專利名稱：治療性的血管生成因子及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及諸如多效素(pleiotrophin)的治療性血管生成因子促進(jìn)血管生成以治療包括心血管病的多種適應(yīng)癥的用途。
多效素(PTN)是屬于肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族的分泌型生長(zhǎng)因子，Lai等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1871113-1121(1992)。起初，多效素作為弱的促分裂原純化自牛子宮和作為軸突突起促進(jìn)劑純化自新生大鼠的腦，Milner等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1651096-1103(1989)；Rauvala，EMBO J.，82933-2941(1989)；和Li等，科學(xué)，2501690-1694(1990)。已有人報(bào)道從人乳腺癌細(xì)胞系的條件培養(yǎng)液中純化出18-kDa的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，Wellstein等，生物化學(xué)雜志，2672582-2587(1992)。已克隆和測(cè)序了人，牛和大鼠PTN的cDNA，F(xiàn)ang等，生物化學(xué)雜志，26725889-25897(1992)；Li等(1990)，文獻(xiàn)同上；Lai等(1992)，文獻(xiàn)同上；Kadomatsu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1511312-1318(1988)；Tomomura等，生物化學(xué)雜志，26510765-10770(1990)；Vrios等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，175617-624(1991)；和Li等，生物化學(xué)雜志，26726011-26016(1992)。
PTN屬于肝素結(jié)合蛋白質(zhì)家族，該家族中包括midkine(MK)生長(zhǎng)因子蛋白。midkine蛋白的氨基酸序列與PTN有約50％的同源性，Kadomatsu等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，110607-616(1990)；和Kretschmer等，生長(zhǎng)因子，599-114(1991)。在神經(jīng)外胚層的發(fā)育過程中，PTN和MK蛋白似乎起著一定的作用。成年時(shí)，所述基因的生理表達(dá)僅出現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)很有限的區(qū)域內(nèi)，Bohlen和Kovesdi，生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展.，3143-157(1991)。
PTN可作為腫瘤中的生長(zhǎng)因子起作用。如PCT WO 96/02257(其內(nèi)容列入本文作為參考)所述，PTN的反義核苷酸已發(fā)展成為可以抑制腫瘤形成。在高度血管化的黑素瘤中，PTN的表達(dá)提高，PTN支持SW13細(xì)胞在軟瓊脂中生長(zhǎng)，Wellstein等，生物化學(xué)雜志，2672582-2587(1992)。純化自不同來源的PTN被描述成對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有促有絲分裂活性，例見Fang等，生物化學(xué)雜志，26725889-25897(1992)；Kuo等，生物化學(xué)雜志，26518749-18752(1990)；Rauvala，EMBO J.，82933-2941(1989)；Merenmies和Rauvala，生物化學(xué)雜志.，26516721-16724(1990)；Li等.，科學(xué)，2501690-1694(1990)；和Milner等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1651096-1103(1989)。PTN顯示出對(duì)牛腦毛細(xì)血管細(xì)胞具有促有絲分裂活性并在兔角膜試驗(yàn)中顯示出血管生成活性(Courty等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，180145-151(1991))。在體外，PTN也顯示出可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的管形成，Laaroubi等，生長(zhǎng)因子，1089-98(1994)。
已在人乳腺癌樣品和人乳腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)到PTN mRNA，F(xiàn)ang等，生物化學(xué)雜志，26725889-25897(1992)。也在致癌劑誘導(dǎo)的大鼠乳房腫瘤中檢測(cè)到PTN，Koyama等，國(guó)家癌癥學(xué)會(huì)雜志，481671-1680(1972)。還發(fā)現(xiàn)其它原發(fā)性人癌癥和細(xì)胞系也能表達(dá)PTN，其中包括黑素瘤，頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。根據(jù)嚙齒動(dòng)物模型，PTN在非癌狀態(tài)下受到很嚴(yán)格的調(diào)控，僅在腦和生殖道區(qū)域表達(dá)，Bloch等，Brain Res.Dev.Brain Res.，70267-278(1992)；和Vanderwinden等，Anat.Embryol.，(Berl)186387-406(1992)。
相對(duì)于成年?duì)顟B(tài)而言，PTN在胚胎發(fā)育過程中有更加廣泛的表達(dá)。在腦，肺間充質(zhì)，腸，腎臟和生殖道，以及骨和軟骨的祖細(xì)胞中可檢測(cè)到PTN(Bloch等，Brain Res.Dev.Brain Res.，70267-278(1992)；和Vanderwinden等，Anat.Embryol.，(Berl)186387-406(1992))。這表明PTN在腦發(fā)育和器官形成的過程中起著重要的生理作用。
PTN已被描述為多效素，例見PCT WO 96/02257(其內(nèi)容列入本文作為參考)。根據(jù)組織來源將其描述為不同的名稱得自牛腦的肝素親和調(diào)節(jié)蛋白，HARP(Courty等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，15F摘要.221-摘要.220(摘要)(1991)；和Biochem.Biophys.Res.Commun.，180145-151(1991))，肝素結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，HBNF(Kovesdi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，172850-854(1990)和Huber等，神經(jīng)化學(xué)研究，15435-439(1990))和p18(Kuo等，生物化學(xué)雜志，26518749-18752(1990))；得自大鼠腦的肝素結(jié)合生長(zhǎng)相關(guān)分子，HB-GAM(Rauvala，EMBO J.82933-2941(1989)；和Merenmies和Rauvala，生物化學(xué)雜志.，26516721-16724(1990))；得自人胎盤和大鼠腦的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子8，HBGF-8(Milner等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1651096-1103(1989))，成骨細(xì)胞特異性因子，OSF-1(Tezuka等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，173246-251(1990))和多效素PTN(Li等，科學(xué)，2501690-1694(1990))。
據(jù)報(bào)道，PTN的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有5個(gè)決定其三維結(jié)構(gòu)的二硫鍵。二硫鍵的存在決定了蛋白質(zhì)的某些特性，例如對(duì)低pH的耐受性和對(duì)還原條件的敏感性，Wellstein等，生物化學(xué)雜志，2672582-2587(1992)；和Fang等，生物化學(xué)雜志，26725889-25897(1992)。
需要開發(fā)給需要血管生成療法的患者施用治療有效量的血管生成生長(zhǎng)因子，如多效素的方法。尤其需要開發(fā)使用血管生成生長(zhǎng)因子治療局部缺血病癥的治療方法。也需要開發(fā)治療血管病，例如心血管病的方法。還需要開發(fā)用于送遞血管生成生長(zhǎng)因子的送遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于生長(zhǎng)因子的受控送遞和釋放。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了刺激需要生成血管的人或動(dòng)物的血管生成的方法。還提供了含有血管生成因子和藥物可接受載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給需要血管生成療法的人或動(dòng)物施用治療有效量的，任選包含在藥物可接受載體中的血管生成因子，如多效素或midkine分子。血管生成因子可以是例如多效素或midkine蛋白。
一個(gè)實(shí)施方案中的載體包括控釋基質(zhì)，例如聚合物，它們可以控釋血管生成因子。聚合物是能生物降解的或生物侵蝕的和生物相容的。可用于控釋的聚合物包括例如聚(酯)，聚(酐類)和聚(氨基酸)。例舉的聚(氨基酸)包括絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血管生成因子可在含有脂質(zhì)體(如異型囊狀脂質(zhì)體)的載體中被提供?？赏瑫r(shí)提供諸如脂質(zhì)體的載體和能將脂質(zhì)體靶向身體內(nèi)預(yù)先選定之位點(diǎn)的靶向配體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，給血管系統(tǒng)，例如心血管系統(tǒng)或外周血管系統(tǒng)施用血管生成因子?？墒┯弥委熡行Я康难苌梢蜃右灾委熇绻跔顒?dòng)脈病，局部缺血性心臟病，糖尿病性外周血管病變或外周動(dòng)脈粥樣硬化病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在創(chuàng)傷處局部施用治療有效量的血管生成因子以促進(jìn)傷口愈合。可被治療的創(chuàng)傷包括潰瘍，褥瘡，外科手術(shù)導(dǎo)致的創(chuàng)傷和外傷導(dǎo)致的創(chuàng)傷。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，給含有神經(jīng)的組織局部施用治療有效量的血管生成因子以治療神經(jīng)病，例如中風(fēng)，多梗死性癡呆和一般的腦局部缺血。還可以給含有骨或軟骨的組織局部施用治療有效量的血管生成因子以治療諸如骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)置換或修復(fù)的病癥。還可在宿主的器官移植位點(diǎn)局部施用治療有效量的血管生成因子以促進(jìn)移植物移入宿主中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，血管生成因子是可分離自例如人細(xì)胞來源的多效素蛋白或midkine蛋白或其活性片斷或類似物，它們可在真核宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了刺激需要血管生成療法的人或動(dòng)物中的血管生成的方法，所述方法包括給所述人或動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的血管生成因子，所述載體含有絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物和/或聚-丙交酯-共-乙交酯。
可以使用的血管生成因子包括多效素，midkine，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族成員，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)家族成員，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)家族成員和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員以及它們的活性片斷和類似物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了刺激需要血管生成療法的人或動(dòng)物中的血管生成的方法，所述方法包括給人或其它動(dòng)物施用治療有效量的，任選包含在藥物可接受載體中的基因轉(zhuǎn)移載體，所述載體能編碼多效素或midkine蛋白的產(chǎn)生。基因轉(zhuǎn)移載體可以是例如裸露的DNA或病毒載體，并且可以與脂質(zhì)體聯(lián)合使用。
圖2圖示了在用含有多效素的植入物治療小鼠創(chuàng)傷之后的時(shí)間內(nèi)聚生血管的橫斷面面積。
實(shí)施本發(fā)明的模式本發(fā)明提供了含有血管生成因子的組合物，及其制備和使用方法。當(dāng)血管組織損壞或患病時(shí)，可給組織施用血管生成因子以使組織重新血管化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的血管生成因子被包含在送遞基質(zhì)中以使該因子局部控釋于損壞或患病位點(diǎn)。本發(fā)明的方法和組合物能促進(jìn)血管生成，形成新的血管，因此可用于多種治療性的應(yīng)用中。血管生成因子優(yōu)選刺激給藥位點(diǎn)的內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。給多種血管化較差的組織治療性施用所述血管生成因子可通過刺激新血管形成來增加血液供應(yīng)。本發(fā)明還提供了送遞核酸構(gòu)建體的方法和組合物，所述構(gòu)建體可指導(dǎo)血管生成因子的表達(dá)。
血管生成因子本文所用術(shù)語“血管生成因子”指的是能刺激血管生成的分子。血管生成因子包括天然多肽生長(zhǎng)因子或者其生物活性片斷或其衍生物或其類似物。血管生成被定義為新血管的生成。體內(nèi)血管生成一般包括刺激內(nèi)皮細(xì)胞并使其生長(zhǎng)。另外，刺激成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞有助于形成含有正常血管組織，包括血管結(jié)締組織外層的完整的細(xì)胞群體，F(xiàn)olkman，1992，EXS 614-13和Bicknell等，1996，Curr.Opin.Oncol.8(1)60-65。
在一個(gè)實(shí)施方案中，血管生成因子是多效素分子。多效素分子包括多效素蛋白。多效素分子可以是例如天然的多效素蛋白及其生物活性片斷，及其修飾和合成形式，包括衍生物、類似物和模擬物，如小分子模擬物。天然多效素蛋白包括多效素家族的蛋白，尤其是人多效素。
多效素蛋白可有利地刺激內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，因此，多效素蛋白可有利地刺激新血管生成和纖維組織形成，這對(duì)于自然的創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)至關(guān)重要。新血管的生成對(duì)于局部缺血組織的補(bǔ)救尤為重要。在一個(gè)實(shí)施方案中，多效素蛋白可分離自天然來源或通過重組方法產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，多效素是成熟的肽，它具有PCT WO 96/02257(其內(nèi)容列入本文作為參考)所述的SEQ IDNO1的堿基477至980所編碼的序列。
其它有用的血管生成因子包括生長(zhǎng)因子，例如midkine，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)家族的成員，包括VEGF-2，VEGF-C和VEGF-D(Plate等，J.Neurooncol，35365-372(1997)；Joukov等，細(xì)胞生理學(xué)雜志，173211-215(1997))；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的成員，包括FGF-1至FGF-18，尤其是FGF-1，F(xiàn)GF-2和FGF-5；肝細(xì)胞瘤衍生的生長(zhǎng)因子(HDGF)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/分散因子(HGF，Boroset等，柳葉刀，345293-295(1995))；上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)家族的成員，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)，EGF和TGF-α-HIII(Brown，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.，7914-922(1995)和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 97/25349)；和血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，包括AA，AB和BB同種型(Hart等，基因工程，17181208(1995))。
其它血管生成因子包括血管生成素(angiopoietin)，如Ang1和整聯(lián)蛋白刺激因子，如Del-1。Ang1描述于Suri等，細(xì)胞，871171-80(1996)；Del-1描述于Hidai等，Genes Dev.，1221-33(1998)(它們的內(nèi)容都列入本文作為參考)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，血管生成因子是midkine分子，midkine分子包括midkine蛋白。midkine分子可以是例如天然的midkine蛋白及其生物活性片斷，及其修飾和合成形式，包括衍生物、類似物和模擬物。
本文術(shù)語“蛋白質(zhì)”，“多肽”和“肽”可以互換使用，它們指的是任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，它可含有經(jīng)修飾的氨基酸，并可由非氨基酸間斷。它也可以被天然修飾或通過干涉進(jìn)行修飾；例如形成二硫鍵，糖基化，十四烷基化，乙酰基化，烷基化，磷酸化或去磷酸化。該定義中還包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的分子量一般為10至20kDa，但已從天然來源分離到分子量較高的形式，Wilkie等，Curr.Biol.，5500-507(1995)。FGF家族的至少18個(gè)成員是已知的(FGF-1至FGF-18)，但并非所有FGF家族成員的人同系物都已被克隆。生物活性不需要糖基化，因此可在真核和原核表達(dá)系統(tǒng)中重組產(chǎn)生該家族的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選所用生長(zhǎng)因子的來源與需施用生長(zhǎng)因子的患者相匹配(例如將人多效素施用于人受試者)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本文所用術(shù)語“來源”指的是蛋白質(zhì)的組織來源(如果它分離自天然來源)或氨基酸序列來源(如果該蛋白質(zhì)是重組產(chǎn)生的)。
已知大多數(shù)血管生成因子可在多種不同的“剪接變體”中產(chǎn)生。通過差異剪接基因上的一個(gè)或多個(gè)外顯子可產(chǎn)生剪接變體。在被翻譯的剪接mRNA中不可能并不保留基因中所有的外顯子。mRNA剪接的差異特異于發(fā)育階段，特定組織或病原狀態(tài)，并可導(dǎo)致由相同的基因產(chǎn)生大量不同的蛋白質(zhì)。對(duì)本發(fā)明有用的血管生成因子包括剪接變體。
適應(yīng)癥使用本文所述的方法和組合物可治療多種適應(yīng)癥。例如血管病，如外周血管病(PVD)，包括外科手術(shù)后或外傷性PVD和心血管病，如冠狀動(dòng)脈病(CAD)。其它可治療的血管病包括糖尿病性外周微血管病和其它血管病變，和由動(dòng)脈粥樣硬化病引起的跛行?？芍委煹木植咳毖孕呐K病包括不宜手術(shù)的心臟病，如伴有嚴(yán)重并發(fā)癥的心臟病。并發(fā)癥的例子包括肺病，如慢性阻塞性肺病，fragile cardiac condition和心律失常(arrythmias)。其它可治療的“不宜手術(shù)的”情形包括對(duì)麻醉，變態(tài)反應(yīng)不耐受的患者，或者接受聯(lián)合藥物治療的患者。也可治療穩(wěn)定或不穩(wěn)定的新發(fā)作心絞痛?？稍诟深A(yù)性心血管手術(shù)的同時(shí)輔助以血管生成因子療法，所述手術(shù)如冠狀動(dòng)脈旁路移植和經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(氣囊血管成形術(shù))。在手術(shù)失敗或干預(yù)后再狹窄的情況下也可實(shí)施血管生成因子療法。
本文所述的方法和組合物可用于多種創(chuàng)傷愈合應(yīng)用和治療燒傷。創(chuàng)傷愈合應(yīng)用包括慢性皮膚潰瘍，褥瘡，燒傷和久治不愈的創(chuàng)傷。也可治療由外傷引起的創(chuàng)傷，例如由事故或外科手術(shù)引起的創(chuàng)傷。
也可治療愈合緩慢或久治不愈的創(chuàng)傷，包括不形成肉芽的創(chuàng)傷。例如，可治療與糖尿病相關(guān)的創(chuàng)傷，如糖尿病性潰瘍。也可治療免疫抑制或無免疫能力的患者中出現(xiàn)的創(chuàng)傷，例如接受癌癥化療的患者，患有獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)的患者，接受移植的患者，和任何患有由藥療法引發(fā)的創(chuàng)傷愈合緩慢的患者中出現(xiàn)的創(chuàng)傷。
其它應(yīng)用包括使因切除手術(shù)或外傷繼發(fā)血液供給斷流的組織區(qū)域血管化，所述手術(shù)包括一般的手術(shù)，整形手術(shù)和移植手術(shù)，還包括治療壞疽前的局部缺血組織或斷肢再接。
本文所述的方法和組合物可用作首選療法，當(dāng)其它可以使用的療法不起作用時(shí)也可以使用本文所述的方法和組合物。由于整體健康狀況較差不能承受外科手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，或由于所患疾病的擴(kuò)散特性(其中有很多小而嚴(yán)重的損害遍布冠狀血管的血液供應(yīng)處，而不是在旁路或開口處有一個(gè)或多個(gè)主要的損害)而被醫(yī)生判定為“不宜手術(shù)的”患者，或者以前嘗試過用侵入療法矯正其疾病但沒有療效的患者可有利地接受本文所述的治療。
本文所述的方法和組合物具有多種神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)外科用途，例如用于治療腦血管疾病，如慢性腦血管功能不全，多梗死性癡呆(MID)，中風(fēng)和一般性的腦局部缺血。
其它應(yīng)用包括組織修復(fù)和加強(qiáng)以及骨修復(fù)，包括治療骨質(zhì)疏松，軟骨修復(fù)，治療關(guān)節(jié)炎，和關(guān)節(jié)置換或修復(fù)，以及毛囊靶向和治療脫發(fā)。一般，可設(shè)計(jì)本文所述的組合物，使其可用于一系列受損的內(nèi)部和外部組織，包括皮膚，生殖系統(tǒng)，生殖泌尿系統(tǒng)，肺系統(tǒng)以促進(jìn)重新血管化和內(nèi)皮修復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可用于皮膚修復(fù)和美容手術(shù)。
載體本文提供的諸如多效素分子的血管生成因子可包含在藥物可接受的載體中。載體可以是生物相容的能控制血管生成因子在原位釋放的送遞基質(zhì)。優(yōu)選血管生成因子能以穩(wěn)定的形式摻入并同時(shí)能基本上維持其活性的基質(zhì)以及生物相容的基質(zhì)。根據(jù)所選擇的送遞基質(zhì)和欲治療的適應(yīng)癥，可設(shè)計(jì)受控釋放，使其按小時(shí)、天、周或更長(zhǎng)的時(shí)間順序進(jìn)行。
將受控送遞基質(zhì)用于血管生成因子，尤其是多效素或midkine蛋白具有很多好處。受控釋放能在一段時(shí)間內(nèi)按控釋動(dòng)力學(xué)釋放劑量。在某些情況下，血管生成因子的送遞需要在幾周內(nèi)持續(xù)到達(dá)需要生成血管的位點(diǎn)。治療時(shí)，在一段時(shí)間內(nèi)(例如幾天或幾周或更長(zhǎng)時(shí)間)的受控釋放可以持續(xù)送遞血管生成因子以得到最佳的血管生成狀況。受控送遞基質(zhì)也是有利的，因?yàn)樗梢员Ｗo(hù)血管生成因子免受體液和組織中的體內(nèi)降解，例如蛋白酶降解。
可根據(jù)例如所選擇的載體等因素將送遞基質(zhì)的受控釋放設(shè)計(jì)為例如超過約12或24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。可選擇釋放時(shí)間，例如使其連續(xù)釋放約12小時(shí)至24小時(shí)；約12小時(shí)至42小時(shí)；或約12至72小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，釋放時(shí)間可持續(xù)例如約2至90天，例如約3至60天。在一個(gè)實(shí)施方案中，血管生成因子，如多效素分子在約7至21天或約3至10天的時(shí)間內(nèi)被局部送遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)多效素蛋白而言，在1，2，3或更多周內(nèi)以受控的劑量施用蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)欲治療的病癥選擇控釋時(shí)間。例如，對(duì)于創(chuàng)傷愈合而言，較長(zhǎng)的時(shí)間更加有效；而對(duì)于一些心血管應(yīng)用而言，較短的送遞時(shí)間可能更加有用。
由基質(zhì)體內(nèi)控釋血管生成因子，如多效素蛋白的量可以是例如約1ng至1mg/天，例如約50ng至500μg/天，或者在一個(gè)實(shí)施方案中，為約100ng/天。根據(jù)治療應(yīng)用，可將含有血管生成因子和載體的送遞系統(tǒng)配制成包括例如10ng至1mg血管生成因子，或者在另一個(gè)實(shí)施方案中，包括約1μg至500μg，或者約10μg至100μg血管生成因子。
送遞基質(zhì)可以是例如擴(kuò)散控制的基質(zhì)系統(tǒng)或可侵蝕的系統(tǒng)，它們描述于例如Lee，“擴(kuò)散控制的基質(zhì)系統(tǒng)”，p155-198和Ron和Langer，“可侵蝕的系統(tǒng)”，p199-224，見“有關(guān)受控藥物送遞的論文”，A.Kydonieus編，Marcel Dekker公司，紐約1992(列入本文作為參考)?；|(zhì)可以是例如可生物降解的材料，它能在原位和體內(nèi)通過水解或酶解(如蛋白酶)自發(fā)降解。任選使用血管生成因子和聚合物載體的綴合物。
送遞基質(zhì)可以是例如天然或合成的聚合物或共聚物，例如水凝膠形式的聚合物或共聚物。具有可裂解之連鍵的聚合物包括例如聚酯，聚原酸酯，聚酸酐，多糖，聚(磷酸酯)，聚酰胺，聚氨基甲酸酯，聚(亞氨碳酸酯)和聚(磷腈)。
聚酯包括聚(α-羥基酸)，如聚(乳酸)和聚(乙醇酸)及其共聚物，以及聚(己內(nèi)酯)聚合物和共聚物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，控釋基質(zhì)是聚-丙交酯-共-乙交酯。使用聚(丙交酯)和聚(乙交酯)共聚物進(jìn)行控釋描述于Lewis，“由丙交酯/乙交酯共聚物控釋生物活性劑”，見于“用作藥物送遞系統(tǒng)的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，編，Marcel Dekker，紐約，1990，p1-41(列入本文作為參考)?？梢远喾N不同的聚合物和共聚物比例得到或形成聚-丙交酯-共-乙交酯，例如100％D，L-丙交酯；85∶15 D，L-丙交酯∶乙交酯；50∶50 D，L-丙交酯∶乙交酯；和100％乙交酯，例見Lambert和Peck，控釋雜志，33189-195(1995)；和Shively等，控釋雜志，33237-243(1995)(列入本文作為參考)?？赏ㄟ^諸如熔體擠出，注射成型法，溶劑澆鑄或溶劑蒸發(fā)的方法加工聚合物。
將聚酸酐用作控釋基質(zhì)并通過熱-熔化和溶劑清除技術(shù)形成微球體描述于Chasin等，“用作藥物送遞系統(tǒng)的聚酸酐”，見于“用作藥物送遞系統(tǒng)的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，編，MarcelDekker，紐約，1990，p42-70(列入本文作為參考)。
可使用多種本領(lǐng)域可以制備得到的聚磷腈，例見Allcock，H.R.，“用作新的生物醫(yī)學(xué)和生物活性材料的聚磷腈”，見于“用作藥物送遞系統(tǒng)的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，編，Marcel Dekker，紐約，1990，p163-193(列入本文作為參考)。
可使用聚酰胺，例如聚(氨基酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物可以是聚(氨基酸)嵌段共聚物。例如，可使用血纖蛋白-彈性蛋白和血纖蛋白-膠原聚合物以及其它蛋白質(zhì)聚合物，包括殼多糖，藻酸鹽和明膠。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。基因和蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到可以設(shè)計(jì)具有受控的化學(xué)和物理特性的絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物?？蓪⑦@些蛋白質(zhì)聚合物設(shè)計(jì)成具有絲樣晶體氨基酸序列嵌段和彈性蛋白樣柔性氨基酸序列嵌段。這些材料的特性是由可得自天然蛋白質(zhì)，如絲心蛋白和彈性蛋白的短的重復(fù)寡肽序列引起的。重組的絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物描述于，例如Protein Polymer Technologies的美國(guó)專利5,496,712，5,514,581和5,641,648；Cappello，J等，生物技術(shù)進(jìn)展，6198-202(1990)；Cappello，J.，Trends Biotechnol.，8309-11(1990)；和Cappello等，生物聚合物，341049-1058(1994)(皆列入本文作為參考)。
聚(磷酸酯)可用作受控送遞基質(zhì)。具有不同側(cè)鏈的聚(磷酸酯)及其制備和加工方法描述于Kadiyala等，“聚(磷酸酯)合成，物理化學(xué)鑒定和生物反應(yīng)”，見于“合成的可生物降解的聚合物的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用”，J.Hollinger編，CRC出版社，Boca Raton，1995，p33-57(列入本文作為參考)。
可使用聚氨基甲酸酯材料，包括例如聚氨基甲酸酯酰胺分段的嵌段共聚物，其描述于例如Biomedical Polymers International的美國(guó)專利5,100,992中(列入本文作為參考)。還可使用Poloxamer聚合物，其為聚氧化烯嵌段共聚物，如氧化乙烯氧化丙烯嵌段共聚物，例如Pluronic凝膠。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，受控送遞基質(zhì)是脂質(zhì)體?？墒褂脙捎H性分子，如含脂質(zhì)的分子形成脂質(zhì)體，例見Lasic，“基因送遞所用的脂質(zhì)體”，CRC出版社，紐約，1994，p67-112(列入本文作為參考)。脂質(zhì)包括例如卵磷脂，鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇?？墒褂锰烊换蚝铣傻闹|(zhì)，例如，用于形成脂質(zhì)體的合成脂質(zhì)分子包括脂類鏈，例如二肉豆蔻?；貦磅；?，二硬脂?；王；妥貦磅；?油?；湣＿€包括膽甾醇。脂質(zhì)體及其形成方法也描述于Nassander，“脂質(zhì)體”，見于“用作藥物送遞系統(tǒng)的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，編，Marcel Dekker，紐約，1990，p261-338(列入本文作為參考)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用包括具有確定大小和分布的獨(dú)立室的異型囊狀脂質(zhì)體，例見DepoTech公司的美國(guó)專利5,422,120和5,576,017(列入本文作為參考)。
可使用含膠原，白蛋白和血纖蛋白原的材料，例見Bogdansky，“用作藥物送遞系統(tǒng)的天然聚合物”，見于“用作藥物送遞系統(tǒng)的可生物降解的聚合物”，Chasin和Langer，編，Marcel Dekker，紐約，1990，p231-259(列入本文作為參考)?？墒褂玫哪z原組合物的例子包括膠原-聚合物綴合物，例見Collagen公司的美國(guó)專利5,523,348，5,510,418，5,475,052和5,446,091(列入本文作為參考)?？梢允褂冒ㄓ坞x巰基的可交聯(lián)的改性膠原，例見Flamel Technologies的美國(guó)專利5,412,076(列入本文作為參考)。包括膠原的蛋白質(zhì)基質(zhì)也描述于Matrix Pharmaceuticals的美國(guó)專利4,619,913(列入本文作為參考)。
也可使用基于hyaluran的藥物送遞系統(tǒng)，包括例如hyaluronan或與親水性聚合物共聚化的hyaluronan或hylan，例見Biomatrix公司的美國(guó)專利5,128,326(列入本文作為參考)。
可使用本領(lǐng)域可制備得到的水凝膠，所述材料包括例如聚(異丁烯酸羥基乙基酯)(聚(HEMA))，不溶于水的聚丙烯酸酯和瓊脂糖，聚氨基酸，如藻酸鹽和聚(L-賴氨酸)，含有聚(氧化乙烯)(PEO)的聚合物和聚乙二醇(PEG)二丙烯酸酯。其它水凝膠的例子包括具有可變長(zhǎng)度的聚氧乙烯側(cè)鏈的甲氧基聚(乙二醇)單異丁烯酸酯的交聯(lián)聚合物鏈，例見Nagaoka等，“用作生物材料的聚合物”(Shalaby，S.W等編)，Plenum出版社，1983，p.381(列入本文作為參考)。
可使用的水凝膠包括親水性和疏水性的嵌段聚合物成分(例見Okano等，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志，15，393，1981)，或移植共聚物結(jié)構(gòu)(例見Onishi等，Contemporary Topics in Polymer Science，(W.J.Bailey & T.Tsuruta編)，Plenum Publ.公司，紐約，1984，p.149)和摻合物(例見Shah，聚合物，28，1212，1987；和美國(guó)專利4,369,229)(皆列入本文作為參考)。
可使用含有聚醚dl-聚丙交酯嵌段共聚物之丙烯酸封端的水溶性鏈的水凝膠，水凝膠可含有聚乙二醇，聚(α-羥酸)，如聚(乙醇酸)，聚(DL-乳酸)或聚(L-乳酸)及其共聚物或聚(己內(nèi)酯)或其共聚物。在一個(gè)實(shí)施方案中，水凝膠可含有聚(乳酸)和聚(乙醇酸)的共聚物，本文將其稱為聚-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物?？墒褂镁酆系暮徒宦?lián)的大分子單體形式的水凝膠，其中大分子單體含有親水性寡聚體，該寡聚體具有可生物降解的單體或寡聚體延伸，其自由端被能夠聚合和交聯(lián)的封端單體或寡聚體封端。親水核心自身可被降解，從而使核心和延伸部分功能相結(jié)合。在長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外光，可見光照射或熱能的影響下使用自由基引發(fā)劑可聚合大分子單體。生物降解發(fā)生在延伸寡聚體內(nèi)的連鍵處，并導(dǎo)致產(chǎn)生無毒的，易于從體內(nèi)清除的片斷。水凝膠的例子描述于美國(guó)專利5,410,016，5,626,863和5,468,505(列入本文作為參考)。
可以使用基于共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的水凝膠，其含有多肽或聚酯成分作為酶解或水解不穩(wěn)定成分，例見Jarrett等，Trans.Soc.Biomater.，Vol.XVIII，182，1995；Pathak等，大分子，26，581，1993；Park等，用于藥物送遞的可生物降解的水凝膠，Technomic Publishing公司，Lancaster，Pa.，1993；Park，生物材料，9，435，1988；和W.Shalaby等，1992(列入本文作為參考)。也可使用透明質(zhì)酸凝膠和聚羥基乙基異丁烯酸酯凝膠。
另外，送遞基質(zhì)可包括能將血管生成因子靶向送遞至身體內(nèi)預(yù)定位點(diǎn)的靶向配體。靶向配體是能與體內(nèi)位點(diǎn)特異性結(jié)合的特異性結(jié)合組成成分。例如，靶向配體可以是抗體或其片斷，受體配體，或選擇性針對(duì)或特異于所需靶位點(diǎn)的粘附分子。靶位點(diǎn)的例子包括血管細(xì)胞間粘附分子(ICAM)和內(nèi)皮細(xì)胞表面受體，如αvβ3。包括靶向配體的送遞基質(zhì)的實(shí)施方案包括與抗體綴合的脂質(zhì)體，其中抗體與脂質(zhì)體之間通過親和素-生物素接頭相連接，例見Sipkins，放射學(xué)，197276(1995)(摘要)；和Sipkins等，放射學(xué)，197129(1995)(摘要)。
制劑和給藥方法可通過本領(lǐng)域已知的多種途徑施用任選包含于載體中的血管生成因子或其制劑，所述途徑包括表面，口服，非腸道(包括靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)和皮下注射以及鼻內(nèi)或吸入給藥)和植入給藥。送遞可以是全身性的，區(qū)域性的或局部的。另外，送遞可以是鞘內(nèi)的，例如CNS送遞。例如，治療創(chuàng)傷時(shí)施用血管生成因子的方式可以是在創(chuàng)傷表面施用血管生成因子，通過腸道或非腸道途徑全身性給藥或者局部或區(qū)域性注射或植入給藥?？砂幢绢I(lǐng)域已知的方法將血管生成因子配制成適當(dāng)?shù)男问揭赃m用于不同的給藥途徑，例見“Remington藥物科學(xué)與實(shí)踐”，Mack Publishing公司，Pennsylvania，1995(列入本文作為參考)。
任選摻入控釋基質(zhì)中的血管生成因子可被配制成多種制劑形式，包括溶液，乳劑，懸浮液，粉末，片劑和凝膠。制劑中可包括本領(lǐng)域可得到的賦形劑，如稀釋劑，溶劑，緩沖液，增溶劑，懸浮劑，粘度控制劑，結(jié)合劑，潤(rùn)滑劑，表面活性劑，防腐劑和穩(wěn)定劑。制劑可包括填充劑，螯合劑和抗氧化劑。當(dāng)使用非腸道制劑時(shí)，制劑還可以，或者可以包括糖，氨基酸或電解質(zhì)。
賦形劑包括多元醇，例如分子量小于約70,000kD的多元醇，如海藻糖，甘露糖醇和聚乙二醇。例見美國(guó)專利5,589,167(列入本文作為參考)。表面活性劑包括例如非離子型表面活性劑，如吐溫表面活性劑，多乙氧基醚類，如多乙氧基醚20或80等和poloxamer，如poloxamer184或188，Pluronic(r)多元醇和其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物等。緩沖液包括Tris，檸檬酸鹽，琥珀酸鹽，醋酸鹽或組氨酸緩沖液。防腐劑包括酚，芐基醇，間甲酚，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯，氯芐烷銨(benzalconium chloride)和苯索氯銨。其它添加劑包括羧甲基纖維素，葡聚糖和明膠。穩(wěn)定劑包括肝素，戊聚糖聚硫酸酯和其它磺酸酯粘多糖(heparinoid)和二價(jià)陽離子，如鎂和鋅。
可將任選與受控送遞基質(zhì)聯(lián)合的血管生成因子加工成多種形式，包括例如微球體，微膠囊，微粒，薄膜和涂層?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的用于將藥物加工成聚合物載體的方法，例如噴霧干燥，沉淀和結(jié)晶。其它方法包括成型技術(shù)，例如溶劑澆鑄，壓縮成型，熱-熔解微囊化和溶劑清除微囊化，例見Laurencin等，“聚(酸酐)”，見于“合成的可生物降解的聚合物的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用”，J.Hollinger編，CRC出版社，Boca Raton，1995，p59-102(列入本文作為參考)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將血管生成因子包含在控釋載體中進(jìn)行局部送遞以使送遞的位置和時(shí)間受到控制較為有利。局部送遞可以到達(dá)例如選定的組織位點(diǎn)，如創(chuàng)傷或其它需要治療的區(qū)域，或者血流不足(局部缺血)的組織區(qū)域，如局部缺血的心臟組織或其它肌肉，如外周。
對(duì)于如閉塞性血管病的適應(yīng)癥而言，也可在缺血區(qū)域附近現(xiàn)存的血管系統(tǒng)附近局部施用任選與載體，如控釋基質(zhì)聯(lián)合的血管生成因子以促進(jìn)治療區(qū)域附近的血管生成。
核酸治療也可通過施用編碼血管生成因子的核酸來施用血管生成因子，因此，可治療性地施用編碼血管生成因子的核酸聚合物。編碼血管生成因子的核酸聚合物(DNA或RNA)可摻入核酸構(gòu)建體(基因轉(zhuǎn)移載體)，該載體中還包括適當(dāng)?shù)男盘?hào)(例如增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，內(nèi)含子加工信號(hào)，終止信號(hào)，poly(A)添加位點(diǎn)等)以在患者細(xì)胞中產(chǎn)生血管生成因子。編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體可以全身性，區(qū)域性，局部或表面送遞，優(yōu)選表面、局部或區(qū)域性送遞以誘導(dǎo)患者身體的細(xì)胞產(chǎn)生血管生成因子?；蛘撸蓪⒕幋a血管生成因子的核酸構(gòu)建體送遞至偏遠(yuǎn)的位點(diǎn)，它將產(chǎn)生血管生成因子并將所述因子分散至患者全身。
編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體可作為“裸露的DNA”(即不具有任何衣殼化的膜或病毒衣殼/包膜)。已知肌細(xì)胞，尤其是骨骼肌細(xì)胞以及心肌細(xì)胞可攝取裸露的DNA并表達(dá)裸露的DNA所編碼的基因。這種送遞編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體的方法是一個(gè)治療冠狀動(dòng)脈病的優(yōu)選模式?？梢跃植克瓦f含有編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體的裸露的DNA，例如通過注射至阻塞周圍區(qū)域的心肌以替代阻塞的外科手術(shù)療法或與后者聯(lián)合。使用超螺旋小環(huán)的非病毒基因送遞所用的DNA載體也可以使用，例見Darquet等，基因治療，41341-1349(1997)(列入本文作為參考)。
也可在非細(xì)胞送遞系統(tǒng)，如脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)懸浮液中送遞編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體。脂質(zhì)體在基因轉(zhuǎn)移療法中的用途是眾所周知的(例見Lee等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，14(2)173-206(1997)；Lee和Huang，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.，14173-206(1997)和Mahoto等，藥物學(xué)研究，14853-859(1997))(列入本文作為參考)。一般將編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體摻入脂質(zhì)體或與脂質(zhì)體復(fù)合，所述脂質(zhì)體可進(jìn)一步衍生化以包括靶向組成成分，如抗體、受體配體或者選擇性針對(duì)或特異于所需靶位點(diǎn)的粘附分子。用于送遞編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體的脂質(zhì)體系統(tǒng)包括DNA/陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，能包裹構(gòu)建體，將聚陽離子一凝聚的DNA截留在脂質(zhì)體中的中性或陰離子脂質(zhì)體，或本領(lǐng)域已知的其它脂質(zhì)體系統(tǒng)。
可以使用經(jīng)由受體介導(dǎo)的胞吞作用促進(jìn)靶細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)移的載體蛋白，例見Uherek等，生物化學(xué)雜志，2738835-8841(1998)。糖基化的聚(氨基酸)也是可以將基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的有用的非病毒載體，例見Kollen，Chest，11195S-96S(1997)(列入本文作為參考)?；蜣D(zhuǎn)移也可通過biolistic方法實(shí)現(xiàn)，如Furth，分子生物技術(shù)，7139-143(1997)(列入本文作為參考)所述的噴嘴注射。可以使用的非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法，例如基因槍，電穿孔，受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和人工大分子復(fù)合物描述于Zhdanov等，Vopr Med Khim，433-12(1997)(列入本文作為參考)。DNA可與蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，肽或其它具有組織靶向配體的聚合物載體復(fù)合，例見Sochanik等，Acta Biochim Pol43293-300(1996)(列入本文作為參考)。使用隨后被胞吞的凝集素配體進(jìn)行的糖靶向的用途描述于Wadhwa等，藥物靶向雜志，3111-127(1995)和Phillips，生物制品，2313-16(1995)(列入本文作為參考)。
其中摻入了編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體的病毒載體也可用于基因送遞。病毒構(gòu)建體在基因治療中的用途是眾所周知的(例見Robbins等，Trends Biotechnol.16(1)35-40(1998)中的評(píng)論)?？捎糜诨蜣D(zhuǎn)移的病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(尤其是小鼠白血病病毒，MLV，小鼠乳腺癌病毒，MMTV和人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒)，腺病毒，單純皰疹病毒和腺相關(guān)病毒。用于本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移的病毒載體可以具有復(fù)制能力，也可以不具有復(fù)制能力。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而言，目前優(yōu)選的是無復(fù)制能力的病毒載體。一般將編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體摻入載體中，通常，所述載體中包括足夠的信息，可以被特定的包裝細(xì)胞系包裝成病毒顆粒。如果病毒載體具有復(fù)制能力，病毒載體也可包括足夠的信息，以編碼復(fù)制新的感染性病毒顆粒所需的因子和信號(hào)。將摻入了編碼血管生成因子的核酸構(gòu)建體的病毒顆粒注射至或灌注至或施用于所需位點(diǎn)。
產(chǎn)生血管生成因子在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種重組產(chǎn)生血管生成因子。對(duì)不糖基化的血管生成因子，和糖基化不是其活性所必需的血管生成因子(如FGF-1和FGF-2)而言，可從天然來源純化產(chǎn)生血管生成因子，或者通過在原核或真核宿主細(xì)胞中重組表達(dá)以產(chǎn)生血管生成因子。對(duì)于糖基化是活性所必需的或需要的血管生成因子而言，從天然來源純化或在真核宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生血管生成因子是合適的。優(yōu)選通過重組表達(dá)產(chǎn)生并純化用于本發(fā)明的血管生成因子。
從天然來源純化血管生成因子的確切方法和方案取決于來源材料和特定的血管生成因子，所述方法是本領(lǐng)域眾所周知的。血管生成因子的純化方法是已知的，易于效仿。
為了重組生產(chǎn)血管生成因子，可將編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子摻入“表達(dá)構(gòu)建體”，所述構(gòu)建體中含有適當(dāng)DNA序列以介導(dǎo)重組宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，只是優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行某種改變。
已對(duì)編碼人、牛和大鼠多效素的cDNA進(jìn)行測(cè)序，F(xiàn)ang等，生物化學(xué)雜志，26725889-25897(1992)；Li等(1990)，文獻(xiàn)同上；Lai等(1992)，文獻(xiàn)同上；Kadomatsu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1511312-1318(1988)；Tomomura等，生物化學(xué)雜志，26510765-10770(1990)；Vrios等，Biochem.Biophys.Res.Commun.175617-624(1991)；和Li等，生物化學(xué)雜志，26726011-26016(1992)。然而，存在很多剪接變體，它們可產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)同種型。在一種優(yōu)選的分離自人源的同種型中，成熟的蛋白質(zhì)有136個(gè)氨基酸(例如由SEQ ID NO1的堿基573至980編碼的蛋白質(zhì))，該蛋白質(zhì)是通過從168個(gè)氨基酸長(zhǎng)的前體蛋白質(zhì)(例如由SEQ ID NO1的堿基477至980編碼的蛋白質(zhì))上蛋白酶裂解32個(gè)氨基酸的N-末端信號(hào)序列產(chǎn)生的。
人，小鼠，雞和非洲爪蟾(Xenopus laevis)的midkine cDNA已被測(cè)序(Tsutsui等，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(2)792-797(1991)；Fu等，基因，146(2)311-312；和Urios等，Biochem.Biophys.Res.Commun.175617-624(1991))。已檢測(cè)到其它的midkine mRNA，雖然似乎只在mRNA的5’非翻譯區(qū)域(5’-UTR)有所不同。優(yōu)選的人源midkine蛋白是121個(gè)氨基酸長(zhǎng)的成熟蛋白質(zhì)，它是143個(gè)氨基酸長(zhǎng)的前體蛋白質(zhì)(例見Genbank登記號(hào)M69148所公開的蛋白質(zhì)和核苷酸序列)的蛋白酶酶解加工產(chǎn)物。
VEGF家族多個(gè)不同成員的人cDNA已被克隆和測(cè)序，其中包括VEGF(Weindel等，Biochem.Biophys.Res.Commun.183(3)1167-1174(1992))，VEGF2(Hu等，國(guó)際專利申請(qǐng)WO95/24473)，VEGF-C(Joukov等，EMBO J.15(2)290-298(1996))和VEGF-D(Yamada等，基因組，42(3)483-488(1997))和VEGF相關(guān)因子VRF186和VRF167(Grimmond等，基因組研究，6(2)122-129(1996))。
FGF家族已知的cDNA序列包括FGF-1(也被稱為酸性FGF或aFGF)(Yu等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，175(4)1073-1080(1992))，F(xiàn)GF-2(也被稱為堿性FGF或bFGF)(Satoshi等，日本專利申請(qǐng)JP 1993262798)，F(xiàn)GF-5(Haub等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，87(20)8022-8026(1990))，F(xiàn)GF-6(也被稱為HST-2)(Iida等，癌基因7(2)303-309(1992))，F(xiàn)GF-8(Payson等，癌基因，13(1)47-53(1996))，F(xiàn)GF-9(Miyamoto等，分子細(xì)胞生物學(xué)，13(7)4251-4259(1993))和FGF-10(Emoto等，生物化學(xué)雜志，272(37)23191-23194(1997))。
上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(EGF)的至少3個(gè)成員是已知的，EGF(Bell等，核酸研究，14(21)8427-8446(1986))，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α，Jakowlew等，Mol.Endocrinol，2(11)1056-1063(1988))和TGF-αHIII(國(guó)際專利申請(qǐng)WO97/25349)的核酸序列可以得到。
編碼PDGF的基因也是已知的，編碼A和B鏈的mRNA已被克隆和測(cè)序，從而可以重組產(chǎn)生(Betsholtz等，自然320(6064)695-699(1986)；和Collins等，自然316(6030)748-750(1985))。
在原核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的多種方法是已知的。一般而言，僅使用血管生成因子的成熟部分(即在正常的翻譯后加工完成之后仍舊保留的血管生成因子部分)在原核細(xì)胞中表達(dá)。血管生成因子可“直接”表達(dá)(即產(chǎn)生的血管生成因子無任何融合或輔助序列)或表達(dá)為融合蛋白。在原核宿主細(xì)胞中直接表達(dá)血管生成因子一般會(huì)導(dǎo)致含有重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的“折射”體或“包涵”體的積累?？墒占w，然后再重新溶解。包涵體中產(chǎn)生的血管生成因子一般需要“重新折疊”(即重新溶解和還原，接著在允許蛋白質(zhì)采取其天然、適當(dāng)折疊的構(gòu)象的條件下氧化)以再生生物活性蛋白質(zhì)。重新折疊的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有幾種重新折疊的方法被認(rèn)為一般適用于所有蛋白質(zhì)(例見美國(guó)專利4,511,502，4,511,503和4,512,922)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法，尤其是使用從天然來源純化因子的成熟方法，可方便地純化重新折疊的血管生成蛋白。
如果要在原核宿主細(xì)胞中將血管生成因子表達(dá)為融合蛋白，那么有很多該因子的融合配對(duì)物可以使用。含有外周質(zhì)蛋白之前導(dǎo)序列的融合蛋白被分泌至革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌的外周質(zhì)中。前導(dǎo)序列常常通過分泌至外周質(zhì)間隙中而被裂解，導(dǎo)致產(chǎn)生不具有任何N-末端延伸序列的血管生成因子。當(dāng)在外周質(zhì)間隙中表達(dá)時(shí)，很多哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)因“伴侶”蛋白質(zhì)的存在和外周質(zhì)更加氧化的環(huán)境而折疊成天然，有活性的構(gòu)象。也可使用維持所表達(dá)的融合蛋白的溶解性的氨基酸序列，或用作“標(biāo)記物”的氨基酸序列(即可用于容易地鑒定或純化融合蛋白的序列)，如寡-組氨酸，或身為細(xì)菌細(xì)胞生物素化底物的序列來制備融合蛋白。不能被天然地適當(dāng)裂解的融合蛋白也可含有可用于除去融合配對(duì)物序列的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。所述序列是本領(lǐng)域眾所周知的。如上所述，作為融合蛋白產(chǎn)生的血管生成因子可能需要重新折疊。重新折疊之后，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法，尤其是使用從天然來源純化因子的成熟方法進(jìn)一步純化血管生成因子。
在真核細(xì)胞中重組生產(chǎn)蛋白質(zhì)是眾所周知的。血管生成因子可在任何真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，所述細(xì)胞包括但不限于芽殖或裂殖酵母，昆蟲細(xì)胞，如黑腹果蠅(D.melanogaster)細(xì)胞系，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和植物。如果宿主細(xì)胞是能識(shí)別并適當(dāng)裂解人信號(hào)序列的宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞系)，則可將血管生成因子的完整編碼區(qū)摻入表達(dá)構(gòu)建體，或者僅使用編碼成熟蛋白質(zhì)的那部分序列。用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體是本領(lǐng)域眾所周知的。產(chǎn)生血管生成因子的優(yōu)選系統(tǒng)包括煙草植物/煙草花葉病毒系統(tǒng)，桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。當(dāng)血管生成因子是多效素且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)，優(yōu)選表達(dá)構(gòu)建體含有多效素的開放閱讀框(ORF)，該閱讀框與異源5’-和3’-序列相連，因?yàn)樘烊?’-和3’-序列可與編碼人蛋白質(zhì)，如hsp70的mRNA形成反義復(fù)合物。
除了重組生產(chǎn)外，也可合成生產(chǎn)血管生成因子。例如，可使用本領(lǐng)域已知的固相技術(shù)合成具有血管生成活性的天然生長(zhǎng)因子肽，包括肽片斷。另外，使用本領(lǐng)域已知的有機(jī)合成技術(shù)也可合成可用作生長(zhǎng)因子模擬物的類似物，例見March，“高級(jí)有機(jī)化學(xué)”，John Wiley &Sons，紐約，1985。類似物包括小分子肽模擬物以及與天然血管生成因子或其片斷同源的合成的活性肽同系物。
本文提及的所有參考文獻(xiàn)都列入本文作為參考。
下列非限制性的實(shí)施例有助于理解本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1體外使用血管生成因子按Fang等，生物化學(xué)雜志，26725889-25897(1992)所述分離重組人多效素(PTN)。為了測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)PTN體外刺激之后增殖增加的百分比，使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法將內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，#CRL-1730)以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于12孔組織培養(yǎng)板中的2ml含10％胎牛血清的F12K培養(yǎng)基中(Life Technologies(Rockville MD)，分別為#11765054和#16140071)。約6小時(shí)之后，細(xì)胞附著于培養(yǎng)板上，在每個(gè)待處理的孔中加入50ng溶于50μl PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽水)中的PTN(6個(gè)處理組，每組n＝6)。在每個(gè)對(duì)照孔(n＝6)中僅加入等體積的PBS以測(cè)定背景增殖水平。在每個(gè)24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，從孔中除去培養(yǎng)基，用2ml PBS洗滌細(xì)胞2次，再補(bǔ)充2ml培養(yǎng)基；只是對(duì)12小時(shí)組而言，在每個(gè)12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)充一次培養(yǎng)基。在每個(gè)24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)再補(bǔ)充相同劑量的PTN直至所示的處理時(shí)間，然后僅補(bǔ)充培養(yǎng)基。一周結(jié)束時(shí)，使細(xì)胞解粘附，并通過標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)計(jì)數(shù)。

圖1顯示了減去平均背景(未處理的)增殖之后，每個(gè)處理組中的平均增加百分比。
實(shí)施例2體內(nèi)用血管生成因子治療小鼠創(chuàng)傷按實(shí)施例1所述分離PTN。為了測(cè)定體內(nèi)局部PTN處理對(duì)小鼠皮下血管系統(tǒng)的影響，在每組5只(n＝10)的BALB/c小鼠(HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)松弛的肋部皮膚下雙側(cè)注射基質(zhì)植入體。為了制備植入體，將溶于PBS溶液(上述)的PTN蛋白混合于室溫下為液體的MatrigelTM(Collaborative Research，MA)中，使?jié)舛冗_(dá)到10μg/ml。按類似方法制備對(duì)照植入體，但緩沖液中不含PTN。由于溫度升高至室溫以上但低于37℃體溫時(shí)基質(zhì)溶液變?yōu)槟z，使用16號(hào)針頭以每個(gè)位點(diǎn)1ml的量將基質(zhì)溶液注射至皮下囊內(nèi)。在體溫下，凝膠溶液變成部分固化的基質(zhì)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，處死相應(yīng)組的小鼠，使用標(biāo)準(zhǔn)的微型測(cè)徑器測(cè)定植入體區(qū)域標(biāo)志性血管的總體密集程度和直徑。圖2顯示了經(jīng)處理(+PTN)和未經(jīng)處理(-PTN)的組在整個(gè)處理時(shí)間內(nèi)聚生血管的平均大小。
實(shí)施例3使用受控送遞基質(zhì)在體內(nèi)生成血管按實(shí)施例1所述得到PTN。為了測(cè)定持續(xù)進(jìn)行局部PTN處理對(duì)體內(nèi)功能性血管系統(tǒng)的影響，使用了眾所周知的Folkman CAM(雞絨毛尿囊膜)試驗(yàn)。將受精5天的雞蛋(local Leghorn white，Half Moon Bay，CA)蛋殼打開一部分之后，將VasotrophinTM系統(tǒng)(Angiogenix公司，Burlingame，CA)置于直徑約為15mm的CAM的前緣。所用VasotrophinTM系統(tǒng)是500μl可生物侵蝕的沉淀物，所述沉淀物由配制成聚(丙交酯-共-乙交酯)基質(zhì)(PLGA，Absorbable PolymerTechnologies，Birmingham，AL)的1μg/ml PTN組成，或者各含有500ng PTN。按類似的方法產(chǎn)生對(duì)照沉淀物，但不含PTN。在接下去的兩周，用肉眼觀察CAM，觀察到血管生長(zhǎng)模式的差異，通過解剖顯微鏡照相機(jī)顯像。
含生長(zhǎng)因子的Vasotrophin系統(tǒng)附近的血管的密集程度和管徑都有顯著的提高。血管朝著沉淀物的方向呈放射狀向內(nèi)生長(zhǎng)或定向生長(zhǎng)。在對(duì)照CAM中，血管按照與完全未處理(膜上未放置任何東西)的CAM相同的方式持續(xù)生長(zhǎng)。相比較而言，對(duì)照血管要稀疏得多，直徑也小得多；而且不是朝著沉淀物的方向生長(zhǎng)。這表明局部持續(xù)暴露于PTN會(huì)直接和特異性地刺激血管密度和管徑增加。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人Colley，Kenneth(ii)發(fā)明名稱治療性的血管生成因子及其使用方法(iii)序列數(shù)1(iv)聯(lián)系地址(A)收件人MORRISON and FOERSTER(B)街道755 PAGE MILL ROAD(C)城市Palo Alto(D)州CA(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼94304-1018(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)Windows(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0b(vi)當(dāng)前申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?
(B)申請(qǐng)日(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名Jihnston，Made1ine I(B)代理號(hào)36,174(C)參考/文檔號(hào)39084-30001.00(ix)聯(lián)系信息(A)電話650-813-5600(B)傳真650-494-0792(C)電傳706141(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1383堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1AAGTAAATAA ACTTTAAAAA TGGCCTGAGT TAAGTGTATT AAAAAGAAGA AATAGTCGTA60AGATGGCAGT ATAAATTCAT CTCTGCTTTT AATAAGCTTC CCAATCAGCT CTCGAGTGCA120AAGCGCTCTC CCTCCCTCGC CCAGCCTTCG TCCTCCTGGC CCGCTCCTCT CATCCCTCCC180ATTCTCCATT TCCCTTCCGT TCCCTCCCTG TCAGGGCGTA ATTGAGTCAA AGGCAGGATC240AGGTTCCCCG CCTTCCAGTC CAAAAATCCC GCCAAGAGAG CCCCAGAGCA GAGGAAAATC300CAAAGTGGAG AGAGGGGAAG AAAGAGACCA GTGAGTCATC CGTCCAGAAG GCGGGGAGAG360CAGCAGCGGC CCAAGCAGGA GCTGCAGCGA GCCGGGTACC TGGACTCAGC GGTAGCAACC420TCGCCCCTTG CAACAAAGGC AGACTGAGCG CCAGAGAGGA CGTTTCCAAC TCAAAAATGC480AGGCTCAACA GTACCAGCAG CAGCGTCGAA AATTTGCAGC TGCCTTCTTG GCATTCATTT540TCATACTGGC AGCTGTGGAT ACTGCTGAAG CAGGGAAGAA AGAGAAACCA GAAAAAAAAG600TGAAGAAGTC TGACTGTGGA GAATGGCAGT GGAGTGTGTG TGTGCCCACC AGTGGAGACT660GTGGGCTGGG CACACGGGAG GGCACTCGGA CTGGAGCTGA GTGCAAGCAA ACCATGAAGA720CCCAGAGATG TAAGATCCCC TGCAACTGGA AGAAGCAATT TGGCGCGGAG TGCAAATACC780AGTTCCAGGC CTGGGGAGAA TGTGACCTGA ACACAGCCCT GAAGACCAGA ACTGGAAGTC840TGAAGCGAGC CCTGCACAAT GCCGAATGCC AGAAGACTGT CACCATCTCC AAGCCCTGTG900GCAAACTGAC CAAGCCCAAA CCTCAAGCAG AATCTAAGAA GAAGAAAAAG GAAGGCAAGA960AACAGGAGAA GATGCTGGAT TAAAAGATGT CACCTGTGGA ACATAAAAAG GACATCAGCA1020AACAGGATCA GTTAACTATT GCATTTATAT GTACCGTAGG CTTTGTATTC AAAAATTATC1080TATAGCTAAG TACACAATAA GCAAAAACAA CCAATTTGGG TTCTGCAGGT ACATAGAAGT1140TGCCAGCTTT TCTTGCCATC CTCGCCATTC GAATTTCAGT TCTGTACATC TGCCTATATT1200CCTTGTGATA GTGCTTTGCT TTTTCATAGA TAAGCTTCCT CCTTGCCTTT CGAAGCATCT1260TTTGGGCAAA CTTCTTTCTC AGGCGCTTGA TCTTCAGCTC TGCGAAATTC CTTCGCTTTT1320TCTTAAGGGT TTCTGGCACA GCAGGAACCT CCTTCTTCTT CTCTTCTACA CCCTCTATGT1380ACC138權(quán)利要求
1.刺激需要生成血管的人或動(dòng)物中的血管生成的方法，所述方法包括給人或其它動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的多效素或midkine分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中多效素或midkine分子是多效素或midkine蛋白。
3.權(quán)利要求1的方法，其中載體包括可控釋多效素或midkine分子的控釋基質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中載體包括能將多效素或midkine分子靶向到體內(nèi)預(yù)定位點(diǎn)的配體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中將分子施用于血管系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將分子施用于心血管系統(tǒng)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中施用治療有效量的分子以治療選自冠狀動(dòng)脈病和缺血性心臟病的病癥。
8.權(quán)利要求1的方法，其中將分子施用于外周血管系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中施用治療有效量的分子以治療選自糖尿病性外周血管病變和外周動(dòng)脈粥樣硬化病的病癥。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在創(chuàng)傷部位局部施用治療有效量的分子以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。
11.權(quán)利要求10的方法，其中創(chuàng)傷選自潰瘍，褥瘡，外科手術(shù)導(dǎo)致的創(chuàng)傷和外傷導(dǎo)致的創(chuàng)傷。
12.權(quán)利要求1的方法，其中給含有神經(jīng)的組織局部施用治療有效量的分子以治療神經(jīng)病。
13.權(quán)利要求12的方法，其中施用治療有效量的分子以治療選自中風(fēng)，多-梗死性癡呆和一般性腦局部缺血的病癥。
14.權(quán)利要求1的方法，其中給含有骨或軟骨的組織局部施用治療有效量的分子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中施用治療有效量的分子以治療選自骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)置換或修復(fù)的病癥。
16.權(quán)利要求1的方法，其中分子是多效素蛋白。
17.權(quán)利要求1的方法，其中分子是多效素分子，并且該多效素分子是分離自人細(xì)胞來源的多效素蛋白或其活性片斷或其類似物。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白質(zhì)是在真核宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。
19.權(quán)利要求1的方法，其中分子是midkine分子，并且該midkine分子是分離自人或動(dòng)物細(xì)胞來源的midkine蛋白或其活性片斷或其類似物。
20.權(quán)利要求3的方法，其中控釋基質(zhì)包括聚合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中聚合物包括可生物降解的或可生物侵蝕的聚合物。
22.權(quán)利要求20的方法，其中聚合物選自聚(酯)，聚(酸酐)和聚(氨基酸)。
23.權(quán)利要求20的方法，其中聚合物是絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。
24.權(quán)利要求1的方法，其中載體包括脂質(zhì)體。
25.權(quán)利要求24的方法，其中脂質(zhì)體含有能將脂質(zhì)體靶向到體內(nèi)預(yù)定位點(diǎn)的靶向配體。
26.權(quán)利要求1的方法，其中在器官移植位點(diǎn)局部施用治療有效量的分子以促進(jìn)移植物移入宿主中。
27.刺激需要血管生成的人或動(dòng)物中的血管生成的方法，所述方法包括給人或動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的血管生成因子，所述載體含有絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中血管生成因子選自多效素，midkine，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族成員，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)家族成員，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員。
29.刺激需要血管生成的人或動(dòng)物中的血管生成的方法，所述方法包括給人或動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的血管生成因子，所述載體含有聚-丙交酯-共-乙交酯；其中血管生成因子選自多效素和midkine分子。
30.用于給人或動(dòng)物治療性送遞多效素或midkine分子的藥物可接受的組合物，所述組合物中含有多效素或midkine分子和藥物可接受的載體。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中多效素或midkine分子是多效素或midkine蛋白。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中載體包括能控釋該分子的聚合物。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中聚合物選自聚(酯)，聚(酸酐)和聚(氨基酸)。
34.權(quán)利要求32的組合物，其中聚合物是可生物降解或可生物侵蝕的。
35.權(quán)利要求32的組合物，其中聚合物是絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物。
36.權(quán)利要求30的組合物，其中載體包括脂質(zhì)體。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中載體包括脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體含有能將脂質(zhì)體靶向至體內(nèi)預(yù)定位點(diǎn)的靶向配體。
38.權(quán)利要求36的組合物，其中脂質(zhì)體包括異囊型脂質(zhì)體。
39.權(quán)利要求30的組合物，其中分子是多效素分子。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中多效素分子是分離自人細(xì)胞來源的多效素蛋白或其活性片斷或其類似物。
41.權(quán)利要求30的組合物，其中分子是midkine蛋白。
42.刺激需要血管生成的人或動(dòng)物中的血管生成的方法，所述方法包括給人或動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的基因轉(zhuǎn)移載體，所述基因轉(zhuǎn)移載體能編碼產(chǎn)生多效素或midkine蛋白。
43.權(quán)利要求42的方法，其中基因轉(zhuǎn)移載體編碼產(chǎn)生多效素蛋白。
44.權(quán)利要求42的方法，其中基因轉(zhuǎn)移載體編碼產(chǎn)生midkine蛋白。
45.權(quán)利要求43的方法，其中基因轉(zhuǎn)移載體是裸露的DNA。
46.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法包括聯(lián)合使用基因轉(zhuǎn)移載體和脂質(zhì)體。
47.權(quán)利要求43的方法，其中基因轉(zhuǎn)移載體是病毒載體。
48.權(quán)利要求44的方法，其中基因轉(zhuǎn)移載體是裸露的DNA。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述方法包括聯(lián)合使用基因轉(zhuǎn)移載體和脂質(zhì)體。
50.權(quán)利要求44的方法，其中基因轉(zhuǎn)移載體是病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了刺激需要血管生成的人或動(dòng)物中的血管生成的方法,還提供了含有血管生成因子和藥物可接受載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述方法包括給人或其它動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的血管生成因子,例如多效素或midkine蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中,載體包括可控釋血管生成因子的控釋基質(zhì),如聚合物。該聚合物是可生物降解的和/或可生物侵蝕的,優(yōu)選是可生物相容的?？捎糜诳蒯尩木酆衔锇ɡ缇?酯),聚(酸酐)和聚(氨基酸)。聚合物包括例如絲彈性蛋白聚(氨基酸)嵌段共聚物和聚－丙交酯－共－乙交酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中,血管生成因子可包含在含有脂質(zhì)體,如異囊型脂質(zhì)體的載體中被提供。如脂質(zhì)體的載體可含有能將脂質(zhì)體靶向體內(nèi)預(yù)定位點(diǎn)的靶向配體?？梢越o血管系統(tǒng),例如心血管系統(tǒng)或外周血管系統(tǒng)施用血管生成因子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,血管生成因子是多效素蛋白或midkine蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中,提供了刺激人或動(dòng)物中的血管生成的方法,所述方法包括給人或動(dòng)物施用治療有效量的包含在藥物可接受載體中的基因轉(zhuǎn)移載體,所述基因轉(zhuǎn)移載體能編碼產(chǎn)生多效素或midkine蛋白?；蜣D(zhuǎn)移載體可以是例如裸露的DNA或病毒載體,并且可以例如與脂質(zhì)體聯(lián)合使用。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1379681SQ99806834
公開日2002年11月13日 申請(qǐng)日期1999年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月17日
發(fā)明者K·J·考雷 申請(qǐng)人:安喬格尼克斯公司