專利名稱：與人ζ鏈胞外域特異性相互作用的免疫制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸分子，它含有編碼一種抗體的可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR)的核酸序列，該抗體特異性地與完整細(xì)胞表面的人ζ(zeta)鏈的胞外域相互作用，該抗體可以通過先用Jurkat細(xì)胞，接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個氨基酸的肽構(gòu)成的偶聯(lián)物免疫大鼠來制取。較好的是，本發(fā)明核酸分子所編碼的肽或多肽是一種單特異性或雙特異性抗體。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸分子或抗體的藥物組合物，還涉及含上述化合物的試劑盒。最后，本發(fā)明還涉及用本發(fā)明抗體測定NK細(xì)胞、T細(xì)胞或它們前體細(xì)胞上ζ鏈或η(eta)鏈表達(dá)的方法。
ζ鏈屬于一族結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，該家族還包括η鏈(ζ鏈的另一種剪接形式)和高親合性IgE-Fc-受體FcεRI的γ鏈。這一族跨膜蛋白的共同特征是它們的長胞內(nèi)域，該結(jié)構(gòu)域包含一個或數(shù)個ITAM基序(免疫受體的酪氨酸活化基序；ζ3，η2，γ1)和9(ζ，η，序列相同)或4(FcεRI-γ)個氨基酸的極短的胞外域。這些蛋白的胞外域序列在小鼠、大鼠和人之間100％保守，而且可能還與其他物種之間保守。
ζ鏈僅在T淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞以及(一定程度上)在它們的前體細(xì)胞上表達(dá)為同源二聚體或與η鏈的異二聚體。在成熟T淋巴細(xì)胞表面上，ζ鏈在結(jié)構(gòu)和功能上與T細(xì)胞受體(TCR)和CD3-復(fù)合物密切相關(guān)。通過TCR參與誘導(dǎo)的信號經(jīng)CD3和ζ鏈轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，其中，與構(gòu)成CD3-復(fù)合物的ε、δ和γ鏈(不是FcεRI-γ)上的單個ITAM相比，ζ鏈上的三個ITAM提供了主要的信號放大作用。
在NK細(xì)胞表面，ζ鏈與IgG-Fc-受體(FcγRIIIA)表現(xiàn)出相似的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)抗體覆蓋的靶細(xì)胞通過FcγRIIIA被NK細(xì)胞識別時，產(chǎn)生的信號通過ζ鏈和/或γ鏈轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞質(zhì)，于是激活NK細(xì)胞裂解被識別的靶細(xì)胞(ADCC，依賴于抗體的細(xì)胞毒性)。
因此，成熟T淋巴細(xì)胞上的TCR復(fù)合物是一種由多條鏈(TCR-α/β或TCR-γ/δ與CD3ε、CD3δ、CD3γ和ζ鏈或它的另一剪接產(chǎn)物η)偶聯(lián)構(gòu)成的寡聚結(jié)構(gòu)(Keegan，今日免疫學(xué)Immunology Today)13(1992)，63-68)。由缺乏胞質(zhì)內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域的多形TCR-α/β或TCR-γ/δ異二聚體識別抗原。不變的CD3蛋白(γ/δ和δ/ε異二聚體)和ζ或η鏈(ζ同源二聚體或ζ-η異二聚體)是正確裝配、運輸和在細(xì)胞表面有效表達(dá)完整TCR復(fù)合物，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)TDR信號所必需的(Clevers，免疫學(xué)評論年報(Annu.Rev.Immunol.)6(1988)629-662，Ashwell，免疫學(xué)評論年報8(1990)，139-167)。信號的傳遞必需一段保守的18氨基酸序列(Reth，自然(Nature)338(1989)383-384，Samelson，J.，生物化學(xué)(Biol.Chem.)267(1992)24913-24916)，稱為免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，它在ζ鏈中有三份，η鏈中有兩份，各CD3亞基中(γ、δ和ε)中有一份。每個ITAM都含有一對酪氨酸-X-X-亮氨酸/異亮氨酸(Y-X-X-L/I)基序，相隔10或11個氨基酸(Cambier，今日免疫學(xué)16(1995)110)。TCR連接后，每個ITAM內(nèi)的酪氨酸殘基迅速磷酸化，并起著信號蛋白?？课稽c的作用，信號蛋白通過src-同源性-2(SH2)結(jié)構(gòu)域與磷酸酪氨酸結(jié)合(Cooke，細(xì)胞(Cell)65(1990)281-291，Glaischenhaus，細(xì)胞64(1991)511-520，Samelson，美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87(1990)，Straus，細(xì)胞70(1992)585-593，Songyan，細(xì)胞72(1993)767-778，Songyan，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)14(1994)2777-2785，Isakov，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)181(1995)375-380)。對抗原特異性T細(xì)胞雜交瘤的ζ鏈缺陷突變株(該突變株不能應(yīng)答抗原，對抗CD-3抗體只有弱應(yīng)答)進(jìn)行的研究證實ζ鏈?zhǔn)荰CR介導(dǎo)的信號傳遞所必需的(Sussman，細(xì)胞52(1988)85-95)。雖然在CD-3抗體刺激應(yīng)答種部分活性的保留表明TCR復(fù)合物的其他鏈能夠補償ζ的缺失，但其他研究顯示，當(dāng)突變系通過轉(zhuǎn)染ζ鏈重建時，重新獲得了識別抗原或應(yīng)答抗CD3抗體的功能，這清楚地表明了ζ鏈在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用(Weissman，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBOJ.)8(1989)3651-3656)。由于其單一構(gòu)形，ζ鏈可能是主要的TCR信號傳遞結(jié)構(gòu)，而它的一式三份ITAM主要起促進(jìn)TCR信號放大的作用。
一般信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特定的ζ鏈介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，TCR復(fù)合物既參與成熟T淋巴細(xì)胞的活化又參與其程序性死亡(凋亡)。有些實驗中，ζ鏈的細(xì)胞質(zhì)尾部附著于不相關(guān)的受體，實驗證明，表達(dá)此類嵌合受體的細(xì)胞系能對與IL-2釋放和上調(diào)其他活化參數(shù)的交聯(lián)抗體作出應(yīng)答(Irving，細(xì)胞64(1991)891-901)。而且，已證明，表達(dá)嵌合ζ鏈衍生物的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)特異性地裂解帶有嵌合ζ受體所識別表面分子的靶細(xì)胞(Romeo，細(xì)胞64(1991)1037-1046，Romeo，細(xì)胞68(1992)889-897)。然而，以上結(jié)果被發(fā)現(xiàn)僅限于活化的T細(xì)胞，因為其余表達(dá)嵌合ζ鏈分子的T淋巴細(xì)胞既不是活化的，當(dāng)通過嵌合受體被激活時，對靶細(xì)胞也沒有任何細(xì)胞毒性(Brocker，實驗醫(yī)學(xué)雜志181(1995)1653-1659)，所述的嵌合受體，根據(jù)生物化學(xué)分析，不與內(nèi)源性TCR亞基結(jié)合，因此是物理上獨立的信號分子(Shinkai，免疫(Immunity)2(1995)401-411)。因此，以上信息表明，嵌合ζ鏈衍生物只能取代活化的完全TCR復(fù)合物，而不能取代靜息T細(xì)胞的TCR。如果當(dāng)細(xì)胞被活化或增殖時發(fā)生強烈的TCR重新接合(reengagement)，將誘導(dǎo)TCR介導(dǎo)的成熟T淋巴細(xì)胞的凋亡(Lenardo，自然353(1991)858-861，Russell，美國科學(xué)院院報88(1991)2151-2157，Critchfield，細(xì)胞免疫(Cell. Immunol.)160(1995)71-78)。成熟T細(xì)胞的死亡在外周免疫系統(tǒng)穩(wěn)定和耐受性中起著重要作用。最近的實驗顯示，ζ鏈?zhǔn)峭ㄟ^TCR結(jié)合有效誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡所必需的，而CD3的信號結(jié)構(gòu)域?qū)CR介導(dǎo)的凋亡只有微弱的作用(CD3ε)或根本沒有作用(CD3γ和δ)(Combadiere，J.Exp.Med.183(1996)2109-2117)。此外，ζ鏈的三個ITAM對誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡具有不同貢獻(xiàn)，最近N末端的那個起著主要作用，其次，C末端的ITAM近似于CD3ε的微弱作用，中間的一個則完全不能誘導(dǎo)凋亡。
T細(xì)胞主要在胸腺內(nèi)發(fā)育，其中的T細(xì)胞前體來自胎兒的肝臟或成人的骨髓。剛進(jìn)入胸腺時，這些早期祖先T細(xì)胞是三陰性的(TNTCR-CD4-CD8-)(Shortman，免疫學(xué)評論年報14(1996)29-47)，但已表達(dá)ζ鏈和CD3鏈(Wiest，實驗醫(yī)學(xué)雜志180(1994)1375-1382，Wilson，國際免疫學(xué)(Int.Immunol.)7(1995)1659-1664)。在胸腺的誘導(dǎo)性環(huán)境中，它們經(jīng)過一系列發(fā)育階段，然后分化成CD4+CD8+雙陽性(DP)胸腺細(xì)胞(Godfrey，今日免疫學(xué)14(1993)547-553)。最不成熟的CD44+CD25--TN-胸腺細(xì)胞和由它衍生的CD44+CD25+-TN-胸腺細(xì)胞仍表現(xiàn)出TCR基因的種系構(gòu)形。然而，以表面表型CD44-/10CD25+為特征的下一成熟階段的TN胸腺細(xì)胞開始重排TCRβ基因座。在此階段以前，ζ鏈雖被表達(dá)，但可能不是胸腺細(xì)胞成熟所必需的(Crompton，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)24(1994)1903-1907)。TN胸腺細(xì)胞的下一步成熟以CD44-/10CD25+轉(zhuǎn)變?yōu)镃D44-CD25+為特征，但在缺乏ζ鏈時受到抑制(Crompton，歐洲免疫學(xué)雜志24(1994)1903-1907)，而且必需TCRβ鏈的重排和表達(dá)(Kishi，歐洲分子生物學(xué)雜志10(1991)93-100，Mombaerts，自然360(1992)225-231，Shinkai，科學(xué)259(1993)822-825)。TCRβ與不變鏈前Tα(pTα)結(jié)合(Groettrup，細(xì)胞75(1993)283-294)，后者取代仍未重排的TCRα鏈形成前TCR，可能與ζ鏈和CD3鏈結(jié)合(Van Oers，實驗醫(yī)學(xué)雜志182(1995)1585-1590)。作為前TCR介導(dǎo)的信號的結(jié)果，發(fā)育中的胸腺細(xì)胞進(jìn)化到DP期。在此階段，胸腺細(xì)胞啟動它們TCRα基因的重排，停止表達(dá)pTα，開始低水平表達(dá)TCR復(fù)合物，后者的多鏈組成與成熟T淋巴細(xì)胞上的TCR復(fù)合物相似(Von Boehmer，Ann.N.Y.Acad.Sci.766(1995)52-61，Robdy，免疫學(xué)評論年報12(1994)265-705)。
CD44-CD25--TN胸腺細(xì)胞的發(fā)育和其后DP胸腺細(xì)胞的發(fā)育在缺乏ζ鏈時受到抑制，并可通過表達(dá)無功能性ITAM的信號缺陷突變ζ鏈來恢復(fù)(Shores，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)159(1997)222-230，Shores，科學(xué)266(1994)1047-1050)，因此，ζ鏈促進(jìn)前TCR表面表達(dá)的重要性可能超過其信號功能的重要性。
進(jìn)一步根據(jù)TCR特異性選擇DP胸腺細(xì)胞。表達(dá)對自身MHC分子(不管MHC蛋白結(jié)合的是什么肽)幾乎沒有特異性的TCR的胸腺細(xì)胞在胸腺內(nèi)死亡，可能是因為它們未能通過它們的TCR收到存活信號(Robey，免疫學(xué)評論年報12(1994)265-705，Jameson，免疫學(xué)評論年報13(1995)93-126)。相反，表達(dá)具有適當(dāng)配體特異性的TCR的胸腺細(xì)胞存活下來，并成熟為CD4+或CD8+的單陽性(SP)T細(xì)胞，表現(xiàn)出高水平的TCR表達(dá)。然而，表達(dá)自身反應(yīng)性或潛在自身反應(yīng)性TCR的胸腺細(xì)胞被去除了(Robey，免疫學(xué)評論年報12(1994)265-705，Jameson，免疫學(xué)評論年報13(1995)93-126)。因此，TCR在DP胸腺細(xì)胞上的結(jié)合導(dǎo)致了兩種截然不同的細(xì)胞命運，或者存活并繼續(xù)成熟(陽性選擇)，或者凋亡(陰性選擇)。
雖然，ζ鏈的ITAM不是胸腺內(nèi)成熟SP T細(xì)胞的發(fā)育(Shores，科學(xué)266(1994)1047-1050)和MHC-限制性選擇(Simpson，國際免疫學(xué)7(1995)287-293)所必需的，但它們似乎通過在胸腺選擇過程中放大TCR結(jié)合所產(chǎn)生的信號應(yīng)答對T細(xì)胞群落的形成起作用。
實際上，最近的一項研究揭示，雖然不特別需要任一單獨ITAM，但TCR復(fù)合物內(nèi)ζ鏈ITAM的數(shù)量與陽性和陰性選擇都直接相關(guān)(Shores，實驗醫(yī)學(xué)雜志185(1997)893-900)。以上結(jié)果可能是預(yù)料中的，如果陽性和陰性選擇主要由TCR信號閾值決定，如果對不同親合性的配體的信號應(yīng)答(在決定發(fā)育胸腺細(xì)胞命運中是致關(guān)重要的)的程度或多或少地分別受到自然ζ鏈內(nèi)一式三份的ITAM或ζ鏈突變體內(nèi)ITAM減少的放大。
因此預(yù)計，天然ζ鏈存在下陽性選擇的胸腺細(xì)胞群落明顯不同于信號缺陷性ζ鏈衍生物存在下所選，后一種群落含有可能陰性選擇的T細(xì)胞(Shores，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(Current Opinion in Immunology)9(1997)380-389)。
NK細(xì)胞是大型粒性淋巴細(xì)胞，占外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的10-15％。它們能夠以一種非主組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性方式殺死腫瘤細(xì)胞和某些被病毒感染的細(xì)胞(Trinchieri，高級免疫學(xué)(Adv.Immunol.)47(1989)187-376，Ritz，高級免疫學(xué)(1988)181-211)。這種溶胞效應(yīng)器功能不需要事先敏化或由輔佐細(xì)胞呈遞抗原。這些特性使得NK細(xì)胞能在激發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答之前引發(fā)自發(fā)性宿主防御。已知NK細(xì)胞有兩種形式的溶胞活性，自然細(xì)胞毒性和ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性)，后者還能殺死抗自然細(xì)胞毒性的靶細(xì)胞。
T細(xì)胞的細(xì)胞毒性是通過克隆型(clonotypic)TCR結(jié)合而產(chǎn)生的活化信號所引發(fā)的，與之不同，NK細(xì)胞的自然細(xì)胞毒性則主要受抑制信號調(diào)節(jié)(Yokoyama，實驗醫(yī)學(xué)雜志186(1997)1803-1808)。抑制性的NK細(xì)胞受體通過與靶細(xì)胞上MHCI類分子的特異性結(jié)合而被結(jié)合，從而抑制在缺乏靶細(xì)胞MHCI類表達(dá)時才釋放的天然細(xì)胞毒性，于是激活自然殺傷作用。NK細(xì)胞受體具有胞質(zhì)內(nèi)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITM，共有序列I/V-X-Y-X-X-L)，這些基序在受體結(jié)合誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化后介導(dǎo)抑制性信號(Muta，自然368(1994)70-73，Thomas，實驗醫(yī)學(xué)雜志181(1995)1953-1956)。
ADCC是由低親合性IgG Fc-受體FcγRIIIA誘導(dǎo)的，并可在體外通過NK細(xì)胞與抗體覆蓋的靶細(xì)胞共培養(yǎng)來證明。FcγRIIIA的配體結(jié)合和交聯(lián)誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活化，產(chǎn)生溶胞活性，表面活化分子和細(xì)胞因子分泌的上調(diào)(Chehimi，實驗醫(yī)學(xué)雜志75(1992)789，Ravetch，免疫學(xué)評論年報9(1991)457)。FcγRIIIA表達(dá)為一種復(fù)合物，包含跨膜的配體結(jié)合性受體糖蛋白CD16和γ及ζ兩條跨膜鏈，這兩鏈負(fù)責(zé)受體的裝配和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Anderson，美國科學(xué)院院報87(1990)2274-2278，Ravetch，免疫學(xué)評論年報9(1991)457)。起初，γ鏈曾被鑒定為IgE的高親合性受體的一個亞基，并與ζ鏈和η鏈屬于同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子家族。當(dāng)NK細(xì)胞上的FcγRIIIA被結(jié)合后，ζ鏈和γ鏈的ITAM內(nèi)發(fā)生酪氨酸磷酸化，于是誘導(dǎo)進(jìn)一步的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這包括含有FcγRIIIA復(fù)合物特異性Src同源性(SH)2結(jié)構(gòu)域的蛋白的征集。最近的研究證明，轉(zhuǎn)染到NK細(xì)胞內(nèi)的嵌合ζ鏈?zhǔn)荏w的結(jié)合似乎與FcγRIIIA介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化相似，因此方式也與T細(xì)胞內(nèi)的相似(Tran，免疫學(xué)雜志155(1995)1000-1009)。
雖然以上所述表明，與完整細(xì)胞表面上人ζ鏈胞外域特異性相互作用/識別該胞外域的抗體為多種目的所需要，例如癌癥治療中，T細(xì)胞或NK細(xì)胞上的人工信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前還沒有成功實驗的報道。未能成功產(chǎn)生滿足上述需要的抗體可能主要是因為參與ζ鏈結(jié)合T細(xì)胞受體和T細(xì)胞上的CD3復(fù)合物或結(jié)合NK細(xì)胞上IgG-Fc-受體的該結(jié)構(gòu)域相當(dāng)短(9個氨基酸)。
因此，本發(fā)明的技術(shù)課題是提供一種可成功滿足以上需要的工具。該課題是通過權(quán)利要求所述實施方式解決的。
所以，本發(fā)明涉及一種核酸分子，它含有編碼一種抗體的可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR)的核酸序列，該抗體特異性地與完整細(xì)胞表面上的人ζ(zeta)鏈的胞外域相互作用，該抗體可以通過先用Jurkat細(xì)胞，接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個氨基酸的肽構(gòu)成的偶聯(lián)物免疫大鼠來制取。
所述的完整細(xì)胞最好是T細(xì)胞或NK細(xì)胞，或他們的前體細(xì)胞，但也包括人工轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，用Jurkat細(xì)胞(ATCC TIB-152)免疫原初大鼠，然后用含有載體分子和上述肽的偶聯(lián)物加強免疫，由此獲得具有所述CDR的抗體。而且估計，其他免疫策略可能也行，例如給大鼠注射一次或多次偶聯(lián)物。雖然在產(chǎn)生抗體時用KLH作為載體，但其他載體也可以。其他載體的例子如BSA。
由于T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的ζ鏈分子或與TCR和CD3結(jié)合，或與FcγRIIIA結(jié)合，或呈自由漂浮的同源或異二聚體，所以，所述的相互作用可能是與以上ζ鏈形式之一，或與其全部。同樣，抗體可能與單ζ鏈相互作用，也可能特異性地與二聚體結(jié)構(gòu)相互作用。因為人的η鏈具有與ζ鏈相同的胞外域，本發(fā)明的抗體也識別與ζ鏈相同構(gòu)像和/或結(jié)合形式的η鏈。而且，抗體還特異性地與大鼠和小鼠的ζ/η鏈胞外域相互作用。
本發(fā)明抗體的一個獨特優(yōu)良特性是，它識別T細(xì)胞和NK細(xì)胞兩種細(xì)胞以及他們前體細(xì)胞上的ζ/η鏈。根據(jù)對ζ鏈結(jié)構(gòu)和結(jié)合形式的了解來看，開發(fā)出這樣的抗體可以認(rèn)為是出人意料的。這極短的9氨基酸肽上的表位必定十分靠近細(xì)胞膜。這樣緊密的結(jié)構(gòu)以及因而與細(xì)胞表面上多分子蛋白復(fù)合物的空間結(jié)合，使得象抗體這樣的大結(jié)構(gòu)，在空間上似乎不可能接觸到這些表位。而且，因為ζ鏈在T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上與不同多分子蛋白復(fù)合物結(jié)合，估計不可能被抗體接觸到的T細(xì)胞上的ζ鏈胞外表位不可能與NK細(xì)胞上的完全相同。此外，因為人、大鼠和小鼠間的序列一致性，ζ鏈胞外域代表著上述三物種內(nèi)的一種自身抗原，因此不可能通過免疫小鼠和大鼠來獲得它的特異性抗體。
本發(fā)明抗體的開發(fā)必然被認(rèn)為是出人意料的理由，除以上所述之外，還因為最可能獲得此類抗體的方法沒有成功。即，用肽-KLH偶聯(lián)物免疫小鼠，從它的脾細(xì)胞RNA克隆一個組合抗體文庫，展示在絲狀噬菌體上，交替地在肽-BSA偶聯(lián)物、純化的CD8+-T-淋巴細(xì)胞和純化的NK細(xì)胞上進(jìn)行體外選擇。雖然最后在CD8+-T-淋巴細(xì)胞上篩選時富集了展示與肽-BSA偶聯(lián)物反應(yīng)的Fab抗體片段的噬菌體克隆，但其中大多數(shù)在下一步純化NK細(xì)胞上篩選時丟失了，說明該克隆集中沒有識別T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上共同的ζ鏈胞外表位的抗體。測試大量與肽-BSA偶聯(lián)物反應(yīng)的克隆，證實都沒有與T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的交叉結(jié)合活性。
只有當(dāng)本發(fā)明用一種過時的，而且相當(dāng)煩瑣的方法來生產(chǎn)這樣的抗體時，才獲得了成功。這一方法包括合成含ζ鏈N末端前11個氨基酸的肽，通過半胱氨酸11上的SH基團將它與KLH偶聯(lián)。分別用Jurkat細(xì)胞初免疫大鼠，用上述偶聯(lián)物免疫小鼠，獲得的雜交瘤細(xì)胞系用11氨基酸肽與BSA的偶聯(lián)物篩選。獲得了150個小鼠雜交瘤細(xì)胞系和45個大鼠雜交瘤細(xì)胞系，它們識別肽-BSA偶聯(lián)物，但通過流式細(xì)胞計數(shù)，只鑒定到一種與T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞都結(jié)合的大鼠IgM抗體。
本發(fā)明的抗體或其相應(yīng)的免疫球蛋白鏈還可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)一步修飾，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加和/或重組和/或其他修飾，可以單獨進(jìn)行，也可以聯(lián)合進(jìn)行。將上述修飾導(dǎo)入免疫球蛋白氨基酸序列的DNA序列內(nèi)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可參見，例如Sambrook的分子克隆實驗室手冊，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所述抗體也可以是嵌合抗體。
本領(lǐng)域眾所周知的是，通常一個CDR，特別是重鏈上的CDR，就能識別一個表位，所以推測，上述方法所得抗體的一個CDR就足以造成至少微弱但明顯的結(jié)合。用以上策略產(chǎn)生的抗體證實，該推測完全正確。然而，較好的是，所述核酸分子含有編碼所述可變區(qū)至少兩個CDR的核酸序列。
本發(fā)明核酸分子的另一優(yōu)選實施例中，所述核酸分子含有編碼所述可變區(qū)三個CDR的核酸序列。
本發(fā)明核酸分子另一優(yōu)選實施例的特征在于所述核酸序列編碼VH鏈。
本發(fā)明核酸分子的另一優(yōu)選實施例中，所述核酸序列編碼VL鏈。
本發(fā)明的核酸分子可以是例如RNA分子或DNA分子。另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的核酸分子是DNA分子。特別好的是合成或半合成的DNA分子。
本發(fā)明核酸分子的另一優(yōu)選實施例中，所述CDR具有以下核苷酸序列之一(a)SEQ ID No.1；(b)SEQ ID No.3；(c)SEQ ID No.5；(d)SEQ ID No.7；(e)SEQ ID No.9；(f)SEQ ID No.11。
本發(fā)明核酸分子的一個特別優(yōu)選的實施例中，所述VH鏈具有核苷酸序列SEQID No.13，或編碼氨基酸序列SEQ ID No.14。
本發(fā)明核酸分子另一優(yōu)選的實施例中，所述VL鏈具有核苷酸序列SEQ IDNo.15，或編碼氨基酸序列SEQ ID No.16。
本發(fā)明還涉及權(quán)利要求1-6中任一項所述的核酸分子，其中的CDR編碼氨基酸序列SEQ ID No.2、4、6、8、10或12之一。
本發(fā)明還涉及一種載體，它包含本發(fā)明的核酸分子。
本發(fā)明的載體可含有其他基因，例如標(biāo)記基因，它們可在合適的條件下在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)對所述載體進(jìn)行選擇。較好的是，本發(fā)明的聚核苷酸與允許在原核或真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列操作性連接。所述聚核苷酸的表達(dá)包括該聚核苷酸轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。確保在真核細(xì)胞(以哺乳動物細(xì)胞為佳)內(nèi)表達(dá)的調(diào)控元件已為本領(lǐng)域所熟知。通常包括確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控序列，可能還包括確保轉(zhuǎn)錄終止并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的聚A信號。其他調(diào)控元件可能還包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強子，和/或天然結(jié)合的或異源的啟動子區(qū)域。在這方面，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很容易理解，編碼至少輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的聚核苷酸可能編碼這兩種免疫球蛋白鏈的可變區(qū)，也可能只編碼其中一種的可變區(qū)。類似的，所述聚核苷酸的表達(dá)可能受同一啟動子的調(diào)控，也可能受分別調(diào)控。允許在原核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控元件可能包括，例如，用于大腸桿菌的PL、lac、trp或tac啟動子，允許在真核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控元件的例子是用于酵母的AOX1或GAL1啟動子，或用于哺乳動物或其他動物細(xì)胞的CMV-、SV40-、RSV-啟動子(Rous肉瘤病毒，CMV增強子，SV40增強子或球蛋白內(nèi)含子)。除了負(fù)責(zé)啟動轉(zhuǎn)錄的元件之外，所述調(diào)控元件還可能包括轉(zhuǎn)錄終止信號，例如聚核苷酸下游的SV40-聚A位點或tk-聚A位點。而且，根據(jù)所用的表達(dá)系統(tǒng)，還可以給本發(fā)明聚核苷酸編碼序列加上前導(dǎo)序列，用于將多肽導(dǎo)入某細(xì)胞區(qū)室或分泌到培養(yǎng)基中，這些前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域所熟知的。前導(dǎo)序列的裝配與翻譯、起始和終止序列成正確的相位關(guān)系，較好的是，前導(dǎo)序列能夠引導(dǎo)所翻譯的蛋白或其一部分進(jìn)入周質(zhì)間隙或胞外培養(yǎng)基?；蜻x的是，異源序列可編碼一個融合蛋白，該蛋白包括C末端或N末端標(biāo)志肽以賦予所需特征，例如簡化所表達(dá)重組產(chǎn)物的純化或穩(wěn)定化。本文中，合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域所熟知的，例如Okayama-Berg cDNA表達(dá)載體pcDV1(Pharmacia)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNA1，pcDNA3(In-vitrogen)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
較好的是，表達(dá)調(diào)控序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體內(nèi)的真核啟動子系統(tǒng)，但也可使用針對原核宿主的調(diào)控序列。載體進(jìn)入合適的宿主后，將宿主維持在適合高表達(dá)核苷酸序列的條件下，根據(jù)需要收集并純化免疫球蛋白輕鏈、重鏈、輕/重鏈二聚體或完整抗體，然后可收集并純化結(jié)合片段或其他免疫球蛋白形式；參見，Beychok，免疫球蛋白合成細(xì)胞，Academic Press，N.Y.(1979)。
本發(fā)明的載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體，它們最好是表達(dá)載體。可用來自逆病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的病毒表達(dá)載體將本發(fā)明的聚核苷酸或載體送入靶細(xì)胞群?？捎帽绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建重組病毒載體；參見，例如，Sambrook的分子克隆實驗室手冊，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)?；蛘?，可將本發(fā)明的聚核苷酸和載體重構(gòu)成脂質(zhì)體送入靶細(xì)胞?？筛鶕?jù)細(xì)胞宿主的類型，用熟知的方法，將含本發(fā)明聚核苷酸(例如免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的編碼序列以及表達(dá)調(diào)空序列)的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，常用氯化鈣轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞，對其他細(xì)胞宿主則采用磷酸鈣處理或電穿孔；參見，Sambrook，同上。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。
所述宿主可以是原核或真核細(xì)胞。本發(fā)明的聚核苷酸或載體在宿主細(xì)胞內(nèi)可能整合到宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，也可能仍在染色體外。
宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，例如細(xì)菌、昆蟲、真菌、植物、動物或人的細(xì)胞。較好的真菌細(xì)胞例如酵母屬細(xì)胞，具體的如釀酒酵母?！霸恕卑ㄋ锌捎肈NA或RNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，從而表達(dá)本發(fā)明抗體或相應(yīng)免疫球蛋白鏈的細(xì)菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性和陽性菌，例如大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，粘質(zhì)沙雷氏菌和枯草桿菌。“真核”包括酵母，高級植物，昆蟲，和較好的哺乳動物細(xì)胞。根據(jù)重組生產(chǎn)過程所用的宿主，本發(fā)明聚核苷酸所編碼的肽或多肽/抗體或免疫球蛋白鏈可能是糖基化的，也可能是非糖基化的。本發(fā)明的抗體或相應(yīng)的免疫球蛋白鏈還可能包括起始的甲硫氨酸殘基?？捎酶鞣N本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，以本發(fā)明的聚核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主。而且，在哺乳動物細(xì)胞和細(xì)菌內(nèi)制備并表達(dá)融合的操作性連鎖基因的方法，也是本領(lǐng)域所熟知的(Sambrook的分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)?？捎闷渲兴龅幕驑?gòu)建物和方法，在真核或原核宿主內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的肽或多肽/抗體或相應(yīng)的免疫球蛋白鏈。通常，根據(jù)宿主選用含有促進(jìn)所需聚核苷酸有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的表達(dá)載體。該表達(dá)載體通常含有一個復(fù)制起始點，一個啟動子和一個終止子，以及供轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型選擇的特殊基因。而且，可用含有本發(fā)明細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動物，最好是哺乳動物，進(jìn)行本發(fā)明肽或多肽的大規(guī)模生產(chǎn)。
可將轉(zhuǎn)化后宿主培養(yǎng)在發(fā)酵罐中，并根據(jù)本領(lǐng)域的已知技術(shù)培養(yǎng)，以獲得最佳的細(xì)胞生長。表達(dá)后，可按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化本發(fā)明的全肽或多肽/抗體、它們的二聚體，單獨的輕鏈和重鏈或其他免疫球蛋白形式，所述方法例如硫酸銨沉淀，親合柱層析，柱層析，凝膠電泳等；參見，Scopes，“蛋白質(zhì)純化”Springer-Verlag，N.Y.(1982)。然后可從培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解物或細(xì)胞膜組分中分離本發(fā)明的抗體或其相應(yīng)免疫球蛋白鏈?？捎酶鞣N常規(guī)方法分離和純化(例如)微生物表達(dá)的本發(fā)明抗體或免疫球蛋白鏈，所述方法例如制備性層析分離和免疫學(xué)分離法，例如用到相關(guān)(例如抗本發(fā)明抗體恒區(qū)的)單克隆或多克隆抗體的免疫學(xué)分離法。對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明抗體還可以與其他分子偶聯(lián)，用于例如藥物定向和造影。這樣的偶聯(lián)，可以在肽或多肽/抗體或抗原表達(dá)后用化學(xué)方法將它們偶聯(lián)于結(jié)合位點，或通過基因工程在DNA水平上與本發(fā)明的肽或多肽/抗體偶聯(lián)。然后在合適的宿主系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)該DNA，收集表達(dá)的蛋白，并根據(jù)需要進(jìn)行復(fù)性。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明核酸分子所編碼肽或多肽的方法，包括，在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主，從培養(yǎng)物中分離所述的肽或多肽。
前文已對所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)行了論述，還可按照公知的方法進(jìn)行。分離肽和多肽的也一樣。
此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明核酸分子所編碼，或用本發(fā)明方法產(chǎn)生的肽或多肽。
本發(fā)明還涉及抗體或其片段或衍生物，其中包含至少一種本發(fā)明的肽或多肽。
較好的是，本發(fā)明的抗體包含完整的上述VH和VL兩鏈，具有合適的恒區(qū)，例如μ、γ、α、κ或λ鏈。
本發(fā)明抗體或其片段或衍生物的具體應(yīng)用包括由于抗體或抗體衍生物特異性地與ζ鏈結(jié)合，或生物活性或藥理活性的分子通過抗ζ鏈抗體或抗體片段/衍生物定向于T細(xì)胞表面，結(jié)果造成TCR的結(jié)構(gòu)性或功能性抑制，從而影響成熟T淋巴細(xì)胞的功能。而且，抗體或抗體片段/衍生物特異性結(jié)合ζ鏈造成的TCR或前TCR的結(jié)構(gòu)性或功能性抑制，影響到胸腺細(xì)胞的發(fā)育和選擇。
在整個T細(xì)胞發(fā)育過程中，即從最不成熟的胸腺細(xì)胞到成熟T淋巴細(xì)胞，ζ鏈一直在表達(dá)，所以，該分子可用于定向于多種T細(xì)胞性惡性腫瘤。
由于抗體或抗體衍生物特異性地與ζ鏈結(jié)合，或生物活性或藥理活性的分子通過抗ζ鏈抗體或抗體片段/衍生物定向于NK細(xì)胞表面，結(jié)果造成FcγRIIIA的結(jié)構(gòu)性或功能性抑制，從而還可以影響NK細(xì)胞的功能。
所以，所述的抗體或片段或衍生物可以是但不限于合成或半合成或經(jīng)典方法生成的單克隆抗體。所述片段包括Fab′或F(ab′)2片段。
本發(fā)明抗體可具有另一結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域通過共價或非共價鍵連接。所述連接可以基于用本領(lǐng)域已知的前文所述方法進(jìn)行的基因融合，也可以通過化學(xué)交連，例如WO94/04686所述。在含本發(fā)明抗體的融合蛋白中，該另一結(jié)構(gòu)域最好通過柔性接頭連接，以多肽接頭為佳，所述的多肽接頭含有多個親水性肽鍵氨基酸，其長度足以跨越所述另一結(jié)構(gòu)域的C末端至本發(fā)明抗體N末端(或反過來)之間的距離。上述融合蛋白還可以具有一個蛋白酶的可剪切接頭或剪切位點。這些間隔部分可以是不溶性的或可溶性的(Diener等，科學(xué)，232148，1986)，并選擇能在靶位置使藥物從抗原上釋放的那些。可與本發(fā)明抗體偶聯(lián)用于免疫治療的治療性制劑是藥物，放射性同位素，凝集素和毒素。可與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的藥物包括那些經(jīng)典藥物，例如絲裂霉素C、柔毛霉素和長春堿。
當(dāng)用放射性偶聯(lián)的本發(fā)明抗體進(jìn)行例如免疫治療時，根據(jù)白細(xì)胞分布以及穩(wěn)定性和發(fā)射性等因素，有些同位素可能比另一些更合適。根據(jù)自身免疫應(yīng)答，有些發(fā)射性物質(zhì)可能比另一些好。一般說來，發(fā)射α和β粒子的放射性同位素適用于免疫治療。較好的是幅距短的高能α發(fā)射性物質(zhì)，例如212Bi?？膳c本發(fā)明抗體、抗原或表位結(jié)合而用于治療的放射性同位素的例子是125I，131I，90Y，67Cu，212Bi，212At，211Pb，47Sc，109Pd和188Re。其他可與本發(fā)明抗體、抗原或表位結(jié)合的治療劑，以及體外和體內(nèi)的治療方法，都是已知的，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可方便的獲知。只要合適，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用編碼上述抗體、抗原或表位的本發(fā)明聚核苷酸或相應(yīng)載體，而不是蛋白質(zhì)物質(zhì)本身。
一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的抗體是雙特異性抗體。
在本發(fā)明雙特異性抗體的一優(yōu)選實施例中，第一特異性針對完整細(xì)胞表面上的人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或它們前體細(xì)胞的表面上可能不同的另一分子。
本發(fā)明的雙特異性抗體可與上述位于相同或不同細(xì)胞上的靶結(jié)合。所述不同細(xì)胞可以是，例如，相同種類的兩個不同T淋巴細(xì)胞，或一個T淋巴細(xì)胞和一個自然殺傷細(xì)胞，或它們的前體細(xì)胞。
在本發(fā)明雙特異性抗體的另一優(yōu)選實施例中，第一特異性針對完整細(xì)胞表面上的人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對不同細(xì)胞表面的一不同分子，該細(xì)胞最好不是T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞。較好的是，該分子是病毒編碼的抗原，腫瘤相關(guān)抗原，或抗原呈遞細(xì)胞(APC)(最好是樹狀細(xì)胞)或非APC上的表面抗原。
本發(fā)明雙特異性抗體的一種較好的應(yīng)用是將T淋巴細(xì)胞再定向于靶細(xì)胞，這是通過用雙特異性抗體同時定向于ζ鏈和一種靶細(xì)胞表面抗原，而不是通過用嵌合ζ鏈?zhǔn)荏w轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞(Romeo，細(xì)胞64(1991)1037-1046)。因為雙特異性抗體結(jié)合天然ζ鏈，ζ鏈則與其他TCR亞基結(jié)合，所以可利用整個TCR復(fù)合物的信號機制。相反，嵌合ζ鏈?zhǔn)荏w不結(jié)合內(nèi)源性TCR亞基，所以可能只改變ζ鏈的信號作用，就活化和凋亡來說，這似乎尚不足以活化靜息T細(xì)胞，卻可能引起T淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)的非平衡改變。
T細(xì)胞再定向的一個較好的應(yīng)用包括，將細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性定向于靶細(xì)胞，從而將其裂解。另一個較好的應(yīng)用是，通過原初T淋巴細(xì)胞的ζ鏈與已修飾抗原呈遞細(xì)胞(APC)或非APC上的表面抗原交連，提供充分的協(xié)同刺激信號，從而引發(fā)幼稚T淋巴細(xì)胞。另一方面，通過ζ鏈介導(dǎo)重定向于不能提供充足信號的細(xì)胞，可使原初T細(xì)胞無能應(yīng)答或缺失。
T細(xì)胞再定向的另一個較好的應(yīng)用是在成熟的活化T淋巴細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡，這是通過ζ鏈介導(dǎo)強TCR重新結(jié)合，類似于介導(dǎo)外周T細(xì)胞耐受性并提供外周免疫系統(tǒng)穩(wěn)定性的機制。
可用雙特異性抗體，通過胸腺細(xì)胞上的ζ鏈與直接參與陽性或陰性選擇過程的胸腺抗原呈遞細(xì)胞上的表面分子交連，改變T細(xì)胞發(fā)育過程中對胸腺細(xì)胞的胸腺選擇。
本發(fā)明雙特異性抗體的另一種較好的應(yīng)用是將NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性再定向于靶細(xì)胞，這是通過用雙特異性抗體同時定向于ζ鏈和一種靶細(xì)胞表面抗原，而不是通過用嵌合ζ鏈?zhǔn)荏w轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞使之定向于靶細(xì)胞(Tran，免疫學(xué)雜志155(1995)1000-1009)。
另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的抗體衍生物是scFv鏈。
本發(fā)明單克隆抗體的一優(yōu)選實施例中，所述抗體是IgM。
本發(fā)明還涉及一種雙特異性受體，它包含本發(fā)明的肽或多肽和與同一細(xì)胞或另一細(xì)胞上表面分子的天然受體、天然配體或其衍生物；較好的是，所述受體或配體是CD4，CTLA-4，B7-1，B7-2，LFA-3，ICAM-1、-2、-3，或MIP-1α、MIP-1β、RANTES或SDF-1等趨化因子。
據(jù)推測，本發(fā)明的雙特異性抗體也可用于本發(fā)明的雙特異性受體。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，它含有本發(fā)明的核酸分子，載體，宿主，肽或多肽，抗體或其片段或衍生物和/或本發(fā)明的雙特異性受體。
本發(fā)明的藥物組合物還可含有一種藥學(xué)上認(rèn)可的運載體。合適的藥學(xué)上認(rèn)可的運載體的例子是本領(lǐng)域所熟知的，包括磷酸鹽緩沖液，水，乳液(例如油/水乳液)，各類潤濕劑，無菌溶液等。含上述運載體的組合物可用常規(guī)方法來配制?？梢院线m的劑量給予這些藥物組合物。給予合適的組合物可通過各種不同的途徑，例如，靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部或透皮給藥。劑量決定于醫(yī)生和臨床因素。正如醫(yī)學(xué)界所熟知的，任一患者的劑量取決于許多因素，包括患者體形，身體表面積，年齡，具體使用的化合物，性別，用藥時間和途徑，總體健康狀況，和目前正在使用的其他藥物。典型劑量可以是，例如，0.001-1000μg(或是用于該水平表達(dá)或抑制該水平表達(dá)的核酸)；然而，具體考慮上述因素時，劑量也可能低于或超過該例舉的范圍。通常，所述藥物組合物的規(guī)律給藥方式是每日1μg-10mg。如果是連續(xù)輸液，也應(yīng)在每分鐘每kg體重1μg-10mg的范圍內(nèi)。可通過定期檢查來監(jiān)測進(jìn)展。劑量可以不同，但靜脈給予DNA的優(yōu)選劑量約為106-1012份DNA分子拷貝。本發(fā)明的組合物可局部給予或全身給予。通常采用腸胃外給予，例如靜脈內(nèi)；還可以(例如)通過生物彈射法(biolistic)遞送到一內(nèi)部或外部靶部位或通過導(dǎo)管遞送到動脈內(nèi)某部位，將DNA直接給藥到靶部位。用于腸胃外給藥的制劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄欖油，和可注射有機酯例如油酸乙酯。水性運載體包括水、醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒質(zhì)包括氯化鈉溶液，Ringer葡萄糖，葡萄糖與氯化鈉，乳糖化的Ringer試劑，或固化油。靜脈媒質(zhì)包括液態(tài)營養(yǎng)補充劑，電解質(zhì)補充劑(例如基于Ringer葡萄糖的那些)，等等。還可以有防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物、抗氧化、螯合試劑，和惰性氣體等。而且，根據(jù)用途，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有白介素或干擾素等其他試劑。
本發(fā)明設(shè)想，用標(biāo)準(zhǔn)載體和/或基因遞送系統(tǒng)將本發(fā)明的各種聚核苷酸和載體單獨或聯(lián)合，并可以與藥學(xué)上認(rèn)可的運載體或賦形劑一起進(jìn)行給藥。給藥后，所述聚核苷酸或載體可能穩(wěn)定地整合到受主的基因組內(nèi)。另一方面，可用病毒載體，它們對特定的細(xì)胞或組織具有特異性，并能在所述細(xì)胞內(nèi)存活。合適的藥物運載體和賦形劑是本領(lǐng)域所熟知的。
而且，還可以將本發(fā)明的藥物組合物，含本發(fā)明的聚核苷酸或載體，用在基因治療中。合適的基因遞送系統(tǒng)有，脂質(zhì)體，受體介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)，裸DNA和病毒載體，例如皰疹病毒、逆病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等；參見前文所述的文獻(xiàn)。還可以用例如Williams(美國科學(xué)院院報88(1991)2726-2729)所述的生物彈射遞送系統(tǒng)，將核酸送到體內(nèi)特定部位以進(jìn)行基因治療。
本發(fā)明的藥物組合物，方法和用途可較好地適用于人類，雖然本文描述的方法和用途還包括對其他動物的治療。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明抗體用于制備藥物組合物的用途，該抗體的第一特異性針對人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或它們前體細(xì)胞表面上的另一不同分子，所述組合物用于治療自身免疫病，免疫缺陷，T細(xì)胞性惡性腫瘤，感染性疾病，或用于抑制免疫應(yīng)答，特別是為了避免器官移植后移植物排斥。
消滅靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞)之外，本發(fā)明描述了通過ζ鏈細(xì)胞外定向結(jié)合T細(xì)胞系(正常或惡性)細(xì)胞的方式，這些方式可在治療上用于增強或抑制免疫應(yīng)答和/或影響與自身免疫病、免疫缺陷或T細(xì)胞性惡性腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞性疾病。較好的是，采用基于ζ鏈(和η鏈)細(xì)胞外定向的免疫抑制來預(yù)防移植后移植物排斥。
本發(fā)明在T細(xì)胞發(fā)育和胸腺細(xì)胞選擇過程中，通過ζ鏈胞外定向改變信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這樣的模式可在治療上用于增強有意的免疫應(yīng)答，例如在感染性疾病、腫瘤和免疫缺陷中，或用于抑制不利的免疫應(yīng)答，例如在自身免疫病或移植后移植物排斥中。
而且，本發(fā)明還涉及本發(fā)明抗體用于制備治療或預(yù)防惡性腫瘤、病毒感染和其他感染性疾病的藥物組合物的用途，該抗體的第一特異性針對人ζ鏈胞外域，第二特異性針對另一細(xì)胞表面上的另一不同分子。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明肽或多體或抗體或其片段或衍生物或雙特異性受體用于制備藥物組合物的用途，即用于增強或抑制NK細(xì)胞依賴性免疫或治療NK細(xì)胞衍生的惡性腫瘤。
通過ζ鏈胞外定向促進(jìn)NK細(xì)胞結(jié)合，消滅靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞)之外，該模式還可在治療上用于增強或抑制NK細(xì)胞依賴性免疫，或影響NK細(xì)胞來源的惡性腫瘤，因為ζ鏈可能在NK細(xì)胞來源的惡性腫瘤上也表達(dá)，該分子還可能被用于定向于惡性NK細(xì)胞。
此外，本發(fā)明還涉及一種測定NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞上ζ鏈或η鏈表達(dá)的方法，包括(a)使本發(fā)明的肽或多肽或抗體或其片段或衍生物與NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞接觸；(b)測定被結(jié)合的肽或多肽，抗體或其衍生物的量。
接觸的進(jìn)行可以是在類似生理條件的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖溶液，PBS)中，最好在冰上，所述肽或多肽或所述抗體或其片段或衍生物與所述NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞一起孵育20-40分鐘。用PBS洗滌兩次后，可(例如)用合適的熒光標(biāo)記的第二抗體檢測被結(jié)合的肽或多肽，抗體或其片段或衍生物，并通過流式細(xì)胞計數(shù)分析來定量，如實施例4所述。
本發(fā)明還涉及含本發(fā)明核酸分子、載體、宿主、肽或多肽、抗體或其片段或衍生物和/或雙特異性受體的試劑盒。
最后，本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因動物，其種系含有本發(fā)明核酸分子或載體的至少一份拷貝。
可用常規(guī)發(fā)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，參見，例如，Palmiter R.D.，Brinster R.L.小鼠的種系轉(zhuǎn)化(Germline transformation of mice)，遺傳學(xué)評論年報(Ann.Rev.Genet)20(1986)，465-499和Capecci M.通過同源重組改變基因組(Altering the genomeby homologous recombination)，科學(xué)244(1991)1288-1292。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選例是母牛，綿羊，家兔，小鼠或大鼠。
表1列舉了PCR擴增鼠Ig重鏈和輕鏈DNA片段所用的引物。
附圖顯示的是

圖1TCR的結(jié)構(gòu)T細(xì)胞活化的早期活動。TCR由克隆型鏈(α+β)和恒鏈(ζ，CD3γ，CD3δ和CD3ε)構(gòu)成，其亞基的組成可能是TCRα+β，CD3εδγε和ζζ。CD3和ζ鏈的胞質(zhì)域內(nèi)的ITAM以小的黑色橢圓表示。A)在靜息T細(xì)胞內(nèi)，ITAM是非磷酸化或部分磷酸化的。蛋白酪氨酸激酶Lck與CD4或CD8的胞質(zhì)域結(jié)合。B)與MHC-肽復(fù)合物相互作用時，TCR和CD4或CD8共聚集，CD3和ζ鏈內(nèi)的ITAM被Src激酶Lck和/或Fyn磷酸化。ZAP-70或相關(guān)激酶Syk與其中兩個酪氨酸殘基已磷酸化的ITAM特異性結(jié)合。當(dāng)ZAP-70加入到TCR-復(fù)合物中時，它被Lck激活，然后，其他分子這樣地加入TCR復(fù)合物，并使活化過程向下游分子推進(jìn)(未顯示)。圓環(huán)P表示磷酸化的酪氨酸殘基。
圖2通過噬菌體展示選擇與人ζ鏈結(jié)合所得Fab抗體片段的ELISA分析。大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的可溶性Fap片段的周質(zhì)制劑與固定化的ζ肽-BSA偶聯(lián)物一起孵育。用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG+IgM抗體的F(ab′)2片段檢測特異性結(jié)合的Fab片段。加入ABTS底物溶液進(jìn)行ELISA顯色。在X軸上顯示每輪體外選擇中的8個克?。挥肊LISA讀數(shù)儀在405nm處測定OD值，在Y軸上表示。作為陰性對照，測試格與PBS而不是與周質(zhì)制劑一起孵育。
圖3CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面上2-B-5抗體的ζ鏈特異性結(jié)合活性的流式細(xì)胞計數(shù)分析。來自兩位健康供者外周血的100.000個單核細(xì)胞與2-B-5雜交瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清液原液一起孵育。用與熒光素(FITC)偶聯(lián)的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體1∶100 PBS稀釋液檢測結(jié)合的ζ鏈特異性大鼠抗體。進(jìn)行三色熒光分析，對CD8+細(xì)胞(三色(tricolor))施加一正柵極(gate)，對CD16+細(xì)胞(PE)施加一負(fù)柵極，這樣，檢測到的只有CD8+T淋巴細(xì)胞(表型CD8+，CD16+)的FITC熒光(實線)，而沒有來自CD8+NK細(xì)胞的任何干擾信號。類似地進(jìn)行三色熒光分析，對CD56+PE細(xì)胞施加一正柵極，對CD38+細(xì)胞(三色)施加一負(fù)柵極，這樣，只檢測到NK細(xì)胞(表型CD56+，CD3-)的FITC熒光(實線)，而沒有來自CD56+T淋巴細(xì)胞的任何干擾信號。作為同型對照(虛線)，使用的是同型但特異性不相關(guān)的抗體(大鼠IgM)的培養(yǎng)物上清液性。用1％的聚甲醛PBS溶液固定標(biāo)記細(xì)胞。在FACS掃描儀(Becton Dickinson)上通過流式細(xì)胞計數(shù)分析細(xì)胞。
圖4證明抗體2-B-5與CD8+T淋巴細(xì)胞裂解物內(nèi)天然ζ鏈反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果。用一種ζ鏈特異性抗體覆蓋96格U形底測試板，該抗體識別人ζ鏈羧基末端的氨基酸144-163，12小時后，用PBS/3％BSA在室溫下封閉1小時。接著，加入CD8+細(xì)胞裂解物原液和數(shù)種濃度稀釋液，室溫下孵育1小時。陰性對照是與PBS而不是細(xì)胞裂解液一起孵育的格。下一步，加入1μg/ml純化抗體2-B-5，孵育1小時。先用生物素化的小鼠抗大鼠IgM抗體，然后用親合素-過氧化物酶偶聯(lián)物檢測結(jié)合的2-B-5抗體。最后，加入ABTS底物溶液進(jìn)行ELISA顯色。用ELISA讀數(shù)儀在405nm處測定有色的沉淀。
圖5基于ELISA的分析大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)表達(dá)的大鼠單克隆抗體2-B-5的重組Fab片段與ζ肽-KLH偶聯(lián)物的特異性結(jié)合。4℃，以ζ肽-KLH偶聯(lián)物覆蓋，12小時后，用PBS/0.05％ Tween洗滌一次。各格用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時，然后再次洗滌。然后，加入含F(xiàn)ab片段的周質(zhì)制劑原液和數(shù)種濃度的稀釋液，孵育2小時。陰性對照是與PBS而不是周質(zhì)制劑一起孵育的格。先用小鼠抗His尾抗體，接著用與過氧化物酶偶聯(lián)的多克隆山羊抗小鼠IgG抗體，檢測與ζ肽-KLH偶聯(lián)物結(jié)合的Fab片段。最后，加入ABTS底物溶液進(jìn)行ELISA顯色。用ELISA讀數(shù)儀在405nm處測定底物顏色的改變。
圖6抗ζ鏈抗體2-B-5的VH區(qū)的DNA序列和蛋白質(zhì)序列。數(shù)字表示核苷酸(nt)位置，氨基酸(aa)用單字母碼表示?？騼?nèi)顯示三個CDR。
圖7抗ζ鏈抗體2-B-5的VK區(qū)的DNA序列和蛋白質(zhì)序列。數(shù)字表示核苷酸(nt)位置，氨基酸(aa)用單字母碼表示?？騼?nèi)顯示三個CDR。
圖8檢測細(xì)胞增殖的基于ELISA的BrdU-摻入試驗結(jié)果為了測定抗ζ鏈抗體2-B-5誘導(dǎo)的CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和PBMC的激活。用純化抗體2-B-5的數(shù)種濃度稀釋液覆蓋96格平底微滴板，4℃過夜。在微滴板的格中加入100.000個CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和未分離的PBMC，分別一式三格。作為2-B-5介導(dǎo)的激活作用特異性的對照，使用同濃度的同型(大鼠IgM)但特異性不相關(guān)的抗體。識別人CD3復(fù)合物的抗體OKT3(IgG2a同型)被用作T細(xì)胞和未分離PBMC激活的特異性陽性對照。特異性不相關(guān)的小鼠IgG2a抗體被用做OKT3的同型對照。還包括一空白對照(沒有細(xì)胞的格)和背景對照(沒有BrdU的格)。孵育3天后，加入BrdU標(biāo)記溶液24小時。接著，裂解細(xì)胞并固定，然后加入抗BrdU抗體，該抗體與新合成的細(xì)胞DNA內(nèi)摻入的BrdU結(jié)合。然后用底物反應(yīng)檢測該與過氧化物酶偶聯(lián)的抗體。用ELISA讀數(shù)儀在450nm波長處定量測定反應(yīng)產(chǎn)物。
圖9抗ζ鏈抗體結(jié)合所誘導(dǎo)的TCR/CD3復(fù)合物內(nèi)化作用的流式細(xì)胞計數(shù)分析。200.000個單核細(xì)胞與1μg/ml抗ζ鏈抗體2-B-5一起在4℃或37℃孵育30或60分鐘；用大鼠抗人CD3抗體進(jìn)行一平行實驗。用冷PBS洗滌兩次來終止加帽過程。為了標(biāo)記細(xì)胞表面結(jié)合的抗體，細(xì)胞與熒光素(FITC)偶聯(lián)的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體1∶100PBS稀釋液一起孵育。陰性對照只用了第二抗體。
圖10抗ζ鏈/抗EpCAM雙特異性單鏈抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列。數(shù)字表示核苷酸(nt)的位置，核苷酸序列下是所得的氨基酸序列。DNA序列從第67位起至第1605位止編碼所述抗體。核苷酸10-66編碼一段前導(dǎo)肽，它在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)雙特異性抗體的分泌。前6個nt(第1-6位)和最后6個nt(第1632-1637位)分別含EcoRI和Sall的限制酶識別位點。
圖11因抗ζ鏈/抗EpCAM雙特異性抗體而再抗EpCAM陽性Kato細(xì)胞的PBMC和CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將100μl體積的200.000個非活化PBMC或CD8+T淋巴細(xì)胞加入100μl體積的10.000個鉻-51標(biāo)記的Kato III細(xì)胞。加入50μl體積，濃度為40ng/ml-5μg/ml的雙特異性抗體。微滴板37℃，5％CO2孵育4小時。然后，從各格取50μl上清液，在γ計數(shù)儀中測定51Cr的釋放。
圖12通過ζ鏈/抗EpCAM雙特異性抗體將NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性再指向EpCAM陽性細(xì)胞。將100μl體積的100.000個NK細(xì)胞加入100μl體積的10.000個鉻-51標(biāo)記的Kato III細(xì)胞。加入50μl體積，濃度為1μg/ml的雙特異性抗體。微滴板37℃，5％CO2孵育4小時。然后，從各格取50μl上清液，在γ計數(shù)儀中測定51Cr的釋放。
本發(fā)明的實施例描述包涵了以上和其他實施方式。有關(guān)本發(fā)明所用的抗體、方法、用途或化合物的其他文獻(xiàn)，可從公共圖書館和數(shù)據(jù)庫獲取，例如用電子工具。例如，可利用網(wǎng)上的公共數(shù)據(jù)庫“Medline”，網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其他數(shù)據(jù)庫及其地址例如http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http//www.infobiogen.fr/，http/www.fmi.ch/biology/research-tools.html，http//www.tigr.org/，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，也可用http//www.lycos.com.獲得。有關(guān)生物技術(shù)專利信息的評論，以及用于檢索和了解當(dāng)前狀況的相關(guān)專利信息來源的調(diào)查報告可參見Berk，TIBECH 12(1994)，352-364。
以上內(nèi)容總體上描述了本發(fā)明。通過以下具體實施例可獲得更完全的理解，這些實施例僅以說明為目的，不限定本發(fā)明的范圍。實施例1用ζ肽-KLH偶聯(lián)物免疫小鼠，并用ζ肽-BSA偶聯(lián)物測定血清效價用ζ肽-KLH偶聯(lián)物(Jerini Bio Tools，Berlin)免疫10周齡的balb/c×C57黑鼠交配產(chǎn)下的F小鼠。含有ζ鏈N末端氨基酸序列(QSFGLLDPKLG)的該肽與馬來酰亞胺活化的KLH通過C末端半胱氨酸的巰基定向偶聯(lián)。將此偶聯(lián)物溶于0.9％NaCl至100μg/ml濃度。然后用完全Freund佐劑乳化，給每個小鼠腹腔內(nèi)注射50μl。在4、8和12周后，除以不完全Freund佐劑替換完全Freund佐之外，以相同的方式對小鼠進(jìn)行加強免疫。第一次加強免疫后10天，采集血樣，ELISA測定抗ζ肽-BSA偶聯(lián)物的抗體血清效價。免疫動物的血清效價比沒有免疫動物高1000倍。第二次加強免疫后3天，按照“現(xiàn)代免疫學(xué)方法”(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，將脾細(xì)胞與P3X63Ag8.653細(xì)胞(ATCCCRL-1580)融合，生成雜交瘤細(xì)胞系。PEG融合后，按100.000個/格將細(xì)胞接種在微滴板的格內(nèi)，培養(yǎng)在補充了10％胎牛血清、300單位/ml重組人白介素6和HAT-添加劑的200μl RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。致密生長格中的培養(yǎng)物上清液按1∶20稀釋，用ELISA分析進(jìn)行測試。用以下ELISA檢測雜交瘤上清液與ζ肽-BSA偶聯(lián)物結(jié)合的能力和ζ肽-KLH偶聯(lián)物一樣(Jerini Bio Tools，Berlin)，將100μlζ肽與牛血清白蛋白偶聯(lián)，然后以5μg/ml的濃度涂到96格U形底微滴板(Nunc，maxisorb)的格內(nèi)。涂覆后在4℃過夜，用洗滌緩沖液(0.1M NaCl，0.05M Na2HPO4，pH7.3，0.05％Tween 20，0.05％NaN3)洗滌三次，然后將脫脂奶粉加入洗滌緩沖液配成200μl 2％的溶液，用該溶液在室溫下封閉1小時。下一步，純的或數(shù)種稀釋度的雜交瘤上清液在室溫下孵育2小時。檢測系統(tǒng)使用的是與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗體。5次洗滌后，最后用TMB底物溶液(四甲基二氨基聯(lián)苯，Boehringer Mannheim)進(jìn)行ELISA顯色。15分鐘后，有色沉淀用ELISA讀數(shù)儀在405nm處測定。
150個克隆的上清液表現(xiàn)出強ELISA信號，挑選它們進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。
為了驗證雜交瘤上清液在T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上的結(jié)合活性，進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。1×106PBMC在150個不同克隆的各50μl上清液原液中，冰上孵育30分鐘，與熒光素(FITC)偶聯(lián)的家兔抗小鼠Ig抗體F(ab)′2片段(Dako Hamburg，CodeNo.F0313)以PBS按1∶100稀釋，用該溶液檢測結(jié)合的抗體。為了避免非特異性結(jié)合，在下一步標(biāo)記中，加入50μl 1∶10稀釋的小鼠血清(Sigma immunochemicals，Deisenhofen，M-5905)反應(yīng)30分鐘，封閉FITC偶聯(lián)的抗體的游離價。為了區(qū)別兩個PBMC亞組，將先前標(biāo)記的細(xì)胞一分為二。一半用1∶100稀釋的三色偶聯(lián)的抗CD8抗體(Caltac實驗室，Burlingame；USA，Code No.MHCD0306)染色；另一半用1∶25稀釋的藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗CD56抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)染色。陰性對照使用特異性不相關(guān)的鼠單克隆抗體而不是雜交瘤上清液。用特異性染色NK細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的非標(biāo)記的抗CD16抗體和抗CD6抗體作為第一標(biāo)記步驟的對照。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson，Heidelberg)上用流式細(xì)胞計數(shù)分析細(xì)胞。按照“現(xiàn)代免疫學(xué)方法”(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述的方法進(jìn)行FACS-染色和熒光強度測定。
進(jìn)行雙色熒光分析，對CD8+細(xì)胞施加正柵極，對CD56+細(xì)胞施加負(fù)柵極，這樣，只分別檢測到CD8+T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞上的FITC熒光。盡管各自的陽性對照抗體明顯染色CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，150份雜交瘤上清液都未顯示在CD8+T淋巴細(xì)胞和/或NK細(xì)胞上的結(jié)合活性。實施例2用噬菌體展示法在鼠組合抗體文庫中體外選擇抗ζ抗體如實施例1所述免疫10周齡的balb/c×C57黑鼠交配產(chǎn)下的F小鼠。第一次加強免疫后10天，采集血樣，ELISA測定抗ζ肽-BSA偶聯(lián)物抗體的血清效價(參見實施例1)。免疫動物的血清效價比未免疫動物高1000倍。第三次注射后3天，收獲小鼠的脾細(xì)胞。用Chomczynski(分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)162(1987)156-159)的方法分離總RNA。通過小鼠脾細(xì)胞RNA的RT-PCR構(gòu)建一個鼠免疫球蛋白(Ig)κ輕鏈和Ig重鏈Fd片段(＝VH+CH1)的DNA文庫。用標(biāo)準(zhǔn)方法合成cDNA(Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第二版)。
選擇引物組(見表1)，使得重鏈含有5′-XhoI和3′-SpeI識別位點，輕鏈片段含5′-SacI和3′-XbaI識別位點。為了PCR擴增HC DNA片段，8種不同的5′-VH家族特異性引物各自與4種與不同IgG亞型HC-CH1結(jié)構(gòu)域3′區(qū)雜交的3′引物組合；為了PCR擴增κ輕鏈片段，7種不同的5′-VK家族特異性引物各自與1種與κ恒區(qū)(CK)3′末端雜交的3′引物組合。
用以下PCR程序進(jìn)行擴增94℃初變性2分鐘；擴增40輪94℃變性20秒，52℃引物退火50秒，72℃引物延伸60秒；然后72℃延長10分鐘。
將450ngκ輕鏈片段(Sacl-XbaI消化)與1400ng噬菌粒pComb3H(Sacl-XbaI消化；大片段)連接(Barbas等，美國科學(xué)院院報88，7978-82(1991))。然后將得到的輕鏈文庫通過電穿孔(2.5kV，0.2cm寬的比色杯，25FD，200Ω，Biorad基因脈沖儀)轉(zhuǎn)化到300μl電感受態(tài)的大腸桿菌XL1Blue中，得到大小為6×108個獨立克隆的文庫。1小時的表型表達(dá)后，在100ml液態(tài)SB培養(yǎng)物中過夜，選出載體編碼羧芐青霉素抗性的陽性轉(zhuǎn)化子。然后離心收集細(xì)胞，用市售的質(zhì)粒制備試劑盒(Qiagen)制備質(zhì)粒。
將2800ng含κ輕鏈文庫的該質(zhì)粒DNA(Xhol-SpeI消化；大片段)與900ng HC-Fd-DNA片段(Xhol-SpeI消化)連接，并仍通過電穿孔(2.5kV，0.2cm寬的比色杯，25FD，200Ω)轉(zhuǎn)化到兩份300μl電感受態(tài)的大腸桿菌XL1Blue中，得到4×108個獨立克隆的抗體Fab片段組合文庫。
1小時的表型表達(dá)后，根據(jù)羧芐青霉素抗性選出陽性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過如此適應(yīng)后，用感染劑量1×1012個輔助噬菌體VCSM13顆粒感染這些克隆，于是產(chǎn)生并分泌出絲狀M13噬菌體，各噬菌體顆粒含編碼單個鼠抗體Fab片段的噬菌粒載體的單鏈拷貝，并在噬菌體表面展示相應(yīng)的Fab蛋白。通過翻譯將HC-Fd片段與噬菌體包被蛋白III融合，Ig輕鏈自發(fā)地與HC片段結(jié)合，這樣將Fab片段錨著在噬菌體表面上。
用PEG8000/NaCl沉淀和離心，從培養(yǎng)物上清液收獲帶有克隆Fab集的噬菌體文庫，重溶于補充了10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，隔日輪換地與固定化ζ肽-BSA偶聯(lián)物或分離的CD8+淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞一起培養(yǎng)。預(yù)先用免疫磁力分離法分離兩個人PBMC亞群。用Ficoll密度梯度離心從外周血獲得單核細(xì)胞，它們先與抗人CD8和CD56的鼠源特異性第一抗體一起孵育，然后用偶聯(lián)了綿羊抗小鼠IgG抗體的順磁性微珠(Dynal，Oslo，Norway)進(jìn)行花結(jié)實驗。用一塊磁鐵貼在含細(xì)胞懸液試管的壁上，分離出CD8+T淋巴細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞。噬菌體文庫分別與純化的CD8+T淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞在4℃連續(xù)攪拌孵育2小時，然后，因為順磁性微珠仍然結(jié)合著細(xì)胞，所以可從非結(jié)合噬菌體顆粒中拯救出結(jié)合噬菌體顆粒的細(xì)胞。
所以，與磁場作用可用來取消每輪從篩選時為減弱噬菌體背景而多次使用洗滌溶液重懸細(xì)胞。最后，用HCl-甘油，pH2.2洗脫特異性結(jié)合的噬菌體顆粒，用2M Tris，pH12中和后，用洗脫物感染新的未感染的大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)物。同樣，用羧芐青霉素抗性選出編碼鼠Fab片段的pComb3H噬菌?？截惓晒D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，然后用VCMS13輔助噬菌體感染，開始另一輪抗體展示和體外選擇。
完整的體外選擇包括前兩輪固定化ζ肽-BSA偶聯(lián)物上的篩選，然后一輪分別在CD8+T淋巴細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞上的篩選。然后，又是兩輪固定化ζ肽-BSA偶聯(lián)物上的篩選，接一輪CD8+T淋巴細(xì)胞上的篩選，最后在CD56+NK細(xì)胞上篩選。為了保持對ζ鏈特異性Fab片段的選擇壓力，按(Barbas等，美國科學(xué)院院報88，7978-82(1991))所述進(jìn)行固定化抗原上的篩選，否則，這些Fab片段可能因非特異性噬菌體洗脫而從含有除ζ鏈之外大量其他抗原的細(xì)胞表面丟失。每輪篩選后，從得到的大腸桿菌培養(yǎng)物制備質(zhì)粒DNA。
為了生產(chǎn)可溶性Fab蛋白，從制備的質(zhì)粒DNA中切下基因III DNA片段(SpeI/NheI)，從而破壞了Fab片段與基因III蛋白的翻譯融合。連接后，將該質(zhì)粒集合轉(zhuǎn)化到100μl熱休克感受態(tài)大腸桿菌XL1Blue中，并在羧芐青霉素LB-瓊脂板上培養(yǎng)。將單克隆培養(yǎng)在10ml LB-Carb-培養(yǎng)物/20mM MgCl2中，6小時后，加入最終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)Fab表達(dá)。
20小時后，離心收獲細(xì)胞，經(jīng)4次-70℃冷凍和37℃融解循環(huán)后，細(xì)菌的外膜被溫度沖擊所破壞，包括Fab抗體片段在內(nèi)的可溶性周質(zhì)蛋白于是釋放進(jìn)入液體。離心去除完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片，用ELIDA測定上清液中Fab抗體片段與ζ肽-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。
用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG+IgM抗體的F(ab′)2片段(0.16μg/ml)檢測與固定化ζ肽-BSA偶聯(lián)物結(jié)合的Fab抗體片段(Pierce，Rockford，USA，Prod.No.311448)。加入底物溶液(含2，2′-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)和過硼酸鈉，進(jìn)行信號顯色，并在405nm處檢測。
與體外選擇前取自文庫的克隆相反，不同輪次篩選后的被測克隆在ζ肽-ELISA中證明呈陽性，頻率全面提高，直至用純化CD8+T細(xì)胞進(jìn)行的第7輪篩選(圖2)。但從第7輪到用純化NK細(xì)胞進(jìn)行的第8輪篩選，陽性克隆數(shù)顯著下降。這顯示，憑借其在T細(xì)胞上結(jié)合活性而富集的克隆大多數(shù)不結(jié)合NK細(xì)胞，只有克隆90例外，它在最后的NK細(xì)胞篩選后仍然存在。
為了驗證ζ肽反應(yīng)性Fab片段在CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞上的結(jié)合活性，進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。1×106個PBMC在50μl周質(zhì)制劑原液中冰上孵育30分鐘，然后與熒光素(FITC)偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG+IgM抗體的F(ab′)2片段(JacksonImmunoresearch Laboratories，West Grove，USA，Code No.115-096-068)的1∶100 PBS稀釋液一起孵育。為了避免非特異性結(jié)合，在以后的標(biāo)記步驟中，加入50μl 1∶10稀釋的小鼠血清(Sigma immunochemicals，Deisenhofen)反應(yīng)30分鐘，封閉FITC-抗體的游離價。為了區(qū)分兩PBMC亞組，將先前標(biāo)記的細(xì)胞一分為二。一半用1∶100稀釋的三色偶聯(lián)的抗CD8抗體(Caltac Laboratories，USA，Code.No.MHCD0306)染色；另一半用1∶25稀釋的藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗CD56抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)染色。陰性對照使用特異性不相關(guān)的Fab抗體周質(zhì)制劑。分別用非標(biāo)記的抗CD16抗體和抗CD6抗體作為NK細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的陽性對照。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson)上進(jìn)行雙色熒光分析，對CD8+細(xì)胞和CD56+施加正柵極，這樣，只分別檢測到CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上的FITC熒光。按照“現(xiàn)代免疫學(xué)方法”(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述的方法進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記和熒光強度測定。
用以上方法，在PBMC上分析了60個不同克隆，它們都在ELISA分析中被證明與ζ肽-BSA偶聯(lián)物反應(yīng)。雖然陽性對照表現(xiàn)出明顯的陽性FACS信號，但抗ζ鏈Fab片段周質(zhì)制劑都不能與CD8+細(xì)胞和NK細(xì)胞的表面結(jié)合。這可以解釋為，用T細(xì)胞表面篩選得到的Fab片段的親和反應(yīng)性低，這對于體外選擇過程中的富集可能已足夠，但卻低于流式細(xì)胞計數(shù)分析的靈敏度。然而，最后在NK細(xì)胞上選擇時，ζ肽反應(yīng)性克隆消失，這明確顯示，這些潛在的T細(xì)胞反應(yīng)性克隆完全不與NK細(xì)胞表面結(jié)合。另一方面，克隆90，根據(jù)其可變區(qū)序列與體外篩選過程中早期出現(xiàn)的其他ζ肽反應(yīng)性克隆的可變區(qū)序列的比較，在最后的NK細(xì)胞表面選擇時才首次出現(xiàn)，很可能具有結(jié)合NK細(xì)胞表面的低親和力，但與T細(xì)胞不反應(yīng)。所以，直到第二輪NK細(xì)胞選擇，克隆90才出現(xiàn)，用相應(yīng)的Fab片段進(jìn)行的流式細(xì)胞計數(shù)分析在T細(xì)胞或NK細(xì)胞上都沒有檢測到結(jié)合信號。實施例3用ζ肽-KLH偶聯(lián)物免疫大鼠，并用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗ζ肽抗體3月齡時，用人T細(xì)胞系Jurkat(ATCC TIB-152)通過腹腔內(nèi)注射1×107細(xì)胞免疫Spargue Dawley大鼠。3個月后，用ζ肽-KLH偶聯(lián)物免疫大鼠。將該偶聯(lián)物溶于0.9％NaCl中達(dá)200μg/ml的濃度。用Freund完全佐劑將該溶液按1∶2乳化，取100μl進(jìn)行腹腔內(nèi)注射和皮下注射。4周后，以相同方式但不加佐劑，對大鼠進(jìn)行加強免疫。加強免疫后3天，殺死動物取出脾細(xì)胞，按標(biāo)準(zhǔn)方法，將其與P3X63Ag8.653細(xì)胞(ATCC CRL-1580)融合，生成雜交瘤細(xì)胞系。PEG融合后，按100.000/格將細(xì)胞接種在微滴板上，培養(yǎng)在200μl補充了10％胎牛血清和HAT添加劑的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。8天后，完全除去培養(yǎng)上清液，換以新鮮的培養(yǎng)基。又4天后，各格的培養(yǎng)上清液按1∶1稀釋，并進(jìn)行ELISA測試(參見實施例1)。挑選與固定化ζ肽-BSA偶聯(lián)物反應(yīng)最強烈的45格的上清液，如實施例1就鼠單克隆抗體篩選所述，在CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上進(jìn)行FACS分析，但使用的是FITC標(biāo)記的抗大鼠免疫球蛋白抗體(IgG+IgM)(Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)而不是FITC偶聯(lián)的大鼠抗小鼠Ig抗體的F(ab′)2片段。在被測的45種不同大鼠單克隆抗體中，只有克隆2-B-5在CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上都結(jié)合。所以，在實施例4-7中，對該克隆進(jìn)行更詳細(xì)的分析。實施例4在CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上進(jìn)行的抗ζ鏈抗體2-B-5的流式細(xì)胞計數(shù)分析為了測試抗體2-B-5在CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上的結(jié)合活性，取兩名健康供者的外周血，通過Ficoll密度梯度離心分離出單核細(xì)胞。將細(xì)胞按100.000/格接種在微滴板上，分別與2-B-5雜交瘤培養(yǎng)上清液原液及其幾個濃度的稀釋液一起孵育。陰性對照用的是同型但特異性不相關(guān)的抗體(大鼠IgM)的培養(yǎng)上清液。冰上孵育30分鐘后，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后用兩種不同的抗體標(biāo)記混合物染色。同時，CD8+T淋巴細(xì)胞與熒光素(FITC)偶聯(lián)的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體((Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)的1∶100 PBS稀釋液，藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的CD56抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)的1∶25PBS稀釋液，和三色偶聯(lián)的CD3抗體(Caltac Laboratories，Burlingame，USA，Cod.No.MHCD0306)的1∶50PBS稀釋液一起在冰上孵育30分鐘。為了避免抗大鼠抗體與小鼠抗體的非特異性結(jié)合，在該標(biāo)記混合物中加入1∶10稀釋的小鼠血清(Sigma Aldrich，St.Louis，USA，Cat.No.054H-8958)。
NK-細(xì)胞與相同的山羊抗大鼠抗體1∶100 PBS稀釋液，三色偶聯(lián)的CD8抗體((Caltac Laboratories，Cod.No.MHCD0806)的1∶100 PBS稀釋液，和藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的CD16抗體(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347617)的1∶25PBS稀釋液一起孵育。也在該混合物中加入小鼠血清。標(biāo)記后的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后用PBS/1％聚甲醛固定。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson，Heidelberg)上對細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。按現(xiàn)代免疫學(xué)方法(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述，進(jìn)行FACS染色和熒光強度測定。
進(jìn)行三色熒光分析，對CD8+細(xì)胞(三色)加以正柵極，對CD16+細(xì)胞(PE)加以副柵極，這樣，檢測到的只是CD8+T淋巴細(xì)胞(表型CD8+，CD16+)上的FITC熒光，而沒有來自CD8+NK細(xì)胞的干擾。同樣，進(jìn)行三色熒光分析，對CD56+細(xì)胞(PE)加以正柵極，對CD3+細(xì)胞(三色)加以副柵極，這樣，檢測到的只是NK細(xì)胞(表型CD56+，CD3+)上的FITC熒光，而沒有來自CD56+T淋巴細(xì)胞的干擾。
如圖3所示，2-B-5雜交瘤抗體與不同供者的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞都特異性地結(jié)合。實施例5用夾心ELISA驗證2-B-5抗體的ζ鏈特異性為了驗證2-B-5抗體的ζ鏈特異性，進(jìn)行夾心ELISA。
為此，純化已知表達(dá)ζ鏈的CD8+T淋巴細(xì)胞的裂解液，與固定化的識別胞外ζ鏈結(jié)構(gòu)域的抗體一起孵育。細(xì)胞裂解液的ζ鏈分子于是被該抗體捕捉，繼而被抗ζ鏈胞外部分的2-B-5抗體檢測到。如實施例1所述，用順磁性微珠分離CD8+T淋巴細(xì)胞。具體步驟按照生產(chǎn)商(Dynal，Oslo，Norway)的說明書進(jìn)行。用除垢劑NP-40(Sigma，deisenhofen)，在蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)(Merk，Darmstadt)存在下，裂解純化的CD8+T淋巴細(xì)胞。有關(guān)詳細(xì)的緩沖液配方，參見Sambrook，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold Spring Hobart，NY(1989)。
如下進(jìn)行夾心-ELISA一種ζ鏈特異性抗體(Santa Cruz Biotechnology，Cat-No1124)識別ζ鏈羧基末端的144-163位氨基酸，叫將它以5μg/ml的濃度涂在96格U形底微滴板(Nunc，Maxisorb)上。涂層在4℃保持過夜，用BSA的3％PBS溶液室溫下封閉1小時。然后，加入CD8+T淋巴細(xì)胞裂解液原液和幾個濃度的稀釋液，培養(yǎng)1小時。陰性對照是與PBS而不是細(xì)胞裂解液一起孵育的孔。在以下步驟中，加入1μg/ml的純化單克隆抗體2-B-5，孵育1小時。先加生物素化小鼠抗大鼠IgM抗體(Zymed，San Francisco，CA.USA；Cat-No.03-9840；工作濃度為400ng/ml)，然后加親合素-過氧化物酶偶聯(lián)物(Dako，Hamburg；Code-No.P03347；工作濃度位1μg/ml)，檢測結(jié)合的2-B-5抗體。最后加入ABTS底物溶液(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat-No.1682008)進(jìn)行ELISA的顯色。用ELISA讀數(shù)儀在405nm測定有色沉淀。
按照生產(chǎn)商的說明使用Bakerbond Abx柱(J.T.Baker，Greisheim，Germany)，用離子交換層析法，從雜交瘤培養(yǎng)上清液中純化大鼠IgM抗體2-B-5。
如圖4所示，單克隆抗體2-B-5與T細(xì)胞裂解液中的ζ鏈分子結(jié)合，被識別胞外ζ鏈結(jié)構(gòu)域的固定化抗體所捕捉，ζ特異性的ELISA信號依賴于裂解液的稀釋度，而且明顯高于陰性對照。實施例6ζ抗體2-B-5可變區(qū)的克隆，和其相應(yīng)Fab片段在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)按照Chomczynski等的方法(生物化學(xué)年報，Vol.162，p.156-9，1989)，從5×106個大鼠雜交瘤細(xì)胞系2-B-5細(xì)胞中分離RNA。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，Cold SpringHarbour Laboratory Press 1989，第二版)，用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶Superscritpt II(Gibco BRL，Eggenstein)逆轉(zhuǎn)錄總RNA。大鼠cμRT(GTGCAGGGCCAGAGAAGGCATC)與大鼠μ鏈恒區(qū)的一段短序列匹配，大鼠ckRT(GTAGGTCGCTTGTGGGGAAGTCTC)與輕鏈(κ鏈)3′非翻譯區(qū)的一部分互補，用這兩段寡核苷酸特異性合成cDNA，兩引物分別位于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IgM-CH1-重鏈或κ輕鏈恒區(qū)的核苷酸序列末端下游70堿基對(bp)處。兩種情況中的核苷酸信息都來自Genebank數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/)，κ鏈登錄號J02574，μ鏈登錄號X68312。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用末端轉(zhuǎn)移酶(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)給cDNA第一鏈加上聚G尾。根據(jù)Gilliland，L.K.等公開(Tissue Antigens 47，1-20，1996)的錨引物5′-Anc尾(CGTCGATGAGCTCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCD)，用一段含聚C延伸的有義引物對加尾cDNA進(jìn)行PCR擴增。將該錨引物與分別對編碼κ輕鏈恒區(qū)C末端或IgM-CH1重鏈C末端的核苷酸序列具有特異性的反義引物混合。將該兩引物稱為3′大鼠ck(GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA)和3′大鼠cμ(ATTGGGACTAGTCTCAACGACAGCTGGAAT)。如下進(jìn)行PCR初變性94℃ 4分鐘；30輪擴增93℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；最后延長72℃3分鐘。這些引物都含有一個限制酶剪切位點(5′-Anc尾EcoRI；3′大鼠ckXbaI；3′大鼠cμSpeI)，從而可將相應(yīng)PCR片段插入分別用EcoRI/XbaI消化或EcoRI/SpeI消化的質(zhì)粒載體；為此，使用bluescript KS+質(zhì)粒載體(Genebank Accession No X52327)，因為它允許用一般測序引物方便地對所得插入片段進(jìn)行序列分析。因為重鏈(VH)可變區(qū)內(nèi)有一個SpeI剪切位點，必須先部分消化，然后克隆全長片段，才能獲得VH鏈的全序列信息。部分消化按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook，Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989，第二版)。重鏈和輕鏈的幾個克隆分別被證明具有相同的序列，可認(rèn)為編碼功能性VL或VH區(qū)(參見圖6和7)。
通過與Genebank數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/)中序列比較，鑒定兩可變區(qū)的成熟N末端，然后設(shè)計第二組PCR引物，以便根據(jù)亞克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中的要求，引入一個與2-B-5Fab抗體片段編碼序列同框的合適的限制酶剪切位點。這兩個引物是5′RVHZXhoI(CAGGTACAGCTGCTCGAGTCTGGGGC-TGAGCTAG)和5′RVKZSacI(GTAAATGTGAGCTCCAGATGACACAGTCTCCTG)，分別與3′大鼠cμ和3′大鼠ck引物聯(lián)用。PCR擴增，并用合適的限制酶組合(XhoI/SpeI用于重鏈片段，SacI/XbaI用于κ輕鏈)消化后，將所得的DNA片段分別克隆到相應(yīng)制備的bluestript質(zhì)粒載體中，然后進(jìn)行序列驗證(測序結(jié)果，參見圖6和7)。
為了在大腸桿菌的周質(zhì)中表達(dá)2-B-5-Fab片段，用限制酶SacI/XbaI從BluescriptKS+中切取相應(yīng)的κ輕鏈，亞克隆入相同酶消化的載體pComb3HHis。然后，用限制酶XhoI/NheI消化所得的質(zhì)粒，以其為載體亞克隆2-B-5重鏈Fd片段(VH+CH1)；該DNA片段用XhoI/SpeI切自相應(yīng)的Bluescript KS+克隆。
pComb3HHis是pComb3H和pComb3(Barbas等，美國科學(xué)院院報88，7978-82(1991))經(jīng)以下修飾而得用NheI剪切pComb3H載體，通過連接插入一段帶有合適末端的雙鏈寡核苷酸。該雙鏈寡核苷酸是5′磷酸化引物His6s(CTAGCCATCACCATCACCATCACA)和His6as(CTAGTGTGATGGTGATGGTGATGG)退火(94℃10分鐘；65℃30分鐘；52℃30分鐘；30℃10分鐘)而成。引物末端的設(shè)計為在與載體融合后，3′NheI限制酶位點被破壞，而5′NheI剪切位點保持完好。最后，進(jìn)行插入片段的測序，驗證克隆成功。
用滲透性沖擊制備細(xì)胞周質(zhì)，并用ELISA檢測與ζ肽-KLH偶聯(lián)物結(jié)合的Fab片段。為此，將以含2-B-5重鏈Fd片段和κ輕鏈的pComb3Hhis轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL1Blue的單克隆培養(yǎng)在10ml補充了羧芐青霉素和20mM MgCl2的Super肉湯培養(yǎng)基中，6小時后，加入最終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)Fab的表達(dá)。20小時后，收獲細(xì)胞，重溶于1ml PBS中。4輪-70℃冷凍和37℃融化后，細(xì)菌的外膜被破壞，含有Fab片段的可溶性周質(zhì)蛋白被釋放到上清液中。離心去除完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收集含ζ-Fab抗體片段的上清液，用于以后的檢測。
用以下ELISA檢測周質(zhì)表達(dá)的單克隆抗體2-B-5 Fab片段與ζ肽-KLH偶聯(lián)物的結(jié)合將抗原固定在96U格ELISA板(Nunc maxisorb)上，濃度為每格50μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中的200μg/ml。涂層在4℃保持12小時，然后用PBS/0.05％Tween洗滌一次。然后用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封閉ELISA板一小時，再洗滌一次。然后，加入含F(xiàn)ab的周質(zhì)制劑原液和幾個濃度的稀釋液，培養(yǎng)2小時。先加1∶200稀釋的小鼠抗His-尾抗體(Dianova，Hamburg，cat.no.DIA900)，然后加1∶5000稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)的多克隆山羊抗小鼠IgG(Fcγ特異性)抗體(Dianova/Jackson，Hamburg，cat.no.115-035-071)，檢測與ζ肽-KLH偶聯(lián)物結(jié)合的Fab片段。最后，加入ABTS底物溶液(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat-No.1682008)進(jìn)行ELISA顯色。用ELISA讀數(shù)儀在405nm測定有色底物的轉(zhuǎn)變率，結(jié)果見圖5。陰性對照是與PBS而不是周質(zhì)制劑一起培養(yǎng)的細(xì)胞。
可檢測到幾個克隆與ζ肽-KLH偶聯(lián)物的特異性結(jié)合，克隆8和9的結(jié)果見圖5。信號強度明顯高于陰性對照，可用樣品稀釋液進(jìn)行滴定。因此，克隆的2-B-5Fab片段的ζ鏈特異性得到了證實。實施例7用抗ζ鏈抗體2-B-5激發(fā)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。
本實驗的目的是分析受抗體2-B-5誘導(dǎo)的T細(xì)胞，NK細(xì)胞和PBMC的激發(fā)和增殖。為此，采用基于測定DNA合成時摻入的5-溴脫氧脲苷(BrdU)的比色免疫試驗(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat.No.1647229)。
第一步，用純化的2-B-5抗體的幾個濃度的稀釋液覆蓋96格平底微滴板(有關(guān)2-B-5的純化，參見實施例5)。涂層在4℃保持過夜。用PBS洗滌3次后，在微滴板的格內(nèi)加入100.000 CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和非分離的PBMC，一式三份，按照實施例2的說明，用磁性微珠和第一抗體抗CD8+(MT-811)和抗CD16(3G8，小鼠IgG1，Dianova，Hamburg，Cat.No.0813)，分離CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。
作為2-B-5介導(dǎo)激發(fā)的特異性的對照，使用同濃度，特異性不相關(guān)的同型抗體(大鼠IgM)?？贵wOKT3(同型IgG2a，Ortho.，Prod.Code 710320，Johnson+Johnson，NewYork，USA)識別人CD3復(fù)合物，用它作為陽性對照，以1μg/ml覆蓋濃度分別用于T細(xì)胞和NK非分離PBMC的激發(fā)。用特異性不相關(guān)的IgG2a抗體作為OKT3的同型對照。還包括一個空白對照(無細(xì)胞的格)和一個背景對照(沒有BrdU)格。培養(yǎng)3天后，加入BrdU標(biāo)記溶液反應(yīng)24小時。在此標(biāo)記期間，嘧啶類似物BrdU取代胸腺嘧啶摻入增殖細(xì)胞的DNA。去除培養(yǎng)基后，固定細(xì)胞，加入變性性溶液變性DNA。DNA的變性是必需的，這是為了提高用與過氧化物酶偶聯(lián)的抗BrdU抗體檢測摻入BrdU的可接近性。該抗體與新合成的細(xì)胞DNA內(nèi)摻入的BrdU結(jié)合。然后用底物反應(yīng)檢測結(jié)合的抗BrdU抗體。用ELISA讀數(shù)儀進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的定量。以405nm處的吸光度作為有色底物的轉(zhuǎn)化率，它與DNA合成水平即增殖細(xì)胞數(shù)直接相關(guān)。所有步驟都按照試劑盒生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。
圖8中，該試驗的結(jié)果清楚地顯示，抗體2-B-5不僅與T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上的ζ鏈短胞外域結(jié)合，而且還通過這一相互作用強烈誘導(dǎo)以上兩種細(xì)胞的激發(fā)。實施例8抗ζ鏈抗體結(jié)合誘導(dǎo)的TCR/CD3復(fù)合物內(nèi)化的流式細(xì)胞計數(shù)分析對許多受體來說，配體結(jié)合的激活作用后緊跟著受體的內(nèi)化。所以，在抗CD3抗體結(jié)合后，典型地觀察到了T細(xì)胞上TCR復(fù)合物的內(nèi)化。因此，2-B-5抗體通過胞外ζ鏈表位結(jié)合TCR復(fù)合物后的內(nèi)化驗證了本發(fā)明抗體的獨特特異性。(Boyer，C.，Auphan，N.，Luton，F(xiàn).，Malburet，J.M.，Barad，M.Bizozzero，J.P.，Reggio，H.和Schmitt-Verhulst，A.M.(1991)。溶胞性T細(xì)胞克隆活化后T細(xì)胞受體/CD3復(fù)合物的內(nèi)化非蛋白激酶C依賴性星形孢菌素敏感性步驟的證據(jù)。歐洲免疫學(xué)雜志21，1623-34)。
為了測定2-B-5抗體與T細(xì)胞表面結(jié)合后的受體內(nèi)化作用，在不同溫度進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)試驗，觀察表面結(jié)合抗ζ鏈抗體的消失。
為此，用Ficoll密度梯度離心法分離來自健康供者外周血的單核細(xì)胞。在微滴板的各格中，200.000個細(xì)胞與1μg/ml抗ζ鏈抗體2-B-5在4℃或37℃培養(yǎng)30或60分鐘，從而為加帽反應(yīng)提供足夠的時間。用大鼠抗人CD3抗體(大鼠IgG2B)(克隆26-II 6-5)進(jìn)行平行實驗作為陽性對照。通過兩次冷PBS洗滌終止加帽反應(yīng)。為了標(biāo)記細(xì)胞表面結(jié)合的抗體，將細(xì)胞與PBS1∶100稀釋的熒光素(FITC)偶聯(lián)的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗體(Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)一起培養(yǎng)。單純用第二抗體作為陰性對照。標(biāo)記后細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后用PBS/0.1％聚甲醛固定。
在FACS掃描儀(Becton Dickinson，Heidelberg)上，對細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。按現(xiàn)代免疫學(xué)方法中所述的方法(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)進(jìn)行FACS染色和熒光強度的測定。
結(jié)果清楚地顯示，在抗ζ鏈抗體2-B-5結(jié)合后，可觀察到37℃培養(yǎng)和4℃培養(yǎng)的細(xì)胞樣品間發(fā)生明顯的熒光強度漂移?？笴D3抗體結(jié)合后，也可看到類似的內(nèi)化方式。與在37℃的受體內(nèi)化相反，在加帽反應(yīng)無法進(jìn)行的4℃培養(yǎng)的樣品，其熒光方式不變。實施例9根據(jù)本發(fā)明的抗ζ鏈特異性構(gòu)建雙特異性抗體為了獲得抗ζscFv片段，以克隆在各自質(zhì)粒載體內(nèi)的VL和VH區(qū)作為模板，分別用寡核苷酸引物對5′VL2B5BsrGI-EcoRV/3′VL2B5GS15和5′VH2B5GS15/3′VH2B5BspEI，進(jìn)行VL和VH特異性PCR。由此，將重疊的互補序列引入PCR產(chǎn)物，在融合PCR過程中，組合成一段15氨基酸(Gly4Ser1)3接頭的編碼序列。用引物對5′VL2B5BsrGI-EcoRV/3′VH2B5BspEI進(jìn)行該擴增步驟，用限制酶EcoRV和BspEI剪切得到的融合產(chǎn)物(或抗ζ鏈scFv片段)，克隆到質(zhì)粒(參見PCT/EP98/07313)中，該質(zhì)粒經(jīng)相同的限制酶消化，含有特異性結(jié)合EpCAM抗原的scFv片段，和用于純化和分析的組氨酸尾C末端。接著，將編碼抗ζ鏈/抗EpCAM的雙特異性單鏈抗體(其結(jié)構(gòu)域排列為VL抗ζ-VH抗ζ-VH抗EpGAM-VL抗EpCAM)的DNA片段通過EcoRI/SalI亞克隆入哺乳動物表達(dá)載體PEF-DHFR(Mack，M.，Riethmuller，G.，和Kufer，P.(1995)?！耙环N以功能性單鏈分子形式表達(dá)的高腫瘤細(xì)胞毒性雙特異性抗體小構(gòu)建物”。美國科學(xué)院院報92，7021-5)。經(jīng)序列驗證(圖10)后，所得的質(zhì)粒DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)染到DHFR缺陷型CHO細(xì)胞中；如Mack等所述，選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行基因擴增和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。如Mack等所述，在Ni-NTA-柱上，用親合性層析，通過C末端的組氨酸尾純化該雙特異性抗體。
引物表5′VL2B5BsrGI/EcoRV 5′-AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GAT GAC ACA GTC TCC-3′3′VL 2B5 GS15 5′-GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT CAGCTC CAG CTT GGT CCC-3′5′VH 2B5 GS15 5′-GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG GTACAG CTG CAG CAA TCT GG-3′3′VH 2B5 BspEI 5′AAT CCG GAA GAG ACA GTG ACC AGA GTG-3′實施例10因雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體而再抗EpCAM陽性靶細(xì)胞的PBMC和CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性在本試驗中，靶細(xì)胞用51Cr標(biāo)記，洗滌，與效應(yīng)細(xì)胞按效靶比20∶1的比例混合，然后與不同濃度的雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體一起培養(yǎng)。定量測定因靶細(xì)胞被殺傷而釋放到上清液中的51Cr，并計算各抗體濃度的比裂解率。
從健康供者血液的新鮮黃色白細(xì)胞層中分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞用于本試驗。先ficoll密度梯度離心，然后離心(100g)去除血小板，分離PBMC。用CD8+亞組柱試劑盒(R&D System，Wiesbaden，Cat-No.HCD8C-1000)，按照生產(chǎn)商的方案，分離細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。100μl補充了10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中加200000個未激發(fā)的PBMC或CD8+T淋巴細(xì)胞，將其分別加入圓底微滴板的各孔。靶細(xì)胞是Kato III細(xì)胞(ATCC HTB-103)，一個EpCAM陽性的胃癌細(xì)胞系，已用鉻-51(NEN-Life Science，Koln；Cat-No.NEZ030S)(約100μCi)標(biāo)記12小時；在微滴板的各格內(nèi)加入100μl體積內(nèi)的10.000個靶細(xì)胞。加入50μl濃度為40ng/ml至5μg/ml的雙特異性抗體。微滴板于37℃，5％CO2培養(yǎng)16小時，結(jié)束時，從各格取50μl上清液，在γ計數(shù)儀(Wallac，1480Wizard 3″，F(xiàn)reiburg)中分析釋放出的51Cr。用含Triton-X100(1.0％的PBS溶液)緩沖液裂解靶細(xì)胞，測定最大51Cr釋放。將靶細(xì)胞在無效應(yīng)細(xì)胞和雙特異性抗體存在下培養(yǎng)，測定自發(fā)性51Cr釋放。靶細(xì)胞與雙特異性抗體一起孵育沒有引起可測的裂解。如下計算比裂解比裂解(％)＝[(cpm，實驗釋放)-(cpm，自發(fā)釋放)]/[(cpm，最大釋放)-(cpm，自發(fā)釋放)]×100。所有測試都平行進(jìn)行3份。所有實驗的3份平行實驗的SD都低于6％。
用流式細(xì)胞計數(shù)分析分離的CD8+效應(yīng)細(xì)胞的純度，用PE偶聯(lián)的抗人CD56抗體染色排除NK細(xì)胞污染。如實施例1所述進(jìn)行FACS分析。使用了以下抗體偶聯(lián)物FITC抗人CD3抗體(Pharmingen Cat-No.30140X)1∶50；PE抗人CD56(BectonDickinson Cat-No.347747)1∶20；三色小鼠抗人CD8(Caltac Lab Code No.MHCD0806)1∶100(Becton Dickinson)。FACS結(jié)果驗證了CD8+細(xì)胞群的高純度(＞99％)。
鉻釋放試驗的結(jié)果(圖11)清楚地顯示雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體能夠令未激發(fā)的PBMC或CD8+細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞再抗EpCAM陽性KATO III細(xì)胞。非分離PBMC介導(dǎo)和分離的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的比裂解率之間的差異是因為NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。實施例11因雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體而再抗EpCAM陽性靶細(xì)胞的PBMC和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性該實驗是為了證明雙特異性抗ζ鏈/抗EpCAM抗體能夠令NK細(xì)胞再抗EpCAM陽性靶細(xì)胞。為了進(jìn)行該試驗，用NK細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，BergischGladbach；Order No.465-02)從人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中分離NK細(xì)胞。該分離方法是基于磁性去除非NK細(xì)胞。先加半抗原偶聯(lián)的CD3、CD14、CD19、CD36和抗IgE抗體的混合物，接著加順磁性微珠結(jié)合的抗半抗原單克隆抗體，間接標(biāo)記T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹狀細(xì)胞和血小板。與磁性微珠結(jié)合的細(xì)胞因磁場而滯留。未標(biāo)記的NK細(xì)胞從柱上洗脫，并保持完好。將3名不同健康供者的100000個NK細(xì)胞加入100μl補充了10％FCS的RPIM1640培養(yǎng)基中，將此加入圓底微滴板的各格中。在各格內(nèi)加入靶細(xì)胞即51Cr標(biāo)記的Kato細(xì)胞(每格100μl，內(nèi)含10000個靶細(xì)胞)。加入50μl 1μg/ml雙特異性抗體。微滴板在37℃，5％CO2中培養(yǎng)4小時。結(jié)束時，取50μl上清液，在γ計數(shù)儀(Wallac，1480Wizard 3″，freiburg)中分析釋放的51Cr。用含Triton-X100(1.0％的PBS溶液)緩沖液裂解靶細(xì)胞，測定最大51Cr釋放。將靶細(xì)胞在無效應(yīng)細(xì)胞和雙特異性抗體存在下培養(yǎng)，測定自發(fā)性51Cr釋放。靶細(xì)胞與雙特異性抗體一起孵育沒有引起可測的裂解。如下計算比裂解比裂解(％)＝[(cpm，實驗釋放)-(cpm，自發(fā)釋放)]/[(cpm，最大釋放)-(cpm，自發(fā)釋放)]×100。所有測試都平行進(jìn)行3份。所有實驗3份平行實驗的SD都低于6％。
用流式細(xì)胞計數(shù)分析分離的NK效應(yīng)細(xì)胞的純度，用三色偶聯(lián)的小鼠抗人CD8抗體染色排除CD8+細(xì)胞污染。如實施例1所述進(jìn)行FACS分析。使用了以下抗體偶聯(lián)物FITC抗人CD3抗體(Pharmingen Cat-No.30140X)1∶50；PE抗人CD56(BectonDickinson Cat-No.347747)1∶20；三色小鼠抗人CD8(Caltac Lab Code No.MHCD0806)1∶100(Becton Dickinson)。FACS結(jié)果驗證了NK細(xì)胞群的高純度(＞98％)。
鉻釋放試驗的結(jié)果顯示了3種情況下，能夠具有重復(fù)性地，令NK細(xì)胞再抗EpCAM陽性靶細(xì)胞。
序列表<110>Connex GmbH<120>與人ζ鏈胞外域特異性相互作用的免疫試劑<130>C1368PCT<140><141><150>EP 98 11 2867.1<151>1998-07-10<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>33<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(33)<400>1cag gca agc cag gac att ggt aat tgg tta gca33Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>褐鼠<400>2Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala1 5 10<210>3<211>21<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(21)<400>3agt gca acc agc ttg gca gac 21Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>褐鼠<400>4Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp1 5<210>5<211>27<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(27)<400>5cta cag cgt tat agt aat ccc aac acg 27Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn Thr1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>褐鼠<400>6Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn Thr1 5<210>7<211>30<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(30)<400>7ggc tac aca ttc acc agt tac gat atg cac 30Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>褐鼠<400>8Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His1 5 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144Asp Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45ggg tgg att tat cct gga aat ggt aat act aag tac aat caa aag ttc 192Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60aat ggg aag gca aca ctc act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95gca aga gat tgg cat tac tat agc agc tat atc cgt ccc ttt gct tac 336Ala Arg Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr100 105 110tgg ggc caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 369Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>14<211>123<212>PRT<213>褐鼠<400>14Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Asp Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>15<211>321<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400>15gac atc cag atg aca cag tct cct gct tcc ctg tct gcg tct ccg gaa48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Glu1 5 10 15gaa att gtc acg atc aca tgc cag gca agc cag gac att ggt aat tgg96Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp20 25 30tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct caa ctc ctg atc 144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile35 40 45tat agt gca acc agc ttg gca gac ggg atc cca tca agg ttc agc ggc 192Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt aga tct ggt aca cag tat tct ctt aag atc agc aga cta cag gtt 240Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val65 70 75 80gaa gat act gga atc tat tac tgt cta cag cgt tat agt aat ccc aac 288Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn85 90 95acg ttt gga gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105<210>16<211>107<212>PRT<213>褐鼠<400>16Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Glu1 5 10 15Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val65 70 75 80Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn85 90 95Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105<210>17<211>1637<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述人造序列<400>17gaattcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggtgta 60cactccgata tccagatgac acagtctcct 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Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln245 250 255Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln260 265 270Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val275 280 285Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu290 295 300Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu305 310 315 320Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly325 330 335Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu340 345 350Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg355 360 365Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly370 375 380Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly385 390 395 400Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro405 410 415Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg420 425 430Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp435 440 445Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val450 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權(quán)利要求
1.一種核酸分子，含有編碼一種抗體的可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR)的核酸序列，該抗體特異性地與人ζ鏈的胞外域相互作用，該抗體可以通過先用Jurkat細(xì)胞，接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個氨基酸的肽構(gòu)成的偶聯(lián)物免疫大鼠來制取。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，它含有編碼所述可變區(qū)至少兩個CDR的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸分子，它含有編碼所述可變區(qū)三個CDR的核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的核酸分子，所述的核酸序列編碼VH鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的核酸分子，所述的核酸序列編碼VL鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的核酸分子，它是DNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的核酸分子，所述CDR具有以下核苷酸序列之一(a)SEQ ID No.1；(b)SEQ ID No.3；(c)SEQ ID No.5；(d)SEQ ID No.7；(e)SEQ ID No.9；(f)SEQ ID No.11。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸分子，所述的VH鏈具有核苷酸序列SEQ ID No.13或編碼氨基酸序列SEQ ID No.14。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸分子，所述的VL鏈具有核苷酸序列SEQ ID No.15或編碼氨基酸序列SEQ ID No.16。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的核酸分子，所述CDR編碼以下氨基酸序列之一(a)SEQ ID No.2；(b)SEQ ID No.4；(c)SEQ ID No.6；(d)SEQ ID No.8；(e)SEQ ID No.10；(f)SEQ ID No.12。
11.一種載體，它含有權(quán)利要求1-10中任一項所述的核酸分子。
12.一種宿主，它是用權(quán)利要求11所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的。
13.一種產(chǎn)生由權(quán)利要求1-10中任一項所述核酸分子編碼的肽或多肽的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12所述的宿主，和從培養(yǎng)物中分離所述肽或多肽。
14.一種肽或多肽，它是由權(quán)利要求1-10中任一項所述核酸分子所編碼的，或是用權(quán)利要求13所述方法產(chǎn)生的。
15.一種抗體或其片段或衍生物，它包含至少一種權(quán)利要求14所述的肽或多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，它是單克隆抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，它是雙特異性抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，它的第一特異性針對完整細(xì)胞表面上人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或它們前體細(xì)胞表面上可能的另一種分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，它的第一特異性針對完整細(xì)胞表面上人ζ鏈的胞外域，第二特異性針對另一種細(xì)胞表面上另一種分子，該另一種細(xì)胞不是T細(xì)胞、NK細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞，該另一種分子是病毒編碼的抗原、腫瘤相關(guān)抗原或抗原呈遞細(xì)胞(APC)或非APC上的表面抗原，所述APC以樹狀細(xì)胞為佳。
20.權(quán)利要求15所述抗體的衍生物，它是scFv鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，它是IgM。
22.一種雙特異性受體，它含有權(quán)利要求14所述的肽或多肽和一種天然受體、天然配體或它們的衍生物，后者與同一或另一細(xì)胞上的一種表面分子相互作用，所述的受體或配體優(yōu)選CD4、CTLA-4、B7-1、B7-2、LFA-3、ICAM-1、-2、-3或MIP-1α、MIP-1β、RANTES或SDF-1等趨化因子。
23.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1-10中任一項所述的核酸分子，權(quán)利要求11所述的載體，權(quán)利要求12所述的宿主，權(quán)利要求14所述的肽或多肽，權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物和/或權(quán)利要求22所述的雙特異性受體。
24.權(quán)利要求18所述抗體用于制備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用于治療或預(yù)防自身免疫病，免疫缺陷，T細(xì)胞性惡性腫瘤，感染性疾病，或用于抑制免疫反應(yīng)以避免例如器官移植后移植物排斥。
25.根據(jù)權(quán)利要求19所述抗體用于制備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用于治療或預(yù)防惡性腫瘤、病毒感染或其他感染性疾病。
26.權(quán)利要求14所述肽或多肽，或權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物，或權(quán)利要求22所述的雙特異性受體用于制備藥物組合物的用途，所述的藥物組合物用于增強或抑制NK細(xì)胞依賴性免疫，或用于治療NK細(xì)胞衍生的惡性腫瘤。
27.一種測定NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞上ζ鏈或η鏈表達(dá)的方法，包括(a)權(quán)利要求14所述的肽或多肽，或權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物與所述NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞接觸；(b)測定被結(jié)合的肽或多肽、抗體或衍生物的量。
28.一種試劑盒，它包含權(quán)利要求1-10中任一項所述的核酸分子，權(quán)利要求11所述的載體，權(quán)利要求12所述的宿主，權(quán)利要求14所述的肽或多肽，權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體或其片段或衍生物和/或權(quán)利要求22所述的雙特異性受體。
29.一種轉(zhuǎn)基因動物，它的種系內(nèi)含有權(quán)利要求1-10中任一項所述核酸分子或權(quán)利要求11所述載體的至少一份拷貝。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸分子,其序列編碼一種抗體的可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR),該抗體特異性地與人ζ鏈的胞外域反應(yīng),該抗體可以通過先用Jurkat細(xì)胞,接著用載體分子與含有大鼠ζ鏈N末端11個氨基酸的肽構(gòu)成的偶聯(lián)物免疫大鼠來制取。較好的是,本發(fā)明核酸分子所編碼的肽或多肽是一種單特異性或雙特異性抗體。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子或抗體的藥物組合物,還涉及包含上述化合物的試劑盒。最后,本發(fā)明還涉及用本發(fā)明抗體測定NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其前體細(xì)胞上ζ鏈或η鏈表達(dá)的方法。
文檔編號A61P31/00GK1308675SQ99808382
公開日2001年8月15日 申請日期1999年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月10日
發(fā)明者C·派特爾 申請人:康納克斯有限公司