專利名稱：疫苗的制作方法
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本發(fā)明涉及一種用于疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑，并計(jì)劃將這種疫苗用于對抗多種傳染性病原體。進(jìn)而，本發(fā)明還涉及一種包含這種免疫調(diào)節(jié)劑的疫苗組合物，以及應(yīng)用此免疫組合物進(jìn)行免疫接種的方法，優(yōu)選地是這種免疫調(diào)節(jié)劑與抗原組合在一起。
霍亂毒素(Ctx)和與之密切相關(guān)的大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(Etx)是強(qiáng)有力的免疫原和粘膜佐劑。但是，它們固有的毒性致使它們不適合用于人。例如，雖然對于實(shí)驗(yàn)動物Ctx是最常用的粘膜佐劑，但是由于它強(qiáng)有力的誘發(fā)腹瀉的特性而不適合用于人。已試圖使毒性與佐劑活性分離開，例如通過使用Ctx和Etx的成份作為其全毒素本身的替換物。大腸桿菌Vero細(xì)胞毒素(Vtx)是另一種已知的細(xì)菌毒素。
Ctx和Etx是由酶活性亞單位A及五聚體亞單位B組成的異六聚體蛋白。已知CtxB和EtxB結(jié)合于GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)，這是一種被發(fā)現(xiàn)普遍存在于哺乳動物細(xì)胞表面的糖神經(jīng)鞘脂。Vtx結(jié)合于與GM1相似類型的受體Gb3。
在試圖防止疫苗研制的毒性問題時，先前已對非毒性亞單位B的佐劑活性進(jìn)行了研究。但是，許多報(bào)告描述的是用CtxB或CtxB的商品制劑進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。這些制劑不可避免地被小量的但生物有效量的活性毒素所污染。因此，不能將歸因于亞單位B的佐劑活性與全毒素的佐劑活性區(qū)分開(Wu和Rwssell(1993)，感染與免疫61314-322，US-518 2109)。隨后使用重組CtxB(xCtxB)進(jìn)行的研究已表明，CtxB是不良的粘膜佐劑，只有加入天然全毒素才能誘發(fā)強(qiáng)旁觀性應(yīng)答(bystander responses)(Tamnra等(1994)疫苗12419-426)。另一些研究已表明，rctxB缺乏全毒素的ADP-核糖基化活性和cAMP-刺激活性，并且表明，因?yàn)樽魟C(jī)制與這些能力相關(guān)聯(lián)，所以CtxB不適合用作佐劑(Vaidy和Lycke(1992)，免疫學(xué)75488-492，Lycke等(1992)，歐洲免疫學(xué)雜志222277-2281，Douce等(1997)。盛染與免疫652821-2828)。
在另一個研究中，鼻內(nèi)給予使用rCtxB作佐劑的卵清蛋白導(dǎo)致了不良的抗體應(yīng)答。在亞單位A中具有突變的CtX非毒性衍生物也對旁觀抗原(bystander antigens)產(chǎn)生微弱的應(yīng)答，而存在活性亞單位A卻顯著地提高了佐劑活性，表明活性亞單位A是必不可少的(Douce等(1997)同上)。
還已顯示，可以用rCtxB和rEtxB增進(jìn)對異源性抗原的耐受性(Sum等(1994)國家科學(xué)院學(xué)報(bào)914610-4614，Sum等(1996)國家科學(xué)院學(xué)報(bào)937196-7201，Bergerot等(1997)國家科學(xué)院學(xué)報(bào)944610-4614，Williams等(1997)國家科學(xué)院學(xué)報(bào)945290-5295)，表明這些分子可能不適合于用作佐劑。
本發(fā)明的基礎(chǔ)盡管本領(lǐng)域一般認(rèn)為CtxB和EtxB具有不良的佐劑活性，并且實(shí)際上可以用作耐受原，但是，本發(fā)明者仍然在鼠模型中研究了rEtxB(因此不含有殘留的全毒素或亞單位A)在鼻內(nèi)HSV疫苗中的用途，并且驚人地發(fā)現(xiàn)，它能夠刺激對病毒攻擊的保護(hù)性免疫應(yīng)答。特別是本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)i)作用劑如EtxB和CtxB可刺激產(chǎn)生高水平的局部(粘膜)抗體(雖然使用rEtxB的免疫接種比使用Ctx/CtxB組合刺激產(chǎn)生了較低水平的全血清抗體)；ii)所產(chǎn)生抗體的分布偏移向非補(bǔ)體性固定抗體，特別是S-IgA和IgG1；iii)作用劑如EtxB和CtxB還可刺激局部和全身的T-細(xì)胞增殖性應(yīng)答；iv)作用劑如CtxB和EtxB有助于使免疫應(yīng)答從Th1-相關(guān)性應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)門h2-相關(guān)性應(yīng)答；v)當(dāng)使用作用劑如CtxB和EtxB作免疫調(diào)節(jié)劑時，可避免Th2-相關(guān)性應(yīng)答的某些有害作用，如產(chǎn)生IgE；vi)與rCtxB相比較，rEtxB是更有效的免疫調(diào)節(jié)劑；vii)作用劑如EtxB和CtxB能夠改變抗原呈遞細(xì)胞用于內(nèi)在化和加工處理抗原的方式，增加抗原的持續(xù)性；viii)如果使作用劑如BtxB和CtxB連接于一種抗原，那末可能通過改變對此免疫調(diào)節(jié)劑的連接而改變對該抗原的加工處理途徑；以及
ix)VtxB在體外對白細(xì)胞群行使類似于由EtxB和CtxB行使的免疫調(diào)節(jié)作用。
這些重要的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明諸方面的基礎(chǔ)，并且使本發(fā)明者能夠預(yù)料到，可結(jié)合于GM1或Gb3的，或者可模擬對GM1或Gb3結(jié)合作用的純EtxB，CtxB和VtxB以及其它作用劑作為免疫調(diào)節(jié)劑是有用的，可在疫苗中用于對抗HSV-1感染以及其它感染的預(yù)防和治療性免疫接種，對這些感染的預(yù)防和治療將從上面列舉的免疫調(diào)節(jié)作用類型獲得益處。對免疫應(yīng)答的刺激作用能夠結(jié)合于GM1或Gb3的，或者能夠模擬對GM1或Gb3結(jié)合作用的EtxB，CtxB，VtxB和其它作用劑，可以起免疫調(diào)節(jié)劑的作用并刺激針對抗原攻擊的特異性免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，在此提供了下列作用劑作為對抗感染性疾病疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性，不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面。在此提供了一種用于針對感染性疾病的疫苗組合物，這些感染性疾病是由感染性病原體引起的，其中疾疫苗組合物包含一種抗原決定因子和選自如下作用劑的免疫調(diào)節(jié)劑；(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；其中的抗原決定因子是所述感染性病原體的抗原決定因子。
可以使該抗原和疫調(diào)節(jié)劑連接，例如共價(jià)地或遺傳地連接，形成單一的有效作用劑。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，是使抗原和免疫調(diào)節(jié)劑化學(xué)偶聯(lián)。例如，可使用異型雙功能交聯(lián)試劑將抗原和免疫調(diào)節(jié)劑化學(xué)偶聯(lián)。在本發(fā)明此方面的大多數(shù)應(yīng)用中，優(yōu)選地是分別給藥(其中的抗原和免疫調(diào)節(jié)劑沒有被這樣連接)，因?yàn)檫@樣能夠分別給予不同的部分。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，在此提供了一種試劑盒，用于對哺乳動物對象如人或獸醫(yī)對象接種疫苗，對抗感染性疾病，此試劑盒包含a)如下作用劑中的一種(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；以及b)一種抗原決定因子，它是感染性疾病的抗原決定因子，用于與所述疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑一起共同給藥。
可按照預(yù)防或治療性疫苗接種方法使用本發(fā)明第二方面的疫苗組合物和本發(fā)明第三方面的試劑盒，在此是將“預(yù)防性疫苗”給予未免疫的個體以便防止疾病發(fā)生，而將治療性疫苗給予已存在感染的個體，以便使感染減少或降低至最少或者消除疾病的免疫病理學(xué)后果。
一旦感染發(fā)生，作用劑如EtxB具有改變免疫應(yīng)答性質(zhì)的能力?？赡馨l(fā)現(xiàn)，含有這種作用劑的治療性疫苗(即不需要含有抗原的疫苗)在免疫應(yīng)答已不能消除感染的情況下特別有用。這種應(yīng)用對于治療慢性疾病可能特別有效，例如對于選自如下致病因素引起的疾病，皰疹病毒、肝炎病毒，HIV，TB和寄生蟲。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，在此提供了一種對宿主預(yù)防或治療疾病的方法，該方法包括對宿主接種含有至少一種抗原決定因子和免疫調(diào)節(jié)劑的疫苗，在此該免疫調(diào)節(jié)劑是(i)無全毒素的EtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
可將此疫苗包裝成用于共給藥，并且可通過多種不同途徑給藥，例如鼻內(nèi)給藥，口腔給藥，陰道內(nèi)給藥，尿道給藥或眼內(nèi)給藥。目前優(yōu)選的途徑是鼻內(nèi)免疫接種。當(dāng)疫苗通過鼻內(nèi)給藥時，可作為噴霧劑或液體的形式給藥。
可作為單劑量或者按多劑量對給藥對象給予抗原決定因子和免疫調(diào)節(jié)劑。
在第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對其感染性病原體是多種皰疹病毒家族成員的疾病。例如，其感染性病原體可能選自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8。特別是其感染性病原體可能是HSV-1，HSV-2，CMV或EBV。
在此第一實(shí)施方案中，抗原決定因子優(yōu)選地是皰疹病毒的即時早期，早期或晚期的基因產(chǎn)物(例如表面糖蛋白)。
如果感染性病原體是HSV-1或HSV-2，那末抗原決定因子可以是選自如下種類基因產(chǎn)物的抗原決定因子gD，gB，gH，gC或潛伏相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物(LAT)。
如果感染性病原體是EBV，那末抗原決定因子可以是gp340或gp350的抗原決定因子，或者是潛伏性蛋白(例如EBNA1，2，3A，3B，3C和-LP，LMP-1，-2A和2B，或EBER)的抗原決定因子。
在第二個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對其感染性病原體是流感病毒的疾病。
在此第二實(shí)施方案中，抗原決定因子優(yōu)選地是病毒包衣蛋白(例如血球凝集毒和神經(jīng)氨酸苷酶)的或內(nèi)部蛋白(例如核蛋白)的抗原決定因子。
在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對其感染性原體是付流感病毒的疾病。
在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對其感染性病原體是呼吸合胞體病毒的疾病。
在第五實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對其感染性病原體是肝炎病毒的疾病。例如，其感染性病原體可能選自甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎和丁型肝炎病毒，特別是此感染性病原體可能是甲型肝炎或丙型肝炎病毒。
在第六實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對腦膜炎。在此第六實(shí)施方案中，其感染性病原體可能選自腦膜炎奈瑟氏首，B型流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。
在第七實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對肺炎或呼吸道感染。在此第七實(shí)施方案中，其感染性病原體可能選自肺炎鏈球菌，嗜肺軍團(tuán)菌和結(jié)核分支桿菌。
在第八實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法，被用于針對性傳播的疾病。在此第八實(shí)施方案中，其感染性病原體可能選自淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原體。
在第九實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對胃腸道疾病。在此第九實(shí)施方案中，其感染性病原體可能選自致腸道病的，產(chǎn)腸毒素的和侵入腸道的大腸桿菌，輪狀病毒，腸炎沙門氏菌，傷寒沙門氏菌，幽門螺桿菌，蠟狀芽孢桿菌，空腸彎曲桿菌和霍亂弧菌。
如果其感染性病原體是選自致腸道病的，產(chǎn)腸毒素的，侵入腸道的，致腸出血的和腸道聚性的大腸桿菌，那末此抗原決定因子可能是細(xì)菌毒素或粘附因子的抗原決定因子。
在第十實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法被用于針對表面感染。在此第十實(shí)施方案中，其感染性病原體可能選自金黃色葡萄球菌，化膿鏈球菌和變異鏈球菌。
在第十一實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面的免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗，本發(fā)明第三方面的試劑盒和本發(fā)明第四方面的方法，被用于針對寄生蟲病。在此第十一實(shí)施方案中，其感染性病原體可能選自瘧原蟲，錐體蟲屬種，岡氏弓形蟲，杜氏利什曼原蟲和盤尾絲蟲屬種。對粘膜免疫應(yīng)答的刺激作用能夠結(jié)合于GM1或Gb3的、或者能夠模擬對GM1或Gb3結(jié)合作用的EtxB，CtxB，VtxB和其它作用劑，可特異性地上調(diào)粘膜抗體的產(chǎn)生。
對于通過體內(nèi)粘膜免疫應(yīng)答可實(shí)現(xiàn)預(yù)防感染或治療的疾病，本發(fā)明第一方面的疫苗免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明第二方面的疫苗組合物和本發(fā)明第三方面的試劑盒特別有效。例如，對于在感染過程中其感染性病原體結(jié)合于粘膜，定居于粘膜或可穿越進(jìn)入粘膜的疾病有效。這類疾病的實(shí)例包括由病毒(HIV，HSV，EBV，CMV，流感病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，輪狀病毒等)引起的疾病，由細(xì)菌(大腸桿菌，沙門氏菌，志賀氏菌，衣原體，淋病奈瑟氏菌，T.Pallidum，包括引起齲齒的鏈球菌屬種)引起的疾病，以及由寄生蟲引起的疾病。
在本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，在此提供了一種針對HSV-1感染的疫苗，它包含至少一種HSV-1抗原決定因子和免疫調(diào)節(jié)劑，其中免疫調(diào)節(jié)劑是(i)無全毒素的EtxB，CtxB，VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
優(yōu)選地此免疫調(diào)節(jié)劑是EtxB。
在本發(fā)明第三方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，在此提供了一種用于針對HSV-1，對哺乳動物對象疫苗接種的試劑盒，它包括a)是如下作用劑的疫苗免疫調(diào)節(jié)劑；(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；以及b)至少一種HSV-1抗原決定因子，用于與所述疫苗免疫調(diào)節(jié)劑一起共同給藥。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，在此提供了如下作用劑在粘膜表面上調(diào)抗體產(chǎn)生中的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；非補(bǔ)體性固定血清抗體的產(chǎn)生也可能被上調(diào)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第五方面可產(chǎn)生S-IgA。
按照本發(fā)明的此第五方面，可連同一個或幾個抗原決定因子一起使用此作用劑。下調(diào)免疫應(yīng)答的病理成分本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)按照所述的方式將純EtxB用作免疫調(diào)節(jié)劑時，避免了Th2相關(guān)應(yīng)答的有害作用，如產(chǎn)生高水平的潛在病理性IgE。盡管如此，由使用EtxB(或者CtxB或VtxB)作免疫調(diào)節(jié)劑所觸發(fā)的免疫應(yīng)答看來有助于誘導(dǎo)Th2相關(guān)的細(xì)胞因子。換句話說，EtxB(或CtxB)可誘導(dǎo)從Th1-型應(yīng)答向Th2-型應(yīng)答轉(zhuǎn)移。這已使本發(fā)明者能夠預(yù)料到，可結(jié)合于GM1或Gb3、或者可模擬對GM1或Gb3結(jié)合作用的純EtxB，CtxB或VtxB，以及其它作用劑，將能夠下調(diào)與Th1和Th2激活有關(guān)的免疫應(yīng)答病理成分。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，在此提供了如下作用劑下調(diào)Th2-相關(guān)的免疫應(yīng)答病理成分的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性，不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
Th1-相關(guān)的免疫應(yīng)答病理成分也可以被下調(diào)。
已知EtxB和CtxB結(jié)合于GM1，并對淋巴細(xì)胞群誘發(fā)不同的作用，包括特異性排除CD8+T細(xì)胞和對B細(xì)胞的相關(guān)激活(WO97/-02045)。因此，認(rèn)為EtxB和CtxB可改變免疫應(yīng)答的平衡，以致于使引起炎癥的Th1相關(guān)反應(yīng)被下調(diào)，而Th2相關(guān)的應(yīng)答被上調(diào)。Th1應(yīng)答包括由激活的T-細(xì)胞分泌8IFN，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。這樣一些應(yīng)答可能是許多病原體感染過程中的重要病理原因。Th2應(yīng)答包括激活T-細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-2，IL-5，IL-10，并已知可促進(jìn)分泌高水平的抗體，特別是IgA。
現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將EtxB按所述方式用作免疫調(diào)節(jié)劑時，可避免Th2相關(guān)應(yīng)答的有害作用，如產(chǎn)生高水平的潛在性病理IgE。因此，EtxB和CtxB能夠下調(diào)與Th1和Th2激活相關(guān)的免疫應(yīng)答病理成分。這樣一些免疫應(yīng)答被調(diào)節(jié)有助于產(chǎn)生高水平的非補(bǔ)體性固定血清抗體，并在粘膜表面產(chǎn)生分泌性IgA。
將根據(jù)本發(fā)明第六方面的作用劑用于治療性病苗接種，對于涉及免疫病理學(xué)機(jī)制的疾病特別有效。這些疾病的例子是HSV-1，HSV-2，TB和HIV。
可以將本發(fā)明的第一和第六方面組合在一起。換句話說，作用劑如EtxB可以被同時用作免疫調(diào)節(jié)劑和治療劑。例如對于涉及免疫病理學(xué)的疾病，使用摻入作用劑如EtxB或CtxB的疫苗不但可以起限制感染的作用，而且也可消除疾病的病理過程。因此，這種免疫調(diào)節(jié)劑既起預(yù)防作用，又有治療作用。對于按這種方式接種疫苗因此很可能特別有效果的感染，其例子包括由皰疹病毒家族，胃腸道和呼吸道病原體引起的疾病。對抗原加工處理途徑的免疫調(diào)節(jié)作用a)延長呈遞本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將EtxB或(CtxB或VtxB)用作免疫調(diào)節(jié)劑時，抗原的內(nèi)在化過程和加工處理途徑被改變了。B亞單位的存在導(dǎo)致延長了其呈遞，可能是通過改變在抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)抗原運(yùn)輸，以致使抗原的降解作用被延緩，因此可保持較長的一段時間。B-亞單位與抗原呈遞相關(guān)的這種特征意味著，根據(jù)本發(fā)明摻入作用劑的疫苗將具有增加的抗原持續(xù)性，并導(dǎo)致可保持的免疫記憶。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，在此提供下列作用劑在疫苗中作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途，以便延長抗原呈遞，并對哺乳動物對象給予可保持的免疫記憶(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，在此提供了一種疫苗組合物，用于針對感染性疾病，它含有抗原決定因子和選自如下作用劑的免疫調(diào)節(jié)劑；(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；其中所述的抗原決定因子是該感染性疾病的抗原決定因子，其中的免疫調(diào)節(jié)劑可延長抗原決定因子的存在時間，并給予可保持的免疫記憶。b)在細(xì)胞內(nèi)將抗原定向于MHC-I或MHC-II相關(guān)的途徑如上面所述，可以將治療或預(yù)防疫苗中的抗原和免疫調(diào)節(jié)劑連接在一起，例如共價(jià)地或遺傳性地連接形成有效的單一作用劑。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過改變抗原對免疫調(diào)節(jié)劑的連接有可能使此抗原定向于細(xì)胞的不同腔室，而因此定向于不同的抗原呈遞途徑。
通過以某種方式使抗原或抗原決定因子連接于免疫調(diào)節(jié)劑，有可能促進(jìn)抗原轉(zhuǎn)位越過胞漿膜進(jìn)入胞液。本發(fā)明者預(yù)料，這將使加載到MHC-I分子上的抗原肽量增加。因此，抗原-免疫調(diào)節(jié)劑的偶聯(lián)物可被用于特異性地促進(jìn)對細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)的激活。誘導(dǎo)CTL對于許多疾病的預(yù)防和治療是有益的，特別是對于由病毒，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌和寄生蟲引起的疾病。
還可以對抗原-免疫調(diào)節(jié)劑偶聯(lián)物的連接進(jìn)行選擇，致使抗原可被傳遞進(jìn)入細(xì)胞核。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，在此提供了一種偶聯(lián)物，它包含抗原或抗原決定因子以及選自如下作用劑的免疫調(diào)節(jié)劑(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的囊泡內(nèi)在化過程具有影響的作用劑。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，在此提供了一種用于針對感染性疾病的疫苗組合物，這種感染性疾病是由感染性病原體引起的，該疫苗組合物包含一種抗原或抗原決定因子與免疫調(diào)節(jié)劑的偶聯(lián)物，此免疫調(diào)節(jié)劑選自如下作用劑(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的囊泡內(nèi)在化過程具有影響的作用劑；其中所述的抗原或抗原決定因子是所述感染性病原體的抗原或抗原決定因子。
可通過多種方法，包括遺傳性連接或化學(xué)偶聯(lián)將抗原或抗原決定因子連接于免疫調(diào)節(jié)劑。在第一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，此偶聯(lián)物是通過將抗原或抗原決定因子遺傳性連接于免疫調(diào)節(jié)劑而構(gòu)成的融合蛋白。優(yōu)選地是將抗原或抗原決定因子遺傳性地連接于免疫調(diào)節(jié)劑的C-端。在第二個優(yōu)選的實(shí)施方案中，是將抗原或抗原決定因子化學(xué)偶聯(lián)于免疫調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地是應(yīng)用雙功能交聯(lián)劑，如異型雙功能交聯(lián)劑，將抗原或抗原決定因子偶聯(lián)于免疫調(diào)節(jié)劑。更優(yōu)選的交聯(lián)劑是N-γ(-馬來亞氨基-丁氧基)-琥珀酰亞胺酯(GMBS)或N-琥珀酰亞胺基-(3-吡啶基-二硫)-丙酸酯(SPDP)。此疫苗組合物可通過多種不同的途徑給藥，例如鼻內(nèi)給藥，口腔給藥，陰道內(nèi)給藥，尿道給藥或眼內(nèi)給藥。優(yōu)選的是鼻內(nèi)免疫接種。
根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供如下作用劑的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的囊泡內(nèi)在化過程具有影響的作用劑；用于一種與抗原或抗原決定因子的偶聯(lián)物中，以便將該抗原或抗原決定因子定向傳遞至抗原呈遞細(xì)胞的胞液或細(xì)胞核。
根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，在此提供了如下作用劑的用途
(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性，不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的囊泡內(nèi)在化過程具有影響的作用劑；用于一種與抗原或抗原決定因子的偶聯(lián)物中，通過MHC-I類分子上調(diào)該抗原決定因子或來自所述抗原的抗原決定因子的呈遞。
優(yōu)選地是將本發(fā)明第十二方面偶聯(lián)物的用途用于與本發(fā)明第五方面作用劑的用途協(xié)同，以激發(fā)強(qiáng)CTL應(yīng)答，并上調(diào)粘膜抗體的產(chǎn)生。這種活性對于預(yù)防和治療病毒性感染；例如流感，特別有效。EtxB是優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)制以前認(rèn)為EtxB和CtxB具有相似的特性。但是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，與rCtxB相比較，rEtxB是更強(qiáng)有力的和更有效的免疫調(diào)節(jié)劑。因此，優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是EtxB，或者是模擬EtxB作用的作用劑。EBVEBV是已知的八種人皰疹病毒中的一種。感染通常發(fā)生在幼年時代，但是，在此階段臨床癥狀通常微弱不能察覺。EBV的原發(fā)性感染后來在生命中與感染性單核細(xì)胞增多癥(IM)有關(guān)，在美國青年人中它是第二種最常見的疾病。EBV還具有致癌的潛力。EBV與地方性Burkitcic淋巴瘤(BL)和未分化的鼻咽癌(NPC)之間存在密切關(guān)系。發(fā)生在免疫受損病人的高比例淋巴瘤也是由EBV引起的，并已表明在某些Hodgkin氏淋巴瘤與EBV之間存在某種聯(lián)系。
潛伏性EBV-感染的細(xì)胞表達(dá)少量所謂的“潛伏性”蛋白。包括六種核蛋白(EBVAs 1，2，3A，3B，3C和-LP)，三種膜整合蛋白(LMP-1，2A和2B)，以及二種在RNA剪接中有作用的非-聚腺苷酸化病毒衍生的RNAs(EBERs)。
EBV潛伏性膜蛋白1(LMP-1)存在于感染細(xì)胞的質(zhì)膜中。它也在鼻咽癌(NPC)和EBV-陽性Hodgkin氏淋巴瘤(HD)中被表達(dá)，表明LMP-1在這些腫瘤形成過程中的作用。LMP-1基因可以改變未感染細(xì)胞的表型，引起細(xì)胞表面激活標(biāo)志的上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。LMP-1還能改變信號傳輸途徑，并具有抗細(xì)胞凋亡作用。在健康的攜帶者或腫瘤病人中尚未證實(shí)針對這種病毒抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答具有任何程度的必然性。
許多動物病毒都具有避免被宿主免疫系統(tǒng)察覺的進(jìn)化性機(jī)制。通常這些機(jī)制涉及干擾TAP-相關(guān)的肽轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。認(rèn)為EBV也具有避免免疫系統(tǒng)察覺的類似進(jìn)化性機(jī)制，因此使它能夠持久地存在于宿主體內(nèi)。這可解釋為什么某些細(xì)胞免疫應(yīng)答不能發(fā)現(xiàn)EBV潛在性蛋白EBVA1，并可解釋為什么顯然不存在這種能對抗LMP1的應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，在此提供了一種疫苗組合物，它含有a)如下作用劑中的一種(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；以及b)一種EBV抗原用于治療和/或預(yù)防EBV相關(guān)疾病。
特別是本發(fā)明第十三方面的這種疫苗組合物含有EtxB，CtxB或具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑。
根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，在此提供了一種治療性組合物，用于治療EBV-相關(guān)的疾病，此組合物含有(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3-結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
特別是本發(fā)明第十四方面的這種治療性組合物含有EtxB，CtxB或具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑。
由于已知EtxB共覆蓋有LMP1，并且EtxB可促進(jìn)LMP-1斷裂，因此推論EtxB(以及具有GM1結(jié)合活性的其它類似CtxB的作用劑)對于刺激抗EBV免疫應(yīng)答是有效的。這種活性可應(yīng)用于疫苗以便預(yù)防EBV相關(guān)的疾病，并可應(yīng)用于治療，只要疾病已發(fā)生就可治療這種疾病。
如果不希望受理論的約束，據(jù)認(rèn)為當(dāng)EtxB共覆蓋有LMP-1時，可通過不同的細(xì)胞內(nèi)途徑加工此抗原，這使抗原能夠繞過被病毒阻斷的正常加工途徑。因此在細(xì)胞表面可有效地呈遞該抗原。如果通過常規(guī)的途徑加工此抗原；EtxB的這種作用還可使被呈遞的抗原以不同的抗原表位呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。
可將本發(fā)明十三方面的疫苗用于預(yù)防EBV感染，或者對于EBV-感染的個體用于防止EBV相關(guān)疾病的發(fā)展。此疫苗還可包含單獨(dú)的佐劑，或者此作用劑(如EtxB或CtxB)本身恰好可起佐劑作用。
對于已經(jīng)形成EBV-相關(guān)疾病的對象，可單獨(dú)(即不含抗原)將本發(fā)明第十四方面指定的作用劑用于治療這種疾病。
用于本發(fā)明第十三和第十四方面的優(yōu)選作用劑是EtxB。
EBV抗原是可以從EBV本身獲得的抗原，或者是由EBV的作用引起被EBV-感染的宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的抗原。此抗原優(yōu)選地是EBV潛伏性膜蛋白。特別優(yōu)選的是抗原LMP-1，LMP-2A，LMP-2B和ENBA-1，以及它們的抗原片段?？蓮腅BV感染的細(xì)胞中分離出此抗原，或者通過合成或重組的方法制備。
本發(fā)明的第十三和第十四方面特別適合于治療和/或預(yù)防下列疾病感染性單核細(xì)胞增多癥，Burkitt氏淋巴瘤，鼻咽癌和Hodgkin氏淋巴瘤。據(jù)信本發(fā)明的這些方面特別適合于治療和/或預(yù)防鼻咽癌和Hodgkin氏淋巴瘤。
通過對哺乳動物對象給予免疫有效劑量，可將本發(fā)明第十三和第十四方面的疫苗或治療組合物用于防止或治療對象發(fā)生或發(fā)展EBV-相關(guān)的疾病。
這種哺乳動物對象可能是例如健康的EBV-感染的或未感染的個體，免疫缺損的個體，或患有EBV-相關(guān)疾病的個體。
可通過任何合適的途徑給予這種疫苗?？蓪⒋俗饔脛┖涂乖瓕Σ溉閯游飳ο蠊餐o藥，或者分開給藥。此作用劑和抗原可以是單獨(dú)的，或者被連接，例如共價(jià)地或遺傳性地被連接，形成有效的單一作用劑。GM1和Gb3-相關(guān)的信號傳輸如果不想受理論的約束，可認(rèn)為GM1或Gb3結(jié)合可直接或間接地觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳輸。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)證據(jù)，表明EtxB與至少另一種受體相互作用，這種受體與GM1相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號事件有關(guān)?？赡蹺txB(或CtxB)對GM1的結(jié)合有助于對一種蛋白質(zhì)的結(jié)合，這種蛋白質(zhì)可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號傳輸。不知道是什么特異性地觸發(fā)這種信號傳輸過程，可能是GM1或該蛋白質(zhì)的磷酸化作用。當(dāng)EtxB/CtxB將GM1結(jié)合在此細(xì)胞的表面時，結(jié)合的GM1在囊泡中被內(nèi)在化(Williams等(1999)今日免疫學(xué)2095-101)。已知GM1和其它糖脂類(如Gb3)被優(yōu)先定位于“膜筏”中，在其中還發(fā)現(xiàn)幾個關(guān)鍵性蛋白質(zhì)受體。因此如下情況是可能的由于B-亞單位的結(jié)合，GM1的內(nèi)在化作用引起這些蛋白質(zhì)的共覆蓋，導(dǎo)致它們被觸發(fā)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程。定義佐劑是一種可非特異性地增強(qiáng)對抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，不同于疫苗載體，佐劑的目的在于使抗原靶向所需的部位。在此名詞“免疫調(diào)節(jié)劑”被用于表示如佐劑一樣起作用的作用劑，用于激治某些免疫應(yīng)答，但是它還可使免疫應(yīng)答定向于特定的方向。
名詞“共給藥”被用于意指這樣給予抗原和免疫調(diào)節(jié)劑，以致可激發(fā)必要的免疫應(yīng)答。因此盡管可在同一時刻和相同的部位給予抗原和免疫調(diào)節(jié)劑，但是，在與給予免疫調(diào)節(jié)劑不同的時間和/或不同的部位給予抗原可能更有益。例如，第一步可將抗原和免疫調(diào)節(jié)劑在一起同時給藥，然后在第二步可通過只給予抗原來加強(qiáng)免疫應(yīng)答。
名詞“抗原決定因子”在此被用于意指抗原上可被抗體或T-細(xì)胞受體識別的位點(diǎn)。優(yōu)選地它是由蛋白質(zhì)抗原產(chǎn)生的，或者作為蛋白質(zhì)抗原一部分的短肽，但是還打算用此名詞包括糖肽和碳水化合物抗原決定因子。此名詞還包括可刺激識別整個有機(jī)體的應(yīng)答的氨基酸的修飾序列或碳水化合物。
有許多已知的方法可用于對某一給定的感染性病原體鑒別抗原決定因子。
例如，可通過在感染的或恢復(fù)期病人，在感染的或恢復(fù)期動物提高的免疫應(yīng)答，或者通過在體外監(jiān)測對含有抗原的制備物的免疫應(yīng)答來鑒別潛在的保護(hù)性抗原。例如，i)可針對感染性病原體的全細(xì)胞裂解物，或被該病原體感染細(xì)胞的裂解物，篩選來自感染的或恢復(fù)期病人的、或者感染的或恢復(fù)期動物的血清樣品，借助于標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測被此免疫血清識別的那些抗原；ii)可針對來自感染性病原體的部分或高度純化的抗原，或者被該病原體感染細(xì)胞的裂解物，篩選來自感染的或恢復(fù)期病人的、或者感染的或恢復(fù)期動物的血清樣品，借助于標(biāo)準(zhǔn)的ELISA技術(shù)其中將部分或高度純化的抗原用于包被微滴定板的孔池，或者借助于免疫印跡技術(shù)檢測被此免疫血清識別的那些抗原；iii)可針對從編碼一種或幾種所需抗原的重組表達(dá)系統(tǒng)獲得的全細(xì)胞裂解物，篩選來自感染的或恢復(fù)期病人的、或者感染的或恢復(fù)期動物的血清樣品，并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的ELASA技術(shù)或蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測那些被此免疫血清識別的抗原。
iv)可針對包含來自所需感染性病原體克隆基因的表達(dá)文庫，篩選來自感染的或恢復(fù)期病人的，或者感染的或恢復(fù)期動物的血清樣品，應(yīng)用菌落印跡免疫檢測技術(shù)鑒別表達(dá)抗原或其片段并被此免疫血清識別的那些克隆；或者v)可在有來源于感染性病原體，或被該病原體感染細(xì)胞的裂解物，或者編碼一種或幾種抗原的重組表達(dá)系統(tǒng)的部分或高度純化的抗原存在下，體外培養(yǎng)來自感染的或恢復(fù)期病人血液的PBLs，或者來自感染的或恢復(fù)期動物的PBL，淋巴結(jié)細(xì)胞，脾細(xì)胞，或固有膜細(xì)胞，以便檢測抗原特異性T-細(xì)胞增殖反應(yīng)。
另一種方式是，有可能檢測對病原體在體內(nèi)存活是必不可少的基因產(chǎn)物，例如通過以下技術(shù)由Holden建立的特征標(biāo)記的誘變技術(shù)，或由Mekalanos建立的IVET(體內(nèi)表達(dá)技術(shù))檢測在體內(nèi)被特異性誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物，或者由Falkow建立的差示熒光誘導(dǎo)法鑒定可能是保護(hù)性抗原的一些基因。應(yīng)用這些方法，可按上面描述的篩選基因產(chǎn)物?？蓪⒋嘶蚩寺∵M(jìn)入表達(dá)載體，并回收抗原用于同調(diào)節(jié)糖鞘脂類相關(guān)活性的作用劑一起摻入疫苗制劑中。
有許多已知的方法可用于對給定的感染性病原體分離抗原。
例如，通過應(yīng)用能夠回收抗原的方法，可以從感染性病原體中，或者從被此病原體感染的細(xì)胞中，提取含有一種或幾種潛在的保護(hù)性抗原的病原體表面成分。這可能包括應(yīng)用細(xì)胞破裂技術(shù)裂解細(xì)胞，例如超聲波處理和/或去污劑提取法。離心法，超濾法或沉淀法可被用于收集抗原制備物。在Richarde等，(1998)，傳染病雜志，177，1451-7中描述的含有HSV-1糖蛋白的抗原制劑可作為這種方法的例證。
還可通過多種方法提取感染性病原體的，或來自被該病原體感染細(xì)胞的抗原，這些方法包括但不局限于尿素提取，堿或酸提取，或者去污劑提取，然后使之經(jīng)受層析分離。可將在空隙或洗脫峰中回收的，含有一種或幾種潛在的保護(hù)性抗原的材料用于疫苗制劑中。
按另一種方法，可將編碼一種或幾種潛在的保護(hù)性抗原的基因克隆進(jìn)入適合于產(chǎn)生抗原的多種表達(dá)載體。這些載體可包括細(xì)菌或真核生物表達(dá)系統(tǒng)，例如大腸桿菌，芽孢桿菌屬種，弧菌屬種，釀酒酵母，哺乳動物和昆蟲細(xì)胞系?？山柚诔Ｒ?guī)的提取，分離和/或?qū)游霾襟E回收抗原。
在此使用的名詞“CtxB”，“EtxB”和“VtxB”包括此種分子的天然和重組的形式。特別優(yōu)選的是重組的形式。通過如下方法可產(chǎn)生此種分子的重組形式將編碼形成該蛋白質(zhì)的特異性多肽鏈(或幾種鏈)的一種或幾種基因插入適合的載體，然后用于轉(zhuǎn)染適合的宿主。例如，可將編碼一種多肽鏈，并由此多肽鏈可裝配EtxB的基因插入例如質(zhì)粒pMM68，然后用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞如弧菌sp.60。用本來已知的方法純化和分離出這種蛋白質(zhì)。借助于已知的方法可從野生型基因產(chǎn)生表達(dá)活性突變型CtxB，EtxB或VtxB蛋白的突變型基因。
名詞“CtxB”，“EtxB”和“VtxB”還包括突變型分子和其它一些合成的分子(含有CtxB，EtxB或VtxB部分的)，這些分子保持有結(jié)合GM1或Gb3的能力，或者模擬對GM1或Gb3結(jié)合作用的能力。
保持有GM1結(jié)合活性、不同于EtxB和CtxB的作用劑，以及保持有Gb3結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑包括結(jié)合GM1或Gb3的抗體。
為了產(chǎn)生這種抗體，可通過注射GM1或Gb3或者它們的任何一種衍生物或同源物，免疫包括山羊、兔、大白鼠等的多種宿主。取決于宿主的種類，可使用不同的佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這些佐劑包括，但不局限于，福氏佐劑，礦物凝膠如氫氧化鋁，以及表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔血蘭蛋白和二硝基苯酚。BCE(卡介苗)和短小棒狀桿菌是可能用于人的佐劑。
人單克隆抗體對本發(fā)明可能是優(yōu)選的?？蓱?yīng)用任何一種提供通過在培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)制備單克隆抗體。這些技術(shù)包括，但不局限于，最初由Koehler和Milsteim(1975，自然256495-497)描述的雜交瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosber等(1983)今日免疫學(xué)472；Cote等UP83)國家科學(xué)院學(xué)報(bào)802026-2030)，以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985)，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R Liss公司PP77-96)。此外，還可以應(yīng)用為產(chǎn)生“嵌合抗體”，將小鼠抗體基因拼接于人抗體基因而獲得具有適當(dāng)抗原特異性和生物活性分子建立的技術(shù)(Morrison等(1984)國家科學(xué)院學(xué)報(bào)816551-6855；Neuberger等(1984)自然312604-608；Jakeda等(1985)自然314452-454)。按另一種方式，也可以使為了產(chǎn)生單鏈抗體所描述的技術(shù)(美國專利NO4.946.779)。改造后用來產(chǎn)生特異性單鏈抗體的靶標(biāo)相互作用成分。
如在Orlandi等(1989，國家科學(xué)院學(xué)報(bào)863833-3877)，以及Winter G和Milstein C(1991，自然349293-299)中所公開的，還可通過體內(nèi)誘導(dǎo)在淋巴細(xì)胞群內(nèi)產(chǎn)生，或者通過篩選重組免疫球蛋白文庫或一批高度特異性的結(jié)合劑來制備抗體。
還可產(chǎn)生包含對GM1或Gb3特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，這種片段包括，但不局限于，可以通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段，以及可以通過還原F(ab’)2片段的二硫橋而產(chǎn)生的Fab片段。另外，還可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫，以便能夠快速和簡便地鑒別具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huse WD等(1989)科學(xué)2561275-1281)。
可通過合成化學(xué)制備肽文庫或有機(jī)物文庫，然后篩選它們結(jié)合GM1/Gb3的能力?？梢越柚趯Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員視為常規(guī)的多種方法對合成的化合物，天然產(chǎn)物，以及其它來源的潛在性生物活性物質(zhì)進(jìn)行篩選。
GM1或Gb3，或者它們的片段可以被用于通過多種篩選技術(shù)中的任何一種篩選肽或其它分子。這種分子可游離在溶液中，固定于固體支持物，安裝在細(xì)胞表面，或者安置在細(xì)胞內(nèi)?？蓽y定活性的消失或者GM1或Gb3與待測作用劑之間結(jié)合復(fù)合物的形成。
測定對GM1/Gb3結(jié)合的另一種方法是通過將純化的GM1/Gb3用于包被微量滴定板。封閉之后，將待測定的作用劑施加于此滴定板，待其相互作用之后洗滴定板，并以對該抗原特異性的抗體進(jìn)行檢測。隨后應(yīng)用基于比色或放射活性的方法(分別為ELISA或RIA)，以抗體對酶或放射性標(biāo)記直接或間接的偶聯(lián)物可對結(jié)合進(jìn)行定量測定。
測定對GM1/Gb3結(jié)合的另一種方法是通過使GM1/Gb3的糖部分結(jié)合于適當(dāng)?shù)膶游鲋|(zhì)，以便能夠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的親和層析。施加于此層析柱的已知化合物從稀釋液中被除去可被用作結(jié)合活性的證據(jù)，或者按另一種方式，當(dāng)以混合的化合物施加于此層析柱，洗脫和隨后的分析將能確定此神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合劑的特性。在蛋白質(zhì)的情況下，分析過程應(yīng)包括肽測序和繪制胰消化圖，隨后同已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。在被洗脫的蛋白質(zhì)不能以此方法鑒定的情況下，那么可以通過標(biāo)準(zhǔn)的生化分析法，例如通過激先吸收質(zhì)譜分析法進(jìn)行質(zhì)量測定，用于對此化合物作進(jìn)一步鑒定。借助于HPLC和對單一同源峰的質(zhì)譜分析，可分析從GM1-親和柱中洗脫的非蛋白質(zhì)。
測定對GM1/Gb3結(jié)合能力和精確相互作用親和性的另一種方法是通過應(yīng)用如以前所報(bào)導(dǎo)的胞質(zhì)表面共振作用(Kugiemko等(1996)生物化學(xué)356375-6384)。
另外，可以將噬菌體顯示法用于鑒別結(jié)合GM1或Gb3的待測作用劑。
噬菌體顯示法是一種利用重組噬菌體的分子篩選方案。此技術(shù)包括用一種基因轉(zhuǎn)化噬菌體，此基因可編碼能夠與GM1/Gb3(或者它們的衍生物或同源物)反應(yīng)的適合配體(在此情況下是一種待測作用劑)，或者以編碼相同配體的核苷酸序列(或者它的衍生物或同源物)轉(zhuǎn)化噬菌體。此轉(zhuǎn)化的噬菌體(優(yōu)選地是使它附著于固體支持物)可表達(dá)此適合的配體(例如此待測作用劑)，并將它顯示在噬菌體的外殼上。分離出含有可識別此待測作用劑的靶標(biāo)分子的實(shí)體(如細(xì)胞)，并使之?dāng)U增。然后對此成功的待測作用劑進(jìn)行鑒定。噬菌體顯示法優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的親和配體篩選技術(shù)。此噬菌體表面以三維構(gòu)型顯示出待測的作用劑，更精確地類似于它的天然存在的構(gòu)象。這便于為篩選目的提供更特異性、更高親和性的結(jié)合。
用于篩選的另一種技術(shù)，可提供對GM1或Gb3具有適當(dāng)結(jié)合親和性的作用劑的高通量篩選，它是基于在WO 84/0356中詳述的方法。概括地說，先在一種固體基質(zhì)上如塑料細(xì)桿或其它某種表面上合成大量不同的小肽待測化合物。使此肽待測作用劑與靶標(biāo)相互作用成分的片段起反應(yīng)并漂洗。然后檢測被結(jié)合的靶標(biāo)相互作用成分，例如借助于本領(lǐng)域熟知的適當(dāng)方法。還可以將純化的靶標(biāo)相互作用成分直接包被在微量滴管板上，用于上述的藥物篩選技術(shù)。另外，也可用非中和性抗體捕捉這種肽，并把它固定化在一種固體支持物上。
在本發(fā)明的所有方面中，具有GM1-結(jié)合活性或Gb3結(jié)合活性的作用劑還能夠交聯(lián)GM1/Gb3受體。EtxB就是一種這樣的作用劑，它能夠借助于其五聚體形式交聯(lián)GM1受體。
有多種方法可用于鑒定這樣一種作用劑，它對由GM1/Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響，但它本身不結(jié)合GM1或Gb3。例如，如果顯示出一種作用劑可上調(diào)B細(xì)胞上的CD25或MHC 11類，或者上調(diào)CD25或促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡，或者上調(diào)單核細(xì)胞分泌IL-10，但是顯示出這種作用劑不結(jié)合GM1或Gb3(例如借助于上述的一種結(jié)合測定法)，那末可以得出結(jié)論，此作用劑能夠模擬GM1/Gb3結(jié)合作用。
現(xiàn)在將參照附圖和下面的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。
這些實(shí)施例參考如下附圖

圖1顯示在以HSV-1糖蛋白/rEtxB免疫接種的小鼠，對血清(MS)中總Ig和IgA以及眼洗出物中IgA的刺激作用。
圖2顯示在以HSV-1/rEtxB免疫接種的小鼠，MLN(腸系膜淋巴結(jié))或CLN(頸淋巴結(jié))淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞增殖作用。
圖3顯示小鼠以HSV-1即在1-20μg EtxB存在時作鼻內(nèi)免疫接種，來自此小鼠MLN和CLN細(xì)胞的T細(xì)胞增殖作用。
圖4顯示以不同量rEtxB或rCtxB作佐劑對小鼠以10天的間隔給予三次HSV-1糖蛋白之后抗-HSV-1血清Ig的水平。
圖5顯示在以HSV-1/rEtxB免疫接種的小鼠，其病毒流出，臨床病癥和潛伏期的減輕。
圖6顯示在以HSV-1感染之后，或者在有EtxB或CtxB作免疫調(diào)節(jié)劑時以HSV-1 Gp免疫接種之后MS中Ig同種型的分布。
圖7顯示在以rEtxB或rCtxB作免疫調(diào)節(jié)劑鼻內(nèi)給予HVS-1Gp之后Ig亞類的分布。
圖8顯示在給予HSV-1糖蛋白之后，不同劑量rEtxB或rCtxB的致免疫作用和對眼洗出物中HSV-1特異性IgA水平的影響。
圖9顯示以HSV-1或假糖蛋白(gp)單獨(dú)，或者存在佐劑時對小鼠給藥之后，血清的免疫球蛋白應(yīng)答。
圖10顯示以HSV-1或假糖蛋白單獨(dú)或者存在佐劑時對小鼠鼻內(nèi)免疫接種之后，眼洗出物中的粘膜IgA。
圖11顯示以HSV-1或假糖蛋白(gp)單獨(dú)或者存在佐劑時對小鼠鼻內(nèi)免疫接種之后，陰道洗出物中的粘膜IgA。
圖12顯示以存在不同劑量rEtxB作佐劑的HSV-1糖蛋白免疫接種的小鼠，其血清中HSV-1特異性免疫球蛋白的水平。
圖13顯示以存在不同濃度rEtxB的HSV-1糖蛋白免疫接種的小鼠，其眼洗出物中IgA的水平。
圖14顯示以存在不同濃度rEtxB的HSV-1糖蛋白免疫接種的小鼠，其陰道洗出物中IgA的水平。
圖15顯示在以Ctx/CtxB或rEtxB鼻內(nèi)免疫接種，或者以HSV-1眼內(nèi)感染之后，血清抗體對HSV-1應(yīng)答的IgG亞類分布。
圖16顯示通過眼劃痕以HSV-1感染的、或者通過鼻內(nèi)給予HSV-1免疫接種的小鼠，在取自這些小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
圖17顯示存在rEtxB作免疫調(diào)節(jié)劑時以HSV-1混合物或假糖蛋白鼻內(nèi)免疫接種的小鼠抗眼HSV-1感染的保護(hù)作用水平。
實(shí)施例1可以將rEtxB同HSV-1 Gp一起用于免疫接種。
以含有10μg或20μg rEtxB的10μg HSV-1糖蛋白(Gp)鼻內(nèi)免疫接種小鼠3次。對照小鼠未作處理，或者給予從HIV-未感染組織培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的假病毒糖蛋白制備物(mock)?？贵w水平被表示為感染后水平的百分?jǐn)?shù)。HSV-1糖蛋白/rEtxB刺激了血清中總Ig和IgA，以及眼洗出物中IgA的產(chǎn)生(圖1)。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，低至0.1μg的rEtxB劑量也可有效地刺激這種應(yīng)答。
來自免疫接種小鼠頸淋巴結(jié)(它靠近疫苗接種部位)和腸系膜淋巴結(jié)(它遠(yuǎn)離疫苗接種部位)的T-淋巴細(xì)胞，當(dāng)在體外與HSV-1共培養(yǎng)時顯示出增殖作用，但是當(dāng)在體外與假HSV-1 Gp共培養(yǎng)或沒有抗原時不顯示出增殖作用(圖2)。
來自以HSV-1 Gp和不同劑量EtxB免疫接種小鼠的MLN和CLN的T-淋巴細(xì)胞應(yīng)答于HSV-1 Gp的增殖作用被顯示在圖3中。
對小鼠以三天的間隔，連同不同劑量的EtxB(或CtxB)一起給予HSV-1糖蛋白之后，抗-HSV-1血清Ig的產(chǎn)生被顯示在圖4中。
最后，以HSV-1和rEtxB免疫的小鼠，在以HSV-1角膜劃痕感染之后顯示出病毒流出減少了(圖5a)，并且顯示出與比照相比局部擴(kuò)散(水腫和眼瞼病)，對三叉神經(jīng)節(jié)的擴(kuò)散(帶狀皰疹形感染)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的擴(kuò)散(腦炎)和潛伏期都減少了(圖5b)。實(shí)施例2rCtxB和rEtxB起免疫調(diào)節(jié)劑作用當(dāng)以EtxB用作免疫調(diào)節(jié)劑，Ig同種型的分布發(fā)生偏移(圖6)。取決于是rCtxB還是rEtxB被用作免疫調(diào)節(jié)劑，Ig亞類的分布有差別(圖7)。實(shí)施例3與rCtxB相比較rEtxB是更有效的免疫調(diào)節(jié)劑。
用rEtxB/HSV-1 Gp比用rCtxB/HSV-1 Gp刺激之后HSV-特異性IgA的水平更高(圖8)。
權(quán)利要求
1.以如下作用劑作為免疫調(diào)節(jié)劑用于抗感染性疾病疫苗的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程有影響的作用劑。
2.權(quán)利要求1的用途，其中的免疫調(diào)節(jié)劑是無全毒素的EtxB。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是其感染性病原體是皰疹病毒家族一個成員的疾病。
4.權(quán)利要求3的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自HSV-1，HSV-2，EBV，VZV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8。
5.權(quán)利要求4的用途，其中的感染性病原體是選自HSV-1，HSV-2，CMV或EBV。
6.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是流感病毒。
7.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是付流感病毒。
8.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是呼吸合胞體病毒。
9.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是肝炎病毒。
10.權(quán)利要求9的用途，其中的感染性病原體是選自甲型，乙型，丙型和丁型肝炎病毒。
11.權(quán)利要求10的用途，其中的感染性病原體是甲型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
12.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是腦膜炎。
13.權(quán)利要求12的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自腦膜炎奈瑟氏菌，B型流感嗜血桿菌，和肺炎鏈球菌。
14.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是肺炎或呼吸道感染。
15.權(quán)利要求14的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自肺炎鏈球菌，嗜肺軍團(tuán)菌，和結(jié)核分支桿菌。
16.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是性傳播疾病。
17.權(quán)利要求16的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自淋病奈瑟氏菌，HIV-1，HIV-2和沙眼衣原體。
18.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是胃腸道疾病。
19.權(quán)利要求18的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自致腸病的，產(chǎn)腸毒素的，腸侵入性的、致腸出血性的和腸聚生性大腸桿菌，輪狀病毒，腸炎沙門氏菌，傷寒沙門氏菌，幽門螺桿菌，蠟狀芽孢桿菌，空腸彎曲桿菌和霍亂弧菌。
20.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是表面感染。
21.權(quán)利要求20的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自金黃色葡萄球菌，化膿鏈球菌和變異鏈球菌。
22.權(quán)利要求1或2的用途，其中的感染性疾病是寄生蟲疾病。
23.權(quán)利要求22的用途，其中的感染性疾病是由感染性病原體引起的，并且此感染性病原體是選自瘧原蟲，錐體蟲屬種，岡氏弓形蟲，杜氏利什曼原蟲和盤尾絲蟲屬種。
24.一種用于針對感染性疾病的疫苗組合物，該感染性疾病是由感染性病原體引起的，其中該疫苗組合物包含一種抗原決定因子和一種選自如下的免疫調(diào)節(jié)劑(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；其中該抗原決定因子是所述感染性病原體的抗原決定因子。
25.權(quán)利要求24的疫苗組合物，其中的感染性疾病是HSV-1感染，并且其中的抗原決定因子是HSV-1的抗原決定因子。
26.權(quán)利要求24或25的疫苗組合物，其中的免疫調(diào)節(jié)劑是無全毒素的EtxB。
27.權(quán)利要求24，25或26的疫苗組合物，其中免疫調(diào)節(jié)劑和抗原決定因子是分開的二部分。
28.權(quán)利要求24、25或26的疫苗組合物，其中的免疫調(diào)節(jié)劑和抗原決定因子是被雙功能交聯(lián)劑連接在一起。
29.一種用于哺乳動物對象針對感染性疾病疫苗接種的試劑盒，該試劑盒包含a)如下作用劑中的一種(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；和b)一種抗原決定因子，它是此感染性疾病的抗原決定因子，用于與所述的疫苗免疫調(diào)節(jié)劑一起共同給藥。
30.一種對宿主預(yù)防或治療疾病的方法，該方法包括以一種包含至少一種抗原決定因子和一種免疫調(diào)節(jié)的疫苗接種該宿主的步驟，在此該免疫調(diào)節(jié)劑是(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
31.如下作用劑上調(diào)在粘膜表面抗體產(chǎn)生的用途；(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
32.如下作用劑在疫苗內(nèi)作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途，以便延長抗原呈遞并給哺乳動物對象保持免疫記憶的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性，不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑。
33.一種用于針對感染性疾病的疫苗組合物，該感染性疾病是由感染性病原體引起的，該疫苗包含一種抗原決定因子和一種選自如下的免疫調(diào)節(jié)劑(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳輸過程具有影響的作用劑；其中所述的抗原決定因子是該感染性病原體的抗原決定因子，并且其中的免疫調(diào)節(jié)劑可延長抗原決定因子呈遞，并給予持久的免疫記憶。
34.如下作用劑在一種與抗原或抗原決定因子的偶聯(lián)物中，定向傳遞該抗原或抗原決定因子至抗原呈遞細(xì)胞的胞液或細(xì)胞核的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的囊泡內(nèi)在化過程具有影響的作用劑。
35.如下作用劑在一種與抗原或抗原決定因子的偶聯(lián)物中，通過MHC I類分子上調(diào)該抗原決定因子或來自所述抗原的抗原決定因子的呈遞的用途(i)無全毒素的EtxB，CtxB或VtxB；(ii)具有GM1-結(jié)合活性、不同于EtxB或CtxB的作用劑，或者是具有Gb3-結(jié)合活性、不同于VexB的作用劑；或(iii)對于由GM1-結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的囊泡內(nèi)在化過程具有影響的作用劑。
36.一種疫苗組合物，它包含a)EtxB，CtxB或者是具有GM1-結(jié)合活性的，不同于EtxB或CtxB的作用劑；以及b)EBV抗原，用于治療和/或預(yù)防EBV相關(guān)的疾病。
37.一種治療組合物，它包含EtxB，CtxB，或者是具有GM1-結(jié)合活性的，不同于EtxB或CtxB的作用劑，用于治療EBV-相關(guān)的疾病。
全文摘要
在此公開了如下作用劑作為免疫調(diào)節(jié)劑用于抗感染性疾病疫苗的用途:(ⅰ)無全毒素的EtxB,CtxB或VtxB;(ⅱ)具有GM1－結(jié)合活性、不同于EtxB或GxB的作用劑,或者是具有Gb3－結(jié)合活性、不同于VtxB的作用劑;或(ⅲ)對于由GM－結(jié)合或Gb3結(jié)合介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號事件具有影響的作用劑。
文檔編號A61K39/385GK1308546SQ9980840
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者T·R·希爾斯特, N·A·威廉斯, A·莫爾甘, A·D·威爾遜, L·A·比爾德 申請人:布里斯托爾大學(xué)