專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽－聚合物綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽-聚合物綴合物，其中所述聚合物是與多肽表面偶聯(lián)的接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的綴合物的工業(yè)組合物和產(chǎn)品，將本發(fā)明的多肽-聚合物綴合物用于減弱工業(yè)組合物和產(chǎn)品的變應(yīng)原性的用途，和涉及一種減弱多肽的變應(yīng)原性的方法。
一種技術(shù)是偶聯(lián)技術(shù)，其中將許多聚合物分子偶聯(lián)到目標(biāo)多肽上。當(dāng)使用該技術(shù)時(shí)，免疫系統(tǒng)難以識(shí)別負(fù)責(zé)形成抗體的表位(在多肽表面上)，從而減弱免疫反應(yīng)。
對(duì)于已被直接引入人體的循環(huán)系統(tǒng)以提供特定的生理效應(yīng)(即藥物制劑)的多肽，典型的潛在免疫反應(yīng)是IgG和/或IgM反應(yīng)，而從呼吸系統(tǒng)吸入的多肽(即，工業(yè)多肽)可能引起IgE反應(yīng)(即，變態(tài)反應(yīng))。
解釋免疫反應(yīng)減弱的一種理論是聚合物分子屏蔽了在多肽表面上的表位，其中多肽負(fù)責(zé)引起抗體形成的免疫反應(yīng)。另一種理論或至少部分因素是所述綴合物越大，得到的免疫反應(yīng)越強(qiáng)。
通常用于與多肽偶聯(lián)以形成綴合物的聚合物是均聚物，即由一種重復(fù)單元組成，例如氧化乙烯(EO)，尤其是聚乙二醇(PEG)，或氧化丙烯(PO)，尤其是聚丙二醇(PPG)。還可使用糖類(lèi)，例如糊精。
美國(guó)專(zhuān)利4,179,337涉及非免疫原性多肽，例如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶聯(lián)的酶和肽激素。
WO96/17929(Novo Nordisk A/S)涉及與聚合物分子、尤其與聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)的修飾多肽綴合物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與親代酶相比，甚至與相應(yīng)的已與PEG或其它均聚物偶聯(lián)的綴合物相比，當(dāng)使接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物與用于工業(yè)應(yīng)用時(shí)的親代多肽共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，呼吸變應(yīng)原性減弱，其中所述聚合物由以下通式表征EOxPOy(Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
第二方面，本發(fā)明涉及在工業(yè)產(chǎn)品中所用的含有本發(fā)明綴合物的組合物。
第三方面，本發(fā)明涉及一種減弱多肽的變應(yīng)原性的方法。工業(yè)多肽用于工業(yè)用途的多肽通常具有酶活性和/或抗微生物活性。工業(yè)多肽(與藥物多肽相比)不意在被引入人體的循環(huán)系統(tǒng)中。
所以，工業(yè)組合物和/或產(chǎn)品(如下定義)，例如洗滌劑，如洗衣和洗碟劑、食物或飼料添加劑，包括用于生產(chǎn)面包的添加劑，用于處理織物的組合物，和個(gè)人護(hù)理用品，包括化妝品，這些產(chǎn)品中用作活性組分的工業(yè)多肽(例如酶)不太可能與人體或動(dòng)物體的循環(huán)系統(tǒng)直接接觸，這是由于這些多肽(或含有這些多肽的產(chǎn)品)不直接注射(或以類(lèi)似方式)入血液中。
因此，在工業(yè)多肽的情況下，潛在的危險(xiǎn)是由于經(jīng)呼吸道吸入多肽所導(dǎo)致的呼吸變態(tài)反應(yīng)癥(即IgE反應(yīng))。
在本發(fā)明上下文中，“工業(yè)多肽”定義為這樣的多肽，包括不旨在引入人體和/或動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)中的肽、蛋白質(zhì)和/或酶，。
這種多肽的例子包括具有如下定義的酶活性的多肽。
本發(fā)明也涉及具有減弱的變應(yīng)原性的工業(yè)組合物和產(chǎn)物。
另外，本發(fā)明涉及將本發(fā)明的多肽-聚合物綴合物用于減弱工業(yè)組合物和產(chǎn)品的呼吸變應(yīng)原性的用途。
最后本發(fā)明涉及通過(guò)將一種或多種接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物與未修飾的親代多肽偶聯(lián)來(lái)減弱多肽(特別是酶)的變應(yīng)原性的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種多肽-聚合物綴合物，它適于工業(yè)用途且作為活性組分引入工業(yè)產(chǎn)品中。本發(fā)明的綴合物具有減弱的呼吸變應(yīng)原性。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“多肽-聚合物綴合物”指在其上共價(jià)偶聯(lián)有一種或多種聚合物的多肽。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“減弱的變應(yīng)原性”指，與相應(yīng)的親代多肽相比，在吸入本發(fā)明的修飾多肽時(shí)所產(chǎn)生的能導(dǎo)致變應(yīng)性狀態(tài)的IgE(在人體內(nèi)，而在特定動(dòng)物中為具有相當(dāng)作用的分子)的量降低?？山粨Q使用術(shù)語(yǔ)“呼吸變應(yīng)原性”。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的未修飾的親代多肽相比，甚至與相應(yīng)的綴合物(其中相應(yīng)數(shù)量的均聚物(如PEG)已與相應(yīng)的親代多肽偶聯(lián))相比，當(dāng)未修飾的親代多肽與接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物偶聯(lián)時(shí)，由吸入多肽引起的潛在變應(yīng)原性反應(yīng)減弱。
眾所周知，聚合物可主要(但不僅)根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)、溶劑(此處為水)、溫度和濃度(S.Forster和M.Antonietti,Adv.Mater,1998,10，第3期，195-217頁(yè))來(lái)采取不同的構(gòu)象/形態(tài)。這些構(gòu)象/形態(tài)包括各種形狀的膠束、薄片、規(guī)則的柱形或雙連續(xù)結(jié)構(gòu)。共聚物在水性介質(zhì)中的分子構(gòu)象，例如溶劑化的無(wú)規(guī)線團(tuán)、伸直的線團(tuán)、棒狀聚合物、超級(jí)線團(tuán)和膠囊是熟知的(水溶性聚合物，M.J.Comstock編輯，ACS Symposium Series,1991)。
因此，在不限于任何理論的情況下，認(rèn)為連接于多肽表面上的接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物在水中采取如親水性較強(qiáng)的均聚物那樣更好地屏蔽所述表面的構(gòu)象。由超分子結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致的協(xié)同效應(yīng)也可降低多肽表面的可接近性。另外，親油性更強(qiáng)的共聚物(與PEG均聚物相比)對(duì)抗體較強(qiáng)的排斥作用也可能起作用。
另外，接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物的剛性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)(與均聚物相比)可導(dǎo)致抗體更難“找到”(從剛性較強(qiáng)的聚合物和采取的構(gòu)象)到達(dá)多肽表面上表位的“路徑”，其中所述多肽表面負(fù)責(zé)導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的IgE的形成。
也認(rèn)為聚合物的疏水性對(duì)多肽-聚合物綴合物的潛在變應(yīng)原性有影響。所以，聚合物的疏水性越強(qiáng)，該聚合物越好地屏蔽多肽。
通過(guò)適當(dāng)選擇聚合物和分子結(jié)構(gòu)，可獲得用于屏蔽多肽表面上的表位的最佳覆蓋度。另外，通過(guò)調(diào)節(jié)所附著的聚合物的性能，可獲得不同配方(例如在脂肪或乳脂中)的最佳性能。
第一方面，本發(fā)明涉及一種多肽-聚合物綴合物，其中一種或多種聚合物已與親代多肽共價(jià)偶聯(lián)，其中所述聚合物由以下通式表征EOxPOy(Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％?！癊O”指氧化乙烯，“PO”指氧化丙烯。所述聚合物的分子量一般在100-100,000Da的范圍內(nèi)，優(yōu)選100-50,000Da，尤其是100-10,000Da。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚合物含有氧化乙烯單元(EO)和氧化丙烯單元(PO)，其比例在10∶90或20∶80或30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20或90∶10的范圍內(nèi)。變應(yīng)原性的評(píng)價(jià)可在吸入試驗(yàn)的基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)變應(yīng)原性，比較氣管內(nèi)(在氣管內(nèi))施用親代多肽和根據(jù)本發(fā)明的相應(yīng)修飾多肽的效果。
現(xiàn)有多種用于評(píng)價(jià)多肽變應(yīng)原性的體內(nèi)動(dòng)物模型。這些模型中的一些可提供用于人類(lèi)危害評(píng)價(jià)的適當(dāng)基礎(chǔ)。合適的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。這些模型試圖根據(jù)在前述致敏動(dòng)物中引發(fā)的反應(yīng)鑒定呼吸變應(yīng)原。根據(jù)上述模型將推定的變應(yīng)原通過(guò)氣管內(nèi)方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。
合適的豚鼠品系-Dunkin Hartley品系-不是像人那樣在變態(tài)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生IgE抗體。不過(guò)，它們能產(chǎn)生另一種類(lèi)型的抗體IgG1A和IgG1B(例如，參見(jiàn)Prentφ,ATLA,19,p.8-14,1991)，上述抗體負(fù)責(zé)針對(duì)包括酶在內(nèi)的吸入多肽的變態(tài)反應(yīng)。因此，當(dāng)使用Dunkin Hartley動(dòng)物模型時(shí)，IgG1A和IgG1B的相對(duì)量是衡量變應(yīng)原性水平的尺度。
適于氣管內(nèi)接觸多肽、例如酶的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway品系在變態(tài)反應(yīng)中可產(chǎn)生IgE。
關(guān)于評(píng)價(jià)豚鼠和小鼠的呼吸變應(yīng)原性的更多細(xì)節(jié)如Kimber等(1996)，基礎(chǔ)和應(yīng)用毒理學(xué)，33,1-10頁(yè)所述。
還可將諸如兔的其它動(dòng)物用于類(lèi)似的研究。聚合物分子與多肽偶聯(lián)的聚合物是具有以下通式的接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物EOxPOy(Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
所述聚合物優(yōu)選由通式(Ⅰ)表征，其中x=10-90％,y=10-90％,且x+y=100％。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物由氧化乙烯單元(EO)和氧化丙烯單元(PO)組成，(EO單元∶PO單元)比例為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20和90∶10。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚合物的分子量在100-100,000Da的范圍內(nèi)，特別是100-50,000Da，尤其是100-10,000Da。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合物的分子量為100-12,000Da，更優(yōu)選300-3,000Da。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合物是二嵌段、三嵌段、多嵌段聚合物。通式(Ⅰ)應(yīng)該理解為包括聚合物，其中EO單元和PO單元獨(dú)立安置。
可用于與多肽表面偶聯(lián)的特定嵌段聚合物的例子是聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)；聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)單丁基醚；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)單丁基醚；聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)單甲基醚；聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)單甲基醚。
優(yōu)選的嵌段聚合物是具有通式H(-OCH2CH2-)x[-OCH(CH3)CH2-]y(-OCH2CH2-)zOH的聚合物，其平均分子量(Mn)為1100，乙二醇含量為10重量％,Mn=1900和50重量％,Mn=2000和10重量％,Mn=2800和10重量％,Mn=2800和15重量％,Mn=2900和40重量％,Mn=4400和30重量％,Mn=5800和30重量％,Mn=8400和80重量％。
其它優(yōu)選的嵌段聚合物是具有通式H(-OCH(CH3)CH2-)x[-OCH2CH2-]y(-OCH(CH3)CH2-)zOH的聚合物，其平均分子量(Mn)為2000，乙二醇含量為50重量％,Mn=2700和40重量％,Mn=3300和10重量％。
特定的嵌段聚合物的例子是購(gòu)自BASF(德國(guó))的p7120:Pluronics，購(gòu)自Union Carbide(美國(guó))的Tergitol，購(gòu)自Fluka(瑞典)的Synperonic。
可用于與多肽表面偶聯(lián)的特定共聚物的例子是聚(乙二醇-共聚-丙二醇)，尤其是平均分子量Mn為2500、乙二醇含量為75重量％和平均分子量Mn為12000、乙二醇含量為75重量％的聚(乙二醇-共聚-丙二醇)；聚(乙二醇-共聚-丙二醇)單丁基醚，尤其是Mn為970、乙二醇含量為50重量％和Mn為1700、乙二醇含量為50重量％和Mn為3900、乙二醇含量為50重量％的聚(乙二醇-共聚-丙二醇)單丁基醚；聚(乙二醇-共聚-丙二醇)單甲基醚。
優(yōu)選的聚合物是由例如PEG和PPG共聚物組成的無(wú)毒聚合物。這樣的聚合物是優(yōu)選的，它與酶表面上的附著基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)的化學(xué)條件較簡(jiǎn)單。
接枝、嵌段、交替或無(wú)規(guī)共聚物可以是星形或支化的。合適的聚合物的制備附著于親代多肽表面上的聚合物可用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。另外，各種聚合物可購(gòu)自例如BASF(德國(guó))、Union Carbide(美國(guó))和Aldrich等公司。聚合物的激活如果與所述多肽綴合的聚合物無(wú)活性，那么必須通過(guò)采用合適的技術(shù)來(lái)激活聚合物。根據(jù)本發(fā)明也考慮通過(guò)連接體將嵌段或共聚物偶聯(lián)到多肽上。合適的連接體是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。
激活聚合物分子和綴合多肽的方法和化學(xué)在文獻(xiàn)中作過(guò)充分描述。
常用于激活不可溶的聚合物的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、雙環(huán)氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亞胺、磺酰鹵、三氯三嗪等激活官能團(tuán)(參見(jiàn)R.F.Taylor,(1991)，“蛋白質(zhì)固定化。功能及應(yīng)用”，Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong(1992)，“蛋白質(zhì)綴合和交聯(lián)化學(xué)”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等(1993)，“固定化親和配體技術(shù)”，學(xué)術(shù)出版社，N.Y.)。上述一些方法涉及激活不溶性聚合物，但也可應(yīng)用于激活可溶性聚合物，例如，高碘酸、三氯三嗪、磺酰鹵、二乙烯基砜、碳化二亞胺等。官能團(tuán)是所述聚合物上的氨基、羥基、硫羥基、羧基、醛或巰基，在選擇激活和綴合化學(xué)時(shí)，必須考慮選擇所述蛋白上的結(jié)合基團(tuán)，其中激活和綴合化學(xué)通常包括ⅰ)聚合物的激活，ⅱ)綴合，和ⅲ)封閉剩余的活性基團(tuán)。
下面將簡(jiǎn)短地描述多種合適的聚合物激活方法。但是，應(yīng)該理解的是也可使用其它方法。
聚合物分子與多肽的自由酸基團(tuán)的偶聯(lián)可在二酰亞胺的幫助下進(jìn)行，例如氨基-PEG或聯(lián)氨基-PEG(Pollak等，(1976)，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，98,289-291)或二偶氮乙酸鹽或酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白質(zhì)綴合和交聯(lián)化學(xué)”，CRC出版社)。
聚合物分子對(duì)羥基的偶聯(lián)一般很難，因?yàn)楸仨氃谒羞M(jìn)行。通常，水解比與羥基的反應(yīng)更占優(yōu)勢(shì)。
聚合物分子對(duì)自由巰基的偶聯(lián)可通過(guò)特定的基團(tuán)如馬來(lái)酰亞胺或鄰吡啶基二硫化物來(lái)達(dá)到。乙烯基砜(美國(guó)專(zhuān)利5,414,135,(1995),Snow等)也是優(yōu)選的巰基，但不如其它提及的基團(tuán)的選擇性高。
多肽鏈中的可接近的精氨酸殘基可被含有兩個(gè)臨近的羰基的基團(tuán)所靶定。
也可以使用通過(guò)親電子方法將激活的PEG與賴(lài)氨酸上的氨基連接在一起的方法。醇的很多常見(jiàn)的離去基團(tuán)可以產(chǎn)生胺鍵。例如，可以使用諸如tresylates的烷基磺酸鹽(Nilsson等(1984)，酶學(xué)方法，第104卷，Jacoby,W.B.著，學(xué)術(shù)出版社Orlando,p.56-66；Nilsson等(1987)，酶學(xué)方法，第135卷；Mosbach,K.，著；學(xué)術(shù)出版社Orlando,p.65-79；Scouten等(1987)，酶學(xué)方法，第135卷，Mosbach,K.，著，學(xué)術(shù)出版社Orlando,1987；p.79-84；Crossland等，(1971)，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志1971,93,p.4217-4219)，甲磺酸鹽(Harris,(1985)，出處同上；Harris等(1984)，聚合物科學(xué)聚合物化學(xué)雜志(J.Polym.Sci.Polym.Chem.)22版，p.341-352)，諸如甲苯磺酸鹽和對(duì)硝基苯磺酸鹽的芳基苯磺酸鹽。
諸如Tresyl chloride的有機(jī)磺酰氯，可將多種聚合物(例如PEG)中的羥基有效轉(zhuǎn)化為良好的離去基團(tuán)(磺酸鹽)，該基團(tuán)在與諸如多肽鏈上的氨基的親核試劑反應(yīng)時(shí)可在聚合物和多肽之間形成穩(wěn)定的鍵。除了高綴合率之外，反應(yīng)條件一般是溫和的(中性或弱堿性pH，以避免變性和很少或不破壞活性)，并滿(mǎn)足對(duì)多肽的非破壞性要求。
甲苯磺酸鹽比甲磺酸鹽更活潑，但也更不穩(wěn)定，分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky,(1995)，生物綴合物化學(xué)(BioconjugateChem.),6,150-165)。還可以用環(huán)氧化物產(chǎn)生胺鍵，但比上述基團(tuán)的活性更小。
用碳酰氯將PEG轉(zhuǎn)化成氯甲酸酯，可使賴(lài)氨酸產(chǎn)生氨基甲酸酯鍵。這一方案可以多種變形實(shí)施，用N-羥基一琥珀酰亞胺(美國(guó)專(zhuān)利，5,122,614,(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技術(shù)應(yīng)用生物化學(xué)(Biotechnol.Appl.Biochem.),15,p100-114；Monfardini等，(1995)，生物綴合物化學(xué)，6,62-69，用咪唑(Allen等，(1991)，糖研究(Carbohydr.Res.),213,p309-319)，用對(duì)硝基苯酚，DMAP(EP632082 A1,(1993),Looze,Y.)等取代氯。所述衍生物通常是通過(guò)使氯甲酸酯與所需的離去基團(tuán)反應(yīng)制成的。所以這些基團(tuán)均可使所述肽產(chǎn)生氨基甲酸酯鍵。
而且，可分別用異氰酸酯和異硫氰酸酯產(chǎn)生脲和硫脲。
可以用與上述相同的離去基團(tuán)和環(huán)狀imid throne由PEG酸獲得酰胺(美國(guó)專(zhuān)利5,349,001,(1994),Greenwald等)。這些化合物的反應(yīng)性很高，但可能導(dǎo)致水解過(guò)快。
還可以使用通過(guò)與琥珀酐的反應(yīng)而獲得的PEG琥珀酸酯。因此其包括使所述綴合物更易于水解的酯基(美國(guó)專(zhuān)利5,122,614,(1992),Zalipsky)。該基團(tuán)可以由N-羥基琥珀酰亞胺激活。
而且，可以引入一種特殊的連接體。使用最久的連接體是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化學(xué)雜志，252,3578-3581；美國(guó)專(zhuān)利4,179,337,(1979),Davis等；Shafer等，(1986),J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.,24,375-378)。
PEG與芳族胺偶聯(lián)，隨后再進(jìn)行重氮化，可產(chǎn)生一種十分活潑的重氮鹽，該鹽可在原位與肽反應(yīng)。還可以通過(guò)PEG的吖內(nèi)酯衍生物的反應(yīng)產(chǎn)生酰胺鍵(美國(guó)專(zhuān)利5,321,095,(1994),Greenwald,R.B.)，從而引入另一個(gè)酰胺鍵。
由于一些多肽不含許多賴(lài)氨酸，可能有利的是對(duì)相同賴(lài)氨酸附著一個(gè)以上的PEG。這可例如通過(guò)使用1,3-二氨基-2-丙醇來(lái)獲得。
PEG還可以通過(guò)氨基甲酸酯鍵與酶的氨基連接(WO95/11924,Greenwald等)。還可將賴(lài)氨酸殘基用作骨架。偶聯(lián)的嵌段或共聚物的位置實(shí)際上，所有離子化基團(tuán)，例如賴(lài)氨酸殘基的氨基，位于多肽分子的表面上(參見(jiàn)例如Thomas E.Creighton,(1993)，“蛋白質(zhì)”，W.H.Freeman和公司，紐約)。所以，在多肽表面上的易于接近的附著基團(tuán)(即，氨基)的數(shù)目等于在多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中的賴(lài)氨酸殘基與N-端氨基的數(shù)目之和。
根據(jù)本發(fā)明，1-100個(gè)聚合物、優(yōu)選4-50個(gè)聚合物分子、5-35個(gè)聚合物與所述親代多肽偶聯(lián)。親代多肽本發(fā)明的修飾多肽可在親代多肽的基礎(chǔ)上采用本領(lǐng)域熟知的任何合適的技術(shù)來(lái)制備，所述修飾多肽的分子量典型地在1-100kDa的范圍內(nèi)，優(yōu)選15-60kDa。
術(shù)語(yǔ)“親代”多肽指任何未偶聯(lián)的多肽(即，待修飾的多肽)。多肽可優(yōu)選是微生物來(lái)源，例如細(xì)菌或絲狀真菌或酵母來(lái)源。親代多肽可以是天然存在(或野生類(lèi)型)的多肽或可以是其變體。
優(yōu)選的多肽是具有抗微生物活性的酶和多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶是適于護(hù)膚組合物和產(chǎn)品的酶，它在護(hù)膚產(chǎn)品所用的pH范圍內(nèi)具有實(shí)質(zhì)性的酶活性。
當(dāng)選擇親代多肽時(shí)，有利的是使用含有數(shù)目多的附著基團(tuán)的多肽。
而且，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌段或共聚物廣泛地分布于親代多肽的表面上。對(duì)于酶，優(yōu)選在接近活性點(diǎn)的區(qū)域內(nèi)不偶聯(lián)嵌段或共聚物。
在本發(fā)明的上下文中，“廣泛地分布”指處于這樣的位置，以使與多肽的附著基團(tuán)偶聯(lián)的聚合物分子屏蔽多肽表面的不同部分，優(yōu)選屏蔽多肽表面的全部或接近全部表面積，以確?？勺R(shí)別的相關(guān)表位被屏蔽，從而不被免疫系統(tǒng)的抗體識(shí)別。認(rèn)為多肽與抗體之間的相互作用表面積在約500平方埃(26×19埃)的范圍內(nèi)(參見(jiàn)Sheriff等，(1987)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第84卷，8075頁(yè))。
為了保證酶活性的最小損失，對(duì)于酶，優(yōu)選在活性點(diǎn)的近距離處不偶聯(lián)聚合物。一般地，優(yōu)選在距離活性點(diǎn)5埃內(nèi)、優(yōu)選10埃內(nèi)不附著聚合物。
另外，根據(jù)本發(fā)明認(rèn)為這樣的多肽也是有利的，所述多肽在可被免疫系統(tǒng)識(shí)別的已知表位處或接近所述表位處含有已偶聯(lián)的聚合物。如果不知道表位的位置，有利的是使盡可能多的聚合物與多肽表面上附著基團(tuán)偶聯(lián)。優(yōu)選所述附著基團(tuán)在活性點(diǎn)的適當(dāng)距離處廣泛地分布在多肽的表面上。
根據(jù)本發(fā)明，滿(mǎn)足上述對(duì)偶聯(lián)聚合物在多肽表面上的分布要求的親代多肽是優(yōu)選的。
對(duì)于酶，特別是在距離活性點(diǎn)0-5埃內(nèi)、優(yōu)選0-10埃內(nèi)不偶聯(lián)聚合物或只偶聯(lián)很少聚合物的酶是優(yōu)選的。酶活性親代酶可具有已知用于如下定義的工業(yè)組合物和產(chǎn)品的任何活性?？紤]的酶活性包括氧化還原酶(E.C.1，“酶命名法”，(1992)，學(xué)術(shù)出版社)，例如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶(E.C.3)，包括蛋白酶，尤其是絲氨酸蛋白酶，例如枯草菌素和脂酶；轉(zhuǎn)移酶(E.C.2)，例如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)；異構(gòu)酶(E.C.5)，例如蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)。水解酶解蛋白酶考慮的解蛋白酶包括具有上述性能(例如，附著基團(tuán)的數(shù)目、附著基團(tuán)的位置等)的蛋白酶，選自酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶(例如枯草菌素)、或金屬蛋白酶。
含有合適數(shù)目的附著基團(tuán)的合適的親代蛋白酶的具體例子如下表1所示表1
枯草菌素PD498的分子量為29kDa，并由SEQ ID No.2可見(jiàn)，含有用于在酶表面上附著聚合物的12個(gè)賴(lài)氨酸基團(tuán)和1個(gè)N-端氨基。如上所述，優(yōu)選的酶具有在其表面上廣泛分布的賴(lài)氨酸。PD498在距離活性點(diǎn)0-10埃處不含賴(lài)氨酸殘基，這特別適于修飾形式。另外，賴(lài)氨酸殘基在酶的表面上廣泛分布(即，遠(yuǎn)離活性點(diǎn))。
酶-枯草菌素DY的分子量為27kDa，并在酶的表面上含有12個(gè)氨基(即，賴(lài)氨酸殘基)和1個(gè)N-端氨基(參見(jiàn)SEQ ID No.3)。
親代酶-Lion Y的分子量為46kDa，在酶的表面上含有14個(gè)氨基(即，賴(lài)氨酸殘基)和1個(gè)N-端氨基(參見(jiàn)SEQ ID No.4)。
中性金屬蛋白酶-嗜熱菌蛋白酶的分子量約為34kDa，在其表面上含有11個(gè)氨基(即，賴(lài)氨酸殘基)和1個(gè)N-端氨基(參見(jiàn)SEQ ID No.5)。脂解酶考慮的脂解酶包括Humicola lanuginosa脂肪酶，如EP258 068和EP305 216所述，Humicola insolens，一種Rhizomucor miehei脂肪酶，如EP238 023所述，犁頭霉屬的種(Absidia sp.)脂解酶(WO96/13578)，假絲酵母屬(Candida)脂肪酶，例如南極洲假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶，例如南極洲假絲酵母脂肪酶A或B，如EP214761所述，假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)和類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶，如EP218272所述，洋蔥假單胞菌(P.cepacia)脂肪酶，如EP331376所述，假單胞菌屬的種脂肪酶，如WO95/14783所公開(kāi)，芽孢桿菌屬脂肪酶，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)脂肪酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysica acta 1131,253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)脂肪酶(WO91/16422)。其它脂解酶包括角質(zhì)酶(cutinase)。如來(lái)自Humicola insolens，門(mén)多薩假單胞菌(Psenudomonas mendocina)(WO88/09367)，或腐皮鐮孢(Fusarium solanipisi)(如WO90/09446所述)。氧化還原酶漆酶考慮的漆酶包括WO96/00290和WO95/33836Novo Nordisk所公開(kāi)的漆酶。
其它氧化還原酶包括過(guò)氧化氫酶、葡糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、鹵過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、超氧化物歧化酶和脂肪氧化酶。轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶合適的轉(zhuǎn)移酶包括WO96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中公開(kāi)的任何轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。異構(gòu)酶蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶對(duì)其無(wú)限制，合適的蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶包括WO95/01425(Novo NordiskA/S)中公開(kāi)的PDI。工業(yè)組合物本發(fā)明的另一方面涉及含有具有減弱的變應(yīng)原性的修飾多肽的“工業(yè)組合物”。
在本發(fā)明的上下文中，“工業(yè)組合物”指不意在引入循環(huán)系統(tǒng)的組合物。換句話(huà)說(shuō)，指不旨在皮內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下給藥的組合物。
如上所述，多肽(例如酶)用于工業(yè)應(yīng)用的主要問(wèn)題在于經(jīng)呼吸系統(tǒng)吸入(例如氣管內(nèi)或鼻內(nèi)直接接觸)所引起的呼吸變態(tài)反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)。
“工業(yè)組合物”的例子是在組合物或產(chǎn)品中所用的多肽，特別是酶和抗微生物多肽，這些組合物或產(chǎn)品例如洗滌劑(包括洗衣和洗碟劑)，家庭用品，農(nóng)用化學(xué)品，個(gè)人護(hù)理用品(例如護(hù)膚品，包括化妝品和美容品)，口服和外用藥品，用于處理/加工織物的組合物，用于清洗硬表面的組合物，和用于生產(chǎn)食物和飼料的組合物(包括食物和飼料添加劑，例如用于生產(chǎn)面包等的添加劑)。根據(jù)本發(fā)明特別考慮的是護(hù)膚品和洗滌劑。護(hù)膚品在本發(fā)明的上下文中，“護(hù)膚品”包括用于清洗、護(hù)理和/或美化機(jī)體皮膚的全部個(gè)人護(hù)理用品，并進(jìn)一步包括其它產(chǎn)品，例如護(hù)發(fā)品，這些產(chǎn)品在使用期間可能與皮膚或呼吸系統(tǒng)接觸。根據(jù)本發(fā)明還考慮用于動(dòng)物的相應(yīng)產(chǎn)品。
根據(jù)本發(fā)明考慮的護(hù)膚品的特定例子是肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚膠、潤(rùn)膚乳、潤(rùn)膚露、清洗霜、清洗露、清洗乳、冷霜、皂霜、化妝底、乳霜、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、護(hù)手霜、精華粉、增白粉、粉皂、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營(yíng)養(yǎng)精華素、乳性粉底、撲面粉、眼影粉、粉底、指甲去光劑、生發(fā)油、發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)膠、滋發(fā)劑、發(fā)定型劑、染發(fā)劑(hair dyes)、染發(fā)劑(hair colorants)、頭屑處理劑、香波、香脂、洗發(fā)劑、美發(fā)噴灑劑、防曬油、防曬劑、剃須泡沫和膠、剃須膏、嬰兒用油、痤瘡護(hù)理用品、止汗劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、除臭劑等。適于護(hù)膚的酶活性本發(fā)明的護(hù)膚組合物包括本發(fā)明的具有減弱的變應(yīng)原性的綴合物和已知用于護(hù)膚組合物的其它組分。
已知護(hù)膚組合物所用的多種酶活性。蛋白酶蛋白酶是皮膚清潔制品的有效成分，它可清除死的角蛋白類(lèi)表皮細(xì)胞上層，因而使得皮膚看上去更有光澤、更嫩。另外，蛋白酶也改進(jìn)了皮膚的光滑度。
而且，蛋白酶可用于美容、洗浴和淋浴制品中，包括洗發(fā)水、調(diào)節(jié)劑、洗液、乳膏、皂?xiàng)l、美容香皂和液體皂。脂酶脂酶可在化妝品中用作皮膚清洗產(chǎn)品和抗痤瘡產(chǎn)品中的活性成分，以除去過(guò)量的皮脂，并在洗浴和淋洗產(chǎn)品(例如霜和露)中作為護(hù)膚的活性成分。
脂酶還可用在頭發(fā)清潔產(chǎn)品中(如香波)，用于從頭發(fā)表面有效去除皮脂和其它脂肪。氧化還原酶用于個(gè)人護(hù)理目的的最常見(jiàn)的氧化還原酶是氧化酶(常為葡糖氧化酶)，具有能確保產(chǎn)生H2O2的底物(如葡萄糖)，然后由過(guò)氧化物酶(常為乳過(guò)氧化物酶)將諸如SCN-或I-氧化成抗微生物劑(SCNO-或I2)。該酶復(fù)合物自然中是已知的，如源于乳和唾液。
氧化還原酶被作為口腔護(hù)理產(chǎn)品(漱口水、牙粉、口香糖)的抗微生物系統(tǒng)加以商業(yè)化應(yīng)用，其中，還可將其與淀粉葡糖苷酶混合，以產(chǎn)生葡萄糖。已知該系統(tǒng)還可用于化妝制品中，用于防腐目的。
氧化還原酶的另一種用途是用氧化酶、過(guò)氧化物酶和漆酶進(jìn)行氧化性染發(fā)(參見(jiàn)例如Novo Nordisk的WO96/00290或WO95/33836)。
已知皮膚(和毛發(fā))表面上所生成的自由基與皮膚的老化過(guò)程(發(fā)質(zhì)受損)相關(guān)。
所述自由基可激活導(dǎo)致脂肪膜、膠原和細(xì)胞破壞的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。將諸如超氧化物歧化酶的自由基清除劑用于化妝品是眾所周知的(R.L.Goldemberg,DCI,Nov.93,p.48-52)。
蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)也是一種氧化還原酶。可將其用于燙發(fā)(waving of hair)(將毛發(fā)里的二硫鍵還原和再氧化)并修復(fù)受損的毛發(fā)(其中，所述損傷主要是還原現(xiàn)有的二硫鍵)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于人體皮膚、毛發(fā)或指甲的護(hù)膚組合物含有(a)氨基官能的活性組分，(b)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，用于催化活性組分對(duì)皮膚、毛發(fā)或指甲的交聯(lián)，和(c)從美國(guó)專(zhuān)利5,490,980已知的載體。
適用于哺乳動(dòng)物的皮膚、毛發(fā)或指甲的化妝品組合物含有(a)至少一種角質(zhì)層包覆蛋白質(zhì)，其量足以在所述皮膚、毛發(fā)或指甲上提供保護(hù)層；(b)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其量足以在角質(zhì)層包覆蛋白質(zhì)和存在于所述皮膚、頭發(fā)或指甲中外露角質(zhì)層的角質(zhì)層蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵；(c)鈣離子，其量足以激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；和(d)化妝可接受的介質(zhì)，其中該組合物包括含有兩相的乳液，且其中角質(zhì)層包覆蛋白包含于其中一相內(nèi)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含于另一相內(nèi)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,525,336)。
JP3083908描述了一種皮膚化妝品，它含有用水溶性物質(zhì)修飾的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。修飾物質(zhì)是例如一種或多種聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、藻酸、羧甲基纖維素、淀粉和羥丙基纖維素。例如通過(guò)引入反應(yīng)基團(tuán)和與酶鍵接來(lái)進(jìn)行修飾。用于提供對(duì)皮膚溫和的物質(zhì)、引起較短持續(xù)時(shí)間的脫色和產(chǎn)生氣味，并具有護(hù)理粗糙皮膚的良好效果、保溫和使皮膚更美。本發(fā)明的護(hù)膚品在第三方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的護(hù)膚組合物的護(hù)膚品。術(shù)語(yǔ)護(hù)膚品”如上定義。
本發(fā)明的護(hù)膚品可含有本發(fā)明的有效量的修飾酶。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的這種有效量可通常在護(hù)膚成品的0-5％的范圍內(nèi)。
本發(fā)明考慮的護(hù)膚品包括(但不限于)以下產(chǎn)品肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚膠、潤(rùn)膚乳、潤(rùn)膚露、清洗霜、清洗露、清洗乳、冷霜、皂霜、化妝底、乳霜、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、護(hù)手霜、精華粉、增白粉、粉皂、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營(yíng)養(yǎng)精華素、乳性粉底、撲面粉、眼影粉、粉底、指甲去光劑、生發(fā)油、發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)膠、滋發(fā)劑、發(fā)定型劑、染發(fā)劑、染發(fā)劑、頭屑處理劑、香波、香脂、洗發(fā)劑、美發(fā)噴灑劑、防曬油、防曬劑、剃須泡沫、剃須膏、嬰兒用油、痤瘡護(hù)理用品、止汗劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、除臭劑等。常用的護(hù)膚品配方術(shù)語(yǔ)“用于護(hù)膚品的組分”指包括已知用于護(hù)膚品配方的所有組分。這種組分的例子可在Wilfried Umbach編輯，Ellis Horwood有限公司出版的“化妝品和美容品”，倫敦(1991)和J.Falbe編輯，Spring-Verlag出版的，化妝品中的表面活性劑”(1987)中找到。
下面給出的是非窮舉性指導(dǎo)配方。這些配方構(gòu)成了本發(fā)明涉及的重要個(gè)人護(hù)理制品配方的概覽。香皂成分 例子 ％表面活性劑 皂(鈉鹽) 83-87螯合劑 乙二胺四乙酸 0.1-0.3稠度調(diào)節(jié)劑 NaCl 大約0.5染料 ＜0.1熒光增白劑＜0.1抗氧化劑 2,6-雙(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚(BHT) 0.1-0.3增白劑 鈦白 0.1-0.3芳香劑1.0-2.0酶 蛋白酶/脂酶 0-5水余量合成洗滌劑成分 例子 ％表面活性劑 月桂基硫酸鹽 30-50月桂基磺基琥珀酸鹽 1-12再脂化劑 脂肪醇 10-20增塑劑 硬脂酰單/雙甘油酯0-10填料 淀粉 0-10活性劑 水楊酸 0-1染料 ＜0.2芳香劑0-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5水余量泡沫洗液和淋浴洗液成分 例子 ％泡沫洗液 ％淋浴洗液泡沫洗液 淋浴洗液表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 10-2010-12可可氨丙基二甲基甜菜堿2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2 -再脂化劑 脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-5 0-4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5成分例子 ％泡沫洗液 ％淋浴洗液泡沫洗液淋浴洗液泡沫穩(wěn)定劑 脂肪酸鏈烷醇酰胺 0.2-2 0-4調(diào)節(jié)劑 季銨化羥丙基纖維素 -0-0.5增稠劑 NaCl 0-3 0-3珠光劑 硬脂酸乙二醇酯0-2 -活性劑 植物提取物0-1 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1芳香劑0.3-3 0.3-2酶 蛋白酶/脂酶0-5 0-5水余量 余量護(hù)膚霜(油包水型和水包油型)成分 例子 ％油包水型 /水包油型(油包水型/水包油型)乳化劑 脫水山梨醇倍半油酸酯3-5 -硬脂酸鋁1-2 -三乙醇胺硬脂酸酯 - 1-2十六烷基/十八烷醇聚乙二醇醚 - 1-3棕櫚酸異丙酯脂肪衍生物 十六烷基/十八烷醇 1-5 0-32-辛基十二烷醇 - 0-2硬脂酸/棕櫚酸 2-103-7辛酸/癸酸甘油三酯 - 0-3硬脂酸甘油酯5-10 -甘油- 0-5濕潤(rùn)劑 山梨醇 1-5 1-5多(羥基羧酸)1-5 1-5丙二醇 0.5-2-硫酸鎂 - 0-3穩(wěn)定劑 對(duì)羥基苯甲酸酯 0-0.8-防腐劑 蛋白酶/脂酶 0.2-0.4 0.2-0.4酶 0-5 0-5水 余量余量用于濕性皮膚的潔體洗液(水包油型)和護(hù)膚洗液成分 例子 ％潔體洗液 ％護(hù)膚洗液潔體洗液 護(hù)膚洗液乳化劑 十六烷基/十八烷醇聚乙二醇醚 1-3 -單月桂酸脫水山梨醇酯 0.5-1-硬脂酸鈉 -1-2月桂基乙醚硫酸鈉 -0.5-2脂肪衍生物 2-辛基十二烷醇1-3 0-5石蠟油-20-25蜂蠟 0.5-1-硬脂酸異辛酯 3-7 -棕櫚酸異丙酯 -2-5潤(rùn)濕劑 甘油 3-5 5-10山梨醇-0-5增稠劑 聚丙烯酸酯0-0.30-1甲基羥丙基纖維素 0-0.30-0.5防腐劑 對(duì)羥基苯甲酸酯0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水 余量 余量洗面液成分 例子 ％表面活性劑月桂基乙醚硫酸鎂 0.2-0.5再脂化劑 己二酸二正丁酯1-2加溶劑蓖麻油聚乙二醇醚 0.1-1清潔和更新成分乙醇 0-15濕潤(rùn)劑甘油 0-5山梨醇0-5防腐劑對(duì)羥基苯甲酸酯0.2-0.4收斂劑植物提取物1-5抗刺激劑 泛酰醇0-1尿囊素0-0.2植物提取物0.5-3酶蛋白酶/脂酶 0-5水 余量洗發(fā)香波成分 例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 12-16可可脂肪酸氨丙基二甲基甜菜堿2-5脂肪酸聚乙二醇酯0-2泡沫促進(jìn)劑 脂肪酸乙醇酰胺 0.5-2.5調(diào)節(jié)劑 季銨化羥乙基纖維素 0.4-1蛋白水解產(chǎn)物0.2-1再脂化劑乙氧基化羊毛脂醇0.2-1添加劑 抗頭皮屑劑 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷 0.1-0.3珠光劑 硬脂酸乙二醇酯 0-2染料＜0.1pH調(diào)節(jié)劑酸/堿 0.1-1芳香劑 0.3-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5水 余量潤(rùn)發(fā)液(hair rinse)和毛發(fā)調(diào)節(jié)液成分例子 ％ ％潤(rùn)發(fā)液毛發(fā)調(diào)節(jié)液表面活性劑 脂肪醇聚乙二醇醚 0.1-0.2 1.5-2.5十六烷基三甲基氯化銨 0.5-1 -二甲基芐基硬脂?；然@ - 0.5-1再脂化劑十六烷基/十八烷基 0.5-1.5 1.5-2.5單/二甘油酯稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇 1-2.5 2.5-3.5增稠劑 甲基羥丙基纖維素 0.3-0.6 0.4-0.8調(diào)節(jié)劑 季銨化羥乙基纖維素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐劑 對(duì)羥基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料 ＜0.1 ＜0.1pH調(diào)節(jié)劑酸/堿 0.1-1 0.1-1芳香劑 0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂酶0-5 0-5水 余量 余量染發(fā)液成分 例子％組分1 堿性染色膏表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 1-4乙氧基化蓖麻油 1-2稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇 8-10還原劑 亞硫酸鈉0.8-1.2緩沖液 氯化銨 0.5-1螯合劑 1-羥基乙烷-1,1-二膦酸 0.1-0.2堿性劑 氨 1.2-2氧化染料 顯色劑 1偶聯(lián)劑 1酶 漆酶0-5水 余量組分Ⅱ 過(guò)氧化氫分散體表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 0.5-1氧化劑 過(guò)氧化氫6-9穩(wěn)定劑 1-羥基乙烷-1,1-二膦酸 1-1.5增稠劑 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶0-5水 余量剃須膏成分 例子％皂 棕櫚酸/硬脂酸30-40氫氧化鉀 5-7氫氧化鈉 1-2脂肪成分 椰子油 5-10聚乙二醇 0-2穩(wěn)定劑 四硼酸鈉 0-0.5硅酸鈉 0-0.5山梨醇 0-3酶 蛋白酶 0-5水余量剃須液成分 例子 ％消毒和酚酸(phonic acid)乙醇 40-80再脂化劑 己二酸二正丁酯1-2增溶劑 乙氧基化蓖麻油0.5-1收斂劑 植物提取物1-10抗刺激劑 泛酰醇0-0.5植物提取物0-2穩(wěn)定劑 甘油 0-5山梨醇0-5丙二醇0-3酶 蛋白酶0-5水 余量洗發(fā)香脂成分 例子 ％稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇 4-5乙氧基化羊毛脂醇 3-6礦脂 凡士林 45-52支鏈?zhǔn)? 10-18抗氧化劑 2,6-雙(1,1-二甲基乙基) 0.5-1-4-甲基苯酚(BHT)芳香劑0.2-0.4染料 0.1酶 脂酶 0-5軟化劑 甘油 余量定型液(setting lotion)成分 例子 ％溶劑 異丙醇 12-20成膜成分 乙烯基吡咯烷酮/乙烯基乙酸酯共聚物2-3.5軟化劑乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨基乙基異丁烯酸酯 0.2-1調(diào)節(jié)劑蛋白水解物 0.2-0.5抗靜電劑 十六烷基三甲基氯化銨 0.1-0.5乳化劑乙氧基化蓖麻油 0.1-0.5芳香劑 0.1-0.2染料 ＜0.1酶脂酶 0-5水 余量洗滌劑公開(kāi)本發(fā)明的洗滌劑組合物可例如配制為包括洗衣添加劑組合物的手洗和機(jī)洗洗滌劑組合物，和適用于染色織物的預(yù)處理、洗滌添加織物柔軟劑組合物，和用于常用家庭硬表面清洗操作和洗碟操作的組合物。
本發(fā)明的洗滌劑組合物含有本發(fā)明的綴合物和表面活性劑。另外，該組合物可任選地含有助洗劑、另一種酶、抑泡劑、柔軟劑、脫色抑制劑和其它通常用于洗滌劑的組分，例如污垢懸浮劑、去污劑、熒光增白劑、耐磨劑、殺菌劑、晦暗抑制劑、著色劑、和/或包封或非包封的香水。
根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物可以為液體、糊劑、凝膠、條狀或顆粒形式。其pH值(在水溶液中的使用濃度下檢測(cè))將通常為中性或堿性，即在7-11的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的顆粒組合物也可為“壓縮形式”，例如它們可具有比傳統(tǒng)顆粒洗滌劑更高的密度，即為550-950克/升。本發(fā)明的酶綴合物或任選引入洗滌劑組合物的另一種酶一般以該組合物的0.00001-2重量％酶蛋白質(zhì)的量引入洗滌劑組合物中，優(yōu)選該組合物的0.0001-1重量％酶蛋白質(zhì)，更優(yōu)選該組合物的0.001-0.5重量％酶蛋白質(zhì)，甚至更優(yōu)選該組合物的0.01-0.2重量％酶蛋白質(zhì)。表面活性劑體系表面活性劑體系可包括非離子型的、陰離子型的、陽(yáng)離子型的、兩性和/或兩性離子型的表面活性劑。該表面活性劑體系優(yōu)選含有陰離子型表面活性劑或陰離子型和非離子型表面活性劑的組合，例如50-100％的陰離子型表面活性劑和0-50％的非離子型表面活性劑。洗衣洗滌劑組合物也可含有陽(yáng)離子型的、兩性、兩性離子型和半極性表面活性劑，以及除上述以外的其它非離子型和/或陰離子型表面活性劑。
表面活性劑的用量一般為0.1-60重量％。表面活性劑的一些例子如下所述。非離子型表面活性劑該表面活性劑包括烷基酚的聚氧化烯(例如聚氧乙烯)縮合物。烷基可在直鏈或支鏈中含有約6-12個(gè)碳原子。環(huán)氧乙烷的用量可以等于約2-25摩爾/每摩爾烷基酚的量。
該表面活性劑也包括伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈，一般含有約8-22個(gè)碳原子。
另外，非離子表面活性劑也包括烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖及其混合物。最優(yōu)選的是含有3-15個(gè)乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和含有2-10個(gè)乙氧基的C8-C18烷基酚乙氧基化物(優(yōu)選平均C10)，及其混合物。
陰離子表面活性劑合適的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化硫酸鹽，它是式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或含有C10-C24烷基組分的羥烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，典型地在約0.5-6之間，更優(yōu)選約0.5-3,M是H或陽(yáng)離子，其可以是例如金屬陽(yáng)離子(例如，鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)，銨或取代的銨陽(yáng)離子。在本發(fā)明中考慮烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代的銨陽(yáng)離子的特定例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽(yáng)離子和季銨陽(yáng)離子，例如四甲基銨陽(yáng)離子和二甲基哌啶鎓陽(yáng)離子和衍生自烷基胺類(lèi)例如乙基胺、二乙基胺、三乙基胺等的那些，及其混合物等。
其它合適的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，它是式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選是C10-C24烴基，優(yōu)選含有C10-C20烷基組分的烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，M是H或陽(yáng)離子，例如堿金屬陽(yáng)離子(例如，鈉、鉀、鋰)，或銨或取代的銨。
其它陰離子表面活性劑包括皂鹽類(lèi)(包括例如，鈉、鉀、銨和取代的銨鹽，例如單、二和三乙醇胺鹽)，C8-C22伯或仲烷基磺酸鹽，C8-C24烯烴磺酸鹽，通過(guò)檸檬酸堿土金屬鹽的熱解產(chǎn)物的磺化制得的磺化多羧酸。烷基苯磺酸鹽是合適的，特別是線型(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中烷基優(yōu)選含有10-18個(gè)碳原子。
洗衣洗滌劑組合物典型地含有約1-40重量％、優(yōu)選約3-20重量％的這種陰離子表面活性劑。助洗劑體系根據(jù)本發(fā)明的組合物可另外含有助洗劑體系。任何傳統(tǒng)的助洗劑體系適用于本發(fā)明，包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸，材料例如乙二胺四乙酸鹽(EDTA)，金屬離子螯合劑，例如氨基多磷酸鹽。此處也可使用磷酸鹽助洗劑。
合適的助洗劑可以是無(wú)機(jī)離子交換材料，通常是無(wú)機(jī)水合硅鋁酸鹽材料，更特別是水合合成沸石，例如水合沸石A、X、B、HS或MAP。
清洗助洗劑鹽類(lèi)的用量通常占該組合物的5-80重量％。優(yōu)選用于液體洗滌劑的助洗劑用量是5-30％。其它洗滌劑酶活性除具有特定活性的本發(fā)明的綴合物之外，洗滌劑組合物可另外含有其它酶活性，例如也是如本發(fā)明所述的酶綴合物的形式，提供清洗性能和/或織物護(hù)理益處，例如蛋白酶、脂酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過(guò)氧化物酶、鹵代過(guò)氧化物酶、氧化酶(例如，漆酶)。
所考慮的酶的具體例子如上述酶活性”一節(jié)中所列。漂白劑所述洗滌劑組合物(特別是在顆粒洗滌劑的情況下)也可含有漂白劑，例如有氧型漂白劑或鹵素型漂白劑。有氧型漂白劑可以是過(guò)氧化氫釋放劑，例如過(guò)硼酸鹽(例如PB1或PB4)或過(guò)碳酸鹽，或可以是例如過(guò)羧酸。粒徑可為400-800微米。當(dāng)存在時(shí)，有氧型漂白化合物的用量將典型地為約1-25％。
過(guò)氧化氫釋放劑可與漂白活化劑組合使用，漂白活化劑例如四乙?；鶃喴一?TAED)，壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS),3,5-三甲基己酰氧基苯磺酸鹽(ISONOBS)或戊酰基葡萄糖(PAG)。
鹵素型漂白劑可以是例如次鹵化物漂白劑，例如三氯異氰脲酸酯和N-氯和N-溴烷磺酰胺。這種材料通常的加量為最終產(chǎn)品的0.5-10重量％，優(yōu)選1-5重量％?？椢飸?yīng)用蛋白酶蛋白酶可用于絲綢的脫膠和砂洗。脂酶在織物精整期間可以用脂酶清除含疏水酯的脂類(lèi)物質(zhì)(例如，甘油三酯)(例如，參見(jiàn)WO93/13256,Novo Nordisk A/S)。氧化還原酶在漂白清洗織物時(shí)，可以用過(guò)氧化氫酶清除過(guò)量的過(guò)氧化氫。糖酶纖維素分解酶被廣泛應(yīng)用于精整粗斜棉布服裝，以使織物的顏色密度發(fā)生局部變化(酶促“石洗”)。
還可將纖維素分解酶用于生物拋光工藝。生物拋光工藝是對(duì)紗線表面的一種特殊處理，它可以改善織物加工和外觀方面的品質(zhì)，而不會(huì)喪失織物的可濕性?？梢杂弥T如披露于WO93/20278中的方法進(jìn)行生物拋光。
在紡織織物的過(guò)程中，紗線要承受相當(dāng)大的機(jī)械張力。為了防止其斷裂，通常要涂以(上漿)膠質(zhì)物質(zhì)(漿料)以將其加強(qiáng)。最常見(jiàn)的上漿劑是天然或修飾形式的淀粉。只有在清除織物上的漿料之后(即脫漿)才可實(shí)現(xiàn)均勻而又持久的精整。優(yōu)選用淀粉分解酶實(shí)現(xiàn)用含有淀粉或修飾淀粉的漿料上漿的織物的脫漿。食品和飼料本發(fā)明的綴合酶或多肽可有利地用于生產(chǎn)食品和飼料。蛋白酶小麥面粉中的谷蛋白是決定面粉被用于焙烤食品中的能力的關(guān)鍵成分。為了改變面團(tuán)的谷蛋白相，有時(shí)需要蛋白水解酶，例如，用蛋白酶將硬質(zhì)小麥面粉軟化。
Neutrase是一種市售中性金屬蛋白酶，可使用其以確保均勻的面團(tuán)質(zhì)量和面包質(zhì)地，并改善風(fēng)味。將谷蛋白適度地或更徹底地降解成肽，因此，為了避免面團(tuán)的過(guò)度軟化，必須進(jìn)行嚴(yán)格控制。
還可將蛋白酶用于對(duì)乳蛋白進(jìn)行修飾。
在生產(chǎn)干酪時(shí)，為了讓乳中的酪蛋白凝固，可以使用諸如粗制凝乳酶或凝乳酶的蛋白酶。
在釀酒業(yè)中，將蛋白酶用于以未發(fā)芽的谷物釀制并控制氮含量。
在動(dòng)物飼料制品中，將蛋白酶用于擴(kuò)大動(dòng)物的消化系統(tǒng)。脂酶將脂酶應(yīng)用于焙烤業(yè)是相當(dāng)新的事物。添加脂酶可以改善面團(tuán)的特性，并改善面包生產(chǎn)質(zhì)量，體現(xiàn)在具有較大的體積、改善的面包瓤結(jié)構(gòu)和更白的面包瓤顏色。所觀察到的效果可以由這樣一種機(jī)制解釋其中，在面團(tuán)混合過(guò)程中，脂酶改變了谷蛋白與某些脂質(zhì)片段之間的相互作用。這樣可以產(chǎn)生改善的谷蛋白結(jié)構(gòu)。
屬于某些意大利干酪類(lèi)型的棕色(blue roan)干酪(如，Danablue)和其它含有乳脂肪的乳制品的風(fēng)味形成取決于乳脂肪被降解成游離的脂肪酸?？蓪⒅赣糜诋a(chǎn)生這類(lèi)制品的風(fēng)味。
在油類(lèi)和脂肪生產(chǎn)業(yè)中，脂酶被用于諸如降低不希望的副產(chǎn)品的目的，以便通過(guò)酯交換對(duì)脂肪進(jìn)行修飾，并合成酯。氧化還原酶另外，本發(fā)明具有減弱的變應(yīng)原性的氧化還原酶可用于生產(chǎn)食品和飼料。
適用于焙烤的幾種氧化還原酶為葡萄糖氧化酶、脂肪氧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶及其組合。通常，面包師是通過(guò)添加抗壞血酸和溴酸鉀加強(qiáng)谷蛋白?？蓪⒛承┭趸€原酶用于替代面團(tuán)系統(tǒng)中的溴酸鹽，方法是通過(guò)氧化谷蛋白中的自由硫羥基。從而形成二硫鍵，導(dǎo)致更強(qiáng)的、具有更大抗性的更有彈性的面團(tuán)的形成。
Gluzyme(Novo Nordisk A/S)是具有過(guò)氧化氫酶活性的葡萄糖氧化酶制劑，可將其用于替代溴酸鹽。面團(tuán)筋力是通過(guò)更大的抗機(jī)械沖擊力、更好的烘烤膨脹性和更大的面包體積等指標(biāo)來(lái)衡量的。糖酶面粉中淀粉酶含量的不同可導(dǎo)致焙烤質(zhì)量的差異。為了使面粉統(tǒng)一，必須加入淀粉酶。淀粉酶和戊聚糖酶通常可提供用于酵母發(fā)酵的糖，改善面包體積，延緩老化，降低變陳速度和由戊聚糖膠形成的粘度。下面將給出糖酶的例子。
某些生麥淀粉酶(maltogenic amylase)可用于將面包的保質(zhì)期延長(zhǎng)2天或更長(zhǎng)的時(shí)間，而不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的粘性。通過(guò)從淀粉分子、低分子量糖和糊精的非還原端裂解，對(duì)糊化淀粉進(jìn)行選擇性修飾。以這種方式修飾的淀粉，使發(fā)生老化作用的可能性較小。所產(chǎn)生的低分子量糖類(lèi)可以改善焙烤食品的保水力，而不會(huì)產(chǎn)生可導(dǎo)致成品中的膠粘性的中等長(zhǎng)度糊精。在面包焙烤期間所述酶被失活，因此，該酶可被視為不必在標(biāo)簽上標(biāo)注的操作助劑。幾乎可以排除Novamyl的過(guò)量。
用真菌α-淀粉酶可以改善面包體積，它可以進(jìn)一步改善面包瓤良好而均勻的結(jié)構(gòu)。所述α-淀粉酶是能產(chǎn)生麥芽糖、糊精和葡萄糖的內(nèi)切酶。高于淀粉糊化溫度的溫度會(huì)使谷類(lèi)和某些細(xì)菌α-淀粉酶失活，因此，在加入小麥面團(tuán)中時(shí)它可導(dǎo)致較小的面包體積和粘性面包內(nèi)部。Fungamyl具有不耐熱的優(yōu)點(diǎn)，并在剛好低于糊化溫度時(shí)失活。
含有若干種戊聚糖酶(pentosanase)和半纖維素酶活性的酶制劑可以改善面團(tuán)的加工和穩(wěn)定性，并改善其新鮮度，面包瓤結(jié)構(gòu)和面包體積。
通過(guò)水解面粉中的戊聚糖級(jí)分，可使其失去大部分水結(jié)合力，這部分水便可以供淀粉和谷蛋白使用。所述谷蛋白變得更有柔性和可延伸性，并使所述淀粉變得更易于糊化?？蓪⑽炀厶敲概c乳化劑組合使用或替代乳化劑。
另外，糖酶可用于由淀粉生產(chǎn)糖漿，所述糖漿被廣泛用于軟飲料、甜食、肉制品、乳制品、面包類(lèi)產(chǎn)品、冰淇淋、嬰兒食品、果醬等。
淀粉的轉(zhuǎn)化通常是分三步進(jìn)行的。
首先，用α-淀粉酶使淀粉液化。獲得主要由寡糖和糊精構(gòu)成的麥芽糖糊精。
然后用淀粉葡糖苷酶處理所述混合物，以便將所述寡糖和糊精水解成葡萄糖。這樣可以得到增甜食品。如果需要高麥芽糖糖漿，可以單獨(dú)使用β-淀粉酶或與支鏈淀粉酶(脫支酶)一起使用。
通過(guò)將葡萄糖混合物異構(gòu)化成果糖可以使葡萄糖混合物變得更甜。因此，可使用固定化的葡萄糖異構(gòu)酶。
在制糖工業(yè)中，加速蔗汁中淀粉的分解是常用的措施。由此降低粗糖中淀粉的含量，并有利于在精糖廠進(jìn)行的過(guò)濾。
另外，可將葡聚糖酶用于分解粗糖汁和糖漿中的葡聚糖。
在制醇工業(yè)中，α-淀粉酶適用于稀釋蒸餾的發(fā)酵液中的淀粉。
在釀酒工業(yè)中，將α-淀粉酶用于促進(jìn)液化。
在乳品工業(yè)中，可將β-半乳糖苷酶(乳糖酶)用于生產(chǎn)低乳糖乳，以供患有乳糖吸收障礙的患者使用。
當(dāng)用經(jīng)乳糖酶處理過(guò)的乳生產(chǎn)風(fēng)味奶制飲料時(shí)，可以減少糖的添加量，但不會(huì)降低該制品的甜度。
在生產(chǎn)煉乳時(shí)，通過(guò)乳糖酶處理可避免乳糖結(jié)晶化，并因此而降低因乳糖結(jié)晶中酪蛋白凝固而造成的稠化的危險(xiǎn)。
在用經(jīng)乳糖酶處理過(guò)的乳(或乳清)生產(chǎn)冰淇淋時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生乳糖結(jié)晶，而且不會(huì)出現(xiàn)缺陷、砂粒。
另外，正如在WO94/21785(Novo Nordisk A/S)中所披露的。已知木聚糖酶可用于若干食品/飼料工業(yè)目的。
將α-淀粉酶用于動(dòng)物飼料工業(yè)，將其加至含有谷物的飼料中，改善淀粉的可消化性?？刮⑸锒嚯脑谌忸?lèi)加工業(yè)中，可將某些細(xì)菌分解酶用于諸如清洗胴體的目的(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,354,681,Novo Industri A/S)。轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明的具有減弱的變應(yīng)原性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶適用于生產(chǎn)食品和飼料。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有交聯(lián)蛋白質(zhì)的能力。
可將上述特性用于含有蛋白質(zhì)的水相的膠凝。可將其用于生產(chǎn)涂抹食品(Novo Nordisk A/S的WO96/08156)。
可將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于改善面粉的烘烤品質(zhì)，例如，通過(guò)對(duì)小麥面粉進(jìn)行修飾將其用于制成具有改進(jìn)的特性的餅，如改善的風(fēng)味、口勁、口感和較大的體積(參見(jiàn)JP1-110147)。
另外，可用于生產(chǎn)糊類(lèi)食品材料，用于食品(諸如冰淇淋、糕點(diǎn)表面裝飾物(toppings)、冷凍甜食、蛋黃醬和低脂肪涂抹食品)中的脂肪替代物(參見(jiàn)WO93/22930,Novo Nordisk A/S)。
另外，可以由乳和乳類(lèi)制品制成用于酸牛乳、木斯、干酪、布丁、橙汁的凝膠，并與碎肉末結(jié)合，改善食品蛋白的口味和結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)WO94/21120和WO94/21129,Novo,Nordisk A/S)。肌醇六磷酸酶本發(fā)明的肌醇六磷酸酶適用于生產(chǎn)食品，如早餐谷物食品、餅、甜食、飲料、面包或湯等，以及動(dòng)物飼料。
肌醇六磷酸酶可用于利用植物蛋白源中所存在的肌醇六磷酸酯/肌醇六磷酸中所結(jié)合的磷，或用于利用結(jié)合于肌醇六磷酸復(fù)合物中的重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的礦物質(zhì)。
可將微生物的肌醇六磷酸酶加入單胃動(dòng)物的飼料中，以免為其飼料添加無(wú)機(jī)磷(參見(jiàn)US專(zhuān)利3,297,548)。
還可將肌醇六磷酸酶用于大豆加工。大豆粉可以含有高含量的抗?fàn)I養(yǎng)因子肌醇六磷酸，它使得這種蛋白源不適用于嬰兒食品、和魚(yú)、牛犢和其它非反芻動(dòng)物的飼料，因?yàn)榧〈剂姿峥梢则掀渲兴嬖诘谋匦璧V物質(zhì)(參見(jiàn)EP0420358)。
肌醇六磷酸酶同樣可用于烘烤目的，通過(guò)烘烤分開(kāi)的含有小麥面粉等和肌醇六磷酸酶的面團(tuán)，可以制成具有較高質(zhì)量的面包(參見(jiàn)JP-0-3076529-A)。
已知具有高肌醇六磷酸酶活性的日本酒曲(koji mold)可用于生產(chǎn)精制日本清酒(參見(jiàn)JP-0-6070749-A)。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的修飾多肽用于減弱工業(yè)組合物的變應(yīng)原性的用途和上述產(chǎn)品。材料和方法材料酶Neutrase衍生自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶，Neutrase的序列如SEQ ID NO:6所示。
PD498枯草菌素型蛋白酶，如WO93/24623所示。PD498的序列如SEQ ID NO:1和2所示。
枯草菌素DY枯草菌素型蛋白酶，如從芽孢桿菌屬的種之變體分離出的SEQ ID NO:3所示(Betzel等，(1993)，生物物理文獻(xiàn)(Archives of Biophysics)，第302卷，2,p.499-502)。ELISA試劑辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的豬抗兔-Ig(Dako,DK,P217，稀釋1∶1000)大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀釋1∶100)。小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀釋1∶200)。
生物素-標(biāo)記的小鼠抗大鼠IgG1單克隆抗體(Zymed03-9140；稀釋1∶1000)。
生物素-標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG1單克隆抗體(Serotec MCA336B；稀釋1∶2000)。
抗生蛋白鏈菌素-辣根過(guò)氧化物酶，(Kirkegard & Perry14-30-00；稀釋1∶1000)。緩沖液和溶液-PBS(pH7.2(1升))NaCl8.00克KCl 0.20克K2HPO41.04克KH2PO40.32克-洗滌緩沖液PBS,0.05％(體積/體積)Tween20-封閉緩沖液PBS,2％(重量/體積)脫脂乳粉-稀釋緩沖液PBS,0.05％(體積/體積)Tween20,0.5％(重量/體積)脫脂乳粉-檸檬酸鹽緩沖液(0.1M,pH 5.0-5.2(1升))檸檬酸鈉20.60克檸檬酸 6.30克
-終止液(DMG-緩沖液)-硼酸鈉，borax(Sigma)-3,3-二甲基戊二酸(Sigma)-CaCl2(Sigma)-Tween20聚氧乙烯失水山梨單月桂酸鹽(Merck cat,822184)-N-羥基琥珀酰亞胺(Fluka art.56480)-光氣(Fluka art.79380)-乳糖(Merck7656)-購(gòu)自Sigma公司的PMSF(苯基甲基磺?；?-琥珀基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)-硝基N-酰苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma S-7388，分子量624.6克/摩爾。-mPEG(Fluka)著色底物OPD鄰-亞苯基二胺，(Kementec cat4260)試驗(yàn)動(dòng)物Brown Norway大鼠(購(gòu)自Charles River,DE)設(shè)備XCELⅡ(Novex)ELISA讀數(shù)器(UVmax，分子設(shè)備)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75色譜柱，購(gòu)自Pharmacia,SW的Mono-Q,Mono-SSLT購(gòu)自SLT實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司的光學(xué)儀(Fotometer)體積排阻色譜(Spherogel TSK-G2000 SW)體積排阻色譜(Superdex 200,Pharmacia,SW)Amicon Cell方法Brown Norwav大鼠的氣管內(nèi)(IT)刺激對(duì)于分子的IT給藥，使用帶有2 1/2”長(zhǎng)金屬針的一次性吸管。將針注入位于會(huì)厭下約1厘米處的大鼠氣管中，注入0.1毫升分子溶液。
試驗(yàn)動(dòng)物是10組Brown Norway大鼠(BN)。起始重量大于200克，結(jié)束時(shí)的重量約為450克。用于確定Brown Norway大鼠中IgE抗體的相對(duì)濃度的ELISA方法用三層夾心ELISA方法確定特定IgE血清抗體的相對(duì)濃度。
1)用10毫克小鼠抗大鼠IgE緩沖液1(50微升/孔)涂覆ELISA板，并在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
2)清空該板，并用封閉緩沖液在室溫下對(duì)該板進(jìn)行至少半小時(shí)的封閉(200微升/孔)。輕輕搖動(dòng)，并用洗滌緩沖液洗滌該板3次。
3)用大鼠血清(50微升/孔)培養(yǎng)，開(kāi)始時(shí)未稀釋?zhuān)缓笥?倍稀釋液稀釋。在一些孔中僅僅加入緩沖液4(空白)。在室溫下培養(yǎng)30分鐘。輕輕搖動(dòng)，并在洗滌緩沖液中洗滌該板3次。
4)將稀釋緩沖液中的酶稀釋至適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度。
將50微升/孔在室溫下培養(yǎng)30分鐘。輕輕搖動(dòng)，并在洗滌緩沖液中洗滌該板3次。
5)稀釋特定的多克隆抗酶抗血清血清(pIg)，以檢測(cè)在稀釋緩沖液中結(jié)合的抗體。將50微升/孔在室溫下培養(yǎng)30分鐘。輕輕搖動(dòng)，并在洗滌緩沖液中洗滌該板3次。
6)在稀釋緩沖液中稀釋辣根過(guò)氧化物酶-綴合的抗-pIg-抗體。將50微升/孔在室溫下培養(yǎng)30分鐘。輕輕搖動(dòng)，并在洗滌緩沖液中洗滌該板3次。
7)在底物緩沖液中混合0.6毫克ODP/毫升+0.4微升H2O2/毫升。恰好在使用之前制備該溶液。培養(yǎng)10分鐘。50微升/孔。
8)為終止反應(yīng)，加入50微升終止溶液/管。
9)以620納米為參照，在492納米處對(duì)該板讀數(shù)。
計(jì)算數(shù)據(jù)，并由Lotus表示。分子量的確定通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法用4-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)的電泳分離(Novex)。通過(guò)銀染色法檢測(cè)蛋白質(zhì)。用相對(duì)于Novex的Mark-12寬泛圍分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移率測(cè)量分子量。蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切斷了肽和對(duì)硝基苯胺之間的鍵，在405納米處給出可見(jiàn)的黃色吸收。
緩沖液例如Britton和Robinson緩沖液，pH為8.3。
底物將100毫克suc-AAPF-pNa溶解于1毫升二甲亞砜(DMSO)中。用Britton和Robinson緩沖液將100ml該溶液稀釋成10毫升。
分析將底物和蛋白酶溶液混合，監(jiān)測(cè)在405納米處的吸收，它是時(shí)間和ABS405納米/分鐘的函數(shù)。應(yīng)該控制溫度(20-50℃，取決于蛋白酶)。這是檢測(cè)樣品中的酶活性的方法。
加入甲苯(干燥的4毫升/克聚合物)以再次溶解油狀物。加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(2.4摩爾/摩爾聚合物)，并用冰浴冷卻該混合物。于0℃逐滴加入三乙胺(2.2摩爾/摩爾聚合物)?？捎^察到鹽酸化三乙胺(Et3N.HCl)立即沉淀。然后于室溫將該混合物攪拌過(guò)夜。用玻璃料(G5)過(guò)濾該混合物，以除去Et3N.HCl。減壓蒸發(fā)濾液直至干燥狀態(tài)，以生成97％(摩爾/摩爾)油狀物。NMR顯示大于90％的活化和小于8％(摩爾/摩爾)的未結(jié)合的NHS。聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)1.900雙(碳酸琥珀酰亞胺基酯)(50重量％乙二醇)的1H-NMR(400兆赫茲)(CDCl3),δ:1.15bs(I=330,PPG中的-CH3),2.69s(I=1.7，未反應(yīng)的NHS),2.83s(I=41琥珀酰亞胺)，3.41m(I=110,PPG中的CH-CH2),3.55m(I=220,PPG中的CH-CH2),3.61m(I=440，主峰)，4.46t(I=19,PEG中的CH2-O-CO-)。
加入甲苯(干燥的2.5毫升/克聚合物)以再次溶解油狀物。室溫下加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(2.4摩爾/摩爾聚合物)。逐滴加入三乙胺(2.2摩爾/摩爾聚合物)?？捎^察到鹽酸化三乙胺(Et3N.HCl)立即沉淀。然后于室溫將該混合物攪拌21小時(shí)。用玻璃料(G5)過(guò)濾該混合物，以除去不溶解的Et3N.HCl。減壓蒸發(fā)濾液直至干燥狀態(tài)，以生成96％(摩爾/摩爾)油狀物。NMR顯示大于70％的活化和小于26％(摩爾/摩爾)的未結(jié)合的NHS。聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)2.900雙(碳酸琥珀酰亞胺基酯)(約40重量％乙二醇)的1H-NMR(400兆赫茲，CDCl3),δ:1.15bs(I=1000，丙二醇中的-CH3),2.68s(I=10.6，未反應(yīng)的NHS),2.84s(I=61.7，琥珀酰亞胺)，3.40m(I=318，丙二醇中的-CH-CH2),3.55m(I=668，丙二醇中的-CH-CH2-),3.61m(I=1022主峰，乙二醇中的-CH2-CH2-),4.46t(I=25.7,-CH2-O-CO-)。
加入甲苯(干燥的2毫升/克聚合物)以再次溶解油狀物。于室溫加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(1.2摩爾/摩爾聚合物)。于0℃逐滴加入三乙胺(1.1摩爾/摩爾聚合物)。可觀察到鹽酸化三乙胺(Et3N.HCl)立即沉淀。于室溫將該混合物攪拌過(guò)夜。然后用玻璃料(G5)過(guò)濾該混合物，以除去不溶解的Et3N.HCl。減壓蒸發(fā)濾液直至干燥狀態(tài)，以生成89％(摩爾/摩爾)油狀物。NMR顯示大于72％的活化和小于5％(摩爾/摩爾)的未結(jié)合的NHS。聚(乙二醇)-共聚-(丙二醇)單丁基醚970碳酸琥珀酰亞胺基酯(約50重量％乙二醇)的1H-NMR(400兆赫茲，CDCl3),δ:0.91t(I=1000，丁基的-CH3),1.15bs(I=8744，丙二醇中的-CH3),1.39m(I=1320，丁基的CH3-CH2-CH2-),1.55m(I=656，丁基的-CH2-O-),2.68s(I=60.8，未反應(yīng)的NHS),2.83s(I=963.2，琥珀酰亞胺)，3.40m(I=3059，丙二醇中的CH-CH2),3.55m(I=2678，丙二醇中的CH-CH2),3.61m(I=1764主峰，乙二醇中的-CH2-CH2-),4.46m(-CH2-O-CO-)。實(shí)施例4用共聚物和嵌段聚合物修飾的蛋白酶的變應(yīng)原性潛力的評(píng)價(jià)將各樣品稀釋成0.015毫克蛋白質(zhì)/毫升，并等分為1.5毫升。將這些級(jí)分在使用前于-20℃保存。另外，將100微升的各級(jí)分在實(shí)驗(yàn)室冰箱中于-20℃在研究開(kāi)始時(shí)、中途和結(jié)束時(shí)進(jìn)行免疫化學(xué)分析。對(duì)每次免疫和每次分析使用新的級(jí)分。
用100微升上述蛋白質(zhì)稀釋液進(jìn)行20次氣管內(nèi)免疫。這樣，第1組為未修飾的PD498，第2組為PD498-EO50PO50970，第3組為未修飾的枯草菌素DY(CDJ31)，第4組為枯草菌素DY(CDJ31)-EO50PO50970，第5組為枯草菌素DY(CDJ31)-EO40PO602900，第6組為Neutrase，第7組為Neutrase-EO50PO50970。各組包括10只大鼠。對(duì)照大鼠接受100微升0.9％NaCl。每2次免疫后一星期從眼睛中收集血樣(2毫升)。通過(guò)血凝集獲得血清，并離心。
特定IgE水平通過(guò)ELISA方法測(cè)定。圖中顯示，與未修飾的酶相比，修飾酶的IgE反應(yīng)減弱。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>多肽-聚合物綴合物<130>seq<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>840<212>DNA<213>芽孢桿菌屬的種PD498<400>1tggtcaccga atgaccctta ctattctgct taccagtatg gaccacaaaa cacctcaacc 60cctgctgcct gggatgtaac ccgtggaagc agcactcaaa cggtggcggt ccttgattcc 120ggagtggatt ataaccaccc tgatcttgca agaaaagtaa taaaagggta cgactttatc 180gacagggaca ataacccaat ggatcttaac ggacatggta cccatgttgc cggtactgtt 240gctgctgata cgaacaatgg aattggcgta gccggtatgg caccagatac gaagatcctt 300gccgtacggg tccttgatgc caatggaagt ggctcacttg acagcattgc ctcaggtatc 360cgctatgctg ctgatcaagg ggcaaaggta ctcaacctct cccttggttg cgaatgcaac 420tccacaactc ttaagagtgc cgtcgactat gcatggaaca aaggagctgt agtcgttgct 480gctgcaggga atgacaatgt atcccgtaca ttccaaccag cttcttaccc taatgccatt 540gcagtaggtg ccattgactc caatgatcga aaagcatcat tctccaatta cggaacgtgg 600gtggatgtca ctgctccagg tgtgaacata gcatcaaccg ttccgaataa tggctactcc 660tacatgtctg gtacgtccat ggcatcccct cacgtggccg gtttggctgc tttgttggca 720agtcaaggta agaataacgt acaaatccgc caggccattg agcaaaccgc cgataagatc 780tctggcactg gaacaaactt caagtatggt aaaatcaact caaacaaagc tgtaagatac 840<210>2<211>280<212>PRT<213>芽孢桿菌屬的種PD498<400>2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser
100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 18 5190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280<210>3<211>274<212>PRT<213>芽孢桿菌屬的種的變體<400>3Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly3540 45Ala Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly65 70 75Val Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu80 85 90 95Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu
100 105 110Trp Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala130 135 140Ser Gly Ile Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly145 150 155Ser Gln Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala160 165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Lys Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly (Ala/Ser) Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Val Ser Val Tyr Ser195 200 205Thr Tyr Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala210 215 220Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Tyr Pro225 230 235Thr Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr240 245 250Asn Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu255 260 265 270Ala Ala Ala Gln<210>4<211>433<212>PRT<213>芽孢桿菌屬的種Y<400>4Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Leu Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Ser Asp50 55 60Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala65 70 75 80Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile85 90 95Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr
100 105 110Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser115 120 125Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val130 135 140Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly145 150 155160Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys165 170 175Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly180 185 190Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly195 200 205Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr210 215 220Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp225 230 235 240Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala245 250 255Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile260 265 270Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu275 280 285Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln290 295 300Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val305 310 315 320Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe325 330 335Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp340 345 350Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp355 360 365Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe370 375 380Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn385 390 395 400Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln405 410 415Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val420 425 430His<210>5<211>316<212>PRT<213>Bacillus thermoproteolyticus<400>5Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp1 5 10 15Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp20 25 30Asn Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr35 40 45Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala50 55 60Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr65 70 75 80Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn85 90 95Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn100 105 110Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln115 120 125Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu130 135 140Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu145 150 155 160Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val165170 175Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val180 185 190Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro195 200 205Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr210 215 220Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala225 230 235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu ThrGln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 315<210>6<211>300<212>PRT<213>解淀粉芽孢桿菌<400>6Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser1 5 10 15Leu Asn Ile Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser20 25 30Lys Pro Thr Gly Thr Gln Ile Ile Thr Thr Asp Leu Gln Asn Arg Glu35 40 45Tyr Asn Leu Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr50 55 60Thr Ser Ser Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys65 70 75 80Val Tyr Asp Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Asp Asn85 90 95Lys Gly Gly Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn100 105 110Asn Ala Ala Trp Ile Gly Asp Gln Met Ile Tyr Gly Asp Gly Asp Gly115 120 125Ser Phe Phe Ser Pro Leu Ser Gly Ser Met Asp Val Thr Ala His Glu130 135 140Met Thr His Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn145 150 155 160Gln Pro Gly Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe165 170 175Asn Asp Thr Glu Asp Trp Asp Ile Gly Glu Asp Ile Thr Val Ser Gln180 185 190Pro Ala Leu Arg Ser Leu Ser Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Gln Pro Asp195 200 205Asn Phe Lys Asn Tyr Lys Asn Leu Pro Asn Thr Asp Ala Ala Ala Thr210 215 220Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Ile225 230 235 240Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser Lys Pro Thr245 250 255Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu Tyr Asn Leu260 265 270Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr Thr Ser Ser275 280 285Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly290 295 300
權(quán)利要求
1．一種多肽-聚合物綴合物，它含有與親代多肽共價(jià)偶聯(lián)的一種或多種聚合物，其中所述聚合物由以下通式表征EOxPOy(Ⅰ)其中x=1-99％,y=1-99％，且x+y=100％。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中x=10-90％,y=10-90％，且x+y=100％。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的綴合物，其中所述聚合物的分子量為100-100,000Da，特別是100-50,000Da，尤其是100-10,000Da。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3的綴合物，其中所述親代多肽的分子量為1-100kDa，尤其是分子量為15-60kDa的酶。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述嵌段或共聚物含有氧化乙烯單元(EO)和氧化丙烯單元(PO)，其比例在10∶90或20∶80或30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20或90∶10的范圍內(nèi)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的綴合物，其中1-100個(gè)聚合物分子、優(yōu)選4-50個(gè)、特別是5-35個(gè)聚合物分子與所述親代酶共價(jià)偶聯(lián)。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述多肽是微生物來(lái)源的，例如細(xì)菌、絲狀真菌或酵母來(lái)源的。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述多肽是一種酶，選自水解酶，包括蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶，例如枯草菌素和金屬蛋白酶，或脂酶，或氧化還原酶，如漆酶和鹵過(guò)氧化物酶，或超氧化物歧化酶。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述親代蛋白酶選自PD498、Savinase、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草菌素DY、lionY、Alcalase、蛋白酶T、Neutrase和JA16。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述酶是SEQ ID NO:1所示的PD498、或SEQ ID NO:3所示的枯草菌素型蛋白酶枯草菌素DY、或SEQ ID NO:4所示的lionY、或SEQ ID NO:5所示的金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶、或SEQ ID NO:6所示的Neutrase。
11．一種含有根據(jù)權(quán)利要求1-10的綴合物的工業(yè)組合物。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的工業(yè)組合物，其中該組合物含有已知用于個(gè)人護(hù)理組合物、尤其是護(hù)膚組合物的組分。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的工業(yè)組合物，它是一種洗滌劑，例如洗衣洗滌劑組合物、洗碟組合物或硬表面清洗組合物。
14．根據(jù)權(quán)利要求11的工業(yè)組合物，它是這樣的組合物，如食品或飼料添加劑，尤其是用于生產(chǎn)面包等的添加劑。
15．根據(jù)權(quán)利要求11的工業(yè)組合物，它是用于處理織物的組合物。
16．將權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的綴合物用于減弱根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的工業(yè)組合物的呼吸變應(yīng)原性的用途。
17．一種用于減弱多肽的變應(yīng)原性的方法，包括將如權(quán)利要求1-3、5、6中任一項(xiàng)所定義的嵌段或共聚物與權(quán)利要求4、7-10中任一項(xiàng)的親代多肽偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽－聚合物綴合物,它含有與親代多肽共價(jià)偶聯(lián)的一種或多種聚合物,其中所述聚合物由通式:EO
文檔編號(hào)A61K8/00GK1312857SQ9980889
公開(kāi)日2001年9月12日 申請(qǐng)日期1999年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月23日
發(fā)明者H－J·杜森, A·A·奧爾森, T·M·法特姆, E·L·羅根 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲有限公司