的方式，其中患者直接接觸核酸或攜帶核酸的載體；或可以是間接的方式，其中，細(xì)胞首先體外用核酸轉(zhuǎn)化，然后移植入患者。這兩種途徑分別已知為體內(nèi)或離體基因治療。在一個特定實(shí)施方案中，體內(nèi)直接施用核酸，其中核酸表達(dá)產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可通過多種本領(lǐng)域已知的方法中任一種完成，如通過將其構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分，且通過如下方法施用進(jìn)行感染使其成為細(xì)胞內(nèi)的，例如，通過缺陷型或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體(見，美國專利4,980,286)；或裸DNA直接注射，或使用微顆粒轟擊(如，基因槍；Biolistic,Dupont)；或用脂類、細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，包封于脂質(zhì)體、微顆粒或微膠囊；或通過將其以與已知能進(jìn)入核的肽鍵連的形式施用；通過將其以與經(jīng)歷受體介導(dǎo)的胞飲作用的配體鍵連的形式施用(見，如Wu和Wu，生物化學(xué)雜志，262:4429-4432)(其可用于靶定于特異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)等等。在另一實(shí)施方案中，可形成核酸配體復(fù)合物，其中，配體包括一種融合性病毒肽以破壞核內(nèi)體，使得核酸免受溶酶體降解。在另一實(shí)施方案中，通過靶定一個特定受體，可體內(nèi)靶定核酸用于細(xì)胞特異性攝入和表達(dá)(見，如，PCT公開文本W(wǎng)O92/06180，1992年，4月16日，(Wu等)；WO92/22635,1992年12月23日，(Wilson等)；WO92/203161992年11月26,(Findeis等)；WO93/141881993年，7月22,(Clarke等),WO93/202211993年10月14,(Young))?；蛘?，可通過同源重組將核酸細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入并摻入宿主細(xì)胞DNA用于表達(dá)(Koller和Smithies,1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)，86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342:435-438)。在一特定實(shí)施方案中，使用一種含有編碼RPI的核酸的病毒載體。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見Miller等，1993，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)217:581-599)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)過修飾，刪除了對于包裝病毒基因組及整合入宿主細(xì)胞DNA而言非必需的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。待用于基因治療的編碼RPI之核酸被克隆入載體，這有助于基因向患者的遞送。更具體地關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的報(bào)道參見Boesen等，1994，生物治療6:291-302，其中描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdrI基因向造血干細(xì)胞遞送，以使干細(xì)胞更加耐受化療。其它闡明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的使用的文獻(xiàn)有Clowes等，1994，臨床研究雜志(臨床研究雜志)93:644-651；Kiem等，1994，血液(Blood)83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,1993,人類基因治療(HumanGeneTherapy)4:129-141；以及Grossman和Wilson,1993，遺傳學(xué)與發(fā)育的當(dāng)代觀點(diǎn)(Curr.Opin.inGeneticsandDevel.)3:110-114)。腺病毒是可用于基因治療的其它病毒載體。對于將基因遞送至呼吸上皮細(xì)胞腺病毒是特別有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸性上皮細(xì)胞，并由此產(chǎn)生溫和性疾病。基于腺病毒的遞送系統(tǒng)之其它靶點(diǎn)是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有可感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。Kozarsky和Wilson,1993，遺傳學(xué)與發(fā)育的當(dāng)代觀點(diǎn)，3:499-503提供了基于腺病毒基因治療的觀點(diǎn)。Bout等，1994，人類基因治療5:3-10證實(shí)，腺病毒載體用于將基因轉(zhuǎn)移入恒河猴的呼吸性上皮細(xì)胞。其它在基因治療中使用腺病毒的例子見于Rosenfeld等，1991，科學(xué)252:431-434；Rosenfeld等，1992，細(xì)胞68:143-155；Mastrangeli等，1993，臨床研究雜志91:225-234；PCT公開文本W(wǎng)094/12649；和Wang等，1995，基因治療2:775-783。腺伴隨病毒(AAV)以被建議用于基因治療(Walsh等，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300；美國專利5,436,146)?；蛑委煹牧硪煌緩缴婕巴ㄟ^如下方法將基因轉(zhuǎn)移入組織培養(yǎng)的細(xì)胞，包括電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或病毒感染。通常，轉(zhuǎn)移方法包括將一種選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。然后將細(xì)胞置于選擇性條件下，以分離那些已攝入并表達(dá)轉(zhuǎn)移入的基因的細(xì)胞。然后，將那些細(xì)胞遞送至患者。在這個實(shí)施方案中，將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，然后體內(nèi)施用所得的重組細(xì)胞。這種導(dǎo)入可通過本領(lǐng)域已知的任何一種方法進(jìn)行，包括但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒載體或噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)體融合等。本領(lǐng)域已知多種用于將異源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)(見如，Loeffler和Behr,1993，酶學(xué)方法，217:599-618；Cohen等，1993，酶學(xué)方法，618-644；Cline,1985，藥物治療(Pharmac.Ther.)29:69-92)且可依本發(fā)明使用，只要受體細(xì)胞的必要發(fā)育及生理功能不被破壞。技術(shù)應(yīng)使核酸向細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移，使得核酸被細(xì)胞表達(dá)，且優(yōu)選地可被其細(xì)胞后代遺傳和表達(dá)。通過本領(lǐng)域已知的多種方法所得重組細(xì)胞可被遞送至患者。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，例如皮下注射上皮細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，可作為皮膚移植物將重組皮膚細(xì)胞移植至患者。優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)施用重組血細(xì)胞(如，造血干細(xì)胞或先祖細(xì)胞)。構(gòu)思施用的細(xì)胞量取決于期望的作用、患者的狀況等，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員決定?？蓪?dǎo)入核酸用于基因治療的細(xì)胞包括任何希望的可得的細(xì)胞類型，包括但不限于，上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；多種干細(xì)胞或先祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或先祖細(xì)胞，如獲自脊髓、臍帶血、外周血、胎肝等。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是患者自體的。在一個實(shí)施方案中，重組細(xì)胞用于基因治療，將編碼RPI的核酸導(dǎo)入細(xì)胞，使得其能被細(xì)胞或其后代表達(dá)，然后將重組細(xì)胞體內(nèi)施用用以治療。在一特定實(shí)施方案中，采用造血干細(xì)胞及先祖細(xì)胞。任何能被分離和體外維持的干細(xì)胞和/或先祖細(xì)胞可有效地根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案施用(見，如PCT公開文本W(wǎng)O94/08598,1994年4月28日；Stemple和Anderson,1992，細(xì)胞，71:973-985；Rheinwald,1980，細(xì)胞生物學(xué)方法(Meth.CellBio.)21A:229；以及Pittelkow和cott,1986,MayoClinicProc.,61:771)。在一特定實(shí)施方案中，用于基因治療的待導(dǎo)入的核酸包含與編碼區(qū)有效連接的誘導(dǎo)型啟動子，使得可通過適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在與否控制核酸的表達(dá)。RPI的抑制以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過施用拮抗(抑制)RPI水平和/或RPI功能的化合物治療或預(yù)防RA，其中所述RPI與患有RA的患者血清中相比，在滑液中的水平升高?？刹捎玫幕衔锇ǖ幌抻诳筊PI抗體(及含有其結(jié)合區(qū)的片段和衍生物)、RPI反義或核酶核酸、和用于通過同源重組“敲除”內(nèi)源性RPI功能的編碼無功能RPI的核酸(見，如，Capecchi,1989，科學(xué)，244:1288-1292)。在一特定實(shí)施方案中，作為RPI拮抗劑，采用含有RPI基因的部分只核酸，其中的核苷酸編碼側(cè)翼(5′和3′)為不同基因序列的RPI，以促進(jìn)通過同源重組的RPI失活作用。(也參見Koller和Smithies,1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:8932-8935；Zijlstra等，1989，自然，342:435-438)?？赏ㄟ^已知的方便的體外檢測鑒定抑制RPI功能的其它化合物，如基于其抑制RPI與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的能力、或抑制任何已知RPI功能的能力，優(yōu)選地在體外檢測，或在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測，盡管也可利用遺傳檢測。也可采用優(yōu)選技術(shù)，用于檢測在化合物施用之前和之后的RPI水平。優(yōu)選地，利用適當(dāng)?shù)伢w外或體內(nèi)檢測以測定特定化合物的作用，以及是否化合物的施用顯示受影響的組織的治療。在特定實(shí)施方案中，與患有RA的患者的血清相比，當(dāng)滑液中檢測的RPI水平或RPI功能的增加(如，高于正常水平或希望的水平)時(shí)，治療性施用(包括預(yù)防性)抑制RPI功能的化合物。可通過如下方法方便的檢測RPI水平或功能的增加，例如，通過定量蛋白質(zhì)和/或RNA、通過獲得患者滑液及血清樣品以及體外檢測其RNA或蛋白質(zhì)水平、編碼RPI的表達(dá)的RNA之結(jié)構(gòu)和/或活性、或RPI本身。可如此采用本領(lǐng)域的許多標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于檢測和/或顯示RPI的激酶檢測、免疫檢測(如，Western印跡、免疫沉淀隨后是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫組化等)和/或雜交檢測，以通過分別檢測和/或顯示檢測編碼RPI的mRNA(如，Northern印跡、點(diǎn)雜交、原位雜交等)檢測RPI的表達(dá)等等。RPI的反義調(diào)控在特定實(shí)施方案中，通過采用RPI反義核酸抑制RPI功能。本發(fā)明提供了治療或預(yù)防用途的核酸，包括至少與基因或編碼RPI的cDNA或其部分反義的6個核苷酸。如此處所用，RPI的“反義”核酸是指依照一些序列互補(bǔ)性可與編碼RPI的RNA(優(yōu)選地mRNA)的部分雜交的核酸。反義核酸可與編碼RPI之mRNA的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)互補(bǔ)。這種反義核酸具有如可抑制RPI功能的化合物的用途，且可用于治療或防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的反義核酸可以是單鏈或雙鏈的寡核苷酸、RNA或DNA或其修飾或衍生的部分，其可被直接施用于細(xì)胞，或者其可通過外源性導(dǎo)入序列在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明還提供含有在藥學(xué)可接受的載體中的有效量的本發(fā)明之RPI反義核酸的藥物組合物，如下述。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在原核或真核細(xì)胞中抑制RPI核酸序列表達(dá)的方法，包括向細(xì)胞提供含有本發(fā)明RPI反義核酸的有效量的組合物。RPI反義核酸及其用途如下詳述。RPI反義核酸RPI反義核酸是至少6個核苷酸，且優(yōu)選為寡核苷酸(從6個至約50個寡核苷酸)。在一特定方面，寡核苷酸至少為10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少100個核苷酸、或至少200核苷酸。寡核苷酸可為DNA或RNA、或其嵌合混合物、或衍生物或修飾變體、單鏈或雙鏈。寡核苷酸可以在堿基部分、糖基部分或磷酸骨架上被修飾。寡核苷酸可包含其它附加的基團(tuán)如肽，或促進(jìn)跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑(見，如，Letsinger等，1989，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:6553-6556；Lemaitre等，1987，美國國家科學(xué)院院報(bào)，84:648-652；PCT公開文本W(wǎng)O88/09810，公開日12月15日，1988)或促進(jìn)跨越血腦屏障的試劑(見如，PCT公開文本W(wǎng)O89/10134，公開于4月25日，1988)、雜交引發(fā)的切割劑(參見如，Krol等，1988，生物技藝，6:958-976)或嵌入劑(參見如，Zon,1988，藥物研究(Pharm.Res.)5:539-549)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，提供了RPI反義寡核苷酸，優(yōu)選為單鏈DNA。寡核苷酸可通過用本領(lǐng)域周知的取代基在其結(jié)構(gòu)上的任何位置加以修飾。RPI反義寡核苷酸可包括至少一種選自以下的修飾的堿基，包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N-6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N-6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2,6二氨基嘌呤。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一種修飾的糖基部分，如選自阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖的糖基。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一種修飾的磷酸骨架，其選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲乙二縮醛或其類似物。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸是α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特定的雙鏈雜合體，其中與通常的β單位相反，各鏈彼此相互平行。(Gautier等，1987，核酸研究(Nucl.AcidsRes.),15:6625-6641)。寡核苷酸可與其它分子偶聯(lián)，如肽、雜交引發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交引發(fā)的切割劑等。可通過本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成本發(fā)明的寡核苷酸，如通過施用自動DNA合成儀(如可從Biosearch、AppliedBiosystems，等購得的)。例如，可通過Stein等，(1988，核酸研究16:3209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可通過采用受控孔的玻璃聚合物支持物制備甲基磷酸酯寡核苷酸(Sarin等，1988，美國國家科學(xué)院院報(bào)85:7448-7451)等。在一個特定實(shí)施方案中，通過外源序列的轉(zhuǎn)錄于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的RPI反義核酸。例如，可體內(nèi)導(dǎo)入載體使得其被細(xì)胞攝入，在細(xì)胞內(nèi)載體或其部分被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸(RNA)。這類載體含有編碼RPI反義核酸的序列。這類載體可為游離的或整合入染色體，只要其可被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生目標(biāo)反義RNA。這類載體可通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。載體可為質(zhì)粒、病毒或其它本領(lǐng)域用于在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的材料。編碼RPI反義核酸的序列之表達(dá)可由本領(lǐng)域周知的在哺乳動物(優(yōu)選為人)細(xì)胞中起作用的啟動子控制。這類啟動子可為誘導(dǎo)型或組成型。這類啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)域(Bernoist和Chambon,1981，自然290:304-310)、包含于勞氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)的啟動子(Yamamoto等，1980，細(xì)胞，22:787-797)，皰疹胸腺嘧啶啟動子(Wagner等，1981,美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:1441-1445)，金屬硫蛋白基因調(diào)控序列(Brinster等，1982，自然，296:39-42)等。本發(fā)明的反義核酸包括與RPI基因(優(yōu)選人RPI基因)的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)的序列。盡管絕對互補(bǔ)是優(yōu)選的，但不是必需的。一個“與至少RNA的一部分互補(bǔ)”的序列在此是指一個具有足夠互補(bǔ)性、能夠與RNA雜交形成穩(wěn)定雙螺旋的序列；對于雙鏈RPI反義核酸，可如此測試雙鏈DNA的一個單鏈，或可檢測三鏈形成。雜交的能力取決于互補(bǔ)性程度以及反義核酸的長度。通常，雜交的核酸越長，可能含有的與編碼RPI的RNA的錯配堿基越多，但仍形成穩(wěn)定雙螺旋(或三螺旋，有時(shí)如此)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過采用標(biāo)準(zhǔn)步驟測定雜交復(fù)合物的熔點(diǎn)以確定錯配的可接受的程度。RPI反義核酸的治療用途當(dāng)患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者滑液中目標(biāo)RPI過量表達(dá)時(shí)，可施用RPI反義核酸治療(或防止)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在優(yōu)選實(shí)施方案中，采用單鏈DNA反義RPI寡核苷酸。表達(dá)或過量表達(dá)編碼RPI的RNA的細(xì)胞類型可通過多種本領(lǐng)域周知的方法鑒定。這些細(xì)胞類型包括但不限于，白細(xì)胞(如，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)和駐留細(xì)胞(如滑膜細(xì)胞)。這類方法包括但不限于，與RPI特異性核酸雜交(如，通過Northern雜交、點(diǎn)雜交、原位雜交)、觀察待體外翻譯RPI的細(xì)胞翻譯RNA的能力、免疫檢測等。在優(yōu)選的方面，可在治療前通過例如免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交的方法檢測患者原代組織的RPI表達(dá)。本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)可接受載體中的有效量的RPI反義核酸，其可施用于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。在治療RA中有效的RPI反義核酸的量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。如可能，在試驗(yàn)及用于人類之前，希望體外測定待治療的腫瘤類型的反義細(xì)胞毒性，隨后在有用的動物模型系統(tǒng)中測試。在一個特定實(shí)施方案中，通過脂質(zhì)體、微顆粒或微膠囊施用含有RPI反義核酸的藥物組合物。在多個本發(fā)明的實(shí)施方案中，可采用這類組合物實(shí)現(xiàn)RPI反義核酸的緩釋。在一特定實(shí)施方案中，可希望利用脂質(zhì)體通過抗體靶定特定的可鑒別的腫瘤抗原(Leonetti等，1990，美國國家科學(xué)院院報(bào)，87:2448-2451；Renneisen等，1990，生物化學(xué)雜志，265:16337-16342)。抑制性核酶及三股螺旋途徑在另一實(shí)施方案中，可通過與周知的降低RPI基因表達(dá)的水平之基因“敲除”、核酶和/或三股螺旋方法一起使用RPI基因序列，從而降低RPI基因的表達(dá)水平和/或RPI基因產(chǎn)物的活性，緩解RA癥狀。在表現(xiàn)出可調(diào)節(jié)RpI基因的活性、表達(dá)或合成的能力之化合物中(包括緩解RA癥狀的能力的化合物)包括有核酶和三股螺旋分子。可設(shè)計(jì)這類分子用于降低或抑制(如希望，不損害)突變靶基因活性。用于制備和使用這類分子的技術(shù)為本領(lǐng)域周知。設(shè)計(jì)催化性切割RPI基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子可用于防止靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，因此防止RPI基因產(chǎn)物的表達(dá)。(參見如，PCT國際公開文本W(wǎng)O90/11364，公開于10月4日，1990；Sarver等，1990，科學(xué)，247:1222-1225)。核酶是能催化RNA特異性切割的酶性RNA分子(綜述見Rossi,1994，當(dāng)代生物學(xué)(CurrentBiology)4,469-471)。核酶作用的機(jī)理包括核酶分子與互補(bǔ)性靶RNA的序列特異性雜交，隨后是內(nèi)切核酸切割事件。核酶分子的組成必須包括一個或多個與靶基因mRNA互補(bǔ)的序列，且必須包括周知的負(fù)責(zé)mRNA切割的催化序列。對于這樣的序列，參見如，美國專利5,093，246，此處引入作為參考。當(dāng)在特異性識別序列位點(diǎn)切割mRNA的核酶可被用于破壞編碼RPI的mRNA時(shí)，優(yōu)選使用錘頭核酶。錘頭核酶通過切割這種位點(diǎn)的mRNA，該位點(diǎn)由與靶mRNA形成互補(bǔ)性堿基對的側(cè)翼區(qū)標(biāo)明。僅僅需要的是靶mRNA具有如下兩個堿基序列5’-UG-3’。錘頭核酶的構(gòu)建和制備為本領(lǐng)域周知，完整的描述見Myers，1995，分子生物學(xué)和生物技術(shù)簡明手冊，VCHPublishers,NewYork，(尤其見圖4,833頁)和見于Haseloff與Gerlach,1988，自然，334,585-591，此處完整引入作為參考。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)核酶使得切割識別位點(diǎn)位于編碼RPI的mRNA之5’端，即增加效率并最小化非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的胞內(nèi)積累。本發(fā)明的核酶還包括RNA內(nèi)切核酸酶(以下稱為Cech型核酶)，諸如天然存在于嗜熱四膜蟲(稱為IVS，或L-19IVSRNA)以及已被ThomasCech及其同事充分描述了的那些(Zaug,等，1984，科學(xué)，224，574-578；Zaug和Cech,1986，科學(xué)，231,470-475；Zaug，等，1986，自然，324,429-433；公開的國際專利申請WO88/04300(UniversityPatentsInc.；Been和Cech,1986，細(xì)胞，47,207-216)。Cech型核酶具有8堿基對活性位點(diǎn)，其與靶RNA序列雜交，其后發(fā)生靶RNA的切割。本發(fā)明涵蓋了那些靶定在編碼RPI基因中存在的8堿基對活性位點(diǎn)序列的Cech型核酶。至于在反義方法中，核酶可由修飾的寡核苷酸(例如，用于增加穩(wěn)定性、靶定等)組成，且應(yīng)被遞送至體內(nèi)表達(dá)RPI的細(xì)胞中。優(yōu)選的遞送方法包括使用編碼在強(qiáng)組成型polⅢ或polⅡ啟動子控制下的核酶之DNA構(gòu)建體，使得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可產(chǎn)生足夠量的核酶，以破壞編碼RPI的內(nèi)源RNA并抑制翻譯。因?yàn)楹嗣溉缤戳x分子一樣是催化性的，為達(dá)到效率需要較低地細(xì)胞內(nèi)濃度。可通過使用靶定同源重組滅活或“敲除”RPI基因或其啟動子，降低內(nèi)源性RPI表達(dá)(如，參見Smithies,等，1985，自然，317:230-234；Thomas和Capecchi,1987，細(xì)胞，51:503-512；Thompson等，1989，細(xì)胞，5:313-321；此處全文引入作為參考)。例如，可使用一種突變、非功能性RPI基因(或完整的不相關(guān)DNA序列)，其側(cè)翼為與內(nèi)源RPI基因同源的DNA(可為編碼RPI的基因之編碼區(qū)或調(diào)控區(qū))，帶有或不帶有選擇性標(biāo)記和/或隱性選擇性標(biāo)記，用這樣的序列轉(zhuǎn)染體內(nèi)表達(dá)靶基因的細(xì)胞。通過靶定同源重組將DNA構(gòu)建體插入，造成靶基因的滅活。這種方法特別適合于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其中對ES(胚發(fā)生干)細(xì)胞的修飾可用于產(chǎn)生具有失活靶基因的動物子代(如見，Thomas和Capecchi,1987以及Thompson,1989，出處同上)。然而，這種方法可經(jīng)修改以適用于人類，只要重組DNA構(gòu)建體直接施用或利用病毒載體體內(nèi)靶定于需要的位點(diǎn)。另外，可通過靶定互補(bǔ)于RPI基因調(diào)控區(qū)(即，RPI基因啟動子和/或增強(qiáng)子)的脫氧核糖核苷酸序列降低內(nèi)源性RPI基因表達(dá)，以形成在體內(nèi)靶細(xì)胞中防止RPI基因轉(zhuǎn)錄的三股螺旋結(jié)構(gòu)(一般參見，Helene,1991，抗腫瘤藥物研究(AnticancerDrugRes.),6(6),569-584；Helene，等，1992，紐約科學(xué)院年鑒(Ann.N.Y.Acad.Sci.),660,27-36；以及Maher，1992，生物檢測(Bioassays),14(12)，807-815)。待用于三股螺旋形成以抑制轉(zhuǎn)錄的核酸分子應(yīng)為單鏈，且由脫氧核苷酸組成。這些寡核苷酸的堿基組成必須經(jīng)設(shè)計(jì)以促進(jìn)通過Hoogsteen堿基配對法則的三股螺旋形成，這一般需要將存在于雙螺旋一個鏈上的嘌呤或嘧啶之相當(dāng)大的延伸。核苷酸序列可是基于嘧啶的，這樣會在所得三股螺旋的三個結(jié)合鏈之間形成TAT和CGC*三聯(lián)體。富含嘧啶的分子提供了同與之處于平行方向的雙螺旋單鏈上之富含嘌呤區(qū)互補(bǔ)的堿基。此外，可選擇富含嘌呤的核酸分子，例如，含有G殘基的延伸。這些分子與富含GC對的DNA雙螺旋形成三股螺旋，其中嘌呤殘基的大部分位于靶雙螺旋的單鏈，導(dǎo)致在三螺旋的三個鏈之間的GGC三聯(lián)體。另外，通過產(chǎn)生所謂“改變角度”的核酸分子，可增加能被靶定三螺旋形成的潛在序列。改變角度的分子可以交替的5′-3′和3′-5′方式合成，使得其與雙螺旋的第一鏈堿基配對，然后與另一鏈配對，消除了對于待存在于雙螺旋的一個鏈上之嘌呤或嘧啶的相當(dāng)大延伸片段的必要性。在其中此處所述的反義、核酶和/或三股螺旋分子用于抑制突變基因表達(dá)的情況中，可能這些技術(shù)非常有效降低或抑制由正常RPI基因等位基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄(三螺旋)和/或翻譯(反義、核酶)，這就增加了這種可能性，其中存在的正常RPI基因產(chǎn)物可能低于正常表型所需的濃度。在這種情況下，為保證維持基本正常的RPI基因活性水平，因此可通過基因治療方法，將編碼并表達(dá)顯示正常RPI基因活性的RPI基因多肽導(dǎo)入細(xì)胞，采用不含有易于受到反義、核酶或三螺旋處理攻擊的序列。此外，當(dāng)RPI基因編碼胞外蛋白質(zhì)時(shí)，可優(yōu)選與正常RPI基因蛋白質(zhì)一起施用，以維持靶基因活性的必要水平?？赏ㄟ^上述本領(lǐng)域關(guān)于DNA和RNA分子合成的任一方法制備本發(fā)明的反義RNA和DNA、核酶及三螺旋分子。這包括本領(lǐng)域周知的化學(xué)合成寡脫氧核糖核苷酸以及寡核糖核苷技術(shù)，諸如固相氨基磷酸化學(xué)合成。此外RNA分子可通過體外和體內(nèi)的編碼反義RNA分子之DNA序列轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生。這類DNA序列可被摻入多種整合了適當(dāng)RNA聚合酶啟動子(如T7或SP6聚合酶啟動子)的載體。此外，可組成型地或誘導(dǎo)型地(取決于采用的啟動子)合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體可被穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞系。治療或預(yù)防實(shí)用性的證實(shí)本發(fā)明化合物在用于人類之前，優(yōu)選地體外測試，然后體內(nèi)用于希望的治療或預(yù)防活性。例如，可使用體外檢測測定是否有施用特定化合物的顯示，包括體外細(xì)胞培養(yǎng)檢測，其中，患者組織樣品在培養(yǎng)液中生長，并接觸或者以其它方法施用化合物，然后觀察這類化合物對組織細(xì)胞的作用?？蓽y試待測化合物之恢復(fù)患有RA的患者中RADF或RPI水平，使之趨向于未患有RA的受試者中所見的水平的能力，或者檢測在RA的試驗(yàn)動物模型中產(chǎn)生類似改變的能力(如，大鼠中非特異性關(guān)節(jié)炎)。能恢復(fù)所述水平的化合物可用做先導(dǎo)藥物，用于進(jìn)一步的藥物發(fā)現(xiàn)，或治療性使用。可通過優(yōu)選技術(shù)、免疫分析、凝膠電泳隨后是顯現(xiàn)、或任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法檢測RADF和RPI的表達(dá)。這類分析可用于篩選侯選藥物或用于臨床監(jiān)測或藥物開發(fā)，其中RADF或RPI的豐度可用做臨床疾病的代用標(biāo)記。在多種特定實(shí)施方案中，可用參與患者疾病各種細(xì)胞類型的代表性細(xì)胞進(jìn)行體外檢測，以測定是否該化合物對這種細(xì)胞類型具有希望的作用。在于人中測試之前可在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ拖到y(tǒng)中檢測用于治療的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔等。對于體內(nèi)檢測，在施用于人之前，可采用任一本領(lǐng)域知曉的動物模型系統(tǒng)。治療/預(yù)防性施用和組合物本發(fā)明提供了通過向受試者施用有效量的本發(fā)明化合物治療(和預(yù)防)的方法。在一優(yōu)選方面，本發(fā)明的化合物是基本上純的(即，基本上不含有限制其作用或產(chǎn)生不希望地副作用的物質(zhì))。受試者優(yōu)選為動物，包括但不限于如牛、豬、馬、雞、貓、狗等，優(yōu)選為哺乳動物，最優(yōu)選為人。在一特定實(shí)施方案中，非人哺乳動物是受試者。當(dāng)化合物含有如上述核酸時(shí)可采用用于施用的制劑和方法。其它合適的制劑和施用路線可選自下述。已知多種遞送系統(tǒng)且可用于施用本發(fā)明的化合物，如脂質(zhì)體包封、微顆粒、微膠囊、能表達(dá)化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞(參見如，Wu和Wu，1987，生物化學(xué)雜志，262:4429-4432)，構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸等等。導(dǎo)入的方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、腦膜外和口內(nèi)途徑?？赏ㄟ^任一方便途徑施用化合物，例如通過輸注或大劑量注射、通過上皮或黏膜襯的吸收(如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)，以及可通過與其它生物活性劑一起施用。施用可為系統(tǒng)性或局部地。此外，通過任一適當(dāng)?shù)耐緩綄⒈景l(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是有利地，包括心室內(nèi)或鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可借助例如結(jié)合至儲液槽的心室內(nèi)導(dǎo)管，如Ommaya儲液槽。也可采用肺部施用，如通過利用吸入器或噴霧器，以及帶有氣溶膠劑的制劑。在一特定實(shí)施方案中，可希望將本發(fā)明的藥物組合物局部施用于需要治療的部位。這可通過例如(不是以限制的方式)手術(shù)中的局部輸注、局部涂用(例如與手術(shù)后的創(chuàng)口包扎一起)、注射、利用導(dǎo)管、利用栓劑或利用植入物的方法，所述植入物為多孔的或非多孔的、或膠凝材料，包括膜，如sialastic膜，或纖維。在一個實(shí)施方案中，可通過在惡性腫瘤或瘤性或前瘤性組織的位點(diǎn)(或原發(fā)位點(diǎn))直接注射來施用。在另一實(shí)施方案中，化合物可以如下形式遞送在囊泡中，特別是在脂質(zhì)體(見Langer，科學(xué)，249:1527-1533(1990)；Treat等，脂質(zhì)體在感染性疾病與癌癥治療中，Lopez-Berestein和Fidler(編),Liss，紐約，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，出處同上，pp.317-327；通常見出處同上)。在另一實(shí)施方案中，可在受控釋放系統(tǒng)中遞送化合物。在一個實(shí)施方案中，可采用泵(見Langer，出處同上；Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等，外科(Surgery)88:507(1980)；Saudek等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，321:574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可采用聚合物材料(見，受控釋放的醫(yī)療應(yīng)用，Langer和Wise(編)，CRCPres.,BocaRaton,Florida(1974)；受控藥物生物利用度，藥品設(shè)計(jì)與性能，Smolen和Ball(編),Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macrornol.Chem.23:61(1983)；還參見Levy等，科學(xué)，228:190(1985)；During等，神經(jīng)科學(xué)年鑒(Ann.Neurol.)25:351(1989)；Howard等，神經(jīng)外科學(xué)雜志(J.Neurosurg.)71:105(1989))。在另一實(shí)施方案中，可將受控釋放系統(tǒng)置于治療靶點(diǎn)(即腦)附近，這樣只需要系統(tǒng)性給藥劑量的一部分。(參見如，Goodson，受控釋放的醫(yī)療應(yīng)用，出處同前，vol.2,pp.115-138(1984))。其它受控釋放系統(tǒng)在Langer(科學(xué)，249:1527-1533(1990))的綜述中討論。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明化合物為編碼蛋白質(zhì)的核酸時(shí)，可體內(nèi)施用核酸促進(jìn)其編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)，這可通過將核酸構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分，且通過如下方法施用使其成為細(xì)胞內(nèi)的，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體(見，美國專利4,980,286)；直接注射，或使用微顆粒轟擊(如，基因槍；Biolistic,Dupont)；或用脂類、細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被，或通過將其以與已知能進(jìn)入核的同型盒樣肽鍵連的形式施用(見如，Joliot等，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)，88:1864-1868)等?；蛘撸赏ㄟ^同源重組將核酸細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入并摻入宿主細(xì)胞DNA用于表達(dá)。本發(fā)明還提供了藥物組合物。這類組合物包括治療有效量的化合物，以及藥學(xué)可接受的載體。在一特定實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)可接受的”是指由聯(lián)邦政府或州政府管理部門批準(zhǔn)或列在美國藥典或其它普遍承認(rèn)的用于動物(尤其是人)的藥典中。術(shù)語“載體”是指稀釋劑、佐劑、賦形劑或治療時(shí)一起使用的溶媒載體。這類藥學(xué)載體可為無菌液體，如水或油類，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)藥物組合物為靜脈內(nèi)施用時(shí)水為優(yōu)選的載體。生理鹽水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用做液體載體，特別是用于注射溶液。適合的藥學(xué)賦形劑包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、脫脂牛奶、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。如需要。組合物可還含有少量保溫劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以為溶液、懸浮液乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等形式。組合物也可被制為如栓劑，帶有傳統(tǒng)的結(jié)合劑和載體如三甘油三酯。口服制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)載體，如口服級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的例子描述于雷明頓制藥科學(xué)(＂Remington′sPharmaceuticalSciences＂，)E.W.Martin。這類組合物含有治療有效量的化合物，優(yōu)選以純化的形式，以及合適量的載體，以提供用于恰當(dāng)施用于患者的形式。制劑應(yīng)與施用模式相適應(yīng)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，依照常規(guī)方法制備組合物，以作為適于靜脈內(nèi)施用于人類的藥物組合物。一般，用于靜脈內(nèi)施用的組合物為無菌等滲水性緩沖液。如需要，組合物也可含有助溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因，以在注射部位緩解疼痛。通常，以單位劑量的單獨(dú)或混合在一起的形式提供各個組分，例如，以在密封容器(如安瓿或標(biāo)明活性劑的量的量筒)中的凍干粉或無水濃縮物形式。當(dāng)組合物待通過輸注給藥時(shí)，可將其分散于含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶中。當(dāng)組合物通過注射給藥時(shí)，可提供用于注射的無菌水或鹽水的安瓿，使得在給藥前組分可被混合。本發(fā)明化合物可被配制為中性或鹽形式。藥學(xué)可接受的鹽包括與游離氨基形成的那些，如衍生于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及與游離羥基形成的那些，如衍生于鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基醇、組氨酸、脯氨酸等。在治療RA中有效的本發(fā)明化合物的量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測定。此外，可任選地利用體外檢測以幫助確定最優(yōu)劑量范圍。在制劑中采用的精確劑量取決于給藥途徑以及疾病或紊亂的嚴(yán)重程度，且應(yīng)當(dāng)根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷和各個患者的情況決定。但是，用于靜脈內(nèi)給藥的適當(dāng)劑量范圍一般在每千克體重約20-500微克活性化合物。用于鼻內(nèi)給藥的適當(dāng)劑量范圍一般在每千克體重0.01pg至1mg。有效的劑量也可從來自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量效應(yīng)曲線外推得知。一般栓劑含有范圍在0.5％-10％(重量)的活性成分；口服制劑優(yōu)選含有10％-95％的活性成分。本發(fā)明還提供了含有填充有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分之一個或多個容器的藥物包裝或試劑盒。任選地，與這類容器結(jié)合的還有以管理藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府部門頒布的許可證，該許可證反映出就人類施用而言得到管理藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府部門準(zhǔn)許。實(shí)施例患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血清和滑液中的蛋白質(zhì)使用下面的參考實(shí)驗(yàn)規(guī)程，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者和未患有RA的患者(即痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎、外傷性滑膜炎患者)之血清和滑液中的蛋白質(zhì)，用等電聚焦和隨后的SDS-PAGE進(jìn)行分離，每個樣品重復(fù)一次。樣品制備一收到血清樣品即進(jìn)行蛋白質(zhì)分析(使用PierceBCACat#23225)。將相當(dāng)于總蛋白為300μg的血清按體積分為若干等份，每一份加入相同體積的10％(W/V)SDS(Fluka71729)、2.3％(W/V)二硫蘇糖醇(BDH443852A)。樣品在95℃加熱5分鐘，然后冷卻至20℃，然后向樣品中加入125μl下述緩沖液8M尿素(BDH452043w)、4％CHAPS(SigmaC3023)、65mM二硫蘇糖醇(DTT)、2％(V/V)Resolytes3.5-10(BDH443382×)。此混合液旋渦混合后，在15℃、13000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，上清液用等電聚焦分析。等電聚焦等電聚焦(IEF)是使用Immobiline_Drystrip試劑盒(PharmaciaBioTech)，遵照產(chǎn)品的使用手冊所述的方法進(jìn)行的，參見Immobiline_Drystrip試劑盒的說明書，Pharmacia,#18-1038-63，版本AB(此處完整引入用作參考)。固定化的pH梯度(IPG)條(18cm,pH3-10非線性條帶，PharmaciaCat,#17-1235-01)在含有8M尿素、2％(W/V)CHAPS、10mMDTT、2％(V/V)Resolytes3.5-10的溶液(Immobiline_Drystrip試劑盒的使用手冊所述)中20℃再水化過夜。進(jìn)行IEF時(shí)，將500μl上清液(上述方法制備)上樣至條帶，且將杯狀上樣單元置于條帶的堿性端。上樣膠用礦物油(Pharmacia17-3335-01))覆蓋，根據(jù)下述條件使用PharmaciaEPS3500XL電源(Cat19-3500-01)立即向條帶提供電壓起始電壓300V2小時(shí)線性梯度300V-3500V3小時(shí)穩(wěn)定在3500V19小時(shí)對于所有的方法，電流限制為12個條帶10mA，功率的限制為5W。溫度始終保持在20℃。6.3．膠的平衡與SDS-PAGE在最后的19小時(shí)步驟后，立即將條帶切下來，并在組成為下述的第一溶液中20℃浸泡10分鐘6M尿素、2％(W/V)DTT、2％(W/V)SDS、30％(V/V)甘油(Fluka,49767)、0.05MTris/HCl,pH6.8(Sigma,Cat:T-1503)。條帶從第一溶液中移出，然后在組成為下述的第二溶液中20℃浸泡10分鐘6M尿素、2％(W/V)碘乙酰胺(Sigma,I-6125)、2％(W/V)SDS、30％(V/V)甘油(Fuka,49767)、0.05MTris/HCl,pH6.8。從第二溶液中將條帶移出，然后將條帶加到支持膠上面，依據(jù)Hochstrasser等人，1988，分析生物化學(xué)(AnalyticalBiochemistry)，173:412-423(此處完整引入用作參考)所述的方法進(jìn)行SDS-PAGE，并作下述修改。6.4．支持膠的制備凝膠在兩塊如下尺寸大小的玻璃平板間形成后板23cm寬，24cm長，前板23cm寬，24cm長，在中央有一19cm長2cm深的刻痕。為了提高SDS-PAGE凝膠的共價(jià)聯(lián)結(jié)，后板用0.4％的γ-異丁烯酰基-氧丙基三甲氧硅烷的乙醇溶液(BindSilaneTM(PharmaciaCat#17-1330-01)處理。前板用RepelsilaneTM(PharmaciaCat#17-1332-01)處理，以減少凝膠的粘附。多余的試劑用水清洗除去，將平板晾干。在此時(shí)，將一粘性條形碼貼于后板上一適當(dāng)?shù)奈恢?不至于與凝膠基質(zhì)接觸)作為區(qū)分凝膠和平板襯層的標(biāo)志。已干的平板裝入容量為13個凝膠夾槽的裝膠盒上，每一夾槽的上下平板用2.5cm寬、1mm后的墊片隔開，夾槽相互之間用醋酸紙隔開，以利于凝膠聚合后夾槽的分離。然后按照Hochstrasser等人前述文獻(xiàn)所用方法制備模具。使用Angelique梯度凝膠灌注系統(tǒng)(大規(guī)模生物學(xué))，灌注9％-16％的線性聚丙烯酰胺凝膠梯度，直至前板刻痕下方2cm處。所用儲備液如下丙烯酰胺(40％水溶液)(Serva,Cat#10677)，交聯(lián)劑為PDA(BioRad161-0202)，濃度為總起始單體總量的2.6％(W/V)。凝膠緩沖液為0.375MTris/HCl,pH8.8，聚合催化劑為0.05％(V/V)TEMED(BioRad161-0801)，引發(fā)劑為0.1％(W/V)的APS(BioRad161-0700)。凝膠中不含SDS，不使用層積膠。灌制好的凝膠可以在20℃過夜聚合，然后在密閉的聚乙烯袋中在6ml凝膠緩沖液中4℃保存，并在4周內(nèi)使用。6.5.SDS-PAGE在電泳緩沖液(0.025MTris、0.198M甘氨酸(Fluka50050)、1％(W/V)SDS，加入少量的溴酚藍(lán))中配制0.5％(w/v)的瓊脂糖(FlukaCat05075)溶液。瓊脂糖混懸液在攪拌的情況下加熱到70℃，直至瓊脂糖溶解。在雙向支持膠的上方灌入瓊脂糖溶液，然后將平衡條帶放入瓊脂糖中，用平面刀將凝膠輕輕敲打直到與雙向膠剛好接觸。按照Amess等人，1985，電泳(Electrophoresis),16:1255-1267)(此處完整引入用作參考文獻(xiàn))所述方法將凝膠放入雙向電泳槽中。電泳槽中充有上述電泳緩沖液，液面剛好高于包含聚丙烯酰胺凝膠的雙向膠的頂端，這樣可以使活性凝膠區(qū)域得到充分的冷卻。將電泳緩沖液加入到由凝膠形成的頂部緩沖液池，然后使用ConsortE-833電源立即向凝膠加上電壓。凝膠在20mA/凝膠的條件下電泳1小時(shí)。功率限制設(shè)定為每一個含6個凝膠的電泳槽150W；電壓限制設(shè)定為600V。1小時(shí)后，凝膠在同上的功率和電壓限制下，40mA/凝膠的條件下電泳，直至溴酚藍(lán)線距凝膠底端0.5cm處。在整個電泳過程中緩沖液溫度應(yīng)保持在10℃。6.6．染色電泳完成后，立即將凝膠從電泳槽中移出進(jìn)行固定。仔細(xì)地將凝膠盒上方的頂端平板取出，使凝膠粘在底端平板上。把粘有凝膠的平板放入染色器皿中，每個這樣的器皿可以放12個凝膠。將凝膠完全浸泡于固定溶液中40％(V/V)乙醇(BDH28719)、10％(V/V)乙酸(BDH100016X)、50％(V/V)水(MilliQ-Miliipore)，固定過程中使固定液始終繞凝膠流動。固定過夜后，從固定器皿中去除固定液，將凝膠浸泡于7.5％(V/V)乙酸、0.05％(W/V)SDS、92.5％(V/V)水中預(yù)染(prime)30分鐘。瀝干預(yù)染溶液后，將凝膠完全浸泡于染色溶液中4小時(shí)。熒光染料溶液是根據(jù)SyproRed(分子探針，Eugene公司，俄勒崗)的使用說明將其稀釋，然后用0.4μm濾膜在抽真空條件下將其濾過制備的。6.7．凝膠成像電泳完成后，立即將凝膠從電泳槽中移出進(jìn)行固定。仔細(xì)地將凝膠盒上方的頂端平板取出，使凝膠粘在底端平板上。把粘有凝膠的平板放入染色器皿中，每個這樣的器皿可以放12個凝膠。將凝膠完全浸泡于固定溶液中40％(V/V)乙醇(BDH28719)、10％(V/V)乙酸(BDH100016X)、50％(V/V)水(MilliQ-Miliipore)，固定過程中使固定液始終繞凝膠流動。固定過夜后，從固定器皿中去除固定液，將凝膠浸泡于7.5％(V/V)乙酸、0.05％(W/V)SDS、92.5％(V/V)水中預(yù)染30分鐘。瀝干預(yù)染溶液后，將凝膠完全浸泡于染色溶液中4小時(shí)。熒光染料溶液是根據(jù)SyproRed(分子探針，Eugene公司，俄勒崗)的使用說明將其稀釋，然后用0.4μm濾膜在抽真空條件下將其濾過制備的。使用Storm掃描儀(分子動力學(xué)，Sunnyvale，加利福尼亞)按照其使用說明(見Storm用戶手冊，1995,4.0版本，零件號149-355，此處完整引入用作參考)對經(jīng)熒光染色的凝膠進(jìn)行成像，可以得到一個計(jì)算機(jī)可讀的結(jié)果，方法作了如下的修改凝膠從染液取出后，輕輕用水清洗，然后于Storm掃描儀上成像，成像條件PMT設(shè)置1000V紅色熒光模式，分辨率為200μm。既然凝膠剛性的結(jié)合于玻璃板上，因而在成像過程中凝膠就可以和掃描儀床體接觸。為了避免凝膠和掃描儀床體之間不一致的接觸造成的干擾，可以在凝膠下面加水膜，并小心不要產(chǎn)生氣泡。而且，凝膠應(yīng)當(dāng)放于由兩個熒光按鈕形成的框架中，這兩個按鈕與凝膠一起成像，可以提供用于鑒定在凝膠中發(fā)現(xiàn)的其它特征的X、Y參照坐標(biāo)。在機(jī)械手切膠器上提供有一個匹配框架，可以用于對凝膠進(jìn)行正確的排列比較。成像完成后，將凝膠密封于含有少量染色溶液的聚乙烯袋中，4℃保存。6.8．?dāng)?shù)據(jù)的數(shù)字化分析使用美國申請第08/980574，5.4、5.5節(jié)(此處引入用作參考)所述方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。下面進(jìn)行更詳細(xì)地描述。6.8.1檢測結(jié)果的計(jì)算機(jī)分析掃描儀的結(jié)果首先使用MELANIEⅡ2DPAGE分析軟件(版本2.2,1997，伯樂實(shí)驗(yàn)室，大力神，加利福尼亞，Cat.#170-7566)進(jìn)行處理，以自動發(fā)現(xiàn)參考點(diǎn)M1和M2；自動修剪圖像(也就是去除凝膠邊界以外的掃描區(qū)產(chǎn)生的圖像，例如參考圖框)；根據(jù)污染去除人為假象；發(fā)現(xiàn)特征并對其進(jìn)行定量；以GIF文件格式產(chǎn)生圖像文件。使用以下參數(shù)檢測特征平滑度=2調(diào)和量算子閾50部分閾1飽和度=100峰態(tài)峭度=0最小周長=106.9pI和MW的測定圖像要進(jìn)行評定以判斷是否可以舍棄，舍棄標(biāo)準(zhǔn)是圖像存在明顯的異常、或有過高或過低的上樣量或總體圖像強(qiáng)度、或分辨率很低、或平行樣品十分不同。如果平行樣品中有一個圖像需要舍棄，那么另一個也必須舍棄，不管其圖像質(zhì)量如何。舍棄的樣品要安排進(jìn)行重新分析。使用界點(diǎn)鑒定來測定在凝膠中發(fā)現(xiàn)的特征的等電點(diǎn)和分子量。這些方法包括在任何給定的生物樣品中都預(yù)計(jì)可見的特定蛋白質(zhì)的鑒定。由于這些共同蛋白質(zhì)在不同的樣品中表現(xiàn)出相同的等電點(diǎn)和分子量，因而它們可以用作標(biāo)準(zhǔn)；這一方法同樣適用于任何可能的凝膠變化或異常。由正常血清凝膠的數(shù)據(jù)集，我們可以人為選出一個凝膠作為第一原版膠。然后通過比較此第一原版膠中發(fā)現(xiàn)的特征與在先正常人血清雙向電泳鑒定出的特征的差異，可以對界點(diǎn)特征進(jìn)行鑒定(參見Bjellqvist等人，1993，電泳，14:1357-1365，此處完整引入用作參考)。在第一原版膠中鑒定出十四個界點(diǎn)特征，標(biāo)記為PL1-PL12和PL15-PL16。這些界點(diǎn)特征鑒定顯示于圖1，其pI和/或MW值列于表Ⅻ。表Ⅻ用于本研究的界點(diǎn)特征在數(shù)據(jù)集中的每一個凝膠中鑒定盡可能多的這些界點(diǎn)。根據(jù)最靠近的兩條已經(jīng)分配pI值的界點(diǎn)，使用內(nèi)插法/外推法(使用MELANIEⅡ軟件)為原版膠中所有特征分配一個pI值；根據(jù)最靠近的兩條已經(jīng)分配MW值的界點(diǎn)，使用內(nèi)插法/外推法(使用MELANIEⅡ軟件)為原版膠中所有特征分配一個MW值。還用已知為其分子簇序號(MCI)的獨(dú)有性數(shù)字標(biāo)記這些特征。第二原版膠選擇RA血清膠和RA滑液膠。使用MELANEⅡ軟件提供的運(yùn)算法則(MELANIEⅡ2DPAGE(版本2.2)使用說明(Melanie集團(tuán)，日內(nèi)瓦，瑞士)中A節(jié)第8-10頁，對這些凝膠中的特征與原版膠中的共同特征進(jìn)行配對。能夠配對的特征就可以與相應(yīng)的MCI聯(lián)系起來，因而可以獲得相關(guān)pI和MW值。這些第二原版膠中不能配對的特征可以通過使用MelanieⅡ軟件參考界點(diǎn)的pI和MW，由線性內(nèi)插/外推法為其分配pI和MW。然后為這些特征產(chǎn)生一個MCI中的額外的獨(dú)特入口值。6.9.1圖形的構(gòu)建數(shù)據(jù)集中所有的凝膠現(xiàn)在都和第一和第二原版膠相匹配，配對的特征都在分子簇索引(MCI)中與相應(yīng)的入口值聯(lián)系起來。通過界點(diǎn)將多份膠排列比較，進(jìn)行匹配過程以找到平行凝膠中成對的相同點(diǎn)。它可以提高分析的準(zhǔn)確度，以保證隨后的pI和MW測量的準(zhǔn)確，因?yàn)榕鋵Φ陌唿c(diǎn)顯示分離的重復(fù)性，同時(shí)可以去除人為假象。測定每一個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的強(qiáng)度并保存。每一個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)被分配一個鑒定碼并與原版膠中的斑點(diǎn)匹配。產(chǎn)生了對于代表一個血清或滑液的樣品的每一個平行組的分析這一方面的最終結(jié)果。對于每一個鑒定斑點(diǎn)的數(shù)字化圖形包含1)唯一的一個給定鑒定碼；2)X,Y坐標(biāo)；3)等電點(diǎn)；4)分子量；5)信號值；6)每一個前述測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差；以及7)與該斑點(diǎn)匹配的原版膠上斑點(diǎn)的MCI的指針。借助實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)(LIMS)，這種圖形可以回溯到產(chǎn)生該圖的實(shí)際儲存的凝膠上，因此，由計(jì)算機(jī)分析凝膠圖形數(shù)據(jù)庫所鑒定的蛋白質(zhì)是可以檢索的。同時(shí)，LIMS可以允許將圖形回溯到原始樣品或患者。6.9.2樣品間的交叉匹配一旦形成了圖形，分析就指向目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇。圖形中的每一個有意義的特征都被賦予一個索引，“分子簇索引(MCI)”，它能夠鑒定所有凝膠中的特征，并且可作為前述特征的(1)-(7)參數(shù)的指針。對于每一種樣品類型(也就是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血清和滑液)，可以由原版膠產(chǎn)生一個分子簇表。相同類型的所有其它樣品的凝膠都可以和相關(guān)的第一和第二原版膠進(jìn)行匹配。然后，每一個樣品的數(shù)字化圖形通過增加(已匹配的特征)分配給在原版膠中的特征相應(yīng)的MCI來加以注釋。6.9.3圖形的差別分析在每一個樣品組中(血清或滑液)，分析圖形以鑒定和選擇在至少50％以上的圖形中存在的那些特征。然后將這些選擇的特征組成一個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液特征組和一個血清特征組。然后比較每一個特征組中的匹配特征，來鑒定在血清和滑液間平均強(qiáng)度至少有2倍差異的那些特征。然后在未患有RA的患者滑液與血清樣品中檢測相同特征。與在RA滑液樣品中相比在RA血清中不同地存在的特征，但是與非RA滑液樣品相比在非RA血清中不是不同地存在的特征被鑒定為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)。6.10所選蛋白質(zhì)的回收與分析RADF中的蛋白質(zhì)可以被機(jī)械手切割，并被加工形成胰蛋白酶切肽。這些肽的部分氨基酸序列可以通過質(zhì)譜分析使用從頭測序加以測定。6.11結(jié)果這些初始實(shí)驗(yàn)鑒定出相對于RA患者血清，在滑液中降低的10個特征和增加的12個特征。相對于RA患者的血清而言，這些RADF的每一個僅僅在滑液中不同地存在，但是相對于非RA受試者血清，在其滑液中不是不同地存在的。這些RADF中不同存在的RPI的部分氨基酸序列已檢測。公用數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)檢索發(fā)現(xiàn)，21個這類部分測序的蛋白質(zhì)為本領(lǐng)域周知，5個在任何檢測的公共數(shù)據(jù)庫中沒有描述。表Ⅷ顯示幾個RPI為同一蛋白質(zhì)的同種型。例如RPI-1和RPI-11是轉(zhuǎn)鐵蛋白的同種型。這些同種型據(jù)信來源于翻譯后加工過程(例如糖基化、磷酸化、乙酰化和最小蛋白質(zhì)水解)。7．實(shí)施例來自患有或未患有RA的患者的血清的蛋白質(zhì)通過等電聚焦及隨后的SDS-PAGE分離并比較來自患有及未患有RA的患者血清的蛋白質(zhì)。如實(shí)施例6所述進(jìn)行分析，除了在實(shí)施例7中的比較是在患有RA的患者與未患有RA的患者之間進(jìn)行。7.1結(jié)果這些初始實(shí)驗(yàn)鑒定出相對于非RA患者血清，在RA患者血清中降低的9個特征和增加的12個特征。這些RADF的詳細(xì)情況見表Ⅲ和Ⅳ。這些RADF的每一個相對于非RA患者的血清在RA血清中不同地存在。這些RADF中不同存在的RPI的部分氨基酸序列已檢測。公用數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)檢索發(fā)現(xiàn)，17個這類部分測序的蛋白質(zhì)為本領(lǐng)域周知，4個在任何檢測的公共數(shù)據(jù)庫中沒有描述。表Ⅺ顯示幾個RPI為同一蛋白質(zhì)的同種型。例如RPI-44和RPI-45是轉(zhuǎn)鐵蛋白的同種型。這些同種型據(jù)信來源于翻譯后加工過程(例如糖基化、磷酸化、乙?；妥钚〉鞍踪|(zhì)水解)。此外，表Ⅷ-Ⅺ顯示，RPI-2、RPI-6、RPI-7、RPI-14、RPI-23、RPI-25、RPI-31和RPI-37代表免疫球蛋白的同種型；RPI-2尤其代表IgG輕鏈的同種型。換言之，優(yōu)選技術(shù)已用于鑒定可特異性與RA結(jié)合并可能反映與該疾病相關(guān)的寡克隆體液免疫反應(yīng)的免疫球蛋白同種型的確定亞型。這類免疫球蛋白同種型(及其片段、針對它的抗體等)可用于診斷、預(yù)后、治療性監(jiān)測及藥物開發(fā)。本發(fā)明不局限于特定的列舉的實(shí)施方案，這些實(shí)施方案意在將發(fā)明的單一方面表述清楚。實(shí)際上，根據(jù)前面描述，對本發(fā)明進(jìn)行除此處所列出的內(nèi)容以外的修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改都落在所附帶的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。此處所引用的出版物都以完整形式引入用作參考。序列表<110>OxfordGlycoSciences(UK)LtdParekh,RajeshBPatel,ThakorbhaiPTownsend,RobertR<120>用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的方法和組合物<130>PWC/P20924WO<140>PCT/GB99/00763<141>1999-03-15<150>GB9805477.8<151>1998-03-13<160>227<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>Homosapiens<400>1AspGlnTyrGluLeuLeuCysLeuAspAsnThrArg1510<210>2<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>2GluGlyTyrTyrGlyTyrThrGlyAlaPheArg1510<210>3<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>3AspTyrGluLeuLeuCysLeuAspGlyThrArg1510<210>4<211>5<212>PRT<213>Homosapiens<400>4CysGlnSerPheArg15<210>5<211>5<212>PRT<213>Homosapiens<400>5IleAsnHisCysArg15<210>6<211>8<212>PRT<213>Homosapiens<400>6SerCysHisThrGlyLeuGlyArg15<210>7<211>8<212>PRT<213>Homosapiens<400>7SerCysHisThrAlaValGlyArg15<210>8<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>8AlaProAsnHisAlaValValThrArg15<210>9<211>8<212>PRT<213>Homosapiens<400>9AlaSerTyrLeuAspCysIleArg15<210>10<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>10TrpCysAlaLeuSerHisHisGluArg15<210>11<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<400>11AspSerGlyPheGlnMetAsnGlnLeuArg1510<210>12<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>12SerAlaSerAspLeuThrTrpAspAsnLeuLys1510<210>13<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>13TrpCysAlaValSerGluHisGluAlaThrLys1510<210>14<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>14LysAspSerGlyPheGlnMetAsnGlnLeuArg1510<210>15<211>12<212>PRT<213>Homosapiens<400>15MetTyrLeuGlyTyrGluTyrValThrAlaIleArg1510<210>16<211>13<212>PRT<213>Homosapiens<400>16CysSerThrSerSerLeuLeuGluAlaCysThrPheArg1510<210>17<211>14<212>PRT<213>Homosapiens<400>17PheAspGluPhePheSerGluGlyCysAlaProGlySerLys1510<210>18<211>13<212>PRT<213>Homosapiens<400>18LysProValGluGluTyrAlaAsnCysHisLeuAlaArg1510<210>19<211>14<212>PRT<213>Homosapiens<400>19GluAspProGlnThrPheTyrTyrAlaValAlaValValLys1510<210>20<211>15<212>PRT<213>Homo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lnMetAsnGlnLeuArg1510<210>200<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>200CysAspGluTrpSerValAsnSerValGlyLys1510<210>201<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>201CysThrSerThrGlyTrpIleProAlaProArg1510<210>202<211>16<212>PRT<213>Homosapiens<400>202SerCysAspAsnProTyrIleProAsnGlyAspTyrSerProLeuArg151015<210>203<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>203GluTyrHisPheGlyGlnAlaValArg15<210>204<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<400>204SerLeuGlyAsnValIleMetValCysArg1510<210>205<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<400>205ThrGlyAspGluIleThrTyrGlnCysArg1510<210>206<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>206LysGlyGluTrpValAlaLeuAsnProLeuArg1510<210>207<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>207GlyGluTrpValAlaLeuAsnProLeuArgLys1510<210>208<211>14<212>PRT<213>Homosapiens<400>208ValGlyTyrValSerGlyTrpGlyGlnSerAspAsnPheLys1510<210>209<211>7<212>PRT<213>Homosapiens<400>209AsnTyrAlaGluValGlyArg15<210>210<211>16<212>PRT<213>Homosapiens<400>210ValValLeuHisProAsnTyrHisGlnValAspIleGlyLeuIleLys151015<210>211<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<400>211TrpLeuGlnGlySerGlnGluLeuProArg1510<210>212<211>17<212>PRT<213>Homosapiens<400>212GlnGluProSerGlnGlyThrThrThrPheAlaValThrSerIleLeu151015Arg<210>213<211>7<212>PRT<213>Homosapiens<400>213TyrLeuThrTrpAlaSerArg15<210>214<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>214SerAlaValGlnGlyProProGluArg15<210>215<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>215GluIleMetGluAsnTyrAsnIleAlaLeuArg1510<210>216<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>216IleAspValHisLeuValProAspArg15<210>217<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>217GluPheAspHisAsnSerAsnIleArg15<210>218<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<400>218ArgProTyrPheProValAlaValGlyLys1510<210>219<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<400>219SetLeuGlyAsnValIleMetValCysArg1510<210>220<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>220SerCysAspIleProValPheMetAsnAlaArg1510<210>221<211>18<212>PRT<213>Homosapiens<400>221ThrAspCysLeuSerLeuProSerPheGluAsnAlaIleProMetGly151015GluLys<210>222<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>222GluAspIlePheMetGluThrLeuLys15<210>223<211>9<212>PRT<213>Homosapiens<400>223GluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArg15<210>224<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>224LeuAspGlyLysPheSerValValTyrAlaLys1510<210>225<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1,4,16,19,22,25)<223>n是a或g或c或t<220><223>人工序列描述探針<400>225nckncckttrtgytcnadngcngcnac27<210>226<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>miscfeature<222>(1,4,10,13,19,22)<223>n是a或g或c或t<220><223>人工序列描述探針<400>226nckngcrtgnggngcrtcnadnagrtt27<210>227<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>miscfeature<222>(1,4,10,13,16)<223>n是a或g或c或t<220><223>人工序列描述探針<400>227nswnadrtcngcnccnswrtc2權(quán)利要求1．一種用于受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選、診斷或預(yù)后的方法，或者用于監(jiān)測向受試者施用的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果的方法，包括(a)用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，以產(chǎn)生特征的雙向圖譜；(b)對于其相對豐度與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在與否相關(guān)的至少一個所選特征，將所選特征中的每一個特征在樣品中的豐度與在一個或多個無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者血清或血漿中所選特征的豐度相比較，其中，樣品中所選一個或多個特征的相對豐度表明受試者中存在或不存在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。2．一種用于受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選、診斷或預(yù)后的方法，或者用于監(jiān)測向受試者施用的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果的方法，包括(a)用雙向電泳分析受試者滑液樣品，以產(chǎn)生特征的雙向圖譜；(b)用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，以產(chǎn)生特征的雙向圖譜；(c)對于其相對豐度與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在與否相關(guān)的至少一個所選特征，將所選特征中的每一個特征在滑液樣品中的豐度與在血清或血漿樣品中所選特征的豐度相比較，其中，滑液樣品中所選一個或多個特征的相對豐度與血清或血漿樣品相比，表明受試者中存在或不存在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。3．一種用于受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選、診斷或預(yù)后的方法，或者用于監(jiān)測向受試者施用的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果的方法，包括(a)用雙向電泳分析受試者滑液、血清或血漿樣品，以產(chǎn)生特征的雙向圖譜；(b)對于其強(qiáng)度與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在與否相關(guān)的至少一個所選特征，將所選特征中的每一個特征在樣品中的強(qiáng)度與在受試者滑液、血清或血漿中的一個或多個所選表達(dá)參考特征(ERF)的強(qiáng)度相比較，其中，相對于所述一個或多個ERF之樣品中所選一個或多個特征的強(qiáng)度表明受試者中存在或不存在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。4．一種用于受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的篩選、診斷或預(yù)后的方法，或者用于監(jiān)測向受試者施用的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果的方法，包括(a)用雙向電泳分析受試者滑液、血清或血漿樣品，以根據(jù)等電點(diǎn)和電泳遷移率分離多種蛋白質(zhì)；和(b)定量檢測至少一種下列類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)RADF-1,RADF-2,RADF-3,RADF-4,RADF-5,RADF-6,RADF-7,RADF-8,RADF-9,RADF-10,RADF-11,RADF-12,RADF-13,RADF-14,RADF-15,RADF-16,RADF-17,RADF-18,RADF-19,RADF-20,RADF-21,RADF-22,RADF-23,RADF-24,RADF-25,RADF-26,RADF-27,RADF-28,RADF-29,RADF-30,RADF-31,RADF-32,RADF-33,RADF-34,RADF-35,RADF-36,RADF-37,RADF-38,RADF-39和RADF-40。5．權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中(a)步驟包括等電聚焦后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。6．一種用于受試者中類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎的篩選、診斷或預(yù)后的方法，或用于監(jiān)測向受試者施用的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果的方法，包括(a)在受試者滑液、血清或血漿樣品中，定量檢測至少一種下列類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)RPI-1,RPI-2,RPI-3,RPI-4,RPI-5,RPI-6,RPI-8,RPI-9,RPI-10,RPI-11,RPI-12,RPI-13,RPI-14,RPI-15,RPI-16,RPI-17,RPI-18,RPI-19,RPI-20,RPI-21或RPI-22,RADF-23,RADF-24,RADF-25,RADF-26,RADF-27,RADF-28,RADF-29,RADF-30,RADF-31,RADF-32,RADF-33,RADF-34,RADF-35,RADF-36,RADF-37和RADF-38。7．權(quán)利要求6的方法，其中定量檢測的步驟包括檢測至少一個樣品等份，所述檢測步驟包括(a)將針對預(yù)選RPI的免疫特異性抗體與樣品等份接觸；且(b)檢測是否樣品等份中至少一種成分與抗體之間發(fā)生結(jié)合。8．權(quán)利要求7的方法，其中抗體為單克隆抗體。9．權(quán)利要求7的方法，其中定量檢測步驟包括用多重抗體檢測多個樣品等份。10．權(quán)利要求9的方法，其中抗體為單克隆抗體。11．一種包括下列已分離的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)之一的制品RPI-1,RPI-2,RPI-3,RPI-4,RPI-5,RPI-6,RPI-8,RPI-9,RPI-10,RPI-11,RPI-12,RPI-13,RPI-14,RPI-15,RPI-16,RPI-17,RPI-18,RPI-19,RPI-20,RPI-21或RPI-22,RPI-23,RPI-24,RPI-25,RPI-26,RPI-27,RPI-28,RPI-29,RPI-30,RPI-31,RPI-32,RPI-33,RPI-34,RPI-35,RPI-36,RPI-37或RPI-38。12．一種包含權(quán)利要求11的制品的試劑盒。14．一種包含多種權(quán)利要求11的制品的試劑盒。15．一種包含已分離的人類蛋白質(zhì)的制品，所述蛋白質(zhì)包含具有VAAIEHFGR或VAALEHFGR序列之一的肽。16．權(quán)利要求15的制品，其中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)約為5.98，表觀分子量(MW)約為52,631。17．權(quán)利要求16的制品，其中pI在5.98的10％變動范圍以內(nèi)，分子量在52,631的10％變動范圍以內(nèi)。18．權(quán)利要求17的制品，其中pI在5.98的5％變動范圍以內(nèi)，MW在52,631的5％變動范圍以內(nèi)。19．權(quán)利要求18的制品，其中pI在5.98的1％變動范圍以內(nèi)，MW在52,631的1％變動范圍以內(nèi)。20．一種包含已分離的人類蛋白質(zhì)的制品，所述蛋白質(zhì)包含帶有下列序列中的一個的肽DSGADIS或DSGADLS。21．權(quán)利要求20的制品，其中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)約為5.36，表觀分子量(MW)約為24,124。22．權(quán)利要求21的制品，其中pI在5.36的10％變動范圍以內(nèi)，MW在24,124的10％變動范圍以內(nèi)。23．權(quán)利要求22的制品，其中pI在5.36的5％變動范圍以內(nèi)，MW在24,124的5％變動范圍以內(nèi)。24．權(quán)利要求23的制品，其中pI在5.36的1％變動范圍以內(nèi)，MW在24,124的1％變動范圍以內(nèi)。25．一種包含已分離的人類蛋白質(zhì)的制品，所述蛋白質(zhì)包含帶有下列序列中的一個的肽NVIDAPIHAR或NVLDAPHAR。26．權(quán)利要求25的制品，其中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)約為5.96，表觀分子量(MW)約為158,868。27．權(quán)利要求26的制品，其中pI在5.96的10％變動范圍以內(nèi)，MW在158,868的10％變動范圍以內(nèi)。28．權(quán)利要求27的制品，其中pI在5.96的5％變動范圍以內(nèi)，MW在158,868的5％變動范圍以內(nèi)。29．權(quán)利要求28的制品，其中pI在5.96的1％變動范圍以內(nèi)，MW在158,868的1％變動范圍以內(nèi)。30．一種能夠免疫特異性結(jié)合下列類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)中的一種的抗體RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9、RPI-10、RPI-11、RPI-12、RPI-13、RPI-14、PPI-15、RPI-16、RPI-17、RPI-18、RPI-19、RPI-20、RPI-21或RPI-22,PPI-23,RPI-24,RPI-25,RPI-26,RPI-27,RPI-28,RPI-29,RPI-30,RPI-31,RPI-32,RPI-33,RPI-34,RPI-35,RPI-36,RPI-37和RPI-38。31．一種包含權(quán)利要求30的抗體的試劑盒。32．一種包含多種權(quán)利要求30的抗體的試劑盒。33．一種藥物組合物，包含治療有效量的一種或多種下列分離的類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)RPI-12、RPI-13、RPI-14、PPI-15、RPI-16、RPI-17、RPI-18、RPI-19、RPI-20、RPI-21、RPI-22、RPI-23和RPI-24。34．一種藥物組合物，包含治療有效量的可免疫特異性結(jié)合一種下列分離的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(PPI)的抗體RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9、RPI-10、或RPI-11。35．一種藥物組合物，包含治療有效量的一種抗體的片段或衍生物以及藥學(xué)可接受的載體，其中抗體可免疫特異性結(jié)合一種下列分離的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9、RPI-10、或RPI-11，所述片段或衍生物含有抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。36．一種治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向需要這類治療或預(yù)防的受試者施用治療有效量的編碼一種下列類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)的核酸RPI-12、RPI-13、RPI-14、RPI-15、RPI-16、RPI-18、RPI-19、RPI-21、RPI-22、RPI-23或RPI-24。37．一種治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向需要這類治療或預(yù)防的受試者施用治療有效量的抑制一種或多種下列類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)的核酸RPI-1、RPI-2、RPI-3、RPI-4、RPI-5、RPI-6、RPI-8、RPI-9或RPI-11。38．權(quán)利要求37的方法，其中核酸是RPI反義核酸或核酶。39．權(quán)利要求4定義的一個或多個RADF在受試者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之篩選、診斷或預(yù)后中的用途，或在監(jiān)測施用于受試者的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果中的用途。40．權(quán)利要求6定義的一個或多個RPI在受試者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之篩選、診斷或預(yù)后中的用途，或在監(jiān)測施用于受試者的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療效果中的用途。41．權(quán)利要求6定義的至少一種免疫特異性針對RPI的抗體在受試者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之篩選、診斷或預(yù)后中的用途，或在監(jiān)測施用于受試者的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療效果中的用途。42．權(quán)利要求41的用途，其中至少一種抗體是單克隆抗體。43．權(quán)利要求15-29中任一項(xiàng)定義的蛋白質(zhì)在受試者類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之篩選、診斷或預(yù)后中的用途，或在監(jiān)測施用于受試者的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物或治療的效果中的用途。44．權(quán)利要求33中定義的至少一種RPI在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。45．權(quán)利要求34中定義的至少一種抗體在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。46．權(quán)利要求35中定義的一種抗體之片段或衍生物在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。47．權(quán)利要求36中定義的核酸在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。48．權(quán)利要求37中定義的核酸在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之篩選、診斷、預(yù)后、和用于監(jiān)測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療效果和藥物開發(fā)的方法和組合物。描述了可以使用雙向電泳分析血清或血漿來測定的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷特征(RADF)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在滑液、血清或血漿中可檢出的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷蛋白質(zhì)同種型(RPI)、包含已分離的RPI的制劑、針對RPI的免疫特異性抗體,以及包含前述的試劑盒。文檔編號A61K39/00GK1300367SQ9980600公開日2001年6月20日申請日期1999年3月15日優(yōu)先權(quán)日1998年3月13日發(fā)明者R·B·佩雷克,T·P·帕泰爾,R·R·湯森申請人:牛津糖科學(xué)(英國)有限公司