專利名稱：新的雜環(huán)取代酰胺、其制備以及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的酰胺，所述化合物是酶抑制劑，尤其是半胱氨酸蛋白酶例如鈣蛋白酶(calpain)(即鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶)及其同工酶和組織蛋白酶例如組織蛋白酶B和L的抑制劑。
鈣蛋白酶是屬于半胱氨酸蛋白酶類的細胞內(nèi)蛋白水解酶，并存在于多種細胞內(nèi)。鈣蛋白酶是由鈣濃度增加而激活的，其分為由μ摩爾級濃度鈣離子激活的鈣蛋白酶Ⅰ或μ-鈣蛋白酶和由毫摩爾級濃度鈣離子激活的鈣蛋白酶Ⅱ或m-鈣蛋白酶(P.Johnson,Int.J.biochem.1990,22(8),811-22)?，F(xiàn)在有人提出還存在其它鈣蛋白酶同工酶的假說(K.Suzuki等人，Biol.Chem.Hoppe-Seyler,1995,376(9),523-9)。
有人懷疑鈣蛋白酶在多種生理過程中起重要作用。這些作用包括裂解調(diào)控蛋白例如蛋白激酶C、細胞骨架蛋白例如MAP2和血影蛋白、肌肉蛋白、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的蛋白降解、血小板活化中的蛋白、神經(jīng)肽代謝、有絲分裂中的蛋白、以及在M.J.Barrett等人，Life Sci.1991,48,1659-69和K.K.Wang等人，Trends in Pharmacol.Sci.,1994,15,412-9中列出的蛋白。
已經(jīng)在多種病生理過程中檢測到了鈣蛋白酶水平增高，例如心臟局部缺血(例如心肌梗塞)、腎局部缺血或中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血(例如中風(fēng))、炎癥、肌肉營養(yǎng)不良、眼睛內(nèi)障、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(例如創(chuàng)傷)、阿爾茨海默氏病等(參見上述K.K.wang的文獻)。人們懷疑這些疾病與細胞內(nèi)鈣水平持續(xù)增高有關(guān)。鈣水平持續(xù)增高導(dǎo)致鈣依賴性過程被過度激活，從而不再受生理調(diào)控的支配。因此，鈣蛋白酶過度活化也可能引起其它病生理過程。
所以有人提出鈣蛋白酶抑制劑可用于治療這些疾病的假說。各種研究證實了這個假說。Seung-Chyul Hong等人,Stroke 1994,25(3),663-9和R.T.Bartus等人，Neurological Res.1995,17,249-58表明了鈣蛋白酶抑制劑在急性神經(jīng)變性疾病或局部缺血例如腦中風(fēng)后發(fā)生的局部缺血中的神經(jīng)保護作用。同樣，實驗性腦損傷后，鈣蛋白酶抑制劑改善了記憶力缺陷以及所發(fā)生的神經(jīng)運動障礙的恢復(fù)(K.E.Saatman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,3428-3433)。C.L.Edelstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995,92,7662-6發(fā)現(xiàn)了鈣蛋白酶抑制劑對由于氧不足導(dǎo)致的腎損傷的保護作用。Yoshida,Ken Ischi等人，Jap.Circ.J.1995,59(1)40-8能表明鈣蛋白酶抑制劑對由局部缺血或再灌注引起的心臟損害的有利作用。因為鈣蛋白酶抑制劑抑制β-AP4蛋白的釋放，所以有人提出其在治療阿爾茨海默氏病中的潛在應(yīng)用(J.Higaki等人，Neuron,1995,14,651-59)。鈣蛋白酶抑制劑還抑制白細胞介素-1α的釋放(N.Watanabe等人，Cytokine 1994,6(6),597-601)。此外，還發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑具有對腫瘤細胞的細胞毒性作用(E.Shiba等人，20th Meeting Int.Ass.Breast Cancer Res.,Sendai Jp,1994,25-28 Sept.,Int.J.Oncol.5(Suppl.),1994,381)。
K.K.Wang,Trends in Pharmacol.Sci.,1994,15,412-8中列出了鈣蛋白酶抑制劑的其它可能應(yīng)用。
文獻中已經(jīng)描述過鈣蛋白酶抑制劑。然而，這些抑制劑主要是不可逆抑制劑或肽類抑制劑。不可逆抑制劑通常是烷基化物質(zhì)，其缺點是在生物體內(nèi)非選擇性地反應(yīng)，或者不穩(wěn)定。因此這些抑制劑通常會表現(xiàn)出不利的副作用、例如毒性，從而限制了其應(yīng)用或者根本不可使用。不可逆抑制劑包括例如環(huán)氧化物E 64(E.B.McGowan等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1989,158,432-5)、α-鹵代酮(H.Angliker等人，J.Med.Chem.1992,35,216-20)或二硫化物(R.Matsueda等人，Chem.Lett.1990,191-194)。
在半胱氨酸蛋白酶例如鈣蛋白酶的已知可逆抑制劑中，有很多是肽醛，尤其是二肽和三肽醛，例如Z-Val-Phe-H(MDL 28170)(S.Mehdi,Trends in Biol.Sci.1991,16,150-3)。在生理條件下，肽醛的缺點是，由于具有高度反應(yīng)性，它們通常是不穩(wěn)定的，可迅速代謝，并且傾向于參與可能是毒性作用原因的非特異性反應(yīng)(J.A.Fehrentz和B.Castro,Synthesis 1983,676-78)。
JP 08183771(CA 1996,605307)和EP 520336描述了衍生自哌啶-4-甲酰胺類和1-羰基哌啶-4-甲酰胺類、并且是鈣蛋白酶抑制劑的醛類化合物。然而，在本申請中要求保護的、并且衍生自通式Ⅰ雜芳基取代酰胺的醛類化合物在現(xiàn)有技術(shù)中沒有被公開過。
肽酮衍生物也是半胱氨酸蛋白酶抑制劑、尤其是鈣蛋白酶抑制劑。例如，已知其中酮基是由吸電子基團例如CF3活化的酮衍生物是絲氨酸蛋白酶抑制劑。對于半胱氨酸蛋白酶，具有通過CF3或類似基團活化的酮的衍生物有很小活性或沒有任何活性(M.R.Angelastro等人，J.Med.Chem.1990,33,11-13)。令人驚奇的是，迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)只有其中一方面α-位離去基團引起不可逆抑制作用、并且另一方面羧酸衍生物活化酮基的酮衍生物是有效的鈣蛋白酶抑制劑(參見上述M.R.Angelastro等人的文獻；WO92/11850；WO92/12140；WO94/00095和WO95/00535)。然而，迄今為止，據(jù)報道只有這些酮基酰胺和酮基酯的肽衍生物是有效的(Zhaozhao Li等人，J.Med.Chem.1993,36,3472-80；S.L.Harbenson等人，J.Med.Chem.1994,37,2918-29，以及上述M.R.Angelastro等人的文獻)。
酮基苯甲酰胺已經(jīng)在文獻中公開過。因此，WO 91/09801、WO94/00095和WO 92/11850中已經(jīng)描述了酮基酯PhCO-Abu-COOCH2CH3。然而，在M.R.Angelastro等人.,J.Med.Chem.1990,33,11-13中，發(fā)現(xiàn)類似的苯基衍生物Ph-CONH-CH(CH2Ph)-CO-COCOOCH3是弱的鈣蛋白酶抑制劑。J.P.Burkhardt,Tetrahedron Lett.,1988,3433-36中也描述了該衍生物。然而，鑒于此人們從來沒有研究過取代苯甲酰胺的重要性。
在很多治療中，例如中風(fēng)的治療中，活性化合物是靜脈內(nèi)給藥的，例如以輸液形式給藥。鑒于此，需要提供在水中具有足夠溶解度的鈣蛋白酶抑制劑來制備輸液。然而，許多現(xiàn)有技術(shù)中的鈣蛋白酶抑制劑的缺點是在水中的溶解度很小或根本不溶解，因此不適于靜脈內(nèi)給藥。這種活性物質(zhì)只能與可促進其在水中溶解的輔助物質(zhì)一起給藥(參見R.T.Bartus等人，J.Cereb.Blood Flow Metab.1994,14,537-544)。然而，這些輔助物質(zhì)例如聚乙二醇通常具有副作用，或?qū)嶋H上不能耐受。因此無需輔助物質(zhì)即可溶于水的非肽類鈣蛋白酶抑制劑具有顯著優(yōu)點。這類抑制劑在現(xiàn)有技術(shù)中沒有描述過，并因此是新的。
本發(fā)明描述了取代的非肽醛、酮基羧酸酯和酮基酰胺衍生物。這些化合物是新的，并且通過合并上剛性結(jié)構(gòu)片段而令人驚奇地表現(xiàn)出獲得半胱氨酸蛋白酶、例如鈣蛋白酶的有效非肽類抑制劑的可能性。此外，所有本發(fā)明通式Ⅰ化合物都具有至少一個脂肪胺基團，因此可與酸形成鹽。大量這些物質(zhì)能在水中表現(xiàn)出溶解性，例如在pH=4-5時能形成0.5％溶液，結(jié)果使化合物具有靜脈內(nèi)給藥例如中風(fēng)治療所需的靜脈內(nèi)給藥所必需的特征。
本發(fā)明涉及通式Ⅰ酰胺、其互變異構(gòu)體和異構(gòu)體、可能的對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體、以及可能的生理可接受鹽， 其中各變量具有下述含義A代表稠合環(huán)，例如 B是苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基(pyrazyl)、噠嗪基、喹啉基、喹嗪基(quinazyl)、喹喔啉基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基和吲哚基，R1是氫、支鏈或直鏈C1-C6-烷基、支鏈或直鏈O-C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C1-C6-烷基苯基、C2-C6-鏈烯基苯基、C2-C6-鏈炔基苯基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、COOH、COO-C1-C4-烷基、NHCO-C1-C4-烷基、NHCO-苯基、CONHR11、NHSO2-C1-C4-烷基、NHSO2-苯基、SO2-C1-C4-烷基、和SO2-苯基，R2是可攜帶苯基、環(huán)己基、吡啶基、噻吩基、吲哚基或萘基環(huán)的支鏈或直鏈C1-C6烷基，其中所述環(huán)被最多2個R1基團取代，R3是氫、COOR5和CO-Z，其中Z是NR6R7和 和R4是氫或(CH2)mNR8R9、O(CH2)mNR8R9或 和R5是可被苯基環(huán)取代的直鏈或支鏈C1-C6-烷基，其中所述苯基環(huán)可被1個或2個R10基團取代，R6是氫或支鏈或直鏈C1-C6-烷基，R7是氫、或支鏈或直鏈C1-C6-烷基，所述烷基可被可攜帶R10基團的苯基或吡啶環(huán)取代，或者被 取代，R8是可被苯基環(huán)取代的直鏈或支鏈C1-C6-烷基，其中所述苯基環(huán)可被1個或2個R10基團取代，R9是可被苯基環(huán)取代的直鏈或支鏈C1-C6-烷基，其中所述苯基環(huán)可被1個或2個R10基團取代，R10可以是氫、支鏈或直鏈C1-C4-烷基、-O-C1-C4-烷基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、CONH2、COOH、COO-C1-C4-烷基、-NHCO-C1-C4-烷基、-NHCO-苯基、-NHSO2-C1-C4-烷基、-NHSO2-苯基、-SO2-C1-C4-烷基、和-SO2-苯基，R11是氫或支鏈或直鏈C1-C6-烷基，R15是氫或具有R8的含義，m是1、2、3、4、5或6,n是0、1或2，且o是0、1、2、3或4。
式Ⅰ化合物可以作為外消旋體、對映異構(gòu)純化合物或非對映異構(gòu)體使用。如果需要對映異構(gòu)純化合物，可通過例如用適當(dāng)?shù)男庑詨A或酸將式Ⅰ化合物或其中間體進行常規(guī)外消旋體拆分來獲得對映異構(gòu)純化合物。另一方面，對映異構(gòu)化合物可通過使用市售化合物例如旋光性氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸來制得。
本發(fā)明還涉及式Ⅰ化合物的內(nèi)消旋體或互變異構(gòu)體，例如其中式Ⅰ上的醛或酮基呈烯醇互變異構(gòu)體的式Ⅰ化合物。
本發(fā)明還包括式Ⅰ化合物的生理可接受鹽，所述鹽可通過將通式Ⅰ化合物與適當(dāng)酸或堿反應(yīng)來制得。適當(dāng)酸和堿的實例列在Fortschritte der Arzneimittelforschung [Advances in DrugResearch],1966,Birkhuser Verlag,Vol.10,pp.224-285中。這些酸和堿包括例如鹽酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、磷酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、馬來酸、富馬酸等，和氫氧化鈉、氫氧化鋰、以及氫氧化鉀等。
本發(fā)明酰胺Ⅰ可依據(jù)在合成方案1中概述的多種方法制得。
合成方案1 將羧酸Ⅱ與適當(dāng)氨基醇Ⅲ連接以形成相應(yīng)的酰胺Ⅳ。在該反應(yīng)中使用在C.R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publisher,1989,pages 972 ff.或Houben-Weyl,Methoden derorganischen Chemie[Methods of Organic Chemistry],4thEdition,E5,Chap.Ⅴ中描述的常規(guī)肽偶合方法。優(yōu)選使用其中羧基COOH被轉(zhuǎn)化成COL的Ⅱ的“活化”酸衍生物。L是離去基團例如Cl、咪唑和N-羥基苯并三唑。然后將該活化酸與胺反應(yīng)以生成酰胺Ⅳ。該反應(yīng)在無水、惰性有機溶劑例如二氯甲烷、四氫呋喃和二甲基甲酰胺中于-20-+25℃溫度下進行。
可將這些醇衍生物Ⅳ氧化以生成本發(fā)明醛衍生物Ⅰ?？刹捎枚喾N常規(guī)氧化反應(yīng)(參見C.R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publisher,1989,page 604 ff.)，例如Swern氧化和類Swern氧化(T.T.Tidwell,Synthesis,1990,857-70)、使用次氯酸鈉/TEMPO進行氧化(上文中S.L.Harbenson等人的文獻)、或Dess-Martin氧化(J.Org.Chem.1983,48,4155)。根據(jù)所采用的方法(參見上述文獻),優(yōu)選在惰性非質(zhì)子傳遞溶劑例如二甲基甲酰胺、四氫呋喃或二氯甲烷中用氧化劑例如DMSO/吡啶×SO3或DMSO/草酰氯于-50-+25℃溫度下進行該氧化反應(yīng)。
或者，可將羧酸Ⅱ與氨基異羥肟酸衍生物Ⅵ反應(yīng)以生成苯甲酰胺Ⅶ。然后用與制備Ⅳ相同的方式進行該反應(yīng)。異羥肟酸衍生物Ⅵ可通過將保護的氨基酸Ⅴ與羥基胺反應(yīng)而制得。在該制備中，也使用已經(jīng)描述過的酰胺制備方法。通過常規(guī)方法，例如用三氟乙酸除去保護基Y2，例如Boc?？赏ㄟ^還原將所得酰氨基異羥肟酸Ⅶ轉(zhuǎn)化成本發(fā)明醛Ⅰ。例如，在-60-0℃、在惰性溶劑例如四氫呋喃或乙醚中使用氫化鋰鋁作為還原劑來進行還原。
在與后一方法類似的方法中，還可以制備同樣可通過還原而轉(zhuǎn)化成本發(fā)明醛Ⅰ的羧酸或羧酸衍生物，例如酯Ⅸ(Y1=OR’、SR,)。C.R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publisher,1989,page 619-26中描述了這些方法。
攜帶酮基酰胺或酮基酯基團的新的雜環(huán)取代酰胺Ⅰ可依據(jù)在合成方案2和3中概述的多種方法制得。
適當(dāng)時，可在室溫或高溫下、例如在25-100℃，在水介質(zhì)或水與有機溶劑如醇和四氫呋喃的混合物中，用酸或堿例如氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀將羧酸酯Ⅱa轉(zhuǎn)化成酸Ⅱ。
采用常規(guī)條件，例如在Houbeh-Weyl,Methoden der organischenChemie[Methods in Organic Chemistry],4thEd.,E5,Chap.V和C.R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCHPublisher,1989,Ch.9中描述的常規(guī)條件，將這些酸Ⅱ與α-氨基酸衍生物連接。
例如，將羧酸Ⅱ轉(zhuǎn)化成“活化的”酸衍生物Ⅱb=Y-COL，其中L是離去基團例如Cl、咪唑和N-羥基苯并三唑，然后通過加入氨基酸衍生物H2N-CH(R2)-COOR將這些活化的酸衍生物轉(zhuǎn)化成衍生物Ⅺ。該反應(yīng)在無水、惰性溶劑例如二氯甲烷、四氫呋喃和二甲基甲酰胺中于-20-+25℃溫度下進行。
合成方案2 通過與上述水解相似的方式，將通常是酯的衍生物Ⅺ轉(zhuǎn)化成酮基羧酸Ⅻ。酮基酯Ⅰ’是在與Dakin-West反應(yīng)類似的反應(yīng)中，使用Zhaozhao Li等人，J.Med.Chem.,1993,36,3472-80的方法制得的。在該方法中，將羧酸例如Ⅻ與草酸單酯酰氯在溶劑例如四氫呋喃中于高溫下(50-100℃)反應(yīng)，然后將所得產(chǎn)物與堿例如乙醇鈉在乙醇中于25-80℃溫度下反應(yīng)，以生成本發(fā)明酮基酯Ⅰ’。可如上所述將所得酮基酯Ⅰ’例如水解，以生成本發(fā)明酮基羧酸。
還可采用類似于Zhaozhao Li等人(參見上文)的方法轉(zhuǎn)化成酮基苯甲酰胺Ⅰ。在惰性溶劑例如二氯甲烷中于室溫下，使用路易斯酸催化劑例如三氟化硼合乙醚、通過加入1,2-乙烷二硫醇將Ⅰ’中的酮基保護，形成了二噻烷。在極性溶劑例如醇中于0-80℃溫度下將這些衍生物與胺反應(yīng)，以形成酮基酰胺Ⅰ(R3=CONR6R7)。
合成方案3 合成方案3中描述了另一方法。采用常規(guī)肽偶合方法(參見上文中的Houben-Weyl)，將酮基羧酸Ⅱ與氨基羥基羧酸衍生物ⅩⅢ反應(yīng)(對于ⅩⅢ的制備，參見S.L.Harbenson等人,J.Med.Chem.1994,37,2918-29或J.P.Burkhardt等人，Tetrahedron Lett.1988,29,3433-3436)，形成了酰胺ⅩⅣ?？蓪⑦@些醇衍生物ⅩⅣ氧化，以生成本發(fā)明酮基羧酸衍生物Ⅰ?？刹捎枚喾N常規(guī)氧化反應(yīng)(參見C.R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCHPublisher,1989,page 604 ff.)，例如Swern氧化和類Swern氧化，優(yōu)選在溶劑例如二氯甲烷或四氫呋喃中、適當(dāng)時加入二甲亞砜，用二甲亞砜/吡啶×SO3復(fù)合物于室溫或-50-+25℃溫度下進行該氧化反應(yīng)(T.T.Tidwell,Synthesis,1990,857-70)，或用次氯酸鈉/TEMPO進行氧化(參見上文中的S.L.Harbenson等人)。
當(dāng)ⅩⅣ是α-羥基酯(X=O-烷基)時，可用與上述方法類似的方法，但優(yōu)選在水/四氫呋喃混合物中于室溫下用氫氧化鋰將這些酯水解，以生成羧酸ⅩⅤ。其它酯或酰胺ⅩⅥ是通過在上述偶合條件下將醇或胺反應(yīng)而制得的?？稍僖淮螌⒋佳苌铫鲅趸陨杀景l(fā)明酮基羧酸衍生物Ⅰ。
上文中已描述過一些羧酸酯Ⅱ的制備；其它羧酸酯Ⅱ是用常規(guī)化學(xué)方法制得的。
A-B鍵是通過在DMF、THF或BuOH中、在碳酸鉀和18-冠-6存在下，將鹵代芳香化合物與相應(yīng)的胺反應(yīng)形成的。二烷基氨基烷基取代基是通過在硼氫化合物、例如BH3-吡啶復(fù)合物或NaBH3CN存在下，用相應(yīng)的胺將醛衍生物還原胺化而獲得的(A.F.Abdel-Magid,C.A.Maryanoff,K.G.Carson,Tetrahedron Lett.10990,31,5595；A.E.Moormann,Synth.Commun.1993,23,789)。
本發(fā)明雜環(huán)取代酰胺Ⅰ是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，尤其是半胱氨酸蛋白酶例如鈣蛋白酶Ⅰ和Ⅱ以及組織蛋白酶B和L的抑制劑。
已經(jīng)用文獻中記載的常規(guī)酶測試法測定了雜環(huán)取代酰胺Ⅰ的抑制作用，以酶活性被抑制50％時所測定的抑制劑濃度(IC50)作為作用標度。以該方式測定酰胺Ⅰ抑制鈣蛋白酶Ⅰ、鈣蛋白酶Ⅱ和組織蛋白酶B的作用。
組織蛋白酶B測試按照類似于S.Hasnain等人，J.Biol.Chem.1993,268,235-40的方法測定組織蛋白酶B抑制作用。
將用抑制劑和DMSO制得的2μL抑制劑溶液(終濃度100μM-0.01μM)加到88μL組織蛋白酶B(得自人肝臟的組織蛋白酶B(Calbiochem),在500μM緩沖液中稀釋至5單位)中。將該混合物在室溫(25℃)預(yù)培養(yǎng)60分鐘，然后通過加入10μL 10mM Z-Arg-Arg-pNA(在含有10％DMSO的緩沖液中)來啟動反應(yīng)。用微量滴定板讀數(shù)計在405nM監(jiān)視反應(yīng)30分鐘。然后由最大梯度確定IC50。
鈣蛋白酶Ⅰ和Ⅱ測試在含有組合物50mM tris-HCl、0.1M NaCl、1mM二硫蘇糖醇、0.11mM CaCl2、pH為7.5的緩沖液中，用螢光鈣蛋白酶底物Suc-Leu-Tyr-AMC(溶于DMSO中，濃度為25mM,Bachem/Switzerland)測定鈣蛋白酶抑制劑的抑制特性。從紅細胞中分離出人μ-鈣蛋白酶，經(jīng)過幾個色譜法純化步驟(DEAE-瓊脂糖，苯基瓊脂糖，Superdex 200和Blue Sepharose)之后，獲得了純度＞95％的酶，其中該酶的純度是通過SDS-PSGE、Western印跡分析和N-末端序列分析測定的。在Spex-Fluorolog熒光計中于λex=380nm和λem=460nm處測定裂解產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的熒光度。在60分鐘的測定期間內(nèi)，底物的裂解與時間呈線性關(guān)系，并且如果測試是在12℃進行的話，鈣蛋白酶的自動催化活性很低。將抑制劑和鈣蛋白酶底物以DMSO溶液形式加到該測試混合物中，其中DMSO的終濃度不能超過2％。
在一次測試中，將10μl底物(終濃度為250μM)和10μl μ-鈣蛋白酶(終濃度為2μg/ml，即18nM)依次加到含有緩沖液的1ml比色杯中。測定15-20分鐘鈣蛋白酶介導(dǎo)的底物裂解。然后加入10μl抑制劑(50-100μM的DMSO溶液)，測定40分鐘對裂解的抑制。
Ki值是依據(jù)可逆抑制的經(jīng)典公式確定的(酶學(xué)方法)Ki=I/(vo/vi)-1；其中I=抑制劑濃度，vo=加入抑制劑前的初速度，v1=平衡中的反應(yīng)速度。
速度是由v=AMC釋放/時間，即強度/時間計算的。
鈣蛋白酶是細胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶。為了阻止鈣蛋白酶降解細胞內(nèi)蛋白，鈣蛋白酶抑制劑必須穿越細胞膜。有些已知的鈣蛋白酶抑制劑例如E64和亮抑蛋白酶肽只能非常困難地越過細胞膜，因此，雖然它們是良好的鈣蛋白酶抑制劑，但是在細胞內(nèi)的作用很弱。人們的目標是發(fā)現(xiàn)能更好地穿過細胞膜的化合物。我們使用人血小板來確定鈣蛋白酶抑制劑穿越膜的能力。
鈣蛋白酶介導(dǎo)的血小板中酪氨酸激酶pp60src的降解血小板活化后，酪氨酸激酶pp60src被鈣蛋白酶裂解。Oda等人在J.Biol.Chem.,1993,268,12603-12608中描述了對此的詳細研究。在該方面,據(jù)表明calpeptin-一種鈣蛋白酶抑制劑可阻止pp60src的裂解。我們按照在該出版文章中使用的方法測定了本發(fā)明化合物的細胞有效性。將用檸檬酸鹽處理的新鮮人血以200g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。收集富含血小板的血漿，并用血小板緩沖液(血小板緩沖液68mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2×6H2O、0.24mMNaH2PO4×H2O、12mM NaHCO3、5.6mM葡萄糖、1mM EDTA、pH7.4)進行1∶1稀釋。離心并用血小板緩沖液洗滌后，將血小板濃度調(diào)節(jié)至107個細胞/ml。在室溫分離人血小板。
在該測試分析中，將分離的血小板(2×106)與不同濃度的抑制劑(溶于DMSO中)在37℃預(yù)培養(yǎng)5分鐘。然后用1μM離子載體A23187和5mM CaCl2將血小板活化。培養(yǎng)5分鐘后，以13000rpm轉(zhuǎn)速將血小板短暫離心，把血小板小丸置于SDS樣本緩沖液中(SDS樣本緩沖液20mM Tris-HCl、5mM EDTA、5mM EGTA、1mM DTT、0.5mMPMSF、5μg亮抑蛋白酶肽/ml、10μg胃蛋白酶抑制劑/ml、10％甘油和1％SDS)。在12％凝膠中分離蛋白，通過Western印跡法鑒定pp60src及其52kDa和47kDa裂解產(chǎn)物。使用購自BiomolFeinchemikalien(Hamburg)公司的多克隆兔子抗-Cys-src(pp60c- src)抗體。用偶合有HRP的山羊第二代抗體(Boehringer Mannheim,FRG)檢測該初生抗體。依據(jù)已知方法進行Western印跡測定。
通過光密度法定量測定pp60src的裂解，所用對照是未活化血小板(對照1未裂解)和用離子載體與鈣處理的血小板(對照2相當(dāng)于100％裂解)。ED50值是顏色反應(yīng)的強度降低50％時抑制劑的濃度。
皮層神經(jīng)元中谷氨酸鹽誘導(dǎo)的細胞死亡該測試是按照Choi D.W.,Maulucci-Gedde M.A.和KriegsteinA.R.,“谷氨酸鹽在皮層細胞培養(yǎng)物中的神經(jīng)毒性”.J.Neurosci.1989,7,357-368中描述的方法進行的。
從15天大小的小鼠胚胎中把皮質(zhì)解剖為兩半，通過酶處理(胰蛋白酶)分離到了獨立細胞。將這些細胞(神經(jīng)膠質(zhì)和皮層神經(jīng)元)接種到24孔板上。3天(涂布昆布氨酸(laminin)的培養(yǎng)板)或7天(涂布鳥氨酸的培養(yǎng)板)后，用FDU(5-氟-2-去氧尿嘧啶核苷)進行有絲分裂處理。將細胞培養(yǎng)15天后，加入谷氨酸鹽來誘導(dǎo)細胞死亡(15分鐘)。除去谷氨酸鹽后，加入鈣蛋白酶抑制劑。24小時后，通過測定細胞培養(yǎng)物上清液中的乳酸脫氫酶(LDH)來確定細胞損傷。
有人提出鈣蛋白酶也在細胞程序死亡中起作用的假說(M.K.T.Squier等人，J.Cell.Physiol.1994,159,229-237；T.Patel等人,Faseb Journal 1996,590,587-597)。因此，在人細胞系代表的另一模型中，在鈣離子載體存在下用鈣誘導(dǎo)細胞死亡。鈣蛋白酶抑制劑必須進入細胞內(nèi)并抑制其中的鈣蛋白酶以阻止所誘導(dǎo)的細胞死亡。
NT2細胞中鈣介導(dǎo)的細胞死亡可在人細胞系NT2中，在離子載體A23187存在下、用鈣誘導(dǎo)細胞死亡。在實驗前20小時，將細胞以105個細胞/孔的量置于微量滴定板中。20小時后，在2.5μM離子載體和5μM鈣存在下、將細胞與不同濃度的抑制劑培養(yǎng)。5小時后，將0.05ml XTT(細胞增殖試劑盒Ⅱ,Boehringer Mannheim)加到該反應(yīng)混合物中。約17小時后，依據(jù)制造商的使用說明，用SLT Easy Reader EAR 400測定光密度。細胞死亡一半時的光密度是由不使用抑制劑、含有細胞、并且這些細胞是在或不在離子載體存在下培養(yǎng)的兩個對照組計算的。
在很多神經(jīng)性疾病或心理障礙中，都發(fā)生谷氨酸鹽活性增加，并導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)過度興奮或毒性作用。谷氨酸鹽通過多種受體介導(dǎo)其作用。其中有兩種受體通過其特異性激動劑被劃分為NMDA受體和AMPA受體。因此，這些谷氨酸鹽介導(dǎo)作用的拮抗劑可用于治療這些疾病，尤其是治療神經(jīng)變性疾病例如亨廷頓氏舞蹈病和帕金森氏病，低氧、缺氧和局部缺血后發(fā)生的神經(jīng)毒害疾病，以及中風(fēng)和創(chuàng)傷后發(fā)生的損傷，或用作抗癲癇劑(參見Arzneim.Forschung 1990,40,511-514；TIPS,1990,11,334-338；Drugs of the Future 1989,14,1059-1071)。抗興奮性氨基酸誘導(dǎo)的腦過度興奮的保護作用(小鼠中的NMDA或AMPA拮抗作用)腦內(nèi)給予興奮性氨基酸EAA(興奮性氨基酸)，結(jié)果誘導(dǎo)了嚴重的過度興奮，導(dǎo)致動物(小鼠)在短時間內(nèi)痙攣和死亡?？赏ㄟ^系統(tǒng)給予例如腹膜內(nèi)給予作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活性化合物(EAA拮抗劑)來抑制這些癥狀。因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中EAA受體的過度激活在多種神經(jīng)性疾病的發(fā)病機制中起重要作用，所以可從已在體內(nèi)證實的EAA拮抗作用得出這樣的結(jié)論，即這種物質(zhì)可用于治療這些CNS疾病。為了測定這種物質(zhì)的效力，通過提前腹膜內(nèi)給予測試物質(zhì)，確定50％動物的由給予固定劑量NMDA或AMPA引起的癥狀被消除時的ED50值。
本發(fā)明雜環(huán)取代酰胺Ⅰ是半胱氨酸衍生物例如鈣蛋白酶Ⅰ和Ⅱ以及組織蛋白酶B和L的抑制劑，因此可用于控制與鈣蛋白酶或組織蛋白酶的酶活性增加有關(guān)的疾病。因此本發(fā)明酰胺Ⅰ可用于治療局部缺血、創(chuàng)傷、蛛網(wǎng)膜下出血和中風(fēng)后發(fā)生的神經(jīng)變性疾病，和神經(jīng)變性疾病例如多發(fā)性梗塞性癡呆、阿爾茨海默氏病和亨廷頓氏舞蹈病，和癲癇，以及可用于治療心臟局部缺血后的心臟損傷、腎局部缺血后的腎臟損傷、骨骼肌損傷、肌肉營養(yǎng)不良、由于平滑肌細胞增殖所導(dǎo)致的損傷、冠狀血管痙攣、腦血管痙攣、眼睛內(nèi)障、和血管成形術(shù)后的血管再狹窄。此外，本發(fā)明酰胺Ⅰ可用于腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移的化學(xué)治療，并且可用于治療其中白細胞介素-1水平增加的疾病，例如炎癥和風(fēng)濕性疾病。
除了常規(guī)藥物輔料以外，本發(fā)明藥物制劑還含有治療有效量的化合物Ⅰ。
對于局部外用給藥，例如以粉劑、軟膏劑或噴霧劑形式給藥，制劑中活性化合物的濃度可以為常規(guī)濃度。按重量計，活性化合物的含量一般為0.001-1％，優(yōu)選為0.001-0.1％。
對于內(nèi)部給藥，制劑以單次劑量給藥。每單次劑量為0.1-100mg/kg體重。根據(jù)所治療疾病的類型和嚴重程度，每天給予一個或多個劑量的制劑。
根據(jù)所需的給藥方式，本發(fā)明藥物制劑含有除活性組分以外的常規(guī)賦形劑和稀釋劑。對于局部外用給藥制劑，可使用藥物技術(shù)中的常規(guī)輔料例如乙醇、異丙醇、乙氧基化蓖麻油、乙氧基化氫化蓖麻油、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇硬脂酸酯、乙氧基化脂肪醇、石蠟油、凡士林和羊毛脂。對于內(nèi)部給藥制劑，合適輔料的實例是乳糖、丙二醇、乙醇、淀粉、滑石和聚乙烯吡咯烷酮。
本發(fā)明藥物制劑還可含有抗氧化劑例如生育酚、叔丁基化甲氧酚以及丁基化羥基甲苯，矯味劑，穩(wěn)定劑，乳化劑和潤滑劑。
本發(fā)明藥物制劑所含有的除活性組分以外的物質(zhì)和在藥物制劑制備中所使用的物質(zhì)在毒理學(xué)方面是無害的，并且與活性化合物相配伍。本發(fā)明藥物制劑是以常規(guī)方法制得的，例如通過將活性化合物與其它常規(guī)賦形劑和稀釋劑混合而制得。
本發(fā)明藥物制劑可以通過多種給藥途徑給藥，例如口服給藥，非胃腸道給藥例如通過輸注的靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥，和局部給藥。因此可采用的劑型有片劑、乳劑、輸液、注射液、糊劑、軟膏劑、凝膠劑、霜劑、洗劑、粉劑和噴霧劑。
實施例實施例12-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)煙[N-(1-氨基甲?；?1-氧代-3-苯基丙-2-基)]酰胺
a)2-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)煙酸乙酯在攪拌下，將4.0g(19.4mmol)2-氯煙酸乙酯與3.2g(19.4mmol)1,2,3,4-四氫異喹啉鹽酸鹽以及5.36 g碳酸鉀一起在50mlDMF中于110℃加熱3小時。然后加入水，用乙醚萃取該混合物；然后將乙醚相用氯化銨洗滌，干燥并蒸發(fā)。通過色譜法(硅膠/庚烷-乙酸乙酯20-1)純化粗產(chǎn)物，獲得了4.8g(87％)產(chǎn)物。
b)2-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)煙酸在煮沸溫度下用2N氫氧化鈉溶液和乙醇將4.8g中間體1a水解(2小時)。將該混合物用水稀釋，然后用乙酸乙酯萃??；用乙酸將水相酸化至pH4-5。抽濾出所得沉淀，并用乙酸乙酯再一次萃取水相，總共獲得了3.3g(81％)產(chǎn)物。熔點為150-152℃。
c)2-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)煙[N-(1-氨基甲?；?1-醇-3-苯基丙-2-基)]酰胺在0℃，首先將1.65g(6.5mmol)中間體1c與1.0ml(7.2mmol)三乙胺和0.88(6.5mmol)1-羥基-1H-苯并三唑(HOBT)置于50mlDMF中，然后加入1.5g(6.5mmol)3-氨基-2-羥基-4-苯基丁酰胺鹽酸鹽，2.7ml(19.5mmol)三乙胺和1.37g(7.2mmol)N’-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。將該混合物在室溫攪拌過夜后，加入水和乙醚，抽濾出固體，獲得了2.4g(85％)產(chǎn)物。
熔點237-239℃d)2-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)煙[N-(1-氨基甲?；?1-氧代-3-苯基丙-2-基)]酰胺在0℃，將1.3g(3.0mmol)中間體1c與1.9ml(13.6mmol)三乙胺溶于30ml DMSO中，然后加入1.92g(12mmol)吡啶-SO3復(fù)合物。將該混合物攪拌過夜后，加入碳酸氫鈉溶液，將該混合物用乙酸乙酯萃取3次。合并乙酸乙酯相，干燥，蒸發(fā)，將殘余物與二氯甲烷攪拌；抽濾出固體，并真空干燥。
產(chǎn)量400mg(產(chǎn)率為理論產(chǎn)率的31％)熔點163-165℃
1H NMR(DMSO-D6):δ=2.8-3.2(6H),4.3(2H),5.4(1H),6.8-7.5(11H),7.8-8.1(3H),9.0(1H)ppm.
以類似方式制備實施例2-5。實施例22-(1,2,3,4-四氫-6,7-二甲氧基異喹啉-2-基)煙[N-(1-氨基甲?；?1-氧代-3-苯基丙-2-基)]酰胺熔點214-216℃1H NMR(DM5O-D6):δ=2.7-3.5(6H),3.8(6H),4.3(2H),5.5(1H),6.7-7.5(9H),7.9-8.1(2H),9.0(1H)ppm.實施例32-(1,2,3,4-四氫-6,7-二甲氧基異喹啉-2-基)煙[N-(1-氨基甲?；?1-氧代己-2-基)]酰胺熔點182℃1H NMR(DMSO-D6):δ=0.9-1.8(9H),2.8(2H),3.5-3.7(8H),4.3(2H),5.1(1H),6.7-6.9(3H),7.7-8.2(4H),9.0(1H)ppm.實施例42-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)苯甲[N-(1-氨基甲酰基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)]酰胺熔點156-158℃1H NMR(DMSO-D6):δ=2.3-3.2(6H),4.0-4.3(2H),5.3(1H),6.9-8.0(15H),10.0(1H)ppm.實施例54-(1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基)煙[N-(1-氨基甲?；?1-氧代-3-苯基丙-2-基)]酰胺熔點160-162℃1H NMR(DMSO-D6):δ=2.7-3.5(6H),4.2-4.5(2H),5.5(1H),7.0-7.4(11H),7.9-8.1(3H),9.1(1H)ppm.其它實施例列在下表中(實施例1-250)。
權(quán)利要求
1．通式Ⅰ酰胺、其互變異構(gòu)體和異構(gòu)體、可能的對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體、以及可能的生理可接受鹽， 其中各變量具有下述含義A代表稠合環(huán)，例如 B是苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、喹啉基、喹嗪基、喹喔啉基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基和吲哚基，R1是氫、支鏈或直鏈C1-C6-烷基、支鏈或直鏈O-C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C1-C6-烷基苯基、C2-C6-鏈烯基苯基、C2-C6-鏈炔基苯基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、COOH、COO-C1-C4-烷基、NHCO-C1-C4-烷基、NHCO-苯基、CONHR11、NHSO2-C1-C4-烷基、NHSO2-苯基、SO2-C1-C4-烷基、和SO2-苯基，R2是可攜帶苯基、環(huán)己基、吡啶基、噻吩基、吲哚基或萘基環(huán)的支鏈或直鏈C1-C6-烷基，其中所述環(huán)被最多2個R1基團取代，R3是氫、COOR5和CO-Z，其中Z是NR6R7和 和R4是氫或(CH2)mNR8R9、O(CH2)mNR8R9或 和R5是可被苯基環(huán)取代的直鏈或支鏈C1-C6-烷基，其中所述苯基環(huán)可被1個或2個R10基團取代，R6是氫或支鏈或直鏈C1-C6-烷基，R7是氫、或支鏈或直鏈C1-C6-烷基，所述烷基可被可攜帶R10基團的苯基或吡啶環(huán)取代，或者被 取代，R8是可被苯基環(huán)取代的直鏈或支鏈C1-C6-烷基，其中所述苯基環(huán)可被1個或2個R10基團取代，R9是可被苯基環(huán)取代的直鏈或支鏈C1-C6-烷基，其中所述苯基環(huán)可被1個或2個R10基團取代，R10可以是氫、支鏈或直鏈C1-C4-烷基、-O-C1-C4-烷基、OH、Cl,F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、CONH2、COOH、COO-C1-C4-烷基、-NHCO-C1-C4-烷基、-NHCO-苯基、-NHSO2-C1-C4-烷基、-NHSO2-苯基、-SO2-C1-C4-烷基、和-SO2-苯基，R11是氫或支鏈或直鏈C1-C6-烷基，R15是氫或具有R8的含義，m是1、2、3、4、5或6,n是0、1或2，且o是0、1、2、3或4。
2．權(quán)利要求1的式Ⅰ雜環(huán)取代酰胺，其中B是苯基，且R3是CONR6R7。
3．權(quán)利要求1的式Ⅰ雜環(huán)取代酰胺，其中B是吡啶基，R1是H，且R3是H。
4．權(quán)利要求1的式Ⅰ雜環(huán)取代酰胺，其中B是吡啶基，R1是H，且R3是CONH2。
5．權(quán)利要求1的式Ⅰ雜環(huán)取代酰胺，其中A代表稠合環(huán)，例如 和B是吡啶基，R1是H，且R3是H。
6．權(quán)利要求1的式Ⅰ雜環(huán)取代酰胺，其中A代表稠合環(huán)，例如 和B是吡啶基，R1是H，且R3是CONH2。
7．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺在治療疾病中的應(yīng)用。
8．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑的應(yīng)用。
9．權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用是作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，例如鈣蛋白酶和組織蛋白酶、尤其是鈣蛋白酶Ⅰ和Ⅱ以及組織蛋白酶B和L的抑制劑的應(yīng)用。
10．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺在制備用于治療其中鈣蛋白酶活性增加的疾病的藥物中的應(yīng)用。
11．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺在制備用于治療神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)元損傷的藥物中的應(yīng)用。
12．權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用是在治療由局部缺血、創(chuàng)傷和大出血引起的神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)元損傷中的應(yīng)用。
13．權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用是在制備用于治療中風(fēng)和顱腦創(chuàng)傷的藥物中的應(yīng)用。
14．權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用是在制備用于治療阿爾茨海默氏病和亨廷頓氏舞蹈病的藥物中的應(yīng)用。
15．權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用是在制備用于治療癲癇的藥物中的應(yīng)用。
16．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ化合物在制備用于治療下述疾病的藥物中的應(yīng)用心臟局部缺血后的心臟損傷、腎局部缺血后的腎臟損傷、骨骼肌損傷、肌肉營養(yǎng)不良、由于平滑肌細胞增殖所導(dǎo)致的損傷、冠狀血管痙攣、腦血管痙攣、眼睛內(nèi)障、和血管成形術(shù)后的血管再狹窄。
17．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺在制備用于治療腫瘤以及腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
18．權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺在制備用于治療其中白細胞介素-1水平增加的疾病的藥物中的應(yīng)用。
19．權(quán)利要求1-5任一項的酰胺在治療免疫性疾病例如炎癥和風(fēng)濕性疾病中的應(yīng)用。
20．口服、非胃腸道和腹膜內(nèi)給藥的藥物制劑，其中每一單位制劑包含至少一種權(quán)利要求1-5任一項的式Ⅰ酰胺和常規(guī)藥物輔料。
全文摘要
通式(Ⅰ)的新的酰胺、其互變異構(gòu)體和異構(gòu)體、可能的對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體、以及可能的生理可接受鹽,其中各變量的含義如說明書所述。
文檔編號A61P25/28GK1303372SQ99806590
公開日2001年7月11日 申請日期1999年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月25日
發(fā)明者W·盧比施, A·梅勒, H·J·特雷貝爾, M·克諾普 申請人:Basf公司