專利名稱：抗炎滴眼劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療以前列腺素為炎癥介質(zhì)的眼炎癥疾病的治療劑，更具體地說，涉及用于例如預(yù)防和治療白內(nèi)障手術(shù)后的前眼炎的滴眼劑。
背景技術(shù)：
非甾體抗炎劑例如那些含有雙氯芬酸鈉的抗炎劑，其抗炎作用原理是抑制炎癥介質(zhì)前列腺素的生物合成，這些抗炎劑不但通過口服給藥用于治療炎癥疾病，而且可以通過局部用藥治療許多炎癥。另外，這些抗炎劑還以局部給藥的滴眼劑形式被廣泛地用于治療眼炎，特別是白內(nèi)障手術(shù)后的前眼炎以及手術(shù)期間和手術(shù)后的并發(fā)癥。
另一方面，這樣的非甾體抗炎滴眼劑具有非常優(yōu)秀的抗炎作用，但臨床上指出副作用例如角膜上皮疾病的發(fā)生率約1.6％(參見若素制醫(yī)藥品附加文書，1996年)。換句話說，需要開發(fā)一種非甾體類抗炎滴眼劑，其不具有高發(fā)生率的角膜上皮疾病副作用。
最近的研究進(jìn)展結(jié)果表明非甾體抗炎劑的作用部位是抑制兩種酶，即環(huán)氧合酶-1(此后稱“COX-1”)和環(huán)氧合酶-2(此后稱“COX-2”)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到COX-1可以保護(hù)細(xì)胞，而COX-2是參與炎癥的酶。因此，需要開發(fā)一種抗炎劑，所述抗炎劑能夠選擇性抑制COX-2，并引起細(xì)胞障礙的可能性低。從上述討論的觀點(diǎn)出發(fā)，已經(jīng)詳細(xì)研究了全身給藥抗炎試劑具有胃潰瘍的副作用。結(jié)果，已經(jīng)完全闡明了COX-1和COX-2的作用，并且還證明COX-1的抑制也與胃潰瘍的發(fā)展有關(guān)。
如上所述，雖已闡明了這些抗炎劑的胃潰瘍作用機(jī)理，但對(duì)于角膜上皮疾病是否由同胃潰瘍相同的作用機(jī)理引起仍然不清楚。因此需要開發(fā)一種藥物，其能夠?qū)OX-1以及COX-2在角膜上皮疾病和眼炎癥中的作用明顯區(qū)分。Masferrer,JL等(Surv.Ophthalmo1.,1997,41(增刊2):S35-S40)報(bào)道用COX-2抑制劑可以抑制前眼炎，但該文完全沒有公開有關(guān)角膜上皮疾病的內(nèi)容。三宅(臨床眼科醫(yī)報(bào)1997,51(11):190-191)認(rèn)為應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑可以緩解角膜上皮疾病，但其絲毫沒有公開關(guān)于解決該疾病的方式。
發(fā)明的公開本發(fā)明者在作為滴眼劑的非甾體抗炎藥中應(yīng)用了選擇性抑制COX-2的藥物，本發(fā)明者們研究了其對(duì)前眼炎癥和眼細(xì)胞疾病的作用從而完成了本發(fā)明。
更具體地說，本發(fā)明涉及含有高COX-2選擇性藥物作為有效成分的抗炎滴眼劑。通過努力觀察了具有COX-1和COX-2選擇性的化合物對(duì)于體內(nèi)抗炎作用和體外損害細(xì)胞能力的作用，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)含有高COX-2選擇性藥物作為有效成分的抗炎滴眼劑在抗炎作用和緩解細(xì)胞損害作用方面是非常優(yōu)秀的。因此，本發(fā)明的目的是提供一種抗炎劑，其能夠緩解細(xì)胞例如角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞的損害，還提供一種滴眼劑，其較少引起角膜上皮細(xì)胞的損傷。
附圖的簡要描述

圖1顯示依托度酸對(duì)由前房穿刺引起的高PGE2含量的作用。
圖2顯示依托度酸對(duì)由前房穿刺引起的高蛋白含量的作用。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明滴眼劑中所用的高COX-2選擇性非甾體抗炎藥的優(yōu)選實(shí)例為依托度酸(1,8-二乙基-1,3,4,9-四氫吡喃并[3,4-b]吲哚-1-乙酸)、N-(2-(環(huán)己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺(NS-398)和美洛昔康(4-羥基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1,2-苯并噻嗪-3-甲酰胺1,1-二氧化物)。
本發(fā)明的滴眼劑需要無菌的藥物制劑，含有依托度酸或NS-398的制劑可以含有作為增溶劑的蓖麻油、芝麻油或其它表面活性劑，這些有效成分可以制成軟膏劑。
美洛昔康還是一種具有高COX-2選擇性的藥物，其特征在于同前面的藥相比，其具有高水溶性。因此，該藥可以在水性滴眼劑中應(yīng)用，并類似地可以制成軟膏劑。
對(duì)于用于治療炎癥的這樣的藥物，在水性藥物制劑中，美洛昔康的優(yōu)選濃度為0.1-1％，在含有例如依托度酸或N-(2-(環(huán)己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺的油性藥物制劑中，藥物的優(yōu)選濃度為0.5-5％。通過炎癥模型試驗(yàn)驗(yàn)證了這些藥物的效果。
關(guān)于損害細(xì)胞的可能性，任何具有COX-2選擇性的藥物均顯示損害角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞的低可能性。具體地說，當(dāng)長時(shí)間接觸藥物時(shí)，非常明顯這些藥物幾乎不引起角膜上皮細(xì)胞的損害。
如上所述，本發(fā)明首次提供了幾乎不損害細(xì)胞例如角膜上皮細(xì)胞或結(jié)膜細(xì)胞的滴眼劑，具體地說，本發(fā)明首次提供含有選擇性COX-2抑制劑的滴眼劑，其顯示高的抗炎效果并且很少造成角膜上皮細(xì)胞的損傷。
以下列實(shí)施例和試驗(yàn)例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1依托度酸 5g對(duì)羥基苯甲酸丙酯 0.01g對(duì)羥基苯甲酸甲酯 0.05g蓖麻油至100ml把依脫度酸、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸甲酯加入到80ml蓖麻油中，使其溶解于蓖麻油后，再添加蓖麻油至總體積為100ml，該溶液經(jīng)滅菌過濾后得到本發(fā)明的滴眼劑。實(shí)施例2N-(2-(環(huán)己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺5g對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.01g對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.05g蓖麻油 至100ml把N-(2-(環(huán)己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸甲酯加入到80ml蓖麻油中，使其溶解于蓖麻油后，再添加蓖麻油至總體積為100ml，該溶液經(jīng)過濾消毒后得到本發(fā)明的滴眼劑。實(shí)施例3美洛昔康0.5g吐溫-80 0.5g甲基纖維素 0.5g硼酸0.1gEDTA0.005g苯扎氯銨0.005g0.1N HCl/0.1N NaOH (把pH調(diào)至7.2所需要的量)純化水 至100ml把美洛昔康、吐溫-80(聚山梨醇酯-80)、甲基纖維素、硼酸、EDTA和苯扎氯銨加入到80ml純化水中，使這些組份溶解于水。加入0.1NHCl或0.1N NaOH把所得溶液的pH調(diào)至7.2，再把純化水加入到該溶液中使其總體積為100ml。經(jīng)滅菌過濾所得溶液，得到本發(fā)明的滴眼劑。
本發(fā)明滴眼劑的使用方法和用量可以根據(jù)例如患者的癥狀和年齡等而變化，但一般來說，該滴眼劑滴入到眼中的劑量為1-2滴，每日1-6次。試驗(yàn)例滴眼劑對(duì)白兔前房炎癥的作用在該試驗(yàn)例中，應(yīng)用體重1.8-2.4kg的日本白兔(日本醫(yī)科學(xué)動(dòng)物資材研究所)，將其分組，每組含動(dòng)物6-7只。
通過耳靜脈把250U/kg肝素(武田藥品工業(yè))給以白兔，然后把約60μl測(cè)試物質(zhì)滴入雙眼。把所述物質(zhì)滴入雙眼45分鐘后，用Benoxil滴眼劑(參天制藥)局部麻醉這些動(dòng)物，然后用27G注射針管收集整個(gè)前房液。該前房液定義為初級(jí)眼房水，用過量戊巴比妥鈉麻醉來處死這些白兔，再次收集眼房水。該前房液被稱為次級(jí)眼房水。
測(cè)定在所收集的次級(jí)眼房水中的蛋白質(zhì)含量和前列腺素E2(此后稱“PGE2”)濃度，將其作為炎癥指標(biāo)。把100μl眼房水用Bond Elute C18柱預(yù)處理后，用Biotrack PGE2EIA系統(tǒng)(Amersham公司)測(cè)定PGE2的濃度。另外，按照Lowry方法，應(yīng)用牛血清蛋白(來自NaKarai有限公司)作為參照蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
把作為測(cè)試物質(zhì)的依托度酸溶解于日本藥典品蓖麻油中，使其濃度為0.5和5％。用生理鹽水稀釋美洛昔康后使用。
從圖1和圖2中所示的數(shù)據(jù)可以看出，在眼房水中，依托度酸抑制由前房穿刺引起的蛋白質(zhì)含量和PGE2含量的升高。
另外，0.1-1.0％濃度范圍的美洛昔康抑制蛋白質(zhì)和PGE2含量的升高，同其它藥相比，其抑制作用是顯著的。表1經(jīng)前房穿刺后，美洛昔康對(duì)蛋白質(zhì)含量和PGE2含量升高的作用

表中的各值為11-12只眼的均值。*,**,***:P＜0.05,0.01,0,001:Dunnett檢驗(yàn)試驗(yàn)例2藥物對(duì)由LPS引發(fā)的眼色素層炎的影響在此試驗(yàn)例中，應(yīng)用體重為1.7-2.4kg的日本雄性白兔組，其中各組由12-16只眼組成。
通過耳靜脈以1.25μg/kg的劑量把由大腸桿菌E.coli得到的脂多糖(LPS)(0.55:B5型，Sigma公司)給以白兔引發(fā)眼色素層炎。給以LPS 4小時(shí)后，用過量戊巴比妥鈉(東京化成)麻醉處死白兔，收集前房液。
按照實(shí)施例1同樣的方法，測(cè)定所收集的眼房水中存在的PGE2濃度和蛋白質(zhì)含量。
另外，是在給以LPS1小時(shí)前，以約60μL/眼的劑量把各個(gè)測(cè)試物質(zhì)滴入這些動(dòng)物的雙眼。
把測(cè)試物質(zhì)NS-398溶解或懸浮在日本藥典品蓖麻油中，使其濃度為0.5％和5％，用生理鹽水稀釋美洛昔康后使用。
從下列表2中所示數(shù)據(jù)明顯可以看出，NS-398明顯抑制PGE2含量的升高。另外，從表3中所示數(shù)據(jù)可以明顯看出，濃度范圍0.1-1％的美洛昔康抑制PGE2含量和蛋白質(zhì)含量的升高，因此，發(fā)現(xiàn)其有良好的抗炎作用。
表2:NS-398對(duì)由LPS引發(fā)的眼色素層炎的作用

表中的各值為12-16只眼的均值。#,##,###:P＜0.05,0.01,0,001:Dunnett檢驗(yàn)表3美洛昔康對(duì)LPS引發(fā)的眼色素層炎的作用

表中的各值為12只眼的均值。**,***:P＜0.01,0.001:Dunnett檢驗(yàn)試驗(yàn)例3環(huán)氧合酶抑制劑對(duì)角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞的影響所用細(xì)胞角膜細(xì)胞為SV40永生人角膜上皮細(xì)胞株(Araki-Sasaki等，IOVS,1995,36:614-621)，結(jié)膜細(xì)胞為Chang人結(jié)膜細(xì)胞株(ATCC CCL-20.2)。
測(cè)試方法在96孔板上中把這些細(xì)胞培養(yǎng)至30-50％鋪滿，然后把用培養(yǎng)基逐步稀釋的各個(gè)測(cè)試物質(zhì)加入到前面的培養(yǎng)基中，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，用PBS(-)洗滌培養(yǎng)板，根據(jù)β-氨基己糖苷酶活性確定殘余細(xì)胞數(shù)。毒性評(píng)價(jià)方法把僅僅用溶劑(用于溶解測(cè)試物質(zhì)的溶劑)的處理組定義為陰性組，對(duì)照組所觀測(cè)到的活細(xì)胞數(shù)定為100％，基于各濃度測(cè)試物質(zhì)所觀測(cè)到的活細(xì)胞數(shù)繪制成劑量相關(guān)曲線，從曲線中確定達(dá)到50％存活率所需的各測(cè)試物質(zhì)濃度(EC50)，把該值定義為毒性值。
從下列表4中所列數(shù)據(jù)可以明顯看出，同對(duì)COX-1和COX-2具有低選擇性的化合物例如吲哚美辛和雙氯芬酸鈉相比，對(duì)COX-2具有相對(duì)高選擇性的依托度酸顯示對(duì)細(xì)胞例如角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞的損害可能性要低。這將導(dǎo)致開發(fā)一種角膜損害小的非甾體抗炎劑。
另外，下列表5中的數(shù)據(jù)顯示美洛昔康僅僅非常弱地?fù)p害角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞。
表4非甾體抗炎劑對(duì)角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞的作用

各測(cè)試物質(zhì)接觸細(xì)胞時(shí)間24小時(shí)。
表5非甾體抗炎劑對(duì)角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞的作用

工業(yè)實(shí)用性能夠選擇性抑制COX-2的本發(fā)明藥物可以用作滴眼劑，其僅僅非常弱地?fù)p害角膜，但對(duì)于治療眼炎顯示非常突出的效果。特別是美洛昔康，與角膜上皮細(xì)胞長時(shí)間接觸后，同結(jié)膜細(xì)胞相比，仍顯示非常好的作用。
權(quán)利要求
1.治療眼炎的滴眼劑，含有選擇性抑制環(huán)氧合酶-2的藥物作為活性成分。
2.權(quán)利要求1的滴眼劑，其中選擇性抑制環(huán)氧合酶-2的藥物為依托度酸。
3.權(quán)利要求2的滴眼劑，其中依托度酸的濃度為0.5-5％。
4.權(quán)利要求1的滴眼劑，其中選擇性抑制環(huán)氧合酶-2的藥物為N-(2-(環(huán)己氧基)-4-硝基苯基)甲磺酰胺。
5.權(quán)利要求4的滴眼劑，其中N-(2-(環(huán)己氧基)-4-硝基苯基甲磺酰胺的濃度為0.5-5％。
6.權(quán)利要求1的滴眼劑，其中選擇性抑制環(huán)氧合酶-2的藥物為美洛昔康。
7.權(quán)利要求6的滴眼劑，其中美洛昔康的濃度為0.1-1％。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗炎的滴眼劑,其含有選擇性抑制COX－2的藥物,所述藥物選自依托度酸、N－(2－環(huán)己氧基)－4－硝基苯基)甲磺酰胺和美洛昔康,其角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜細(xì)胞損害微弱,而具有優(yōu)良的抗炎作用。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1301177SQ99806227
公開日2001年6月27日 申請(qǐng)日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者三宅謙作, 釣谷昌敞, 屋田浩子, 鈴木秀一, 豐田好洋 申請(qǐng)人:若素制藥株式會(huì)社