專利名稱：穩(wěn)定化的瞬時基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)導(dǎo)入真核培養(yǎng)細(xì)胞的外源基因的瞬時表達(dá)的方法和試劑。
背景技術(shù)：
外源DNA導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞可用于許多目的。例如，該技術(shù)可提供遺傳互補(bǔ)的方法鑒定特定基因，例如表達(dá)對代謝途徑關(guān)鍵的酶的基因可通過其拯救該途徑缺陷的細(xì)胞的能力來鑒定。外源基因的導(dǎo)入也可以是為了將受體細(xì)胞暴露于正常情況下對該細(xì)胞而言非天然的高劑量蛋白質(zhì)中，例如為了殺死惡性細(xì)胞而導(dǎo)入細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)。此外，可將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞以獲得足夠多的外源基因的蛋白產(chǎn)物，以便可收獲該蛋白用于進(jìn)一步研究或用作藥物。此外，外源基因的導(dǎo)入可看作體細(xì)胞基因治療的有前途的途徑?；蛑委煹哪繕?biāo)是通過提供缺失或缺陷基因的有功能的拷貝或提供用于治療目的的臨時治療性外源基因產(chǎn)物，來治愈先天的遺傳缺陷。體細(xì)胞基因治療的一個途徑是離體策略，其中從機(jī)體分離細(xì)胞，將轉(zhuǎn)基因DNA插入細(xì)胞，然后將該細(xì)胞導(dǎo)回機(jī)體。在另一個途徑中，用直接導(dǎo)入患者體內(nèi)的外源DNA靶向體內(nèi)細(xì)胞。有多種方法可用于外源基因?qū)牖罴?xì)胞。
可將轉(zhuǎn)染方法分為設(shè)計(jì)成獲得外源基因“瞬時”或“穩(wěn)定”表達(dá)兩類。對于現(xiàn)有方法，這兩類結(jié)果之間的劃分界限是導(dǎo)入的DNA是否整合至宿主基因組中，已整合外源DNA的細(xì)胞通常稱為“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化相比，轉(zhuǎn)染DNA的瞬時表達(dá)并不依賴于外源DNA整合至宿主細(xì)胞染色體。盡管人們認(rèn)為施加給細(xì)胞的大多數(shù)DNA被迅速轉(zhuǎn)入核內(nèi)，但在一些系統(tǒng)中，在轉(zhuǎn)染后長達(dá)80小時仍可檢測到表達(dá)而不存在任何可檢測的整合(見例如Gorman,C.,DNA克?、颍瑢?shí)用方法(DNA CloningⅡ,A Practical Approach),Glover,D.M.,編輯，IRL Press,Oxford，第143-190頁(1985)；Wynshaw-Boris等，生物技術(shù)(BioTechniques)，4:104-117(1986))。在瞬時表達(dá)可檢測之前無需篩選步驟。然而，典型地，攝取了外源DNA的細(xì)胞僅有約1-10％從未整合的外源基因轉(zhuǎn)錄mRNA(見例如Gorman等，核酸研究(Nucl.Ac.Res.)，11:7631-7648(1983))。盡管在瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)染DNA沒有整合至宿主DNA中，但在約0.001-1％的這些細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DNA的確獲得整合(Alam和Cook，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)，188:245-254(1990))。該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的少部分細(xì)胞被認(rèn)為在緊接著轉(zhuǎn)染之后觀察到的外源基因表達(dá)圖譜中無顯著或有用的作用。已開發(fā)了用病毒載體增加整合外源DNA的最初轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例的方法(Flamant等，國際發(fā)育生物學(xué)雜志(Int.J.Dev.Biol.)，38:751-757(1994)；Bilbao等，F(xiàn)ASEB J.,11:624-634(1997))。
不經(jīng)過選擇步驟，外源基因的表達(dá)通常在兩至三天內(nèi)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物中消失。典型地，在約48小時表達(dá)最高，并只在24-80小時可檢測到(Gorman(1985)；Wynshaw-Boris等(1986)；Berthold,W.,Dev.Biol.Stand.,83:67-79(1994))。普遍認(rèn)為轉(zhuǎn)染細(xì)胞攝取的大多數(shù)DNA被核酸酶迅速降解或被細(xì)胞分裂稀釋(見例如Gorman(1985)；用陽離子脂試劑進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染指南(Guide to Eukaryotic Transfection with Cationic LipidReagents)，生物技術(shù)(Life Technologies)；Bilbao等(1997))。
因?yàn)樗矔r表達(dá)不要求靶細(xì)胞處于活躍分裂，所以它可在非正常分裂的定期分化細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)，盡管對轉(zhuǎn)染的易感性在這些細(xì)胞中變化非常大。例如，當(dāng)直接注射至鼠骨骼肌中時，裸DNA可長時期表達(dá)(Wolff等，科學(xué)(Science)，247,1465-1468(1990))。在其它研究中，裸DNA被用作疫苗(如Cohen,J.,科學(xué)，259,1691-1692(1993))，缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于利用成肌細(xì)胞作為載體遞送轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(Partridge和Davies,Brit.Med. Bull.,51:123-137(1995))。
許多研究集中于在體內(nèi)用脂質(zhì)體遞送外源DNA至肝細(xì)胞中(見例如，Wu和Wu，生物化學(xué)雜志(J.Bioil.Chem.)263:14621-14624(1988)；Chow等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,248:506-13(1989)；Wu等，生物化學(xué)雜志，264:16985-16987(1989)；Kaneda等，生物化學(xué)雜志，264:12126-12129(1989a)；Kaneda等.科學(xué)，243:375-378(1989b)；Wilson等，生物化學(xué)雜志，267:963-967(1992a)；Wilson等，生物化學(xué)雜志，267:11483-11489(1992b)；Chowdhury等，生物化學(xué)雜志，268:11265-11271(1993)；Perales等，美國國家科學(xué)院院刊91:4086-4090(1994)；Kormis和Wu，肝病研討會(Seminars in Liver Disease),15:257-267(1995)；Buolo等，Mol.Marine Bid.Biotech.,5:167-174(1996))。外源DNA靶向特定體內(nèi)組織的一個途徑是受體介導(dǎo)的脂質(zhì)體遞送(見Kormis和Wu(1995)的評論)。在將該策略應(yīng)用于肝時，Wu和他的同事們利用了肝細(xì)胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體將注入的脂質(zhì)體靶向肝。許多出版物描述了該脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)(Wu和Wu(1988)；Wu等(1989)；Wilson等(1992a)；Wilson等(1992b)；Chowdhury等(1993)；Perales等(1994))。脫唾液酸糖蛋白和與聚賴氨酸形成靜電復(fù)合物的DNA一起包裝在脂質(zhì)體中。當(dāng)最初的努力成功之后，該小組試圖通過對受體大鼠進(jìn)行部分肝切除使外源DNA的穩(wěn)定整合最大化。因?yàn)樵偕渭?xì)胞提供比正常肝中存在的更高比例的S期細(xì)胞，這種策略期望增加可整合外源DNA的肝細(xì)胞的比例。在部分肝切除手術(shù)后，轉(zhuǎn)染后血液中可檢測到轉(zhuǎn)基因蛋白的時間長達(dá)11周(Wu等(1989))。最初，這些研究者認(rèn)為注射的DNA已經(jīng)整合，但后來的實(shí)驗(yàn)揭示沒有可檢測的整合DNA，相反，顯示保留的外源DNA留存在原生質(zhì)膜/核內(nèi)體部分中(Wilson等(1992b)；Chowdhury等(1993))。此驚人發(fā)現(xiàn)說明部分肝切除通過獨(dú)立于DNA合成本身的機(jī)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因DNA存留。其他人報(bào)道了通過改變DNA與脂質(zhì)的比例改善使用脂質(zhì)體遞送載體轉(zhuǎn)染的效率(Buolo等(1996))。
另一個小組也采用靶向策略將注射的DNA導(dǎo)向肝(Kaneda等(1989a)；Kaneda等(1989b))。在此，轉(zhuǎn)基因DNA和核內(nèi)正常存在的蛋白質(zhì)即非組蛋白染色體蛋白質(zhì)一起包裝在脂質(zhì)體中。他們觀察到注射的小泡向肝細(xì)胞的核轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在注射后可測到的轉(zhuǎn)基因表達(dá)長達(dá)7或8天。然而該DNA并未整合至肝細(xì)胞染色體中。其他人報(bào)道了CaPO4-DNA沉淀直接注射至肝、脾或腹膜后外源DNA在體內(nèi)成功表達(dá)(Kaneda等(1989a))。
已顯示許多試劑增加體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率。一個小組報(bào)道在CaPO4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH，可實(shí)現(xiàn)高達(dá)50％的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率(Chen和Okayama，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.),7:2745-2752(1987))。
另一種報(bào)道增強(qiáng)轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)的試劑是丁酸或它的鈉鹽(Gorman等(1983))。將細(xì)胞暴露在丁酸鈉中12小時后，Gorman等觀察到表達(dá)轉(zhuǎn)基因的受體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加了2-4倍，當(dāng)該結(jié)構(gòu)中加入SV40增強(qiáng)子時，外源基因表達(dá)水平增加了25-100倍。在用存在丁酸鹽時轉(zhuǎn)染的其它培養(yǎng)物篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體時，他們觀察到產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對照相比顯著增加。但是，Palermo等(生物技術(shù)雜志(J.Biotech.)，19:35-48(1991))等觀察到無論丁酸鹽在轉(zhuǎn)染步驟中是否存在，它都可誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增加。的確，許多報(bào)道證明丁酸鹽能誘導(dǎo)某些蛋白質(zhì)的合成或增加體外細(xì)胞分化(Boffa等，生物化學(xué)雜志，256:9612-9621(1981)；Kruh，分子細(xì)胞生物化學(xué)(MoL Cell.Biochem.)42:65-82(1982)；Chabanas，等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.),183:141-151(1985)；Parker，生物化學(xué)雜志，261:2786-2790(1986)；Kooistra，等，Biochem.J.,247:605-612(1987)；Kaneko，等，Canc. Res.,50:3101-3105(1990)；Nathan等，Exp.Cell Res.,0:76-84(1990)；Palermo等，(1991)；Kosaka等，Exp.Cell Res.,2:46-51 5(1991)；和Oh等，Biotechnol.Bioeng.,42:601-610(1993))。基因誘導(dǎo)的最佳丁酸鹽濃度根據(jù)不同細(xì)胞類型而變化，其細(xì)胞毒性作用最小的適當(dāng)濃度范圍必須對每一類靶細(xì)胞通過經(jīng)驗(yàn)確定(見例如，Gorman(1985)；Parker等(1986)；Oh等(1993))。有報(bào)道稱丁酸(或丁酸鹽)還能可逆地抑制培養(yǎng)細(xì)胞的生長(Boffa等(1981))，增強(qiáng)干擾素的抗腫瘤作用(Kruh,1982)。
在沒有篩選步驟時如果有增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率和持續(xù)時間的方法和試劑，則瞬時表達(dá)，即未整合外源DNA的表達(dá)，的有用性將可極大地改善。
而且，本文證明本發(fā)明化合物抑制培養(yǎng)細(xì)胞對培養(yǎng)基中的葡萄糖的消耗，從而迫使細(xì)胞依賴替代碳源作為能源。同樣這些細(xì)胞顯示產(chǎn)氨增加，從而提示蛋白質(zhì)被用作能源的替代來源。此外，這些化合物存在時生長的細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)和分泌內(nèi)源性的堿性磷酸酶活性。
本發(fā)明還提供通過各種遞送系統(tǒng)導(dǎo)入靶細(xì)胞的外源基因的長期瞬時表達(dá)，運(yùn)送系統(tǒng)包括但不限于陽離子脂(即脂質(zhì)體)和各種合成聚合物如樹狀聚合物(也稱“星形(starburst)”聚合物；例如見美國專利5,661,025)。本發(fā)明化學(xué)化合物許多影響外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞很久之后的外源基因表達(dá)的命運(yùn)，因此其作用不依賴于導(dǎo)入DNA的方法。一些本發(fā)明化合物在導(dǎo)入外源DNA后的頭四天內(nèi)對增加表達(dá)程度特別有效，因此看起來增加攝入細(xì)胞內(nèi)的初始DNA量，和/或增加表達(dá)DNA的細(xì)胞的比例，而其它化合物延長瞬時表達(dá)的持續(xù)時間。
本發(fā)明化合物含有疏水部分和酸性部分，后者可采取鹽或酯的形式。而且，它們是生物適合的，也就是說，當(dāng)以增強(qiáng)瞬時表達(dá)的有用濃度應(yīng)用于細(xì)胞時，50％以上的細(xì)胞保持存活。
本發(fā)明的方法涉及將所述化合物分為“A型”制劑，其主要增加外源DNA加至細(xì)胞后頭4天中瞬時表達(dá)的程度，和“B型”制劑，其主要在外源DNA進(jìn)入細(xì)胞之后穩(wěn)定瞬時表達(dá)。在本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案中，通過如下方法獲得表達(dá)在轉(zhuǎn)染步驟之前、過程中、之后用A型化合物或制劑處理細(xì)胞，并在導(dǎo)入外源DNA后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)(如12-60小時)再加入B型化合物或制劑，其后使它與細(xì)胞接觸。在轉(zhuǎn)染步驟之前和過程中的時期稱為“瞬時表達(dá)第一期”，外源DNA進(jìn)入靶細(xì)胞之后的時期稱為“瞬時表達(dá)第二期”。通常在貫穿瞬時表達(dá)兩個時期在培養(yǎng)基中保持至少一種A型化合物。本發(fā)明還提供測定單個化學(xué)化合物效力的分析方法，進(jìn)而提供用于瞬時表達(dá)兩個時期的兩或多個化合物組成的制劑。
與以前觀察到的相比，本發(fā)明的化學(xué)化合物使活細(xì)胞能在長得多的時期內(nèi)維持外源DNA的瞬時表達(dá)。而且，加入這些化合物之后，令人驚奇的是，培養(yǎng)細(xì)胞減少對葡萄糖的消耗，同時增加其它能源如蛋白質(zhì)也可能還有脂類的利用。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在無飼養(yǎng)細(xì)胞和無需用蛋白質(zhì)類或其它粘著促進(jìn)分子預(yù)先包被細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)時培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法。
附圖簡述參考如下詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的上述方面和許多伴隨的優(yōu)點(diǎn)將更容易理解和更好地理解，其中

圖1顯示暴露于本發(fā)明幾種不同化合物中的細(xì)胞的生長曲線。圖1圖示實(shí)施例4和表7所述的一些平板的細(xì)胞生長量。圖1插入框中的數(shù)字相應(yīng)于表7中所列的平板數(shù)；圖2圖解說明一些化合物的細(xì)胞毒性，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于表7。圖2插入框中的數(shù)字相應(yīng)于表7中所列的平板數(shù)；和圖3圖解說明實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每對柱型圖相應(yīng)于表10所示的其中一個平板，如圖所標(biāo)明。這些實(shí)驗(yàn)涉及在各種延長瞬時表達(dá)持續(xù)時間的化學(xué)化合物存在時類似肝細(xì)胞的分化豬PICM-19 3BT細(xì)胞中的瞬時表達(dá)。
圖4圖解說明實(shí)施例8所述實(shí)驗(yàn)中每天收獲的樣品中測量的β-半乳糖苷酶的量，還說明了在穩(wěn)定瞬時表達(dá)的化合物存在時培養(yǎng)于生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的長期穩(wěn)定化(即32天)。
圖5A-5C圖解說明實(shí)施例8所述實(shí)驗(yàn)每天取樣的培養(yǎng)基中氨、葡萄糖和乳酸的濃度。圖5A顯示每個樣品中所測量的氨濃度；圖5B顯示每個樣品中所測量的葡萄糖濃度；圖5C顯示每個樣品中所測量的乳酸濃度。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明對于外源基因的表達(dá)采用瞬時表達(dá)比穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，采用瞬時表達(dá)可快速分析相對大數(shù)量的結(jié)構(gòu)。其次，它可作為遞送僅希望在發(fā)病期間存在于機(jī)體中的治療蛋白的方法。而且，瞬時表達(dá)可避免標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化程序所引起的突變或細(xì)胞死亡的危險，在標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化程序中外源DNA可插入細(xì)胞的關(guān)鍵基因中。此外，瞬時表達(dá)可在未永生化的原代細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體只能從可在培養(yǎng)中長期存活和分裂的細(xì)胞來建立。但是，除了肝切除模型外，目前已知的瞬時表達(dá)方法的一個主要缺點(diǎn)一直是外源基因表達(dá)時間相對短，以及轉(zhuǎn)染試劑包括純化的DNA本身傾向?qū)罴?xì)胞有毒。而且，肝切除或其它手術(shù)切除對大多數(shù)實(shí)際目的而言過于激烈。因此，本發(fā)明提供拓寬該方法適用性的穩(wěn)定化瞬時表達(dá)的方法。定義轉(zhuǎn)染本文術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的任何方法，包括脂質(zhì)體介導(dǎo)法、病毒載體、CaPO4-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖、裸DNA、與蛋白質(zhì)復(fù)合的DNA、在星形聚合物(樹狀聚合物)存在時轉(zhuǎn)染、或其它將DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法。
外源DNA/轉(zhuǎn)基因DNA適當(dāng)制備用于受體真核細(xì)胞中表達(dá)的遺傳物質(zhì)，典型地但不必需來源于受體細(xì)胞以外的生物。典型地，轉(zhuǎn)基因DNA含有生物學(xué)活性蛋白或蛋白域的編碼區(qū)(轉(zhuǎn)基因)。轉(zhuǎn)基因DNA通常為環(huán)狀，并可連接真核啟動子或其它在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)外源基因功能性轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)信號。調(diào)節(jié)信號可包括結(jié)合RNA聚合酶的啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止信號、poly(A)添加信號等。增強(qiáng)子可是組織特異的或可誘導(dǎo)的，而且指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因蛋白分泌的信號肽可加在該結(jié)構(gòu)中以產(chǎn)生分泌至培養(yǎng)基中的融合蛋白。
β-半乳糖苷酶(β-gal)可將無色底物轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀讬z測的有色產(chǎn)物的細(xì)菌酶。該基因在以下實(shí)施例中用作說明本發(fā)明效用的代表性外源基因。
“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”描述外源基因(“轉(zhuǎn)基因”)導(dǎo)入活宿主細(xì)胞的過程。表達(dá)或含有外源DNA的宿主細(xì)胞稱為“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”，轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞的過程稱為“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。不同細(xì)胞類型對轉(zhuǎn)化的易感性不同，典型地，導(dǎo)入外源DNA的程序通過調(diào)節(jié)各種參數(shù)來優(yōu)化，所述參數(shù)有例如pH、培養(yǎng)基類型、DNA量、CO2濃度、或DNA導(dǎo)入方法(參見例如Chen和Okayama，分子細(xì)胞生物學(xué)7:2745-2752(1987)；Buolo等(1996))。
用于增強(qiáng)外源基因瞬時表達(dá)的本發(fā)明方法和試劑在多種真核細(xì)胞中有效，例如腫瘤細(xì)胞系、分化細(xì)胞和非永生化原代細(xì)胞。已顯示有效的具體細(xì)胞系包括人結(jié)腸癌細(xì)胞、鼠黑素瘤細(xì)胞、豬原代肝細(xì)胞和類似分化肝細(xì)胞的豬細(xì)胞系。
對于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA可采用任何方便的方法導(dǎo)入細(xì)胞，包括但不限于脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、與CaPO4-DNA共沉淀孵育、玻璃珠、與DEAE-葡聚糖孵育、將DNA連入病毒載體等。對于脂轉(zhuǎn)染，將DNA與脂質(zhì)體結(jié)合，脂質(zhì)體是聚集形成膜結(jié)構(gòu)的脂分子形成的充滿液體的囊泡。DNA分子可包在脂質(zhì)體中或與脂質(zhì)體膜相連。作為外源基因?qū)爰?xì)胞的方法，將脂質(zhì)體與受體細(xì)胞融合。盡管應(yīng)用廣泛，脂轉(zhuǎn)染的一個局限是脂質(zhì)體對活真核細(xì)胞多少有毒。在其它常用方法中，DNA可與CaPO4共沉淀，然后應(yīng)用于細(xì)胞，或者通過與DNA形成靜電復(fù)合物的DEAE-葡聚糖聚合物介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入，該復(fù)合物通過胞吞作用內(nèi)在化至細(xì)胞中(Kormis和Wu,Seminars Liv.Dis.,15:257-267(1995))。轉(zhuǎn)染程序的實(shí)例到處可見(見例如，Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)，第2版(1989)，其以參考文獻(xiàn)并入本文；Gorman,C.,第6章，第143-190頁，DNA克隆Ⅱ一實(shí)用方法(DNA CloningⅡ-A Practical Approach),IRLPress,Oxford(1985),Glover,D.M.編；Wynshaw-Boris等，生物技術(shù)(BioTechniques),4:104-119(1986)；Chang,Pi.(編)，體細(xì)胞基因治療(Somatic Gene Therapy),CRC Press,1995；和“用陽離子脂試劑進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染指南”(Guide to Enkaryotic Transfection with Cationic LipidReagents),Life Technologies(Gibco-BRL)；Matthews和Keating，分子生物技術(shù)(Molec.Biotech.),5:259-261(1996))。還可使用電穿孔，其涉及用短暫高壓電脈沖將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞((見例如Barsoum,J.,分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology),48:225-237(1995))。
過去，當(dāng)外源DNA以CaPO4共沉淀形式或使用DEAE-葡聚糖導(dǎo)入細(xì)胞時，觀察到最初大多數(shù)細(xì)胞攝取DNA，但其中僅小部分在DNA導(dǎo)入后表達(dá)DNA(見例如，Gorman(1985))。典型地，采用現(xiàn)有程序轉(zhuǎn)染DNA的表達(dá)是短暫的。更少的小部分受體細(xì)胞(0.1-0.001％)通過將轉(zhuǎn)染DNA共價連入宿主基因組使其穩(wěn)定整合(見例如Wynshaw-Boris等(1986))。觀察到的低水平共價整合的可能原因是要發(fā)生外源DNA整合必需存在活躍的DNA合成。因此，通常認(rèn)為細(xì)胞只有在細(xì)胞周期的S期時才對穩(wěn)定轉(zhuǎn)化易感。然而，因?yàn)檗D(zhuǎn)染培養(yǎng)物中僅有極少部分細(xì)胞含有整合的外源DNA，所以從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蛋白的量很少甚至不可檢測。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化程序通常依賴于轉(zhuǎn)染后篩選步驟來增加穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的比例(如 Kelleher和Vos(1994))。當(dāng)采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染程序時，在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞之后2-3天內(nèi)瞬時表達(dá)典型地衰退至不可檢測水平，除非轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該選擇培養(yǎng)基有利于穩(wěn)定整合了轉(zhuǎn)染DNA的細(xì)胞的生長或利于含有整合DNA的細(xì)胞的檢測和克隆(如Gorman(1985)；Buolo等(1996))。
可在各種實(shí)驗(yàn)條件下選擇分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的純系培養(yǎng)物，以獲得整合了外源基因和持續(xù)表達(dá)該基因的細(xì)胞系。典型地，可篩選基因，例如賦予藥物抗性或編碼生色蛋白的基因，可與編碼目標(biāo)蛋白的DNA同時導(dǎo)入宿主細(xì)胞。適于該目的的報(bào)告基因的例子包括細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、細(xì)菌β-半乳糖苷酶等(見例如Alam和Cook，分析生物化學(xué)，188:245-2S4(1990))。如果使用藥物抗性標(biāo)記，必需將藥物抗性細(xì)胞暴露于相關(guān)藥物數(shù)周，以便穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞在培養(yǎng)物中占優(yōu)勢。此外，含有整合DNA的細(xì)胞可通過如下共轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)來鑒定，該共轉(zhuǎn)染基因可將生色底物轉(zhuǎn)化為允許鑒定和手工克隆單個穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的有色物質(zhì)。在極少數(shù)情況下，目標(biāo)基因本身賦予穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞可篩選性狀。無論何種情況，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的建立和分離將需要一到三個月完成(Wynshaw-Boris等(1986))。相反，轉(zhuǎn)染步驟之后，根據(jù)本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在非篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即該培養(yǎng)基沒有選擇性殺死缺乏轉(zhuǎn)基因蛋白的細(xì)胞的藥物，而且該方法不使用生色或其它方式區(qū)分或物理分離未整合DNA的細(xì)胞和含有外源DNA的細(xì)胞。還有，采用本發(fā)明方法，細(xì)胞持續(xù)表達(dá)可檢測量的轉(zhuǎn)基因蛋白的時間遠(yuǎn)超過用傳統(tǒng)方法可望獲得的約80小時。采用本發(fā)明方法，轉(zhuǎn)染后4-5天乃至32天均可檢測到轉(zhuǎn)染的外源DNA的同源DNA和RNA。應(yīng)用本發(fā)明方法時，瞬時表達(dá)典型地在約第2-3天內(nèi)達(dá)到最高，然后降低至約初始水平的1/3，之后穩(wěn)定保持7天至數(shù)周，盡管該模式根據(jù)所用的一或多種試劑不同可能會改變。因此，本發(fā)明特別有用的特征是它提供相對長時期的瞬時表達(dá)而無需建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物所用的冗長篩選步驟。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在非選擇培養(yǎng)基上維持至少4天后檢測到外源蛋白。非選擇性培養(yǎng)基可是組織培養(yǎng)基，或當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞存在于活宿主時可是血、血漿或細(xì)胞外液體。對本公開發(fā)明的該實(shí)施方案以及所有其它的實(shí)施方案來說，“試劑”理解為除了表達(dá)載體或轉(zhuǎn)基因DNA本身之外的化學(xué)化合物。當(dāng)該化學(xué)化合物從細(xì)胞培養(yǎng)基中除去后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)逐漸消失并且細(xì)胞恢復(fù)以前的行為。
盡管大多數(shù)病毒載體僅在活躍分裂的細(xì)胞中有效，來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的載體可用于將外源DNA導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞(見例如Verma和Somia，自然(Nature),389:239-242(1997))，通常其并不整合。腺病毒在用于瞬時表達(dá)時顯得尤為有效(例如Kelleher和Vos(1994))。如果需要，含有外源DNA的質(zhì)?；虿《据d體可提供位于啟動子和插入位點(diǎn)之間或插入位點(diǎn)之后的核苷酸序列，以便載體提供的核苷酸序列編碼的一或多個氨基酸與外源DNA編碼的蛋白質(zhì)融合。這種融合序列可提供指導(dǎo)所期望翻譯后修飾的多肽，例如分泌信號肽，或糖基附著位點(diǎn)。
對于根據(jù)本發(fā)明的瞬時表達(dá)，在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞之前、過程中或之后，將細(xì)胞與一或多種下述化學(xué)化合物接觸，隨后外源DNA的表達(dá)與不存在這些化合物時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比實(shí)質(zhì)性增強(qiáng)?！霸鰪?qiáng)瞬時表達(dá)”是指當(dāng)采用本發(fā)明方法時轉(zhuǎn)染之后頭幾天內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的量與對照相比增加了，或者是指瞬時表達(dá)期間與對照相比延長了，或兼而有之。對于這些方法，轉(zhuǎn)染細(xì)胞與增加初始DNA攝取或表達(dá)效率、或者延長外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后的有效半衰期的一或多種化學(xué)試劑接觸。單個化合物可能發(fā)揮上述兩種作用?！巴庠碊NA的有效半衰期”的確定是基于測量培養(yǎng)樣品中存在的轉(zhuǎn)基因蛋白的量，而不是直接測量轉(zhuǎn)基因DNA的量。
可用于本發(fā)明方法的具體試劑包括多種化學(xué)化合物，其特征以下將作全面描述。“試劑”可由單一化學(xué)化合物或兩或多種化合物的組合組成。而且該試劑可包括在瞬時表達(dá)第一期中施用的一或多種化合物以及外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后添加的其它一或多種化合物。這些瞬時表達(dá)增強(qiáng)試劑可存在于外源DNA導(dǎo)入之前、過程中或之后。當(dāng)在導(dǎo)入DNA之后加至細(xì)胞時，該試劑典型地與細(xì)胞保持接觸至少24小時或更長。
用作本發(fā)明方法試劑的化學(xué)化合物包括至少一個疏水部分和至少一個酸性部分。即使輕微疏水的部分，例如具有一個二碳鏈的部分，也可為本發(fā)明提供足夠的疏水性。酸性和疏水部分可存在于單個試劑中，例如疏水有機(jī)分子。對于某些該化學(xué)化合物，酸性部分可修飾成鹽或酯。在一個實(shí)施方案中，化學(xué)化合物是羧酸衍生物，其通用分子式是R1-C(=O)OR2，在另一個實(shí)施方案中，化學(xué)化合物是磺酸衍生物，其通用分子式是R7-SO2-OR8。
適合的羧酸衍生物(即R1-C(=O)-OR2)包括天然存在的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)、它們的非天然旋光異構(gòu)體、和某些氨基酸衍生物(例如3-甲基-L-組氨酸，α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、葉酸、谷胱甘肽、馬尿酸、高絲氨酸、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲酰-L-甲硫氨酸和鳥氨酸)。
關(guān)于通用羧酸衍生物分子式R1-C(=O)-OR2，對于氨基酸而言，R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的側(cè)鏈。可用于本發(fā)明方法的其它氨基酸衍生物包括還含有烷基取代基和具有其它功能基團(tuán)的烷基取代基的氨基酸。這些氨基酸衍生物可用上述羧酸衍生物分子式表示，其中R1是-CHNH2(CH2)nR5，n=1-7，R5選自CH3、OH、CONH2、C6H4OH和CONHNH2?；蛘撸琑1是-(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；-CH(CO2H)NHCONH2，或者R1是-C5H4N(即尼克酸和衍生物)。
除了氨基酸，可用于本發(fā)明方法的羧酸衍生物包括烷基、芳基和取代的烷基和芳基羧酸衍生物。優(yōu)選的烷基和取代烷基羧酸衍生物可用上述通用分子式表示，其中R1是-(CH2)nR6，其中n=1-9,R6選自吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2和NHC(=NH)NH2。優(yōu)選的芳基羧酸衍生物包括苯甲酸和它的衍生物。苯甲酸衍生物可用上述分子式表示，其中R1是-C6H4R4，這里R4選自H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3和O(CH2)nCH3，其中n=1-3。已發(fā)現(xiàn)支鏈常常比直鏈更有效。
本發(fā)明中有用的羧酸衍生物包括羧酸(即R2是H)；羧酸酯(如R2是CH3和(CH2)nCH3，其中n=1-8)，包括具有其它功能基團(tuán)如醚和酮基的酯(如R2是(CH2)xO(CH2)yCH3和(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7)；和羧酸鹽，包括金屬鹽(如鋰、鈉、鉀、鈣和鎂)和相對低分子量的陽離子(如銨)。
適合的磺酸衍生物可用通用分子式R7-SO2-OR8表示，它包括烷基、芳基、取代烷基和芳基磺酸衍生物(即，R7是烷基、芳基、取代烷基和芳基)。優(yōu)選地，磺酸衍生物是低級烷基(即直鏈或支鏈C1-C5烷基)磺酸，更優(yōu)選氨基取代的低級烷基磺酸，例如?；撬?。優(yōu)選地，芳香磺酸衍生物是苯磺酸衍生物，更優(yōu)選氨基取代苯磺酸，例如3-氨基苯磺酸。本發(fā)明中有用的磺酸衍生物包括磺酸(即R8是H)、磺酸鹽包括金屬鹽(如R8是鋰、鈉、鉀、鈣或鎂)和相對低分子量的有機(jī)陽離子(如R8是銨離子)。
在另一個實(shí)施方案中，可用作本發(fā)明方法試劑的化學(xué)化合物包括多糖，既包括天然存在的多糖如來自植物或動物來源的多糖，它們常常以羧化形式天然存在，也包括用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)程序羧化的多糖。例如幾丁質(zhì)或纖維素可用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法羧化。
對本發(fā)明有用的多糖包括糖胺聚糖，糖胺聚糖是具有重復(fù)二糖單位的線性聚合物，所述二糖單位包含一個氨基已糖和一個羧酸或磺酸酯或二者兼有(綜述見Hascall等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)230:390-417(1994))。天然存在的糖胺聚糖有4類(ⅰ)透明質(zhì)酸；(ⅱ)硫酸軟骨素和硫酸皮膚素；(ⅲ)硫酸角蛋白；和(ⅳ)硫酸肝素和肝素。天然狀態(tài)的后三種類型是蛋白多糖，即它們與蛋白質(zhì)鏈共價連接。這些蛋白多糖必須在去蛋白之后才對本發(fā)明方法有效。去蛋白作用可通過任何方便的方法來實(shí)現(xiàn)，例如在堿如KOH或NaOH中加熱(Bray等，1944；Partridge,S.M.,Biochem J. 43:387-397(1948))。
對本發(fā)明特別有用的化合物是磺酸化的氨基多糖。正常不含硫的天然存在氨基多糖如透明質(zhì)酸或半乳甘露聚糖可采用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)如通過在硫酸存在時加熱來修飾。優(yōu)選地，多糖是磺酸化N-乙酰氨基多糖。如果在轉(zhuǎn)染步驟之后添加，多糖試劑通常對增強(qiáng)瞬時表達(dá)最有效。
用于本發(fā)明的磺酸化N-乙酰氨基多糖的制備效率隨聚合物的大小而變化。典型地，適合的多糖含有從約1到約50個重復(fù)單位，優(yōu)選1-20個重復(fù)單位，更優(yōu)選1-10個重復(fù)單位，重復(fù)單位通常包含一個二糖。因此，優(yōu)選的磺酸化N-乙酰氨基多糖平均分子量不大于20 kDa，更優(yōu)選不大于9 kDa，最優(yōu)選不大于4 kDa。從天然來源提取的磺酸化氨基多糖通常由20 kDa或更大的聚合物構(gòu)成，但可采用本領(lǐng)域熟知的方法將大聚合物打斷變成更小更適合大小的聚合物。這些方法通常包括首先在堿性溶液、然后在酸性溶液中加熱該聚合物(如，Bray等，Biochem.J.38:142，(1944))。在硫酸中加熱可同時磺酸化和打斷多糖鏈。應(yīng)該理解，多糖制品在大小上不是均一的，指定多糖制品的大小只是近似的。多糖制品的平均分子量可采用本領(lǐng)域已知的方法通過電泳確定，如Partridge,S.M.,(1948)?！捌骄肿恿俊笔侵冈陔娪臼聚欀杏^察到的峰值處聚合物的大小或平均值，或采用其它大小測定分析方法觀察到的平均值。
優(yōu)選的磺酸化N-乙酰氨基多糖包括硫酸軟骨素、肝素和硫酸皮膚素。硫酸軟骨素是結(jié)締組織天然存在的成分，通常從軟骨提取物中純化。它在分子量、重復(fù)二糖的N-乙酰半乳糖胺殘基處的磺化程度和硫酸化重復(fù)單位與非硫酸化重復(fù)單位的相對分布上均有變化。硫酸軟骨素的商業(yè)制品典型地含有可變的軟骨素-6-硫酸(C6)和軟骨素-4-硫酸(C4)的比例。“A型”硫酸軟骨素制品通常含有30％的C6異構(gòu)體和70％的C4異構(gòu)體，而“C型”硫酸軟骨素制品通常含有10％的C4和90％的C6。A型和C型硫酸軟骨素制品均可從例如Sigma或Biorelease公司獲得。例如Biorelease公司提供幾種A型制品No.409-4U(4 kDa)；No.409(9 kDa)；和No.4D36(＞20 kDa)。A型(主要是C4)和C型(主要是C6)制品均對增強(qiáng)瞬時表達(dá)有效。
優(yōu)選的多糖包括半乳甘露聚糖，它是從Cyamopsis tetragonolobus種子的胚乳作為具有與甘露聚糖主鏈相連的α-1,6-連接的D-半乳糖殘基的高分子量β-1,4 D-半乳甘露聚糖(如達(dá)到約1,200,000道爾頓)而分離的。適于本公開方法的半乳甘露聚糖包括2-羥丙基醚衍生物，通稱為羥丙基半乳甘露聚糖。商業(yè)上可購得的半乳甘露聚糖制品可通過先進(jìn)行斷裂和磺化來更有效地增強(qiáng)瞬時表達(dá)。這可通過例如在硫酸中加熱來實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明方法中有用的其它化學(xué)化合物包括腎上腺素、輔酶B12和甲鈷胺。
對增強(qiáng)瞬時表達(dá)有效的化學(xué)化合物具有下列共同期望特征1．在有效增強(qiáng)瞬時表達(dá)的濃度范圍內(nèi)加入培養(yǎng)細(xì)胞時很少或沒有細(xì)胞毒性。對于多糖試劑，該范圍是約0.01-0.5 mM。對于其余可有效增強(qiáng)瞬時表達(dá)的化合物，該濃度是約1-15 mM。這些最佳量是可能已作為細(xì)胞培養(yǎng)基成分而存在的這些物質(zhì)(如某些氨基酸)的量之外的。根據(jù)本分析沒有細(xì)胞毒性的化合物在此定義為“生物適合的”。對于本發(fā)明而言，細(xì)胞毒性物質(zhì)可定義為持續(xù)暴露于給定濃度的該物質(zhì)時在SW480細(xì)胞的8天靜止培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)染后4天內(nèi)導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)降低＞50％的物質(zhì)，其中到這8天時期結(jié)束時不出現(xiàn)細(xì)胞的凈增加。然而，應(yīng)理解各種細(xì)胞類型對不同的化學(xué)化合物的敏感性不同。因此，雖然可用SW480作為測定化學(xué)化合物生物適合濃度的方便工具，但可能需要按經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)用SW480測定的濃度，以優(yōu)化不同類型細(xì)胞的生物適合性。細(xì)胞毒性分析在實(shí)施例4中有更詳細(xì)的描述。
2．總含有一個陰離子功能基團(tuán)(例如羧基、磺酸基等)，通常是酸，并且可修飾該基團(tuán)以降低細(xì)胞毒性。優(yōu)選的修飾是形成酯或鹽(包括基于有機(jī)陽離子的鹽)，因?yàn)樵摶衔镞M(jìn)入細(xì)胞后，鹽和酯鍵可容易被代謝過程斷裂。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶液中該化學(xué)化合物的pH為4.5-10.5。
3．除了陰離子基團(tuán)外，該分子還包括相對疏水的有機(jī)基團(tuán)。對于磺酸化多糖以外的化合物而言，分子的這部分優(yōu)選是非極性和疏水性的。同樣，通過相對疏水的功能基團(tuán)的存在可修飾磺酸化多糖的天然親水特性(例如，硫酸軟骨素的2-取代位的N-乙酰基是一個修飾的氨基，該基團(tuán)與未修飾的氨基相比相對疏水)。許多證明對本發(fā)明有效的化合物含有有機(jī)和疏水的酸性基團(tuán)。
4．幾種最有效的試劑(例如50/50的苯甲酸和苯甲酸鈉的混合物(苯甲酸緩沖液)，以及硫酸軟骨素)具有抗氧化和自由基清除特性(如見MerckIndex)。
以下，磺酸化氨基多糖以外的化合物將稱為“組Ⅰ”，而多糖試劑稱為“組Ⅱ”。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞之前和之間(即轉(zhuǎn)染步驟)用選自組Ⅰ的化學(xué)化合物接觸細(xì)胞，外源DNA導(dǎo)入之后進(jìn)一步用選自組Ⅱ的化學(xué)化合物接觸細(xì)胞。無論在轉(zhuǎn)染之前、過程中或之后加至細(xì)胞，組Ⅰ化合物均有效，然而組Ⅱ化合物在細(xì)胞攝取外源DNA之后加入時是最有效的。組Ⅰ化合物最優(yōu)選在DNA加入培養(yǎng)物之前、過程中和之后都存在。
應(yīng)注意，在同種化合物用于增強(qiáng)瞬時表達(dá)的不同實(shí)驗(yàn)中觀察到一些變化。在觀察到低于期望程度增強(qiáng)的情況下，該現(xiàn)象與轉(zhuǎn)染溶液中檢測到的高水平內(nèi)毒素相關(guān)，內(nèi)毒素水平的測定使用實(shí)施例10所述LAL分析進(jìn)行。因此，建議通過在存在細(xì)菌最少的條件下制備所有瞬時表達(dá)溶液，例如在標(biāo)準(zhǔn)無菌條件的超凈工作臺中制備該溶液，以最小化內(nèi)毒素污染。使用這些條件，通常獲得0.015-0.06的LAL水平(見表12)，該水平遠(yuǎn)低于FDA條例注射水允許的0.25 Eu/ml最大值?？稍鰪?qiáng)轉(zhuǎn)染的內(nèi)毒素水平上限還未測定，但在一個實(shí)驗(yàn)中，用含有0.24 Eu/ml的溶液可觀察到增強(qiáng)瞬時表達(dá)。因此，該上限似乎大于0.24并且可能在0.5-1.0 Eu/ml之間。
本發(fā)明提供用于延長培養(yǎng)細(xì)胞瞬時表達(dá)的方法，所述培養(yǎng)細(xì)胞包括原代培養(yǎng)物、已建立的細(xì)胞系、分化細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)物、生長因子維持的正常細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞例如從各種腫瘤建立的培養(yǎng)物，包括雜交瘤細(xì)胞、SW480 P3人結(jié)腸癌細(xì)胞系(ATCC#CCL228以下稱為＂SW480細(xì)胞＂)。本發(fā)明方法有效的特定細(xì)胞系的例子包括IB-3細(xì)胞(人支氣管上皮細(xì)胞系)；ATCC No.BP6-FO細(xì)胞(鼠黑素瘤)；PICM-9(豬外胚層來源的肝干細(xì)胞樣細(xì)胞)；COS-7；CHO-K1；人黑素瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明方法還對外源DNA導(dǎo)入體內(nèi)細(xì)胞有用。所述化合物可采用任何方便的方法施用，包括口服、局部給藥、輸注、注射、或肺氣溶膠遞送。如果希望將宿主暴露化學(xué)化合物限制于接受外源DNA的組織，則可通過局部注射導(dǎo)入化學(xué)化合物，例如直接注射至實(shí)體瘤塊、或通過將靶向特定組織的蛋白整合在脂質(zhì)體中、或?qū)⒒衔锊⑷刖徛到獾陌牍腆w生物適合聚合物?？稍谧⑸渫庠碊NA遞送載體的同時或之后，相同位點(diǎn)注射化合物或化合物的組合。作為替代，可將化合物置于在靶位點(diǎn)提供化合物緩釋的載體中，例如通過惰性固體生物適合載體的溶解來進(jìn)行。此外，本發(fā)明化合物可與裸DNA共施用，由此增加它們的有效性。
本發(fā)明包括收獲或檢測在上述化合物存在時導(dǎo)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)的蛋白質(zhì)?？刹捎萌魏畏奖愕姆椒ㄊ斋@蛋白，例如提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞、或提取細(xì)胞生長培養(yǎng)基，如外源蛋白設(shè)計(jì)含有分泌信號肽的情況。給定蛋白的純化步驟將取決于該蛋白的物理性質(zhì)，如大小、形狀、疏水性、穩(wěn)定性等。收獲的蛋白可用物理方法如凝膠電泳、等電聚焦，或?qū)游龇ㄈ绺邏阂合鄬游龅葯z測或定量。還可在數(shù)天的期間內(nèi)重復(fù)檢測轉(zhuǎn)基因蛋白以監(jiān)測所產(chǎn)生蛋白的相對或絕對量，從而提供評價不同轉(zhuǎn)染方法效率或被測化合物效力以估計(jì)其增強(qiáng)瞬時表達(dá)的能力的方法。粗細(xì)胞提取物可用于分析收獲蛋白的酶學(xué)或其它生物學(xué)活性，或者可采用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)一步純化該蛋白，然后進(jìn)行該蛋白活性的功能分析。如果轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)表達(dá)，則可從宿主的體液如乳汁或其它機(jī)體組織收獲蛋白。
本發(fā)明方法導(dǎo)致在培養(yǎng)真核細(xì)胞或瞬時表達(dá)的哺乳動物宿主中快速生產(chǎn)有用量的轉(zhuǎn)基因編碼蛋白。對于真核來源的轉(zhuǎn)基因，在真核細(xì)胞中表達(dá)是特別有利的，因?yàn)樗鏊拗骷?xì)胞可支持剪接和翻譯后修飾。而且，從真核細(xì)胞收獲的蛋白質(zhì)比從細(xì)菌宿主收獲的蛋白質(zhì)更不可能含有有毒污染物。
本發(fā)明方法提供從轉(zhuǎn)染的真核宿主細(xì)胞獲得商業(yè)上有用數(shù)量的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)如生長因子、激素、抗生素等而無需轉(zhuǎn)染后篩選步驟也無需建立含有穩(wěn)定整合外源DNA的永久細(xì)胞系的方法。這些方法可擴(kuò)大用于快速獲得待測其藥物學(xué)特性的生物物質(zhì)。
用選自本發(fā)明組Ⅱ的化學(xué)化合物接觸細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞粘著、細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸和通訊增加，因此，施用這些化合物提供了增強(qiáng)這些細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的方法。因此，本發(fā)明包括通過在加至培養(yǎng)基中的磺酸化氨基多糖存在時生長細(xì)胞來增強(qiáng)細(xì)胞貼附培養(yǎng)基質(zhì)從而增加培養(yǎng)細(xì)胞壽命的方法。例如，肝細(xì)胞在培養(yǎng)時正常不能存活，除非提供飼養(yǎng)細(xì)胞或預(yù)先用促進(jìn)肝細(xì)胞貼壁的物質(zhì)包被培養(yǎng)基質(zhì)(見例如，Sidhu和Omiecinski,藥物遺傳學(xué)(Pharmacogenetics),5:24-36(1995))。然而，硫酸軟骨素對促進(jìn)具有分化肝細(xì)胞特征的細(xì)胞系培養(yǎng)物長期生長有效。與表面基質(zhì)結(jié)合的硫酸軟骨素以前被提議可用于在控制處于表面上的細(xì)胞模式的裝置中提供細(xì)胞粘附表面(美國5,593,814)。其他人報(bào)道聯(lián)合其它化合物一起施用硫酸軟骨素以促進(jìn)培養(yǎng)或體內(nèi)的細(xì)胞粘附(美國5,593,814；美國4,458,678；美國4,418,691；美國4,711,780；美國5,545,722)。
當(dāng)本發(fā)明試劑接觸培養(yǎng)細(xì)胞時，該細(xì)胞顯示代謝過程改變，包括葡萄糖消耗降低和乳酸產(chǎn)生以及產(chǎn)氨增加。因此，本發(fā)明方法可用于操作細(xì)胞代謝以便該細(xì)胞利用替代的碳源如氨基酸和肽甚至可能是脂質(zhì)。對操作細(xì)胞能源利用特別有用的試劑是苯甲酸、4-乙基苯甲酸、硫酸軟骨素和苯甲酸鹽緩沖劑的組合，其中苯甲酸鹽緩沖劑是苯甲酸和苯甲酸鈉的等摩爾混合物。本發(fā)明方法可用于體外或體內(nèi)操作細(xì)胞代謝，如治療哺乳動物肥胖。
還有，組Ⅰ和Ⅱ化合物均誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)可用標(biāo)準(zhǔn)堿性磷酸酶分析檢測的提高水平的內(nèi)源磷酸酶活性?？稍谵D(zhuǎn)染細(xì)胞中測量到的該磷酸酶的量就在轉(zhuǎn)基因基因產(chǎn)物開始從轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中消失之前似乎增加或出現(xiàn)峰值。因此，定期測量該磷酸酶活性提供了一種監(jiān)測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)以便能預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)的降低的方法。
本發(fā)明提供增強(qiáng)體外和體內(nèi)瞬時表達(dá)的試劑。最佳地，這些化合物在外源DNA導(dǎo)入之前、之間和之后施用，組Ⅱ化合物在DNA導(dǎo)入之后施用。當(dāng)在體內(nèi)使用時，組Ⅰ化合物可作為引子注射至受體組織或，與轉(zhuǎn)基因DNA溶液混合靜脈內(nèi)注射，或在注射導(dǎo)入外源基因之后施用，或可作為食物補(bǔ)劑施用。例如腫瘤可通過直接注射化學(xué)化合物來預(yù)先處理，然后注射DNA，再然后口服相同或不同化合物的補(bǔ)劑。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生長于生物反應(yīng)器(即持久維持細(xì)胞于模擬實(shí)體瘤的半固體塊中的培養(yǎng)系統(tǒng))的細(xì)胞中獲得外源基因穩(wěn)定化瞬時表達(dá)的方法。在該模型瘤系統(tǒng)中發(fā)展的程序可用于將表達(dá)抗腫瘤化合物如IL-2的基因直接轉(zhuǎn)染至實(shí)體瘤，并可作為測定新的抗腫瘤候選藥物的測試系統(tǒng)。
組Ⅰ和組Ⅱ化合物似乎通過不同機(jī)制起作用增強(qiáng)瞬時表達(dá)，因?yàn)閮山M化合物的組合常常比分開使用這些化合物時更有效(見如實(shí)施例6)。在本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)染之前、過程中、之后用組Ⅰ的一或多種化合物接觸細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染步驟之后用組Ⅱ的一種化合物即磺酸化多糖接觸細(xì)胞。
為便于描述可用作延長瞬時表達(dá)持續(xù)時間的試劑的化學(xué)化合物，定義了下列參數(shù)。這些參數(shù)稱為“X”因子、“G”因子和“K”因子。
1．X因子X=100-A×100C]]>其中“A”是在所選時間期間內(nèi)對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)量，“C”是加入了化學(xué)化合物的細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。
該因子反映了加至轉(zhuǎn)染細(xì)胞的化學(xué)化合物在轉(zhuǎn)染后頭四天中增強(qiáng)穩(wěn)定瞬時表達(dá)的程度。對于有穩(wěn)定瞬時表達(dá)活性的化學(xué)化合物，X的值將大于1。例如，如果在一種化合物存在時表達(dá)加倍，則X=50。優(yōu)選的化合物X大于10，最優(yōu)選的化合物X大于25。該因子提供了一種比較轉(zhuǎn)染后頭四天培養(yǎng)基中存在本發(fā)明化學(xué)化合物時觀察到的外源基因表達(dá)的量和缺乏該化合物的對照培養(yǎng)物中觀察到的表達(dá)的量的方法。因此，X因子與存在和不存在該化合物時觀察到的表達(dá)量之間的比例相關(guān)。當(dāng)所述試劑為一種以上化學(xué)化合物的混合物時可同樣計(jì)算X值。
累積蛋白表達(dá)即“A”和“C”的值，通過對培養(yǎng)細(xì)胞等分試樣每天測量的值求和來測量。
2．G因子。G因子與X因子只有評價的時間期間不同。為了計(jì)算G因子，從第4-7或4-14天測量表達(dá)的蛋白量，其中第0天是外源DNA加至細(xì)胞中的當(dāng)天。下標(biāo)表示兩個時間期間中哪一個作為測量基礎(chǔ)。因此，“G7”表明是在第4-7天進(jìn)行的測量，而“G14”表明測量是在第4-14天進(jìn)行的。象“X”因子一樣， 其中“A”和“C”的定義同X因子。
根據(jù)X和G因子描述化合物是有用的，因?yàn)橐恍較低或?yàn)樨?fù)值的化合物可能具有較高或正的G因子。具有高G7或G14的化合物對DNA已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞之后即在瞬時表達(dá)的第二期中向培養(yǎng)物加入一或多種化合物的瞬時表達(dá)特別有用。優(yōu)選的化合物G＞0，更優(yōu)選G＞10，最優(yōu)選G＞25。
3．K因子。K因子是對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源DNA表達(dá)變化的速度常數(shù)與暴露于本發(fā)明化學(xué)化合物的細(xì)胞中外源DNA表達(dá)變化的速度常數(shù)之比。K根據(jù)下列等式確定 其中”k(DNA)”是轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)的蛋白質(zhì)濃度變化的一級速度常數(shù)，它是蛋白質(zhì)隨時間變化的函數(shù)，即-d(DNA)dt=k(DNA),]]>它等價于log(DNA)=-kt2.303+log(DNA)0.]]>為方便起見，此處使用術(shù)語“d(DNA)”，反映轉(zhuǎn)染DNA有效濃度的變化，盡管觀察到的外源基因產(chǎn)物的量的變化可能還取決于細(xì)胞中外源DNA濃度以外的參數(shù)。因此，對照轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中一級反應(yīng)速度表示為-k(DNA)=d(DNA)/dt，或log(DNA)=-kt/2.303+log(DNA)0。因此當(dāng)log(DNA)對時間作圖時，Y截距或log(DNA)0反映了表達(dá)的轉(zhuǎn)染DNA的起始濃度。而且，當(dāng)表達(dá)降低時該線的斜率等于-k(DNA)/2.303。
使用外源DNA加至細(xì)胞之后約24小時開始進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)測量結(jié)果，k(DNA)值可通過使用計(jì)算機(jī)程序以外源蛋白質(zhì)濃度的log對時間作圖來獲得。由于取樣誤差和各種因素引起的可變性，數(shù)據(jù)點(diǎn)通常不形成平滑的線。然而，程序?yàn)槊總€數(shù)據(jù)集計(jì)算出“最適”線，并確定所獲曲線相應(yīng)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)變化時期的那部分的斜率。典型地，在轉(zhuǎn)染后48小時期間觀察到蛋白質(zhì)合成的最大量。此后，表達(dá)速度典型地以一定速度降低，對此通過在轉(zhuǎn)染之前、過程中和/或之后用本發(fā)明各種化學(xué)化合物接觸細(xì)胞進(jìn)行操作。因此，計(jì)算在這段降低時期內(nèi)的斜率以提供k(DNA)和K值，用于比較不同化學(xué)化合物的效力。對于特別有效的本發(fā)明化學(xué)化合物制劑，表達(dá)速度最初降低之后跟著表達(dá)速度增加，或者在有些情況下，在整個實(shí)驗(yàn)期間均沒有觀察到降低。
因此，K因子反映了化學(xué)化合物對外源DNA已導(dǎo)入細(xì)胞之后外源基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響，而不是這些化合物對初始DNA攝取的影響。K因子之所以重要是因?yàn)榕c改善瞬時表達(dá)的其它報(bào)告的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要來自提供在轉(zhuǎn)染步驟之后穩(wěn)定瞬時表達(dá)的方法，而不是來自試圖改善DNA攝取效率的傳統(tǒng)途徑。然而，本發(fā)明一些化學(xué)化合物在轉(zhuǎn)染后頭四天有效性最大，提示它們可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞攝取增加數(shù)量的轉(zhuǎn)染DNA來起作用。這些化合物也可延長外源DNA進(jìn)入細(xì)胞之后基因表達(dá)的有效半衰期。
K值可為正值或負(fù)值，這可按如下理解。K本身是一個比較實(shí)驗(yàn)和對照培養(yǎng)物之間轉(zhuǎn)基因表達(dá)變化速度的比值。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物是采用本發(fā)明化合物增強(qiáng)瞬時表達(dá)的培養(yǎng)物。對對照培養(yǎng)物而言，轉(zhuǎn)基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)染步驟之后開始的即通常是給細(xì)胞加入轉(zhuǎn)基因之后約24小時的比較期間不可避免地降低。因此，代表對照培養(yǎng)物轉(zhuǎn)基因表達(dá)變化的曲線斜率總是負(fù)值，即負(fù)的斜率。對大多數(shù)本發(fā)明化合物，轉(zhuǎn)基因表達(dá)量在該比較期間也將降低，盡管不象對照培養(yǎng)物一樣多。因此，對于這些化合物，代表表達(dá)變化的曲線斜率將是負(fù)值。在計(jì)算這些化合物的K值時，實(shí)踐中可用來自對照培養(yǎng)物的負(fù)值除以來自實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物的負(fù)值，得到一個正的K值。然而，本發(fā)明一些化合物如此有效以致于該測量期間表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的量實(shí)際上增加而不是降低。在這種情況下，描繪實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物這種變化的曲線斜率將為正值而不是負(fù)值，結(jié)果K本身為負(fù)值。
因此，對于K為正值的化合物，K的絕對值將隨該化合物有效性的增加而增加。對于K為正值的優(yōu)選化合物，K優(yōu)選大于1，更優(yōu)選K＞10，最優(yōu)選K＞50。相反，當(dāng)K值為負(fù)時，K的絕對值將隨該化合物有效性的增加而降低。因此，對于K為負(fù)值的優(yōu)選化合物，優(yōu)選K＜-1000至-100，更優(yōu)選K＜-100至-10，最優(yōu)選K＜-10至-0.001。
在不存在本發(fā)明化學(xué)化合物時，轉(zhuǎn)基因DNA表達(dá)的衰退，即k(DNA)，是一個一級反應(yīng)。當(dāng)給培養(yǎng)物加入本發(fā)明化學(xué)化合物時，與對照培養(yǎng)物相比，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的動力學(xué)急劇變化。在化合物存在時，隨著外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生長期延伸，k(DNA)逐漸變得更正。的確，對于一些最優(yōu)選的制劑即K＞40的制劑，這種變化太劇烈了，以致于傳統(tǒng)的一級動力學(xué)不能充分代表該結(jié)果。因此，似乎優(yōu)選化合物/制劑的動力學(xué)變成了假一級或二級反應(yīng)，即一種傳統(tǒng)知識沒有預(yù)測到的結(jié)果。
本發(fā)明方法有用的許多化合物和制劑在實(shí)施例中討論，并包括在表1、8、9和10的列表中，其中給出了X、G和K值。
本發(fā)明還提供基于SW480細(xì)胞系篩選化學(xué)試劑以確定它們是否能穩(wěn)定瞬時表達(dá)的方法。待篩選的候選化學(xué)化合物是生物適合的，并含有至少一個疏水部分和至少一個酸性部分。在外源DNA第0天導(dǎo)入之前、過程中和/或之后，將被測化合物或化合物組導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)物如SW480細(xì)胞中，其中所述外源DNA編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中表達(dá)時能被檢測到。如上所述，可使用各種其它類型細(xì)胞。為了監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，以定期間隔如每天收獲培養(yǎng)物樣品，并測定樣品中外源蛋白質(zhì)的量。培養(yǎng)物中積累表達(dá)的蛋白質(zhì)的量通過對每天的樣品測量值求和來確定，比較被測培養(yǎng)物即用被測化合物接觸的培養(yǎng)物和未與化合物接觸的平行對照培養(yǎng)物之間的這些蛋白總和值。用于蛋白測量的培養(yǎng)物等分試樣可在第0-4天之間、或第4-7天之間、或第4-10天之間每天收獲一次，根據(jù)上面給出的公式采用這些測定的蛋白量分別計(jì)算X、G7或G14的值。如果由此測定的X、G7或G14的值大于零，則可得出結(jié)論該試劑增強(qiáng)瞬時表達(dá)。優(yōu)選地，對于這種化合物X、G7或G14大于10，最優(yōu)選大于25。由此鑒定的化學(xué)化合物可用于在上述程序中增強(qiáng)外源基因的瞬時表達(dá)。優(yōu)選的產(chǎn)品制劑選自顯示最高(或最正)的X或G值并表現(xiàn)出最有利的K因子的那些無毒化合物或化合物的組合。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的各種化學(xué)化合物可一起用于使轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增強(qiáng)最大化。例如，可使用各種化合物在該步驟中的不同時間處理相同培養(yǎng)物。不同制劑要求不同的特性組合。兩種不同類型的優(yōu)選制劑是A型制劑具有高X值的化合物。這些化合物在緊隨轉(zhuǎn)染步驟后具有高活性，因此可能在瞬時表達(dá)的第一期通過增強(qiáng)DNA的攝取效率起作用。因此，與對照培養(yǎng)物即無這些化合物的培養(yǎng)物相比，使用了A型化合物或制劑時從上述半對數(shù)圖得到的log(DNA)0或Y截距更高。這些化合物被認(rèn)為影響了DNA攝取的效率，因?yàn)閅截距是緊接著外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)活性外源DNA濃度的粗略測量值。許多被測化合物具有正的X因子值(如見表1)。因此，本發(fā)明不僅提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DNA的化學(xué)化合物而且提供看起來可增強(qiáng)細(xì)胞的初始DNA攝取的化合物。許多被測化合物具有高的G7或G14值或高的正K值以及高的X值，因此在瞬時表達(dá)的兩個時期內(nèi)均有效(例如見表1,3,8和9)。
B型制劑在這一類中有用的化合物具有高的G和K因子。同時希望高的X值，但不是必需的。最優(yōu)選的B型穩(wěn)定劑具有大于25的G7或G14值，并且當(dāng)K為正時，K值大于1，更優(yōu)選K大于10。更進(jìn)一步，在A或B型制劑中當(dāng)認(rèn)為特定試劑是最優(yōu)選的化合物時，需要重復(fù)顯示X和/或G因子大于25的實(shí)驗(yàn)。
對于體內(nèi)和體外應(yīng)用均可采用A型和B型兩種制劑使瞬時表達(dá)最大化。例如，一個優(yōu)選的方法涉及首先通過在轉(zhuǎn)染之前將細(xì)胞暴露于一或多種X大于25的A型化合物中來預(yù)先處理細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染期間也存在A型化合物，并且最好在瞬時表達(dá)的整個期間內(nèi)均保持其存在。轉(zhuǎn)染步驟后，在瞬時表達(dá)的剩余期間內(nèi)用一或多種優(yōu)選每種G7或G14大于25的B型化合物接觸細(xì)胞。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，A型化合物是苯甲酸鹽緩沖劑，B型化合物是硫酸軟骨素。優(yōu)選地，軟骨素的分子量為20kDa或更低，更優(yōu)選9kDa或更低，最優(yōu)選4kDa或更低。在一個優(yōu)選實(shí)施方案，A型化合物是苯甲酸和4-乙基苯甲酸，B型化合物是苯甲酸鹽緩沖劑和硫酸軟骨素。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案，A型制劑包括苯甲酸鹽緩沖劑和谷氨酸，B型化合物是硫酸軟骨素。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案，B型制劑是硫酸軟骨素和硫辛酸，其具有如下分子式 對于體外應(yīng)用，當(dāng)轉(zhuǎn)染步驟前將細(xì)胞在A型制劑存在時培養(yǎng)數(shù)小時，例如20-24小時，可獲得最佳結(jié)果。以飲食(或口服應(yīng)用)形式用A型制劑預(yù)先處理是體內(nèi)應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)選擇。已知許多對增加瞬時感染有效的化合物無毒(見下表1)。培養(yǎng)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之后最好在A型化合物存在時維持至少48小時。如果希望，在約90％以上細(xì)胞攝取外源DNA之后即DNA加入培養(yǎng)物之后數(shù)天，可除去A型制劑，或者該制劑可保持并在瞬時表達(dá)的第二期與細(xì)胞接觸。B型制劑最好在瞬時表達(dá)的最高峰時加入細(xì)胞，典型地該最高峰發(fā)生在轉(zhuǎn)染后24-48小時。最佳地，實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)定期重復(fù)用含有B型制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
顯然，本發(fā)明方法可在體內(nèi)使用(即動物研究或臨床操作)。特別地，在實(shí)體瘤的基因治療中，A型制劑可與DNA遞送載體共同施用，其中在施用DNA之前受體組織通過注射A型制劑“預(yù)先處理”。之后，施用B型制劑。
對于每種化合物有用的濃度范圍不同，有用范圍的上限可用細(xì)胞毒性作用來限制。將DNA/A型制劑直接注射至腫瘤中將只涉及常規(guī)步驟，因?yàn)槎喾N藥物載體是本領(lǐng)域所熟知的。如果需要，直接注射可避免將非靶組織暴露于轉(zhuǎn)染試劑?？蓪⒛憠A、脂質(zhì)體制劑、或控釋制劑與B型制劑聯(lián)合施用以延長對轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的局部作用。此外，在轉(zhuǎn)基因DNA導(dǎo)入之后B型制劑可作為食物補(bǔ)劑(或添加物)給患者長期服用。根據(jù)各種因素例如毒性等，可聯(lián)合注射和食物服用以獲得最佳效果。該方法具有向腫瘤遞送高劑量細(xì)胞毒性蛋白而不損害其它機(jī)體組織的優(yōu)點(diǎn)。采用該策略，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞本身在數(shù)天內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生細(xì)胞毒性蛋白，從而提供比給腫瘤簡單注射該劑量蛋白遠(yuǎn)為有效的遞送方法。當(dāng)外部應(yīng)用的所述蛋白無法輕易通過質(zhì)膜或該蛋白的細(xì)胞內(nèi)半衰期較短時，該方法尤為有用。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，選自組Ⅰ的化合物可與選自組Ⅱ的化合物如硫酸軟骨素共價或非共價連接。
實(shí)施例1瞬時表達(dá)增強(qiáng)的篩選方法對照轉(zhuǎn)染程序下列程序用于提供瞬時表達(dá)將SW480 P3(ATCC # CCL228)人結(jié)腸癌細(xì)胞(典型地，1×106細(xì)胞)接種在6孔組織培養(yǎng)板的孔中。接種的孔數(shù)與將要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染后的天數(shù)相一致。每孔含有來自30ml儲存液的1ml完全培養(yǎng)基，該儲存液含有26.4ml RPMI組織培養(yǎng)基，4mM L-谷氨酰胺，3.0ml胎牛血清，和10ug/ml慶大霉素。接種后細(xì)胞在37℃含有10％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，此期間細(xì)胞附著在培養(yǎng)板上。
24小時預(yù)孵育步驟之后，通過除去RPMI和添加900ul OPTI-MEM_(Gibco)培養(yǎng)基來進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該培養(yǎng)基含有2ug表達(dá)巨細(xì)胞病毒啟動子控制下的細(xì)菌β-半乳糖苷酶的VR1412 DNA(Vical,Inc.,San Diego，CA)和8ug陽離子脂混合物(按等摩爾比混合的二油酰磷脂酰乙醇胺和1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(如，＂DMRIE/DOPE＂))，其中脂與DNA的摩爾比為0.99∶1。應(yīng)注意，典型的瞬時轉(zhuǎn)染程序使用10ugDNA/106細(xì)胞，但本文所描述的方法使用更少的DNA以降低細(xì)胞毒性。然后，在37℃孵育平板4小時。
4小時孵育步驟后，每孔加入100ul熱滅活胎牛血清(以終止轉(zhuǎn)染)和12.0ul 50mg/ml慶大霉素。外源DNA加入孔中之后24小時，將一個孔中的所有細(xì)胞用胰蛋白酶消化并記數(shù)，然后每孔裂解2×104細(xì)胞并儲存在液氮中，用于以后測量β-半乳糖苷酶濃度。此時，每個未收獲的孔加入上述OPTI-MEM培養(yǎng)基(無L-谷氨酰胺)。在之后的實(shí)驗(yàn)中，每隔24小時再收獲一個孔，并將未收獲的孔每48小時加入1ml OPTI-MEM(無L-谷氨酰胺并含有測試化合物)。測試化合物的程序?yàn)榱藴y試各種化合物增強(qiáng)瞬時表達(dá)的效力，修改上述用于對照培養(yǎng)物的程序，在培養(yǎng)基中加入候選化學(xué)化合物。程序的其余部分與用于對照培養(yǎng)物的程序相同。
每天保留2×104細(xì)胞的裂解樣品，用于β-半乳糖苷酶分析，并丟棄每孔的剩余細(xì)胞。將裂解液冷凍保存在液氮中，直到可進(jìn)行β-半乳糖苷酶分析。采用基于氯酚紅的氯酚紅程序分析解凍樣品的β-半乳糖苷酶，其中用紫外光/可見光分光光度計(jì)在580nm處定量測定有色產(chǎn)物。
大量化學(xué)化合物的分析結(jié)果見下表1。表1給出實(shí)驗(yàn)中測定的X值，實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞采用實(shí)施例中所述方法培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)菌β-半乳糖苷酶基因。表1中，標(biāo)有星號的G因子表示G7的值，其它G值是G14的值。
為了比較，表1包括了在分析中測定為負(fù)值的化合物和大量測定為正值的化合物。表1所示pH值是在水溶液中測定的，所述水溶液是通過用去離子水稀釋培養(yǎng)基制備的儲存液來產(chǎn)生的。觀察到從pH3(谷光甘肽)至pH10(腎上腺素)的化合物對延長瞬時表達(dá)持續(xù)時間有效。優(yōu)選的pH范圍是約pH4.5-10.5。
對于此系列實(shí)驗(yàn)，如果計(jì)算的X,G或K值任意一個大于零，則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果是陽性的。
表1
表1(續(xù))
請注意，表1中X＞1的化合物是在轉(zhuǎn)染后頭幾天內(nèi)增加瞬時表達(dá)程度的化合物。這些化合物可影響細(xì)胞攝取使它們攝取更多數(shù)量的DNA/細(xì)胞，或者可促使比無這些化合物時更高比率的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)外源DNA。還可能這些化合物增強(qiáng)早期轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。這些化合物以前還未報(bào)道過對轉(zhuǎn)染具有這些影響。有趣的是，注意到黑素顯著抑制瞬時表達(dá)。
除表1所列的化合物之外，還測定發(fā)現(xiàn)能延長瞬時表達(dá)的其它化合物包括叔丁基苯甲酸、乙氧基苯甲酸、異丙基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、異丁基苯甲酸、硫酸軟骨素和半乳甘露聚糖，尤其是羥丙基半乳甘露聚糖。
實(shí)施例2化學(xué)化合物增強(qiáng)瞬時表達(dá)并降低葡萄糖消耗進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步分析增強(qiáng)瞬時表達(dá)的方法。對于這些實(shí)驗(yàn)，用實(shí)施例1所述瞬時表達(dá)程序測定表2所述的5個培養(yǎng)條件。使用6孔培養(yǎng)板接種足夠數(shù)量孔的SW480細(xì)胞，以便每孔的細(xì)胞可按如下所述收獲。這些實(shí)驗(yàn)采用平均分子量為4 kDa的A型硫酸軟骨素(Biorelease公司，Manchester,N.H.,No.409-4k)。
表2
每天收獲一孔以記數(shù)，并裂解每個收獲孔的2×104細(xì)胞，裂解物保留用于β-半乳糖苷酶分析。同樣這些孔的上清液冷凍保存，用于之后評價pH、葡萄糖消耗、以及乳糖和氨的產(chǎn)生。如下表3所示，培養(yǎng)板2、3和4中所用的各種化學(xué)化合物組合在增強(qiáng)和維持基因表達(dá)的能力上不同。在該實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)板4的總體表現(xiàn)最好，具有高X和G因子。該實(shí)驗(yàn)中包括組Ⅱ化合物的僅有的培養(yǎng)板3清楚地顯示出轉(zhuǎn)染效率的降低跡象(即低X因子)，但顯示維持表達(dá)的前景(即相對高的G因子)。
表3
典型地，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示20％范圍的標(biāo)準(zhǔn)差。事實(shí)上，本領(lǐng)域已知通常轉(zhuǎn)染效率即使在相同實(shí)驗(yàn)的不同培養(yǎng)皿間也不同(例如見Simoni和Gromoll,J Endocrinol.Invest.,19:359-364(1996))，因此此處觀察到的變異并不奇怪。因此，小于25的X和G因子并不認(rèn)為比對照顯著提高。
值得注意的是，硫酸軟骨素-一種聚陰離子碳水化合物-的存在允許轉(zhuǎn)染順利地進(jìn)行，它還導(dǎo)致基因表達(dá)的實(shí)質(zhì)性改善。其它實(shí)驗(yàn)觀察到如果在轉(zhuǎn)染步驟之前或過程中與細(xì)胞接觸，則聚陰離子碳水化合物具有阻斷轉(zhuǎn)染進(jìn)程的傾向。在轉(zhuǎn)染之前或過程中使用時顯示這種阻斷作用的聚合物包括硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素(見實(shí)施例4)、羧甲基纖維素和N-羧甲基脫乙酰殼多糖N,S-硫酸鹽。然而，當(dāng)在轉(zhuǎn)染步驟之后而不是過程中加入時，肝素對增強(qiáng)瞬時表達(dá)有效；同樣，其它聚陰離子碳水化合物以約4kDa分子量范圍在轉(zhuǎn)染后加入時也可期望增強(qiáng)瞬時表達(dá)。
在上述實(shí)驗(yàn)規(guī)劃中，包括一個對照實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)板1A和1B，表3)以確定培養(yǎng)基中存在的抗生素慶大霉素是否對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。比較對照培養(yǎng)板#1A和1B的結(jié)果，很明顯慶大霉素或多或少抑制了蛋白的產(chǎn)生。與沒有慶大霉素的對照培養(yǎng)板1B相比，有慶大霉素的對照即培養(yǎng)板1A中X和G因子的值稍低，由此得出上述結(jié)論。而且，β-半乳糖苷酶分析結(jié)果支持該結(jié)論。
在同樣這些細(xì)胞樣品中分析了葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生及氨的產(chǎn)生。根據(jù)Kodak提供的臨床實(shí)驗(yàn)室測定血清葡萄糖和乳酸水平常用的標(biāo)準(zhǔn)程序，使用Kodak Ektachem DT60Ⅱ分析儀測定葡萄糖和乳酸。該分析通過將10ul每個測試樣品加入膜覆蓋的塑料載片上的孔中進(jìn)行，該孔中含有測定葡萄糖或乳酸必需的所有試劑(Ektachem DT載片(GLU)或Ektachem DT載片(LAC))。測定葡萄糖時，該分析基于葡萄糖氧化酶可催化分子氧與葡萄糖的反應(yīng)，然后第二個反應(yīng)產(chǎn)生紅色染料，該染料的強(qiáng)度與樣品中葡萄糖的量成比例。同樣，測定乳酸的載片提供能產(chǎn)生紅色染料的酶和底物，紅色染料的量與施加到載片上的乳酸的量成比例。將載片放在Ektachem DT60Ⅱ分析儀上，該紅色通過反射率分光光度法測量。同樣，氨分析采用Ektachem DT載片(NH3)進(jìn)行，這是基于氨與溴酚藍(lán)反應(yīng)可產(chǎn)生被該相同儀器檢測的藍(lán)色染料。
葡萄糖和乳酸濃度隨時間變化的測量結(jié)果見表4。令人驚奇的是，表4表明含慶大霉素的對照(培養(yǎng)板1A)比任何也含有慶大霉素實(shí)驗(yàn)樣品消耗更多的葡萄糖并產(chǎn)生更多的乳酸(注意，沒有慶大霉素的對照即培養(yǎng)板1B不包括在表4中)。表4的數(shù)據(jù)清楚的表明相對于對照，接受了表2所述化學(xué)化合物的細(xì)胞在代謝上產(chǎn)生了深刻的轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變與外源基因的高表達(dá)水平相對應(yīng)。
除了表4中的數(shù)據(jù)外，還觀察到苯甲酸和4-乙基苯甲酸的組合導(dǎo)致葡萄糖消耗降低。在此，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染步驟之前和過程中首先給SW480細(xì)胞應(yīng)用A型制劑，在DNA導(dǎo)入細(xì)胞之后一天加入一種B型制劑。A型制劑由含有1mM苯甲酸、1mM 4-乙基苯甲酸鹽和4mM L-谷氨酰胺的OPTI-MEM組成，B型制劑含有這些相同成分，此外還含有0.1mM的硫酸軟骨素。在整個實(shí)驗(yàn)過程中還存在慶大霉素。在本實(shí)驗(yàn)中，在6孔培養(yǎng)板中于轉(zhuǎn)染之后培養(yǎng)了14天或在生物反應(yīng)器中于轉(zhuǎn)染之后培養(yǎng)了32天的細(xì)胞觀察到基本上沒有葡萄糖的消耗，在此期間細(xì)胞持續(xù)從轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)蛋白。
表4
以前已報(bào)道了，當(dāng)施用于培養(yǎng)的肝細(xì)胞時，組Ⅰ化合物丁酸鹽可補(bǔ)償葡萄糖饑餓對翻譯后糖基化的影響，極有可能增加細(xì)胞內(nèi)葡萄糖庫(Morrow等，Biochem.Biophys.Res.Comm.112:115-125(1983))。然而，Morrow等沒有分析培養(yǎng)物中的葡萄糖消耗，因此未觀察到本文所注意到的組Ⅰ化合物存在時代謝的轉(zhuǎn)變。觀察到的葡萄糖代謝的轉(zhuǎn)變是本發(fā)明極重要的特征。它不僅與化學(xué)化合物對基因治療方法有關(guān)效率的增強(qiáng)相關(guān)(本實(shí)施例充分說明該點(diǎn))，而且提示這些相同化學(xué)化合物選擇性和無毒性地改變細(xì)胞代謝途徑的能力可應(yīng)用于廣泛的治療，包括例如在治療肥胖時調(diào)節(jié)脂肪/脂代謝。
實(shí)施例3生物反應(yīng)器中增強(qiáng)瞬時表達(dá)在Genespan原型孵育設(shè)備的高效空心纖維灌流原型生物反應(yīng)器裝置(以下稱為＂HPBr＂裝置)中進(jìn)行4個基于脂轉(zhuǎn)染的基因轉(zhuǎn)染系列實(shí)驗(yàn)。該裝置主要包括兩套空心纖維通過的無菌室。通過一套纖維持續(xù)循環(huán)培養(yǎng)基，而細(xì)胞生長所必需的氣體(如氧氣和二氧化碳)通過第二套纖維通入。這些纖維由多孔材料組成，氣體和營養(yǎng)成分可從中沿著一個方向通過，而室內(nèi)生長細(xì)胞產(chǎn)生的廢物分子可沿另一方向通過。在該裝置中生長的細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)，或可與兩套空心纖維的外表面貼附。
HPBr裝置的一個有用特征是細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)動管道通過的小室來攪動。當(dāng)小室沿著其長軸向一個方向轉(zhuǎn)動120度，然后向另一個方向轉(zhuǎn)動120度時，構(gòu)成一個轉(zhuǎn)動“循環(huán)”。作為替代，培養(yǎng)物可在“靜止”狀態(tài)生長，無需轉(zhuǎn)動。
采用HPBr裝置進(jìn)行一系列SW480細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。每個實(shí)驗(yàn)包括一個平行對照，對照中細(xì)胞接種在傳統(tǒng)6孔培養(yǎng)板中，并置于傳統(tǒng)的10％CO2孵育箱中。采用實(shí)施例1中對照培養(yǎng)板所用方法培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染對照6孔培養(yǎng)板，而生物反應(yīng)器裝置采用下列實(shí)驗(yàn)程序。HPBr裝置實(shí)驗(yàn)采用實(shí)施例1所述用于6孔培養(yǎng)板的類似程序在HPBr裝置中進(jìn)行4個β-半乳糖苷酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，只是各種試劑的體積需按比例調(diào)整以適合生物反應(yīng)器中更大的體積和更多的細(xì)胞。由于HPBr特有的細(xì)胞培養(yǎng)灌流模型(即連續(xù)飼養(yǎng))，所以沒有必要手工定期飼養(yǎng)。
生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)的程序與實(shí)施例1所述程序在下列方面不同。將充足的Cytodex_1微載體(即由交聯(lián)葡聚糖構(gòu)成的微球，其用于細(xì)胞附著的表面具有帶正電荷的季銨功能基團(tuán)；Sigma,St.Louis,MO)在磷酸緩沖鹽水中預(yù)先溶脹，并導(dǎo)入HPBr側(cè)口中。每10個細(xì)胞使用約一個微載體珠。在實(shí)驗(yàn)開始時，給該裝置共注射1×107活SW480細(xì)胞和1×106微載體珠。在細(xì)胞接種至該裝置時存在表5所述的培養(yǎng)基。表5列出了本研究中用的轉(zhuǎn)動參數(shù)(＂cpm,＂當(dāng)于cycles per minute循環(huán)/分鐘)。給每個生物反應(yīng)器加入839ml的培養(yǎng)基。在第2、3和4輪實(shí)驗(yàn)(“輪”是指不同的實(shí)驗(yàn))的OPTI-MEM培養(yǎng)基中含有0.1mM硫酸軟骨素(BioreleaseNo.409-4k)。在轉(zhuǎn)染步驟之后，更換再循環(huán)的OPTI-MEM培養(yǎng)基(即管道中的培養(yǎng)基)，但含有細(xì)胞的區(qū)室(毛細(xì)管外空間)中的培養(yǎng)基不更換。更換的培養(yǎng)基包括表5所列的化合物。在細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器后24小時向毛細(xì)管外空間加入含有外源DNA的脂質(zhì)體。與管道內(nèi)的體積(839ml)相比，該空間的體積較小(17ml)。
表5
每天從每個生物反應(yīng)器的細(xì)胞區(qū)室取出細(xì)胞和上清樣品(約1.5ml)，并加入同樣體積的新鮮培養(yǎng)基以替換之。測定細(xì)胞的數(shù)目和存活性，裂解2×104活細(xì)胞，并用于按實(shí)施例1所述分光光度法進(jìn)行β-半乳糖苷酶測定。
表6的數(shù)據(jù)比較了4個灌流裝置實(shí)驗(yàn)(#2-5輪)和培養(yǎng)板對照(#1輪)的結(jié)果。在表6中，標(biāo)有“曲線下區(qū)域”的欄目是指在本實(shí)驗(yàn)兩星期持續(xù)時間內(nèi)每天收獲的等量細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶量的時間函數(shù)圖中曲線下方的面積。因此，“曲線下區(qū)域”欄中的值以任意單位如cm2表示，并且反映了該實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間內(nèi)每個細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的總量。表6最后一欄顯示每一輪即每一個細(xì)胞培養(yǎng)板或生物反應(yīng)器在第13天的所有活細(xì)胞中存在的β-半乳糖苷酶的總量。
很明顯，灌流生物反應(yīng)器可用于放大的基因轉(zhuǎn)染和收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這對于治療應(yīng)用是有利的(如對于產(chǎn)生大量穩(wěn)定或瞬時表達(dá)外源基因的T淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞，如用于體細(xì)胞治療)。該系統(tǒng)也可用作人造器官以便可容易地和實(shí)際地研究外源基因的長期表達(dá)；在某種意義上，這等同于進(jìn)行體內(nèi)完整器官的活組織檢查。
表6在培養(yǎng)板和HBPr裝置中2周產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶
表6中的數(shù)據(jù)顯示，操作生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)動參數(shù)提供了使用該裝置增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率并保持瞬時表達(dá)的方法。
如上所述，可導(dǎo)入微球至小室內(nèi)以提供細(xì)胞粘附位點(diǎn)。例如，已觀察到當(dāng)永生小鼠黑素瘤細(xì)胞(即ATCC #B16-F0)導(dǎo)入存在微球的小室時，該微球充當(dāng)積累大細(xì)胞團(tuán)的“種子”。進(jìn)一步觀察到這些細(xì)胞團(tuán)可被轉(zhuǎn)染，而且之后這些團(tuán)中的細(xì)胞瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)染DNA。通過對小室內(nèi)的培養(yǎng)基取樣可很容易地從這些培養(yǎng)物得到樣品。該取樣可通過將注射器的新鮮培養(yǎng)基液流射向該細(xì)胞團(tuán)，導(dǎo)致足夠取樣的許多細(xì)胞在培養(yǎng)基變成懸浮狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)。該細(xì)胞團(tuán)類似實(shí)體瘤，并提供模式系統(tǒng)用于開發(fā)有效向體內(nèi)腫瘤遞送治療蛋白的治療方法。
采用對生物反應(yīng)器中生長的細(xì)胞團(tuán)有效的相同程序，給小鼠皮下注射黑素瘤細(xì)胞，使其在注射位點(diǎn)發(fā)展成腫瘤，然后將含有β-半乳糖苷酶載體DNA的脂質(zhì)體直接導(dǎo)入該腫瘤以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的瞬時表達(dá)。對β-半乳糖苷酶表達(dá)有效的方法期望對其它蛋白質(zhì)也有效，可進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)評價向體內(nèi)實(shí)體細(xì)胞團(tuán)直接遞送各種蛋白質(zhì)如編碼治療蛋白的DNA的效果。
本發(fā)明方法所用的生物反應(yīng)器系統(tǒng)對產(chǎn)生大量經(jīng)遺傳修飾表達(dá)外源蛋白質(zhì)的細(xì)胞是有用的。為了治療，可將這些細(xì)胞給患者施用，此后只在治療計(jì)劃規(guī)定時間內(nèi)保持活性狀態(tài)。因此，本發(fā)明提供獨(dú)特形式的基因治療方法，其中導(dǎo)入的基因可簡單通過限制其接觸穩(wěn)定化物質(zhì)來關(guān)閉，即施用瞬時表達(dá)治療蛋白的細(xì)胞然后僅在希望轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)的時間里施用增強(qiáng)化合物。
最后，應(yīng)當(dāng)注意，硫酸軟骨素的使用很重要，因?yàn)楸M管轉(zhuǎn)動速度相對較高，它也能使貼壁依賴細(xì)胞很好地貼附微載體。此結(jié)果表明，組Ⅱ化合物加入培養(yǎng)基時可有效提供培養(yǎng)細(xì)胞對固體基質(zhì)的貼壁。
實(shí)施例4細(xì)胞毒性分析按照實(shí)施例1所述程序在6孔培養(yǎng)板中測試大量化合物以測定其在SW480細(xì)胞中的細(xì)胞毒性與促進(jìn)外源基因攝取和表達(dá)的能力之間的關(guān)系。除非特別注明，除對照之外，所有培養(yǎng)板均含有4mM L-谷氨酰胺以及抑制細(xì)菌生長的慶大霉素。
細(xì)胞毒性分析按如下進(jìn)行。第0天在待測細(xì)胞毒性的化學(xué)化合物存在時將SW480細(xì)胞(約1×106細(xì)胞/孔)接種在含1ml RPMI的6孔培養(yǎng)皿中。在孔中接種后24小時，除去RPMI培養(yǎng)基，并按實(shí)施例1所述將含有外源DNA的脂質(zhì)體于1ml OPTI-MEM培養(yǎng)基中加至培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基還含有待測細(xì)胞毒性的化學(xué)化合物。還包括與實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)板相同的對照培養(yǎng)板，只是其培養(yǎng)基中不存在被測化合物。實(shí)驗(yàn)和對照培養(yǎng)物在“靜止”狀態(tài)下生長，也就是說，培養(yǎng)板不進(jìn)行搖動、轉(zhuǎn)動或其它攪拌。每天從一個實(shí)驗(yàn)孔和一個對照孔收獲細(xì)胞并用臺盼藍(lán)染色測定活性，共進(jìn)行8天。在暴露于脂質(zhì)體DNA的對照培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)染后頭4天細(xì)胞數(shù)保持相當(dāng)恒定或僅僅輕微增加，然后到第8天結(jié)束時增加至約1×107/孔。在頭4天當(dāng)中對照培養(yǎng)物生長遲滯推測是由于脂質(zhì)體DNA本身的輕微細(xì)胞毒性作用引起的。如果在外源DNA導(dǎo)入后4天內(nèi)觀察到活細(xì)胞數(shù)降低＞50％，而且第8天結(jié)束時沒有細(xì)胞凈擴(kuò)大，則認(rèn)為處于實(shí)驗(yàn)濃度的被測化合物具有細(xì)胞毒性。這里使用的硫酸軟骨素與實(shí)施例2中的相同。
通過應(yīng)用該測試程序，在許多情況下可能操作單個化合物或化合物制劑的濃度達(dá)到SW480細(xì)胞良好耐受而又能增強(qiáng)這些細(xì)胞中瞬時表達(dá)水平的濃度。對其它類型細(xì)胞也已測定了其耐受本發(fā)明一些化學(xué)化合物的能力。例如，測定了人黑素瘤細(xì)胞、鼠黑素瘤細(xì)胞和COS-7細(xì)胞(ATCC CRL1651)耐受在表9中應(yīng)用于培養(yǎng)板#6的制劑的能力。這些細(xì)胞在對被測化合物的敏感性上多少不同，但鑒定了一組所有這些細(xì)胞類型均能耐受的濃度，也就是說，根據(jù)上述分析在這些濃度下化合物沒有細(xì)胞毒性。
發(fā)現(xiàn)所有增強(qiáng)瞬時表達(dá)的磺酸化氨基多糖均能支持正常細(xì)胞生長，也就是說，它們在增強(qiáng)瞬時表達(dá)的濃度時毒性并不太大以致細(xì)胞能夠耐受。暴露于表7中各種化合物和制劑的細(xì)胞的細(xì)胞生長和細(xì)胞毒性曲線見圖1和2，其中描述各圖的數(shù)字相應(yīng)于表7中的培養(yǎng)板數(shù)。表7說明多糖肝素(約6 kDa；Sigma)在轉(zhuǎn)染過程中存在時阻斷瞬時表達(dá)，但硫酸軟骨素(Biorelease，A型)在同樣條件下增強(qiáng)瞬時表達(dá)。肝素介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制可能是由于在肝素和脂質(zhì)體的陽離子脂之間形成了復(fù)合物，從而使DNA沒有載體遞送其進(jìn)入細(xì)胞。然而，在其它實(shí)驗(yàn)中觀察到在轉(zhuǎn)染步驟之后加入細(xì)胞時肝素增強(qiáng)瞬時表達(dá)。羥丙基半乳甘露聚糖也觀察到在一定程度上增強(qiáng)瞬時表達(dá)，盡管不如硫酸軟骨素那樣有效(見實(shí)施例10)。
表7
含有丁酸鹽緩沖劑的培養(yǎng)板表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因，但是，在本組實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)條件下該緩沖劑對SW480細(xì)胞有細(xì)胞毒性。
實(shí)施例5用星形聚合物轉(zhuǎn)染本組實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明方法增強(qiáng)瞬時表達(dá)的作用是否依賴于DNA遞送至細(xì)胞的方法的問題。采用類似實(shí)施例1中的方法使用兩種不同的化學(xué)化合物組合(見表8)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，只是這里DNA在樹狀聚合物存在時導(dǎo)入細(xì)胞而不是使用脂質(zhì)體遞送。這些樹狀聚合物是顯微合成聚合小球(最先由Dow Chemicals商業(yè)化為用于定制大小的“星形”聚合小球標(biāo)準(zhǔn))，它能通過化學(xué)方法衍生而起陽離子脂的作用。本發(fā)明中使用的樹狀聚合物由F.C.Szoka,Jr.(藥學(xué)/藥物化學(xué)系，加州大學(xué)，SanFrancisco,CA)提供。雖然脂轉(zhuǎn)染或樹狀聚合物介導(dǎo)的方法進(jìn)行基因遞送的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，基于物理化學(xué)特性如它們的形狀和化學(xué)部分的分布，它們極有可能十分不同。
使用的方法在如下步驟中與實(shí)施例1的不同。將14ug DNA用397ul去離子水稀釋，56ug樹狀聚合物用393ul去離子水稀釋。使用前不超過1小時，混合DNA溶液和樹狀聚合物懸液。向每孔加入OPTI-MEM(733ul)和DNA/樹狀聚合物混合物(167ul)，用手搖動6孔培養(yǎng)板以確保徹底混勻。孵育5后小時，除去含有DNA/樹狀聚合物的培養(yǎng)基并加入1.0ml培養(yǎng)基。該程序的其余步驟見實(shí)施例1所述。
如表8所示，當(dāng)使用樹狀聚合物作為向細(xì)胞遞送DNA的方法時，被測化合物是有效的。用于這些實(shí)驗(yàn)的硫酸軟骨素與實(shí)施例2相同。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地說明表8所示的化學(xué)化合物制劑在DNA進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮作用，因此不論采用何種方法導(dǎo)入DNA均有效。
表8
實(shí)施例6瞬時表達(dá)期間的蛋白生產(chǎn)以下實(shí)驗(yàn)說明本瞬時表達(dá)系統(tǒng)可用于根據(jù)前述實(shí)施例所述方法快速大量生產(chǎn)由導(dǎo)入受體細(xì)胞的外源基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。
進(jìn)行15個培養(yǎng)板實(shí)驗(yàn)，其中向SW480細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入表9所示的化學(xué)化合物，所述細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中按詳細(xì)描述于實(shí)施例1的方法轉(zhuǎn)染。計(jì)算X、G14和K因子，以及2×104細(xì)胞14天產(chǎn)生的蛋白累積量，結(jié)果顯示于表9的最后一欄。表9所示數(shù)據(jù)說明在所有列出的組合物存在時產(chǎn)生的蛋白量均優(yōu)于對照。用于這些實(shí)驗(yàn)的硫酸軟骨素同實(shí)施例2。按照它們的效用排列，最有效的制劑是在培養(yǎng)板6、3、13和14中使用的制劑。在同時接受A型和B型制劑的培養(yǎng)板中可觀察到更好的結(jié)果，因此這些組合物對于動物測試尤為有用，例如使用毒性蛋白治療腫瘤、給特定組織遞送激素、或其它可能需要遞送生物活性蛋白的病理情況。在其它實(shí)驗(yàn)中，觀察到，當(dāng)與硫酸軟骨素聯(lián)合使用時(正如培養(yǎng)板6或13)，α-硫辛酸可作為苯甲酸鹽緩沖劑的替代物產(chǎn)生相似的結(jié)果。
表9
注所有培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基均包括慶大霉素，并且除了對照外還含有4mML-谷氨酰胺。
這些實(shí)驗(yàn)還說明增強(qiáng)的瞬時表達(dá)可用于非?？焖俚纳a(chǎn)毫克級蛋白，而無需先建立外源基因已穩(wěn)定整合的細(xì)胞系。因此，增強(qiáng)的瞬時表達(dá)提供了一種有效表達(dá)足量候選生物藥物的新方法，以便對該藥物進(jìn)行回收和快速篩選藥物活性。因此，本發(fā)明提供實(shí)現(xiàn)加速藥物開發(fā)項(xiàng)目的方法。例如培養(yǎng)板6，每2×104細(xì)胞在14天內(nèi)可產(chǎn)生約26ng的β-半乳糖苷酶(見表9)。按比例擴(kuò)大至含約2×106細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)，采用該制劑產(chǎn)生的蛋白積累量將為約2.6mg。在實(shí)施例2應(yīng)用的HPBr裝置中，常規(guī)生長有109細(xì)胞，因此在該培養(yǎng)物中幾天內(nèi)可獲得幾十毫克或甚至數(shù)百毫克新的或感興趣的蛋白。
實(shí)施例7肝細(xì)胞的瞬時表達(dá)來源于豬胚胎細(xì)胞(外胚層階段)的全能(干細(xì)胞樣)克隆非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(PICM-19 3BT細(xì)胞；之后稱為“PICM-19細(xì)胞”)從Dr.N.Talbots(U.S.D.A.,Beltsville,MA)處獲得。這些細(xì)胞的行為類似肝干細(xì)胞，當(dāng)在5％或更少的CO2存在下培養(yǎng)時數(shù)月內(nèi)其表現(xiàn)出自我再生的性質(zhì)。在更高的CO2水平(例如達(dá)到約10％)，這些細(xì)胞開始分化。已從分化的PICM-19細(xì)胞中分離出至少兩種不同的分化細(xì)胞表型，即成熟的肝細(xì)胞和產(chǎn)生膽汁的可塑性肝細(xì)胞。已誘導(dǎo)分化的PICM-19細(xì)胞可用作檢測原代肝細(xì)胞(與其極為類似的一種細(xì)胞類型)轉(zhuǎn)染特征的一種手段。在以原代豬肝培養(yǎng)物進(jìn)行的早期實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果印證了SW480細(xì)胞的上述結(jié)果。因?yàn)樵渭?xì)胞培養(yǎng)物含有肝細(xì)胞以外的細(xì)胞類型，所以用提供肝細(xì)胞樣細(xì)胞相同來源的PICM-19細(xì)胞重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)。
使用的操作程序與用于轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的實(shí)施例1所述程序一致，每孔使用1×107細(xì)胞，只是PICM-19細(xì)胞接種在絲裂霉素C-失活的STO鼠成纖維飼養(yǎng)細(xì)胞(CRL1503)層上，因?yàn)檎Ｇ闆r下無這種飼養(yǎng)細(xì)胞存在時PICM-19細(xì)胞不能生長。在脂質(zhì)體制備中，DNA/脂質(zhì)與細(xì)胞的比例同實(shí)施例1。整個這些實(shí)驗(yàn)中孵育箱維持10％CO2。PICM-19細(xì)胞增殖并在該培養(yǎng)條件下分化成成熟肝細(xì)胞。為確保分化完全，培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)染步驟前在10％CO2中維持3周。
表10描述了以這些細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染研究中使用的培養(yǎng)基，以及這些培養(yǎng)物中測定的X、G7和K因子。用于這些實(shí)驗(yàn)的硫酸軟骨素同實(shí)施例2。表10所示結(jié)果與以SW480獲得的發(fā)現(xiàn)一致，并且當(dāng)在相同條件下轉(zhuǎn)染成年豬肝原代分離物時也觀察到這些結(jié)果。
令人驚奇的是，還觀察到，缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板能支持分化的PICM-19細(xì)胞至少4周。正如圖3所示，這些細(xì)胞還表達(dá)轉(zhuǎn)染DNA，雖然相對于其它測試培養(yǎng)板效率降低。該結(jié)果十分令人吃驚，因?yàn)樵诓缓曫B(yǎng)細(xì)胞層或加入細(xì)胞前培養(yǎng)板未應(yīng)用蛋白質(zhì)包被(例如膠原)的情況下，肝細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長或維持超過幾天的報(bào)道從未有過。引人注意的是，培養(yǎng)板4中的細(xì)胞與在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中的細(xì)胞一樣貼壁，說明硫酸軟骨素為細(xì)胞的生長和維持創(chuàng)造了類似體內(nèi)的條件。因此，這些實(shí)驗(yàn)首次說明硫酸軟骨素可用于在無飼養(yǎng)細(xì)胞的低價培養(yǎng)基組分中培養(yǎng)肝細(xì)胞并維持其類似于所觀察到的體內(nèi)肝細(xì)胞的表型。
表10
實(shí)施例8從生長在生物反應(yīng)器中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)回收轉(zhuǎn)基因mRNA和DNA在32天的實(shí)驗(yàn)中使用實(shí)施例3所述高效生物反應(yīng)器裝置(HPBr)，其中按實(shí)施例3和表5所述轉(zhuǎn)染并增殖SW480。除非以下特別描述，所用條件和分析與實(shí)施例3所述相同。實(shí)驗(yàn)開始時，將從組織培養(yǎng)瓶中新鮮收獲的1×107個SW480細(xì)胞注射至HPBr裝置，同時加入1×106個預(yù)溶脹微球。然后在含有1mm苯甲酸和1mm 4-乙基苯甲酸(一種A型制劑)的培養(yǎng)基中不轉(zhuǎn)動地培養(yǎng)細(xì)胞24小時。24小時后，加入編碼β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒DNA，并以30 cpm的速度轉(zhuǎn)動該生物反應(yīng)器4小時。然后用含有1mm苯甲酸、1mm 4-乙基苯甲酸和0.1mM硫酸軟骨素(Biorelease Corp.No.409-4k)的飼養(yǎng)培養(yǎng)基沖洗3次，將含有DNA的培養(yǎng)基從生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外空間(ECS)中除去。該后一種試劑組合是B型制劑。之后，用于循環(huán)生物反應(yīng)器的1升培養(yǎng)基更換為1升含有同樣B型制劑的飼養(yǎng)培養(yǎng)基。在以后的實(shí)驗(yàn)中，循環(huán)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基每7天以1升新鮮的含有B型制劑的飼養(yǎng)培養(yǎng)基更換。DNA除去后該裝置不再轉(zhuǎn)動以便細(xì)胞能形成腫瘤樣實(shí)體塊。
從DNA從生物反應(yīng)器中除去后24小時開始，每天從ECS取出等量的細(xì)胞和培養(yǎng)物上清，持續(xù)32天。通過用培養(yǎng)基流沖打細(xì)胞塊以分離出一些細(xì)胞然后回收少量所獲細(xì)胞懸液的方法進(jìn)行細(xì)胞取樣。通過瞬時離心分離每個樣品的細(xì)胞和培養(yǎng)基。每天等量樣品中取2×104細(xì)胞用于β-半乳糖苷酶的分析，每個上清用于其代謝信號的分析，即葡萄糖、乳酸和氨的濃度。在第32天收集了每天樣品后，通過胰蛋白酶消化從ECS中收獲剩余細(xì)胞，并且取2.8×105個收獲細(xì)胞用于RNA和DNA的提取。
按實(shí)施例3所述方法分析每天細(xì)胞樣品中的β-半乳糖苷酶，這些分析的結(jié)果見圖4。圖4顯示了β-半乳糖苷酶表達(dá)峰出現(xiàn)于第4天，并且直到約第12天基本上一直保持不變，之后的值不大恒定但仍保持相對高水平。最后的數(shù)據(jù)點(diǎn)，相應(yīng)于該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時通過胰蛋白酶消化收集的細(xì)胞，在圖4中以正方形標(biāo)記顯示，并且該值是峰值的大約60％。因此，在整個32天期間該培養(yǎng)物中產(chǎn)生了相對高水平的β-半乳糖苷酶。
使用實(shí)施例2所述程序測定上清中的葡萄糖、乳酸和氨的濃度，這些測定的結(jié)果見圖5A-5C。從圖5A和5B可見葡萄糖和乳酸濃度在整個實(shí)驗(yàn)過程中均無顯著變化(考慮到這些樣品中存在的乳酸量低并且在第7天后測定的量相對恒定，因此并不認(rèn)為乳酸的波動是顯著的)。相反，到培養(yǎng)基更換間的每7天時期結(jié)束時，在每次提供新鮮培養(yǎng)基氨濃度值落回基值之前，氨濃度增加2倍以上。每次培養(yǎng)基更換后氨的這種重復(fù)累積充分支持這個想法，即暴露于轉(zhuǎn)染穩(wěn)定化化合物會使細(xì)胞改變其代謝，從使用葡萄糖(糖酵解)轉(zhuǎn)變?yōu)槭褂玫鞍谆虬被嶙鳛橹饕荚?三羧酸循環(huán))。如果該實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞使用葡萄糖作為其主要能量來源，則在每7天的期間中增加的是乳酸而非氨的濃度(注意，圖5B提示在第一個7天的期間中可能發(fā)生了一些糖酵解)。
氨是氨基酸代謝物進(jìn)入三羧酸循環(huán)的早期步驟脫氨基反應(yīng)的副產(chǎn)品。因此，在培養(yǎng)基中氨積累的最可能解釋是細(xì)胞在暴露于用于穩(wěn)定瞬時表達(dá)的化合物的過程中使用氨基酸或可能是肽或蛋白作為其能量來源。例如這些氨基酸可能來源于培養(yǎng)基中存在的肽。這些肽可能是在培養(yǎng)基的血清熱滅活過程中血清蛋白的熱誘導(dǎo)分解產(chǎn)生的。
瞬時表達(dá)穩(wěn)定化化合物引起細(xì)胞從使用葡萄糖作為能源轉(zhuǎn)變成使用氨基酸作為能源的能力是其用途的重要暗示。例如氨基酸代謝的三羧酸循環(huán)在脂肪和脂質(zhì)代謝中同樣十分重要。因此，用瞬時表達(dá)誘導(dǎo)化合物處理細(xì)胞或人對象也可通過激活三羧酸循環(huán)導(dǎo)致脂肪和脂質(zhì)代謝的增加。因此，該化合物可用作例如控制體重的試劑。這些結(jié)果也說明圖5A-5C中特有的代謝信號與增強(qiáng)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因瞬時表達(dá)的生理狀態(tài)間相關(guān)。
為制備核酸，離心沉淀在32天孵育期結(jié)束時收獲的2.8×105胰蛋白酶消化細(xì)胞，用5ml無鈣無鎂PBS洗滌，在室溫下與1ml TRIZOLTM(LifeTechnologies)混合。然后將懸浮于TRIZOLTM中的細(xì)胞在4℃孵育10分鐘。在此，將樣品凍存于-70℃。解凍后，樣品置于室溫20分鐘，然后加入200ul氯仿，劇烈混合15秒，室溫孵育5-20分鐘。然后，在4℃以2,000×g離心樣品以將該乳濁液分為兩相。
為分離RNA，仔細(xì)收集上層水相不要包含任何中間相，轉(zhuǎn)移至另一管中以沉淀RNA，取0.5ml異丙醇與該液相混合，該管在室溫孵育10-20分鐘，然后4℃以12,000×g離心收集RNA沉淀。用1ml 70％(v/v)的乙醇仔細(xì)洗滌該沉淀，室溫空氣干燥5-10分鐘，重懸于30ul無RNA酶的水(Five Prime Three Prime)中。
為分離DNA，收集上述下相有機(jī)層，與300ul 100％的乙醇顛倒混合，然后置于室溫2-3分鐘沉淀DNA。在4℃以2,000×g離心5分鐘收集DNA沉淀，然后用含有0.1mM的檸檬酸鈉的10％乙醇洗滌兩次。第二次洗滌后，4℃2,000×g離心5分鐘再次收集DNA沉淀，并室溫重懸于70％的乙醇洗滌10-20分鐘。離心再次收集沉淀，簡單干燥，于8mM氫氧化鈉中重懸和溶解。
為檢測β-半乳糖苷酶序列的存在，于260nm讀取吸光值以確定RNA濃度，然后用無RNA酶的水稀釋RNA溶液至終濃度100ug/ml。然后取50ul稀釋的RNA溶液與150ul 50∶50的37％甲醛和20×SSC溶液混合。將樣品加熱至55-60℃ 20分鐘以變性靶核酸，置于冰上，再加入200ul無RNA酶的水。振蕩樣品并瞬時離心以沉淀不溶物，在輕度真空狀態(tài)下上樣至狹縫印跡裝置的孔中以收集RNA至GeneScreen PlusTM膜(NewEngland Nuclear)。用50ul 10×SSC洗滌孔，并將該膜暴露于紫外光下以使RNA與膜交連，然后在約90℃干烤1小時除去甲醛。用相同程序?qū)NA樣品作狹逢印跡，只是不使用真空。
通過與轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒中存在的β-半乳糖苷酶基因的一部分相應(yīng)的32p標(biāo)記的寡核苷酸雜交，測定狹縫印跡膜上β-半乳糖苷酶基因mRNA或DNA的存在。該寡核苷酸的核苷酸序列是5′CTCCAACGCAGCACCATCAC 3′(SEQ ID NO:1)。為了雜交，取10ml雜交緩沖液(1ml 50×Denhardt′s溶液，10ul 10mg/ml聚腺苷酸，12.5ml 20×SSC,5ml 10％十二烷基硫酸鈉，和2.5ml 0.5M NaPO4(pH6.5)，終體積50ml)放入含有狹縫雜交膜和1×106記數(shù)/ml32P標(biāo)記探針的塑料袋中。將袋密封，在52-53℃孵育過夜。雜交之后用含有5×SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉的緩沖液在室溫洗膜5-10分鐘，共兩次，然后再用相同緩沖液在52-53℃洗膜2次，每次20-30分鐘，然后用X光片曝光。
在獲得的放射自顯影片上，顯示的信號表明在轉(zhuǎn)染后32天收獲的細(xì)胞中存在含有β-半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)染DNA。因此，很明顯該DNA在整個32天實(shí)驗(yàn)期間保持相對高的量。同樣，用β-半乳糖苷酶探針雜交后RNA狹縫印跡的放射自顯影顯示驚人的強(qiáng)信號。在無數(shù)以前的實(shí)驗(yàn)中，顯示出在從培養(yǎng)基中除去誘導(dǎo)化合物之后2-3天內(nèi)細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生降低并消失。因此，很明顯本實(shí)驗(yàn)中觀察到的可檢測β-半乳糖苷酶DNA和mRNA的保持不是由于整合了外源DNA的細(xì)胞的生長造成的。而且，mRNA的典型半衰期僅約1-3天，因此32天孵育期間結(jié)束時β-半乳糖苷酶mRNA的存在提示該mRNA是最近轉(zhuǎn)錄的，這樣轉(zhuǎn)染外源DNA必定保持在整個32天實(shí)驗(yàn)期間存在。
32天孵育之后檢測到β-半乳糖苷酶DNA提示在該期間外源DNA復(fù)制和數(shù)量增加的可能性。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞持續(xù)生長和分裂，人們會預(yù)期在第0天加入的質(zhì)粒DNA已被稀釋，因此32天后分析的細(xì)胞將含有極少的β-半乳糖苷酶DNA。因此，令人吃驚地存在容易檢測數(shù)量的β-半乳糖苷酶mRNA和DNA，提示轉(zhuǎn)染DNA可能已在實(shí)驗(yàn)過程中復(fù)制，這可能在線粒體內(nèi)進(jìn)行。
實(shí)施例9在用瞬時表達(dá)穩(wěn)定化化合物處理的細(xì)胞中堿性磷酸酶的誘導(dǎo)下列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指出，除了誘導(dǎo)三羧酸循環(huán)外，按實(shí)施例8所述處理的細(xì)胞的代謝信號還包括正常情況下在培養(yǎng)基中幾乎不能從SW480細(xì)胞檢測到的內(nèi)源性磷酸酶活性的誘導(dǎo)。將細(xì)胞在塑料組織培養(yǎng)皿中生長，并使用實(shí)施例8所述相同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染和增殖。每天加入幾毫升飼養(yǎng)培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞。從轉(zhuǎn)染后第一天開始，每天從培養(yǎng)板收獲培養(yǎng)基的等分試樣，按實(shí)施例8所述分析這些等分試樣的葡萄糖、乳酸、和氨的濃度。出人意料地，當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)分析這些相同樣品的內(nèi)源性磷酸酶活性時，檢測到高數(shù)量的活性。與傳統(tǒng)生長的SW480細(xì)胞相比，觀察到的提高程度的范圍在從約2倍到約20倍。
按如下設(shè)計(jì)測量“分泌的堿性磷酸酶活性”(SEAP)的實(shí)驗(yàn)。每個樣品取0.5ml與2×SEAP緩沖液(1×SEAP緩沖液=1M二乙醇胺，0.50mM氯化鎂，pH 9.8)混合。作為對照，同時檢測牛腸粘膜堿性磷酸酶。牛堿性磷酸酶是用1×SEAP制備的。這些實(shí)驗(yàn)的生色底物是0.15M磷酸對硝基苯基酯，它在被堿性磷酸酶切割后產(chǎn)生可在405nm處檢測的產(chǎn)物。給每個分析管中加入(100ul)底物，然后將該管置于37℃。之后，對照樣品每分鐘讀一次吸光度，共10分鐘，同時在第1和6分鐘測定每個實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度。采用下列公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品的磷酸酶活性單位/ml 其中A405nm=405nm處的吸光度，V=分析管中的體積，df=稀釋因子，VE=加入分析管中的樣品體積。
對于該組實(shí)驗(yàn)，V=1.1 ml,df=2.2，和VE=0.5 ml。
為測定誘導(dǎo)的磷酸酶活性是否熱敏感，用與上述SEAP緩沖液相同但含有0.01 M L-高精氨酸的分析緩沖液對相同樣品進(jìn)行第二組實(shí)驗(yàn)。將對照酶樣品(Clontech Laboratories)和培養(yǎng)基樣品在該緩沖液中加熱至65℃5-10分鐘，然后加入底物。已知該加熱處理破壞表達(dá)該酶的大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的堿性磷酸酶，的確，它破壞了這些樣品中的磷酸酶活性以及對照堿性磷酸酶樣品中的磷酸酶活性。誘導(dǎo)的磷酸酶的最佳pH還未確定，因此，這些結(jié)果并不一定說明所誘導(dǎo)的磷酸酶是“堿性磷酸酶”。盡管還存在其它磷酸酶，在動物細(xì)胞中常見的磷酸酶包括在溶酶體中發(fā)現(xiàn)的酸性磷酸酶和胰腺堿性磷酸酶。
在許多實(shí)驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物開始從轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中消失的期間開始時，培養(yǎng)基中檢測到突發(fā)性的誘導(dǎo)磷酸酶活性。因此，磷酸酶活性的波峰提供涉及轉(zhuǎn)基因DNA從轉(zhuǎn)染細(xì)胞有效排除的細(xì)胞內(nèi)事件的標(biāo)志。
實(shí)施例10分子量對硫酸軟骨素的有效性的影響進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以測定多糖大小對其增強(qiáng)瞬時表達(dá)的有效性的影響。對于這些實(shí)驗(yàn)，所用程序是實(shí)施例6中所述用于培養(yǎng)板#6(見表8)的程序，只是用下面描述的化合物替代加至培養(yǎng)板#6/表8的硫酸軟骨素。
為了評價在應(yīng)用本程序時可期望的變異性程度，在使用平均分子量為4 kDa的硫酸軟骨素的4個分開的實(shí)驗(yàn)中對X和G14值取平均值。在所有4個實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行培養(yǎng)板#6/表8的程序。這些比較所用的硫酸軟骨素或從Biorelease獲得，或通過用堿然后是酸處理大(＞20 kDa)的硫酸軟骨素(A型)來制備。非購買制品的大小通過根據(jù)廠家說明(Pharmacia)使用PhastSystem凝膠與Biorelease 4 kDa硫酸軟骨素進(jìn)行電泳比較來確定。結(jié)果見表11，其中在4次實(shí)驗(yàn)中觀察到的X和G14的范圍顯示在平均值下邊的括弧內(nèi)。這些數(shù)據(jù)表明所述程序是相當(dāng)可重復(fù)的，因?yàn)槭褂脙蓚€不同硫酸軟骨素制品獲得了類似的結(jié)果。而且，除了一個例外(即409-4K制品的X因子)，X和G因子觀察到非常窄的變化范圍。假定瞬時表達(dá)結(jié)果典型地變化約20％，這些結(jié)果說明變異程度可以接受。
表11變異性
為了確定大小對多糖增強(qiáng)瞬時表達(dá)的能力的影響，測定了各種大小的硫酸軟骨素。這組實(shí)驗(yàn)包括A型和C型硫酸軟骨素，見表12。表12的結(jié)果清楚地顯示＞20 kDa的硫酸軟骨素在根據(jù)該程序使用時無效，而9kDa和4 kDa的制品均有效。表12還給出了鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表示為內(nèi)毒素單位/ml(Eu/ml)，該實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染之前、過程中和之后但在加入血清之前對所有使用的培養(yǎng)基進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)提供水溶液中革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的定量測定。LAL實(shí)驗(yàn)是用BioWhittaker(Walkersfield，MD)的Pyrogent_03 Plus試劑盒按廠家說明書進(jìn)行的。表12中LAL結(jié)果是在加入血清之前分析的轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基的結(jié)果。所有用于這些實(shí)驗(yàn)的溶液均在超凈工作臺中用標(biāo)準(zhǔn)無菌程序制備。
表12
*Biorelease公司，340 Granite St.,2ndFl.,Manchester,NH 03102+Soft Gel Technologies公司，6982 Bandini Blvd.Los Angeles,CA 90040
因?yàn)楸?2中顯示的結(jié)果提示多糖鏈越小產(chǎn)生的結(jié)果越好，所以進(jìn)行了另一些實(shí)驗(yàn)以確定來自硫酸軟骨素的單個重復(fù)單位是否對增強(qiáng)瞬時表達(dá)有效。如表13所示，盡管來自C型(ΔDi-6S)硫酸軟骨素的二糖單位比對照給出了更好的結(jié)果，但確定來自A型的二糖單位(是主要單體)有細(xì)胞毒性，因此不適于在本程序中使用。還測定了聚甘露糖、甘露糖和2-羥丙基醚形式的半乳甘露聚糖，發(fā)現(xiàn)它們對增強(qiáng)瞬時表達(dá)有效，見表13。
表13
*Sigma,#C4045(ΔDi-45)；#C4170(ΔDi-65)**Carrington Laboratories,Irving,TX+Carbomer,Inc.,Westborough,MA總之，看起來平均分子量為4 kDa的C型硫酸軟骨素對在瞬時表達(dá)第二期過程中增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因蛋白生產(chǎn)特別有效。
盡管已闡述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解，可在其中進(jìn)行各種修改而不脫離本發(fā)明的主旨和范圍。
權(quán)利要求
1．在真核細(xì)胞中增強(qiáng)外源基因瞬時表達(dá)的方法，其包括以能在該細(xì)胞中表達(dá)的形式將編碼蛋白質(zhì)的外源DNA分子導(dǎo)入該細(xì)胞；在導(dǎo)入DNA之前、過程中或之后用生物適合的瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑接觸該細(xì)胞；導(dǎo)入DNA之后，在非選擇性培養(yǎng)基中維持細(xì)胞；和在非選擇性培養(yǎng)基中維持細(xì)胞至少4天之后，檢測細(xì)胞中的外源蛋白質(zhì)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含至少一種具有如下分子式的羧酸衍生物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的側(cè)鏈；C6H4R4，其中R4是H,CH3,(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2選自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金屬平衡離子或低分子量有機(jī)陽離子。
3．權(quán)利要求2的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含選自3-甲基-L-組氨酸、α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、葉酸、谷胱甘肽、馬尿酸、高絲氨酸、N-(4-氨基芐基)-L-谷氨酸二乙酯、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲酰-L-甲硫氨酸、和鳥氨酸的氨基酸衍生物。
4．權(quán)利要求2的方法，其中R1是pH在4.5-10.5之間的非極性或疏水的。
5．權(quán)利要求1的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含具有下列分子式的磺酸衍生物R7-SO2-OR8其中R7是低級烷基、芳基、取代的低級烷基、芳基、取代的低級烷基或取代的芳基；而且R8是氫、金屬平衡離子或低分子量的有機(jī)陽離子。
6．權(quán)利要求5的方法，其中R7是氨基取代的低級烷基或氨基取代的芳基。
7．權(quán)利要求5的方法，其中磺酸衍生物選自3-氨基苯磺酸、?；撬岷推潲}。
8．權(quán)利要求1的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含糖胺聚糖。
9．權(quán)利要求8的方法，其中糖胺聚糖是磺酸化氨基多糖。
10．權(quán)利要求9的方法，其中磺酸化氨基多糖包含N-乙?；被嗵?。
11．權(quán)利要求10的方法，其中N-乙?；被嗵鞘橇蛩彳浌撬?。
12．權(quán)利要求1的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含選自腎上腺素、輔酶B12和甲鈷胺的化合物。
13．權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑包含苯甲酸和4-乙基苯甲酸；或苯甲酸鹽緩沖劑和硫酸軟骨素；或苯甲酸鹽緩沖劑和谷氨酸；或谷光甘肽、甲硫氨酸、甘氨酸、α-氨基-正丁酸、?；撬?、苯丙氨酸、苯甲酸鹽緩沖劑和丙氨酸；或4-乙基苯甲酸、苯甲酸和硫酸軟骨素；或α-硫辛酸和硫酸軟骨素。
14．權(quán)利要求1的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑的濃度是1-15mM。
15．權(quán)利要求9的方法，其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑的濃度是0.01-0.5mM。
16．權(quán)利要求11的方法，其中硫酸軟骨素的平均分子量不超過9000道爾頓。
17．權(quán)利要求11的方法，其中硫酸軟骨素的平均分子量不超過4000道爾頓。
18．權(quán)利要求1的方法，其中在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞之前和過程中用第一瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑接觸細(xì)胞，其中該試劑包含至少一種具有如下分子式的化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的側(cè)鏈；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2選自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金屬平衡離子或低分子量有機(jī)陽離子；或第一瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含具有如下分子式的化合物R7-SO2-OR8其中R7是低級烷基、芳基、取代的低級烷基、或取代的芳基；而且R8是氫、金屬平衡離子或低分子量的有機(jī)陽離子；在外源DNA導(dǎo)入之后，用第二瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑接觸細(xì)胞，其中第二試劑包含磺酸化氨基多糖。
19．權(quán)利要求18的方法，其中在DNA導(dǎo)入細(xì)胞之后細(xì)胞進(jìn)一步持續(xù)暴露于第一試劑中。
20．權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞。
21．權(quán)利要求20的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞選自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系、雜交瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)細(xì)胞。
22．權(quán)利要求21的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞是SW480 P3細(xì)胞。
23．權(quán)利要求1的方法，其中收獲外源基因編碼的蛋白質(zhì)。
24．權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞存在于活宿主中，并且瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑通過口服或注射導(dǎo)入宿主。
25．權(quán)利要求1的方法，其中外源DNA通過選自脂轉(zhuǎn)染、病毒載體、細(xì)胞暴露于磷酸鈣的共沉淀和在樹狀聚合物存在時轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入細(xì)胞。
26．權(quán)利要求25的方法，其中DNA通過病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞，并且該病毒載體包含腺病毒。
27．權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑含有至少一個酸性部分和至少一個pH在4.5-10.5之間時疏水的部分，而且其中酸性基團(tuán)可修飾形成鹽或酯。
28．權(quán)利要求27的方法，其中酸性部分在pH4.5-10.5之間時是疏水和有機(jī)的。
29．篩選含有至少一種化學(xué)化合物的試劑以確定該試劑是否能增強(qiáng)真核細(xì)胞中外源基因瞬時表達(dá)的方法，其中該試劑是生物適合的并含有至少一個疏水部分和至少一個酸性部分，該方法包含步驟在第0天給第一和第二SW480 P3細(xì)胞導(dǎo)入能在細(xì)胞中表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的外源DNA分子；在導(dǎo)入DNA之前、過程中或之后，用所述試劑接觸第二細(xì)胞；積累測量兩種細(xì)胞中第0和4天之間或第4和7天之間或第4和14天之間從外源DNA表達(dá)的蛋白質(zhì)的量，并用這些量按照下列等式分別計(jì)算X、G7或G14的值 其中“A”是在第一細(xì)胞中表達(dá)的外源基因編碼蛋白質(zhì)的量，“C”是在第二細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的量；和如果X或G7或G14大于10，則確定該試劑能增強(qiáng)瞬時表達(dá)。
30．權(quán)利要求29的方法，其中X或G7或G14大于25。
31．增強(qiáng)細(xì)胞中外源基因瞬時表達(dá)的方法，包括給細(xì)胞導(dǎo)入能在細(xì)胞中表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的外源DNA分子；和用當(dāng)根據(jù)權(quán)利要求29的分析評價試劑時X或G7或G14大于25的試劑接觸細(xì)胞。
32．操作細(xì)胞代謝降低細(xì)胞葡萄糖消耗的方法，包括用誘導(dǎo)細(xì)胞使用蛋白質(zhì)或氨基酸作為其主要能量來源的試劑接觸細(xì)胞。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述試劑進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性磷酸酶活性。
34．權(quán)利要求32的方法，其中所述試劑能增強(qiáng)細(xì)胞中外源基因瞬時表達(dá)，其中該試劑包含至少一種具有如下分子式的化學(xué)化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的側(cè)鏈；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2選自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金屬平衡離子或低分子量有機(jī)陽離子；或組成如下分子式的磺酸衍生物的基團(tuán)R7-SO2-OR8其中R7是低級烷基、芳基、取代的低級烷基、或取代的芳基；而且R8是氫、金屬平衡離子或低分子量的有機(jī)陽離子；或一種磺酸化氨基多糖。
35．權(quán)利要求34的方法，其中所述試劑包含選自苯甲酸、4-乙基苯甲酸、苯甲酸鹽緩沖劑和硫酸軟骨素的化合物。
36．權(quán)利要求34的方法，其中將試劑體內(nèi)施用給哺乳動物。
37．增強(qiáng)細(xì)胞貼附培養(yǎng)基質(zhì)的方法，其中向培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入一種磺酸化氨基多糖。
38．權(quán)利要求37的方法，其中細(xì)胞是為了在培養(yǎng)時生長正常情況下需要飼養(yǎng)層的細(xì)胞。
39．權(quán)利要求37的方法，其中細(xì)胞是肝細(xì)胞，并且磺酸化氨基多糖是硫酸軟骨素。
40．增強(qiáng)真核細(xì)胞中外源基因瞬時表達(dá)的方法，其包括以能在該細(xì)胞中表達(dá)的形式將編碼蛋白質(zhì)的外源DNA分子導(dǎo)入該細(xì)胞；在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞過程中用第一試劑接觸該細(xì)胞，其中第一試劑包含至少一種具有如下分子式的化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的側(cè)鏈；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCOMH2；或C5H4N；而且其中R2選自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金屬平衡離子或低分子量有機(jī)陽離子；或第一試劑包含至少一種具有如下分子式的化學(xué)化合物R7-SO2-OR8其中R7是低級烷基、芳基、取代的低級烷基或取代的芳基；而且R8是氫、金屬平衡離子或低分子量的有機(jī)陽離子；并在外源DNA導(dǎo)入過程中和/或之后，用第二試劑接觸細(xì)胞，其中第二試劑包含至少一種磺酸化氨基多糖，或其中第二試劑包含至少一種具有如下分子式的化學(xué)化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的側(cè)鏈；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2選自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金屬平衡離子或低分子量有機(jī)陽離子；或第二試劑包含至少一種具有如下分子式的化學(xué)化合物R7-SO2-OR8其中R7是低級烷基、芳基、取代的低級烷基或取代的芳基；而且R6是氫、金屬平衡離子或低分子量的有機(jī)陽離子；而且其中當(dāng)X按如下公式計(jì)算時第一試劑的X值大于25X=100-(A×100)C,]]>而且其中第二試劑的G7或G14值大于25，其中G7或G14按如下公式計(jì)算 其中對于X或G7或G14,“A”是用第一和第二試劑接觸的第一細(xì)胞中表達(dá)的外源基因編碼蛋白的量，而“C”是沒有用第一或第二試劑接觸的第二細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的量。
41．權(quán)利要求40的方法，其中細(xì)胞在外源DNA導(dǎo)入之前、之后持續(xù)地、或之前和之后持續(xù)地與第一試劑接觸。
42．權(quán)利要求40的方法，其中第一試劑含有苯甲酸鹽緩沖劑，而且第二試劑含有硫酸軟骨素。
43．權(quán)利要求40的方法，其中第一試劑含有苯甲酸和4-乙基苯甲酸，而且第二試劑含有苯甲酸鹽緩沖劑和硫酸軟骨素。
44．權(quán)利要求40的方法，其中第一試劑含有苯甲酸鹽緩沖劑和谷氨酸，而且第二試劑含有硫酸軟骨素。
45．權(quán)利要求40的方法，其中在外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞之前細(xì)胞與第一試劑接觸約24小時。
46．增強(qiáng)真核細(xì)胞中外源基因瞬時表達(dá)的方法，其包括以能在該細(xì)胞中表達(dá)的形式將編碼蛋白質(zhì)的外源DNA分子導(dǎo)入該細(xì)胞；并且，在外源基因?qū)隓NA之前、過程中或之后用瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑接觸該細(xì)胞；其中瞬時表達(dá)增強(qiáng)劑包含選自如下物質(zhì)的化合物3-甲基-L-組氨酸、α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、谷胱甘肽、馬尿酸、高絲氨酸、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲?；?L-甲硫氨酸、鳥氨酸、N-(4-氨基芐基)-L-谷氨酸二乙酯、4-乙酰丁酸乙酯、腎上腺素、甲鈷胺、苯甲酸、苯甲酸鹽緩沖劑、4-乙基苯甲酸和磺酸化N-乙?；被嗵?、來源于C型硫酸軟骨素的二糖單體單位、聚甘露糖、甘露糖；或具有如下分子式的磺酸衍生物R7-SO2-OR8其中R7是低級烷基、芳基、取代的低級烷基、芳基、取代的低級烷基、或取代芳基，而R8是氫、金屬平衡離子、或低分子量有機(jī)陽離子；或苯甲酸和4-乙基苯甲酸；或苯甲酸和4-乙基苯甲酸和硫酸軟骨素；或苯甲酸和L-谷氨酰胺；或苯甲酸鹽緩沖劑和硫酸軟骨素；或苯甲酸鹽緩沖劑和谷氨酸；或硫辛酸和硫酸軟骨素；或苯甲酸鹽緩沖劑、硫酸軟骨素和L-谷氨酰胺；或硫酸軟骨素和L-谷氨酰胺；或丁酸鹽緩沖劑和L-谷氨酰胺；或含有谷光甘肽、甲硫氨酸、甘氨酸、α-氨基-正丁酸、?；撬?、苯丙氨酸、苯甲酸鹽緩沖劑和丙氨酸的混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供用于增強(qiáng)真核細(xì)胞中瞬時表達(dá)的方法和化學(xué)試劑。還提供在實(shí)體瘤中獲得延長的瞬時表達(dá)的模式系統(tǒng)、在無飼養(yǎng)細(xì)胞或與基質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞外基質(zhì)時培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法、操作細(xì)胞代謝以降低葡萄糖消耗的方法以及誘導(dǎo)內(nèi)源磷酸酶活性分泌的方法。
文檔編號A61K31/131GK1306569SQ99807164
公開日2001年8月1日 申請日期1999年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月8日
發(fā)明者R·A·格菲, A·S·格菲 申請人:基因斯潘公司