專利名稱：穩(wěn)定的基因制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為有關(guān)用于基因治療的穩(wěn)定的基因制劑。更為詳細地說，本發(fā)明有關(guān)的制劑含有在制造過程中及組合物的保存穩(wěn)定性良好的基因或含有導(dǎo)入了該基因的載體。
背景技術(shù)：
近年來，以治療或預(yù)防疾病、特別是遺傳病為目的的基因治療開始了試驗性的臨床應(yīng)用。在基因治療研究的初期，基于導(dǎo)入細胞基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)高效率主要研究了以病毒用作載體的方法。但是，自從發(fā)現(xiàn)將有自己翻譯能力的質(zhì)粒DNA(pDNA)直接投入到動物的肌肉內(nèi)后能夠表達遺傳信息以來，由于pDNA比病毒載體有較高的安全性，且易于工業(yè)化生產(chǎn)，于是用pDNA的基因治療法開始了廣泛的研究。
在用pDNA基因治療的基礎(chǔ)研究中，現(xiàn)在最為關(guān)注的是提高pDNA向細胞的導(dǎo)入效率和延長遺傳信息的表達期。已經(jīng)報道了以提高pDNA的細胞導(dǎo)入效率為目的將pDNA封入陽離子性的脂質(zhì)體的方法及與聚合物形成復(fù)合體的方法。而且，也報道了以延長遺傳信息表達期為目的用與生物體親和性高的膠原蛋白(特開平9-71542)或聚乙酸乙烯酯(Journal of Controlled Release 47,123,(1997))為載體的緩釋性制劑。盡管這些問題已獲解決，但是含有基因的基因制劑本身如果不能保持一定的高品質(zhì)、穩(wěn)定且經(jīng)濟地供給的話，基因治療實際上就不能得到廣泛的推廣。
在制劑的制造或保存中保持基因制劑中有效成分基因的生物活性的穩(wěn)定性是重要的。眾所周知，將閉環(huán)狀的pDNA用限制性酶切斷、將其置入肌肉內(nèi)后，其遺傳信息的表達降低到投入閉環(huán)狀的pDNA時的10％。因此，為了保持基因的生物活性，在制造和各種可以預(yù)料條件下的保存中保持pDNA的一級結(jié)構(gòu)是很重要的。
盡管在前述的基礎(chǔ)研究中有一部分報告提及了pDNA保存時的穩(wěn)定性(Proceedings of National Academy of Sciences of the USA,93,7305(1996))，但是，關(guān)于基因制劑的制造或制劑的穩(wěn)定性至今還未進行過系統(tǒng)的探討。如同后述的試驗例所示，將單獨含有pDNA，或者為提高pDNA導(dǎo)入效率或為延長基因表達時間而添加了化合物的基因配制品置于制劑化工藝中一般使用的冷凍干燥條件下，或者置于適當?shù)谋３制淦焚|(zhì)穩(wěn)定的保存狀態(tài)下的話，有效成分pDNA便被分解，生物活性顯著受損。
發(fā)明公開本發(fā)明者以獲得穩(wěn)定的基因制劑為目的進行了銳意研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有pDNA的溶液中添加了糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸(除氨基酸外)時，或者是在含有膠原或明膠時添加了氨基酸類的情況下，溶液狀態(tài)的保存過程中和/或該溶液的凍結(jié)干燥工藝中和/或該溶液的干燥品在保存過程中其pDNA的分解受到了大大地抑制?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
本發(fā)明一種方式是穩(wěn)定的基因制劑，它含有所需的基因或?qū)肓怂杌虻妮d體、和至少一種糖類和/或至少一種非疏水性氨基酸和/或至少一種具有兩個以上羧基的有機酸(氨基酸除外)。
具體的說糖類是單糖、二糖、三糖以上的寡糖或它們的糖醇。更具體地說它們是葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇或甘露醇。
非疏水性氨基酸類具體地說是谷氨酸、天門冬氨酸或其鹽。
含有一種具有兩個以上羧基的有機酸具體為有2個或3個羧基的有機酸或他們的鹽，更具體地是指檸檬酸或酒石酸。
導(dǎo)入了所需基因的載體具體地說是質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明的基因制劑也可以含有促進基因?qū)爰毎奈镔|(zhì)、或醫(yī)學(xué)上允許的添加劑。促進基因?qū)爰毎奈镔|(zhì)有陽離子性脂質(zhì)、陽離子性聚合物或疏水性聚合物。醫(yī)學(xué)上允許的添加劑為有生物體親和性的材料。
本發(fā)明的基因制劑中含有的所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體可以被生物體親和性材料所擔載。生物體親和性材料具體地說是指膠原、明膠或它們的混合物。
本發(fā)明包括將含有所需基因或含有導(dǎo)入了所需基因的載體的溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的配制品經(jīng)干燥工藝、最好是凍結(jié)干燥而得到的本發(fā)明基因制劑。
另外，本發(fā)明包括在溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的基因制劑或經(jīng)過溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)、或者是懸濁液狀態(tài)的工藝制造的基因制劑中，在溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)、或者是懸濁液狀態(tài)中的糖類、非疏水性氨基酸類及有2個以上羧基的有機酸(氨基酸除外)類相對于總體的含量約為1W/V％以上的本發(fā)明基因制劑。
本發(fā)明的另一種方式涉及基因制劑穩(wěn)定化的方法，該方法包括向含有所需基因或?qū)肓怂杌蜉d體的基因配制品中加入至少一種糖類和/或至少一種非疏水性氨基酸和/或至少一種具有兩個以上羧基的有機酸(氨基酸除外)。
進一步的，本發(fā)明的另一種方式涉及通過將本發(fā)明的基因制劑給予生物體進行基因治療的方法。
本發(fā)明還有一種方式涉及含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體、至少含有一種氨基酸，及生物體親和性材料、特別是膠原或明膠的穩(wěn)定性基因制劑。相關(guān)的基因制劑進一步地可以含有促進基因?qū)爰毎奈镔|(zhì)，例如陽離子性脂質(zhì)、陽離子性聚合物或疏水性聚合物。本發(fā)明包括有如下特征的基因制劑，該制劑的所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體被生物體親和性材料、特別是膠原或明膠所擔載為特征。
在這樣的方式中本發(fā)明包括將含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體的溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的配制品經(jīng)干燥狀態(tài)特別是凍結(jié)干燥而得到的本發(fā)明基因制劑。
另外，本發(fā)明包括，在溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的基因制劑或者是經(jīng)溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)工程而制造的基因制劑中，溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)中的氨基酸相對于總體的含量為1％W/V以上的本發(fā)明基因制劑。
作為另外一種方式，本發(fā)明涉及基因制劑穩(wěn)定化的方法，包括向含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體和生體材料、特別是膠原或明膠的基因配制品中加入至少一種以上的氨基酸類。
作為另一種方式，本發(fā)明涉及將上述本發(fā)明基因制劑給與生物體的基因治療方法。
圖的簡單說明

圖1為含有氨基酸的基因制劑中(實施例1)所含pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖2為含有糖類的基因制劑中(實施例2)所含pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖3為含有帶2個羧基的有機酸和氨基酸的基因制劑中(實施例3)所含pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖4為含有糖類和基因?qū)氪龠M成分的基因制劑中(實施例4)所含pCAHST-l的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖5為將含有糖類的基因制劑(實施例2)在40℃條件下保存后pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖6為含有糖類和基因?qū)氪龠M成分的基因制劑(實施例4)經(jīng)37℃4周保存后pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖7為含有糖類和基因?qū)氪龠M成分的基因制劑(實施例5)經(jīng)40℃4周保存后pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖8為含有膠原的海棉狀基因制劑(實施例7)所含pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖9為含有膠原的棒狀基因制劑(實施例8)所含pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)評價結(jié)果的電泳照片。
圖10為含有膠原的棒狀基因制劑(實施例8)在血中pCAHST-1的檢出時間的圖。
圖11為含有膠原的棒狀基因制劑(實施例8)在血中HST-1濃度隨時間變化的圖。
圖12為試驗例10中投藥部位的HST-1量隨時間變化的圖。
圖13為實施例10在血中的血小板數(shù)隨時間變化的圖。
圖14為含有氨基酸的基因制劑(實施例9)所含pCAHST-1凍結(jié)干燥時的穩(wěn)定化度的圖(試驗例11)。
圖15為含有糖類的基因制劑(實施例10)所含pCAHST-1凍結(jié)干燥時的穩(wěn)定化度的圖(試驗例12)。
圖16為含有脂肪變性(athero)膠原和氨基酸的基因制劑(實施例11)所含pCAHST-1凍結(jié)干燥時的穩(wěn)定化度的圖(試驗例13)。
圖17為含有脂肪變性膠原和糖類的基因制劑(實施例12)中pCAHST-1凍結(jié)干燥時的穩(wěn)定化度(試驗例14)。
圖18為含有氨基酸的基因制劑(實施例9)和含有糖類基因制劑(實施例10)在40℃條件下保存時的pCAHST-1穩(wěn)定化度的圖(試驗例15)。
圖19為含有脂肪變性膠原和氨基酸的基因制劑(實施例11)和含有脂肪變性膠原和糖類的基因制劑(實施例12)在40℃條件下保存時的pCAHST-1穩(wěn)定化度的圖(試驗例16)。
本發(fā)明的最佳實施方式如上所述，本發(fā)明的主要內(nèi)容是含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體和至少一種糖類和/或至少一種非疏水性氨基酸和/或至少一種有2個以上羧基的有機酸的穩(wěn)定基因制劑；以及含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體、膠原或明膠及至少一種氨基酸類的穩(wěn)定基因制劑。另一方面本發(fā)明的制劑是這些含有糖類、非疏水性氨基酸和/或有機酸，或者含有膠原或明膠及氨基酸使所含基因或載體更穩(wěn)定的穩(wěn)定化增強(分解抑制作用)制劑。
“所需基因”只要是可以進行基因治療的基因便可。在此，所謂的基因治療是指用基因進行治療的意思。例如，基因治療時編碼要求表達的蛋白質(zhì)遺傳信息的基因、和細胞內(nèi)特定的DNA及RNA相對應(yīng)抑制基因表達的反義序列。反義序列不導(dǎo)入載體也可使用。
作為“導(dǎo)入了所需基因的載體”，在導(dǎo)入細胞的時候優(yōu)選在細胞內(nèi)表達編碼的遺傳信息的形態(tài)、含有啟動子等表達目的基因所需的要素，或者含有可以導(dǎo)入染色體的要素，例如pDNA。
本發(fā)明的基因制劑中即使同時存在導(dǎo)入了其他所需基因的數(shù)種載體也可以。另外，一個載體即使編碼了復(fù)數(shù)的遺傳信息也可以。對基因制劑中含有的載體的量沒有特別的限制。
基因治療時編碼要求表達的蛋白質(zhì)的基因例如可以用于遺傳病的處置的基因，如編碼腺苷脫氨酶、脫氧胸腺嘧啶核苷酶等酶類，GM-CSF、IL-2等細胞因子類、或成纖維細胞增殖因子HST-1(FGF4)的基因，但并不僅僅限于這些因子。另外，作為基因治療時編碼要求表達的其他蛋白質(zhì)的基因是以下述內(nèi)容為目的基因。即以表達的蛋白質(zhì)或肽為抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，進行感染癥或腫瘤的預(yù)防或治療。也就是說，編碼上述成為抗原的蛋白質(zhì)或肽的基因，例如編碼流感病毒的表面蛋白質(zhì)HA和NA或核蛋白質(zhì)NP的各種蛋白質(zhì)、丙型肝炎病毒的E2和NS1蛋白質(zhì)、乙型肝炎病毒的HBs抗原蛋白質(zhì)、甲型肝炎病毒的衣殼蛋白質(zhì)VP1和VP3、或者是類衣殼蛋白質(zhì)、登革熱病毒的Esp蛋白質(zhì)、RS病毒的F或G蛋白質(zhì)、狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)G和N蛋白質(zhì)、皰疹病毒的gD蛋白質(zhì)、日本腦炎病毒的E1或pre-M蛋白質(zhì)、輪狀病毒的外殼蛋白質(zhì)VP7和外殼蛋白質(zhì)VP4、人免疫缺陷病毒的gp120和gp160蛋白質(zhì)、利什曼原蟲的主要表面抗原蛋白質(zhì)、瘧疾生殖芽胞的主要表面抗原蛋白質(zhì)(circum sporozoite protein)、弓漿蟲的54-kd和CS蛋白質(zhì)、導(dǎo)致齲齒的Streptococcus mutans菌體表層蛋白質(zhì)Pac的基因。另外，還有編碼MAGE-1、MAGE-3或BAGE等癌退縮抗原、及酪氨酸酶、Mart-1、gp100、gp75等組織特異抗原、p15、Mucl、CEA、HPV E6、E7、HPR2/neu等的基因；以及“Immunization with DNA”:Journal of Immunological Methods，176卷，1994年，145-152頁發(fā)表的基因核酸。但是，并不只限這些。
“糖類”是指醫(yī)學(xué)上允許的單糖、二糖、三糖以上的寡糖或者這些糖的糖醇或它們的誘導(dǎo)體。只能添加到本發(fā)明的基因制劑中能改善制劑的穩(wěn)定性，就不限定糖的種類。另外，本發(fā)明基因制劑可以含有兩種以上糖類的混合物。
糖類中單糖例如葡萄糖、半乳糖、果糖等，優(yōu)選葡萄糖；二糖優(yōu)選蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖。
糖醇例如山梨糖醇、甘露醇。優(yōu)選甘露醇。
糖的衍生物例如脫氧糖、氨基糖、磷酸脂類等、以及將這些作為構(gòu)成成分的二糖。
“非疏水性氨基酸”是指氨基酸中具有非疏水性的氨基酸類。在此“非疏水性”是指和水的親和性比較強的性質(zhì)。本發(fā)明中以甘氨酸的水親和性為基準，比它水親和性強的性質(zhì)稱為“非疏水性”。其中將水親和性數(shù)值化的指標記載于Kyte,J.& Doolittele，,R.F.,1982在J.Mol.Biol.157,105-132。根據(jù)這一基準，不是非疏水性的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。“非疏水性氨基酸類”優(yōu)選谷氨酰受、天門冬酰胺、谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉、脯氨酸。最優(yōu)選谷氨酰胺、谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉。
含有膠原或明膠的本發(fā)明制劑中，“氨基酸類”是指醫(yī)學(xué)上允許的氨基酸及其鹽、以及它們的衍生物。如果通過添加到發(fā)明基因制劑中能改變制劑的穩(wěn)定性的話，氨基酸的種類并不限于這些。氨基酸類不僅是谷氨酸或天門冬氨酸等酸性氨基酸，也包括一般氨基酸分類上的堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸、組氨酸、及酸性、堿性以外的氨基酸甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬氨酰胺、谷氨酰胺、異亮氨酸、半胱胺酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸。因此，本發(fā)明中氨基酸類與其水溶液的性質(zhì)無關(guān)，此外也包括存在堿性或中性側(cè)鏈的氨基酸。氨基酸鹽是指鈉鹽、鉀鹽等。含有膠原或明膠的本發(fā)明制劑中的“氨基酸類”優(yōu)選谷氨酰胺、天門冬酰胺、谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸。更優(yōu)選具有削弱膠原和DNA的靜電相互作用的谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉、精氨酸、組氨酸、賴氨酸。最優(yōu)選的為精氨酸、組氨酸。
“具有2個以上羧基的有機酸”是指醫(yī)學(xué)上允許的有2個以上羧基的有機酸(氨基酸除外)及其鹽，以及他們的衍生物。如果通過添加到本發(fā)明的基因制劑中能改善制劑的穩(wěn)定性的話有機酸的種類除氨基酸外沒有特別的限定。
具有2個以上羧基的有機酸及其鹽優(yōu)選含有2個或3個羧基的有機酸及其鹽，更優(yōu)選飽和或不飽和脂肪族的有機酸。2個或3個羧基的有機酸及其鹽是指檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、延胡索酸及其鹽，優(yōu)選檸檬酸、酒石酸的鹽。
本發(fā)明的基因制劑包括以下制劑。含有上述的糖類、非疏水性氨基酸類及有2個以上羧基的有機酸類中任何一種的制劑，以及含有它們當中任意2者或3者全含有的制劑。并且，任何情況下糖類、氨基酸類及有機酸類同時可以含有一種以上。
本發(fā)明的基因制劑中，糖類、非疏水性氨基酸類、含有2個以上羧基的有機酸類的各個含量，或?qū)⑺鼈兓旌鲜褂脮r的總體含量，或者是含有膠原或明膠的本發(fā)明基因制劑中氨基酸的含量最好設(shè)定在對本發(fā)明制劑中含有的基因或載體分解具有抑制效果的量以上。但是，可以根據(jù)該基因或載體的濃度及量或者基因制劑實施的方式進行適當?shù)脑O(shè)定。例如，將pDNA以濃度10μg/ml溶解的NaCl 150mM、及10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液經(jīng)凍結(jié)干燥后可得到目的基因制劑?；蛘呤潜４孢@樣加工干燥的基因制劑時，應(yīng)優(yōu)選含有1％(W/V)以上的糖類和/或非疏水性氨基酸類和/或具有2個以上羧基的有機酸類溶液。其中，干燥前或?qū)嵤└稍飼r溶液狀態(tài)的基因制劑通常采用的pH范圍為pH5-8，優(yōu)選pH6-8，更優(yōu)選pH7-8。
本發(fā)明的基因制劑可以添加醫(yī)學(xué)上允許的添加劑或能夠改善基因表達的物質(zhì)。糖類、氨基酸類及有機酸類的量也可以根據(jù)這些添加劑的種類及量進行變動。
醫(yī)學(xué)上允許的添加劑如生物體親和材料或芝麻油、角鯊烯等油類，但并不僅限于此。
作為添加劑如果使用的生物體親和材料能夠擔載基因或擔載含有該基因載體的話，可以將本發(fā)明的基因制劑做成緩釋性制劑。此處所說的生物體親和性材料如，1)膠原、明膠、血纖維蛋白、白蛋白、透明質(zhì)酸、肝素、硫酸軟骨素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、果膠、瓊脂糖及阿拉伯膠；2)乙醇酸、乳酸、氨基酸的聚合物及這些物質(zhì)的兩個以上的共聚物；及3)羥基磷灰石、聚甲基丙烯甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙稀、聚丙烯及聚稀等。但并不僅限于此。優(yōu)選的例為膠原、明膠或它們的混合物。
此處的“擔載”是指將所需基因或含有該基因的載體均勻地分散或包裹在生物體親和性材料中。
能夠改善基因表達的物質(zhì)可以舉出促進基因向細胞導(dǎo)入或促進基因向核移動的物質(zhì)。前者例如，陽離子性脂質(zhì)、陽離子性聚合物、疏水性聚合物等?！瓣栯x子性脂質(zhì)”如DOTMA(N-(1-(2,3-二(十八碳烯氧))丙基)-N-三甲基銨氯化物、DOSPA(2,3-二(十八碳烯氧)-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟醋酸鹽)、DDAB(二甲基二(八甲苯基)銨溴化物)、TM-TPS(N,NⅠ,NⅡ,NⅢ-四甲基-N’,N”,N-四軟脂?；?、DMRIE(1,2-二肉豆蔻?；醣?3-二甲基羥乙基銨溴化物)、N-(α-三甲基銨乙?；?-二(十二烷基)-D-谷氨酸鹽氯化物(Biochemical Biophysical ResearchCommunication,196,1042(1994)等，也可以使用這些陽離子性脂質(zhì)和DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)等中性脂質(zhì)構(gòu)成的陽離子性脂質(zhì)體，陽離子性脂質(zhì)和膽固醇的混合物?！瓣栯x子性聚合物”是和基因具有靜電作用的聚合物，例如，DOGS(二(十八烷酰胺甘氨酰精胺)等脂聚胺、AlkCWK18等肽、聚賴氨酸及其衍生物(Proceedings of Academy Sciences of the USA,89,6094(1992))等陽離子聚氨基酸及其衍生物、聚乙烯亞胺、聚酰胺、枝接共聚物等。疏水性聚合物是和基因有疏水性相互作用的聚合物。例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。此外，AlkCWD18等肽也可以使用。在此所指陽離子性脂質(zhì)體如，以1∶1含有DOSPA和DOPE的LIPOFECTAMINE注冊商標，Life Technologids,Inc.，羅可維爾，MD.USA)，以1∶1含有DOTMA和DOPE的脂質(zhì)體，以1∶2.5含有DDAB和DOPE的LIPOFECTACE(注冊商標，Life Technologise,Inc.，羅可維爾，MD.USA)，以1∶1.5含有TM-TPS和DOPE的CELLFECTIN(注冊商標Life Technologise,Inc.，羅可維爾，MD.USA)等，但并不限于這些。此外，此處所言陽離子性脂質(zhì)和膽固醇的混合物以下列物質(zhì)為例，如DMRIE和膽固醇的摩爾比為1∶1的混合物DMRIE-C(Life Techmologise,Inc.，羅可維爾，MD.USA)?；蛘呤菫榱艘种萍毎麅?nèi)的核內(nèi)體引起的基因分解，也可以使用具有將核內(nèi)體的內(nèi)容物放出的能力的惰性化病毒、CHEMS(膽固醇半琥珀酸嗎啉鹽)等。
作為促進基因向核移動的物質(zhì)，如，HMG-1、2混合物等(highmobility group-1,2 mixture實驗醫(yī)學(xué)，12,184(1994))。
關(guān)于本發(fā)明的基因制劑的形態(tài)沒有特殊的限制，例如，可以是溶液狀、懸濁狀、凝膠狀、海棉狀、粉末狀、微粒狀、棒狀、膜狀等形態(tài)。
溶液狀基因制劑的制造方法可例舉如下1)按需要在添加了添加劑并含有所需基因或含該基因的載體的溶液中加入糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，經(jīng)溶解后制得均一的、溶液狀態(tài)的基因制劑的方法；及2)按需要在添加了添加劑并含有所需基因或含該基因的載體的溶液中加入糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，經(jīng)混合后制得均一的、溶液狀態(tài)的基因制劑的方法。
或也包括這樣的方法，即在含有膠原或明膠的溶液中，添加已按需要添加了添加劑并含有所需的基因或含該基因的載體的溶液及氨基酸類或氨基酸類的溶液，經(jīng)溶解或混合后制得均一的、溶液狀態(tài)的基因制劑。
微粒狀基因制劑的制造方法可例舉如下1)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液進行噴霧干燥的方法；及2)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液進行凍結(jié)干燥、然后將得到的海棉狀物進行粉碎的方法；或也包括這樣的方法，即在含有膠原或明膠的溶液中，添加已按需要添加了添加劑并含有所需基因或含該基因的載體的溶液及氨基酸類或氨基酸類的溶液，經(jīng)溶解或混合后，將得到的溶液進行噴霧干燥、或?qū)⒃撊芤簝鼋Y(jié)干燥，再將凍結(jié)干燥品進一步地粉碎的方法。
棒狀基因制劑的制造方法可例舉如下1)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液經(jīng)噴霧干燥后制得微粒子，然后將微粒子壓縮成棒狀的方法。
2)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液進行凍結(jié)干燥得到的海棉狀物、然后將其粉碎成微粒子后再壓縮成棒狀的方法。
3)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液進行凍結(jié)干燥，然后將得到的海棉狀物再壓縮成棒狀的方法。
4)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液進行凍結(jié)干燥，將得到的海棉狀物加入水等后進行混煉，然后從噴咀孔擠壓出棒狀物，最后再干燥的方法。
5)將含有所需基因或含該基因的載體、糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個以上羧基的有機酸類，及按需要添加了添加劑的溶液進行凍結(jié)干燥，將得到的微粒子和液狀或具有粘和性軟膏狀的硅酮混合，加入硬化劑，然后從噴咀孔擠壓出棒狀物的方法。
或者是在含有膠原或明膠的情況下，也包括在上述方法中除了使用膠原或明膠及氨基酸類以外其他同樣的方法。
本發(fā)明的基因制劑可以按治療目的的疾患、目標器官等以各種方法給藥。例如，可以進行皮下、肌肉內(nèi)等給藥，或者是可以直接對腎臟、肝臟、肺、腦等患病的對象部位直接給藥。如果直接對患病部位給藥的話就可以進行器官選擇性治療。
以下，以使用質(zhì)粒DNA(pDNA)作為含有所需基因的載體的場合為例，說明本發(fā)明得到的基因制劑。
1)將單獨含有pDNA或含有除pDNA與糖類、非疏水性氨基酸類及具有2個羧基以上的有機酸類以外的添加物(醫(yī)學(xué)上允許的添加劑、生物體親和性材料、促進基因?qū)氲奈镔|(zhì)等)的溶液進行一般的凍結(jié)干燥制劑化時，無論哪種情況凍結(jié)干燥后都能觀察到pDNA分解。而組成中含有糖類和/或非疏水性氨基酸類和/或具有2個羧基以上的有機酸類進行凍結(jié)干燥時，與組成中不含這些物質(zhì)時進行凍結(jié)干燥相比pDNA分解被抑制了。
2)將單獨含有pDNA或含有除pDNA與糖類、非疏水性氨基酸類及具有2個羧基以上的有機酸類以外的添加物(醫(yī)學(xué)上允許的添加劑、生物體親和性材料、促進基因?qū)氲奈镔|(zhì)等)的溶液進行干燥，得到的干燥品在40℃條件下保存時，無論哪種情況都能觀察到pDNA分解。而將組成中含有糖類和/或非疏水性氨基酸類和/或具有2個羧基以上的有機酸類的溶液經(jīng)干燥得到的制品進行保存時，與不含這些物質(zhì)時相比pDNA分解被抑制了。
3)將含有pDNA和膠原或明膠的溶液制劑化、進行常規(guī)的凍結(jié)干燥時，無論哪種情況凍結(jié)干燥后都觀察到pDNA的分解。而組成中含有氨基酸類的溶液進行凍結(jié)干燥時與組成中不含這些物質(zhì)的溶液進行凍結(jié)干燥時相比pDNA分解被抑制了。
4)將含有pDNA和膠原或明膠的溶液經(jīng)干燥得到的制品置于40℃條件下保存時，無論哪種情況都觀察到pDNA的分解。而將組成中含有氨基酸類溶液經(jīng)干燥得到的制品進行保存時，與不含這些物質(zhì)的相比pDNA分解被抑制了。
象這樣以含有糖類和/或非疏水性氨基酸和/或具有2個羧基以上的有機酸類組成使pDNA穩(wěn)定化的效果不止限于上述干燥工藝及干燥狀態(tài)下的保存，即使是溶液狀態(tài)也能得到同樣的效果。特別是組成中含有以提高基因?qū)胄蕿槟康亩褂玫年栯x子脂質(zhì)時其效果更顯著。即，5)將單獨含有pDNA或含有除pDNA與糖類、非疏水性氨基酸類及具有2個羧基以上的有機酸類以外的添加物(醫(yī)學(xué)上允許的添加劑、生物體親和性材料、促進基因?qū)氲奈镔|(zhì)等)及含有陽離子脂質(zhì)類組成的溶液以溶液狀態(tài)保存時，無論哪種情況都能觀察到pDNA的分解。而將組成中含有糖類和/或非疏水性氨基酸類和/或具有2個羧基以上的有機酸類的組成溶液保存時，與不含這些物質(zhì)時相比pDNA分解被抑制了。
前述的有關(guān)本發(fā)明制劑的基因分解抑制(穩(wěn)定化)效果在后述的試驗例和表9有更具體的闡述。
另外，將在本發(fā)明中得到的編碼HST-1/FGF4的pDNA和膠原及葡萄糖構(gòu)成的棒狀基因制劑對小鼠的肌肉內(nèi)給藥時，給藥后38日內(nèi)血中始終檢出了pDNA，給藥60天后在血中及給藥部位有HST-1的基因表達。另一方面，以溶液態(tài)給與pDNA時，給藥后僅30天有HST-1的表達。這一結(jié)果表明，pDNA從膠原及葡萄糖構(gòu)成的棒狀的基因制劑中被緩慢的釋放，同時，在基因制劑內(nèi)能長期間穩(wěn)定地保存。
實施例以下舉實施例、參考例及試驗例更詳細地說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不受這些實施例及試驗例的限定。
在以下的實施例中就制劑的制備進行說明。該制劑含有導(dǎo)入了成纖維細胞增殖因子HST-1(FGF4)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,2980-2984(1987)的質(zhì)粒載體pCAHST-1?，F(xiàn)已明確HST-1基因產(chǎn)物對巨核細胞具有血小板增加因子的作用，能有效地抑制癌的化療和放療時的嚴重副作用一一血小板減少癥(J.Clin.Invest.,96:1125-2230,1995,Oncogene,13:9-19,1996).pCAHST-1是在表達載體pCAGGS(Gene,108,193-200(1991))的CAG啟動子部分和聚合A序列間導(dǎo)入了HST-1基因的質(zhì)粒載體。其中，CAG啟動子作為高表達的載體已登記在特開平3-168087號公報中。
實施例1含有氨基酸的基因制劑(干燥狀態(tài))分別調(diào)制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸鈉或賴氨酸鹽酸鹽的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液。將調(diào)制的溶液1ml經(jīng)-40℃凍結(jié)后，在室溫、負壓下干燥一夜，由此凍結(jié)干燥制備干燥狀態(tài)的基因制劑。
實施例2含有糖類的基因制劑(干燥狀態(tài))分別調(diào)制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖或甘露醇的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液。將調(diào)制的溶液1ml經(jīng)-40℃凍結(jié)后，室溫、負壓下干燥一夜，由此凍結(jié)干燥制備干燥狀態(tài)的基因制劑。
實施例3含有2個以上羧基的有機酸及氨基酸類的基因制劑(干燥狀態(tài))分別調(diào)制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的谷氨酸鈉、天門冬氨酸鈉、酒石酸鈉二水合物或檸檬酸三鈉二水合物的150mMNaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液。將調(diào)制的溶液1ml經(jīng)-40℃凍結(jié)后，室溫負壓下干燥一夜，由此凍結(jié)干燥制備干燥狀態(tài)的基因制劑。
實施例4含有糖類及陽離子性脂質(zhì)的基因制劑(干燥狀態(tài))分別調(diào)制含有3μg/ml的pCAHST-1、24μg/ml的DMRIE-C(Gibco BRL公司制，基因?qū)氪龠M成分)及10mg/ml蔗糖的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液。將調(diào)制的溶液1ml經(jīng)-40℃凍結(jié)后，在室溫負壓下干燥一夜，由此制備干燥狀態(tài)的基因制劑。
實施例5含有糖類及基因?qū)氪龠M成分的基因制劑(溶液狀)向150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液中分別加入pCAHST-1、DMRIE-C(Gibco BRL公司制)及蔗糖，并混合，使其最終濃度分別為3μg/ml的、24μg/ml、10mg/ml。由此制備液狀基因制劑。
實施例6緩釋性基因制劑(凝膠狀)向0.1w/w％脂肪變性膠原溶液(500mg)中分別加入100μg/ml的pCAHST-1溶液(200μl)及10mg/ml葡萄糖、蔗糖或谷氨酸一鈉溶液(500μl)，混合后37℃下保溫，由此制備凝膠狀基因制劑。其中，本實驗例及以下的實施例、參考例中使用的脂肪變性膠原可以從高研(股份公司)獲得。
實施例7緩釋性基因制劑(海棉狀)將實施例6制備的含有葡萄糖的凝膠狀基因制劑進行了凍結(jié)干燥。由此得到含有500μg脂肪變性膠原、20μg pCAHST-1、5mg葡萄糖、蔗糖或谷氨酸鈉鹽的海棉狀基因制劑。
實施例8緩釋性基因制劑(棒狀)向0.86w/w％脂肪變性膠原溶液(29.1g)中分別加入60g水、11mg/ml的葡萄糖溶液(10ml)，混合，然后加入100μg/ml的pCAHST-1溶液(80ml)，混合。將得到的溶液進行凍結(jié)干燥。在干燥品中加入適當?shù)恼麴s水進行混煉，然后將混煉制品放入注射器中擠出成型，再干燥獲得pCAHST-1的收率為74％的制劑。即獲得每1mg含有17μg pCAHST-1、300μg葡萄糖的棒狀基因制劑。
參考例1除不加氨基酸外，按實施例1記錄的操作，制備了干燥狀態(tài)的組合物。
參考例2除不加蔗糖外，按實施例4記錄的操作，制備了干燥狀態(tài)的組合物。
參考例3除不加葡萄糖外，按實施例5記錄的操作，獲得了液狀的組合物。
參考例4除不加糖類溶液或谷氨酸一鈉溶液外，按實施例6及7記錄的操作，獲得了含有500μg的脂肪變性膠原及20μg pCAHST-1的海棉狀組合物。
參考例5除不加葡萄糖溶液外，按實施例8記錄的操作，獲得了每1mg含有20μg pCAHST-1的棒狀干燥組合物。
參考例6除不加pCAHST-1溶液外，按實施例8記錄的操作，獲得了每1mg含有300μg葡萄糖的棒狀干燥組合物。
試驗例1凍結(jié)干燥時氨基酸抑制基因分解的效果將實施例1的基因制劑及參考例1的組合物在凍結(jié)干燥后溶解于水，進行瓊脂糖電泳，評價pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。
瓊脂糖電泳是采用水平型電泳儀(Mupid,Adobansu(股份公司))，在TAE緩沖液中用0.8％瓊脂糖進行的。電泳后，用溴化乙錠進行了染色，然后在透射儀上進行了照相。其成象用掃描儀掃描，用解析軟件算出了一級結(jié)構(gòu)完好的超卷曲型pDNA(CC)和被切斷的pDNA(OC)的所有譜帶的強度，CC比率，即計算了一級結(jié)構(gòu)的保持率(CC保持率)。此時，將沒有處理的pDNA(CC)保持率設(shè)為100％。在試驗例2以后進行瓊脂糖電泳時也用了這一方法。
得到的結(jié)果列入表1和圖1。圖中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整的超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加(參考例1)泳道3谷氨酸一鈉(實施例1)泳道4甘氨酸(實施例1)泳道5丙氨酸(實施例1)泳道6苯丙氨酸泳道7賴氨酸鹽酸鹽(實施例1)泳道8無處理表1含有氨基酸的pCAHST-1溶液凍結(jié)干燥后的CC保持率(％無處理)

結(jié)果表明，制劑中添加谷氨酸一鈉與無添加氨基酸的制劑相比，pCAHST-1的分解被抑制了。
試驗例2凍結(jié)干燥時糖類抑制基因分解的效果將實施例2的基因制劑及參考例1的組合物在凍結(jié)干燥后溶于水。按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。結(jié)果如表2和圖2所示。結(jié)果表明，與未添加糖類相比，加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖及甘露醇制劑其pCAHST-1的分解被大幅度地抑制了。
表2pCAHST-1含糖溶液凍結(jié)干燥后的CC保持率(％無處理)

圖2中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加(參考例1)泳道3蔗糖(實施例2)泳道4蔗糖(實施例2)泳道5麥芽糖(實施例2)泳道6乳糖(實施例2)泳道7甘露醇(實施例2)泳道8無處理試驗例3凍結(jié)干燥時具有2個以上羧基的有機酸及氨基酸抑制基因分解的效果將實施例3的基因制劑及參考例1的組合物在凍結(jié)干燥后溶于水。按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。結(jié)果如表3和圖3所示。結(jié)果表明，與未添加有機酸的制劑相比，加入谷氨酸一鈉、天門冬氨酸鈉、酒石酸鈉二水合物或檸檬酸三鈉二水合物的制劑其pCAHST-1的分解被大幅度地抑制了。
表3含有具有2個以上羧基的有機酸及氨基酸的pCAHST-1緩沖液凍結(jié)干燥后的CC保持率(％無處理)

圖3中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加(參考例1)泳道3谷氨酸一鈉(實施例3)泳道4天門冬氨酸鈉(實施例3)泳道5酒石酸鈉二水合物(實施例3)泳道6檸檬酸三鈉二水合物(實施例3)泳道7無處理試驗例4含有陽離子性脂質(zhì)的基因溶液在凍結(jié)干燥時蔗糖抑制基因分解的效果將實施例4的基因制劑及參考例2的組合物在凍結(jié)干燥后溶于水。按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。結(jié)果如表4和圖4所示。結(jié)果表明，與未添加的制劑相比，加入蔗糖抑制了pCAHST-1的分解。
表4含有陽離子性脂質(zhì)的pCAHST-1溶液凍結(jié)干燥后的CC保持率(％無處理)

圖4中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加(參考例2)泳道3蔗糖(實施例4)泳道4無處理試驗例540℃保存時葡萄糖抑制基因分解的效果(1)將實施例2基因制劑中的葡萄糖處方的干燥制劑及參考例1的組合物在40℃條件下保存1、2及4周。保存后的pCAHST-1一級結(jié)構(gòu)按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價。結(jié)果如表5和圖5所示。結(jié)果表明，與未添加葡萄糖的制劑相比，加入葡萄糖的制劑在相關(guān)條件下其pCAHST-1的保存穩(wěn)定性被大幅度地改善了。
表5含有葡萄糖的pCAHST-1干燥品在40℃保存后的CC保持率(％無處理)

圖5中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加(參考例1/40℃-1周)泳道3無添加(參考例1/40℃-2周)泳道4無添加(參考例1/40℃-4周)泳道5蔗糖(實施例2/40℃-1周)泳道6蔗糖(實施例2/40℃-2周)泳道7蔗糖(實施例2/40℃-4周)泳道8無處理試驗例637℃保存時蔗糖抑制基因分解的效果將實施例4基因制劑及參考例2的組合物在37℃條件下保存4周。保存后的pCAHST-1一級結(jié)構(gòu)按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價。結(jié)果如表6和圖6所示。結(jié)果表明，與未添加蔗糖的制劑相比，添加了蔗糖的制劑在相關(guān)條件下其pCAHST-1的保存穩(wěn)定性被大幅度地改善了。
表6含陽離子性脂質(zhì)的pCAHST-1干燥品在37℃-4周保存后的CC保持率(％無處理)

圖6中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加(參考例2/37℃-4周)泳道3蔗糖(實施例4/37℃-4周)泳道4無處理試驗例740℃保存時葡萄糖抑制基因分解的效果(2)將實施例5的液狀基因制劑及參考例3的組合物在40℃條件下保存4周。保存后的pCAHST-1一級結(jié)構(gòu)按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價。結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，與試驗例5的干燥制劑相同，與未添加葡萄糖的制劑相比，加入葡萄糖的制劑在相關(guān)條件下其pCAHST-1的保存穩(wěn)定性被大幅度地改善了。
圖7中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,0C表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1無處理泳道2葡萄糖(實施例5/40℃-4周)泳道3無添加(參考例3/40℃-4周)
泳道4分子量參照物(λHind Ⅲ)試驗例8含有膠原時糖類等抑制基因分解的效果(1)將實施例7的海棉狀基因制劑及參考例4的海棉狀組合物用150mM的NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.4)的溶液加熱溶解，然后用膠原酶處理。處理后，按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價了pCAHST-1-級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，與未添加糖類的制劑相比，葡萄糖、蔗糖及谷氨酸鈉的添加制大幅度地抑制了pCAHST-1的分解(圖8、表7)。
表7含有膠原、糖類及氨基酸的pCAHST-1溶液凍結(jié)后的CC保持率(％無處理)

圖8中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2葡萄糖(實施例7)泳道3蔗糖(實施例7)泳道4谷氨酸一鈉(實施例7)泳道5無添加(參考例4)泳道6無處理試驗例9含有膠原時糖類等抑制基因分解的效果(2)將實施例8的棒狀基因制劑及參考例5的棒狀組合物用137mM的NaCl,2.7mM KCl,25mM Tris-HCl(pH7.4)的溶液加熱溶解，然后用膠原酶處理。處理后，按試驗例1的操作通過瓊脂糖電泳評價了pCAHST-1一級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，與未添加糖類的制劑相比，葡萄糖添加到制劑中大幅度地抑制了pCAHST-1的分解(圖9、表8)。
表8棒狀組合物中含有的pCAHST-1的CC保持率(％無處理)

圖9中，CC表示一級結(jié)構(gòu)保持完整超卷曲型的pCAHST-1,OC表示被切斷了的pCAHST-1。各泳道所示內(nèi)容如下泳道1分子量參照物(λHind Ⅲ)泳道2無添加①(參考例5)泳道3無添加②(參考例5)泳道4葡萄糖①(實施例8)泳道5葡萄糖②(實施例8)泳道6無處理試驗例10應(yīng)用了穩(wěn)定基因制劑的基因?qū)雽嵤├?的棒狀基因制劑(脂肪變性膠原/葡萄糖-pCAHST-1)及參考例5的棒狀組合物(脂肪變性膠原-pCAHST-1)分別切斷，使之含有50μg的pCAHST-1。然后將它們注入ICR小鼠(雌性，6-7周齡)的右大腿部肌肉內(nèi)。(給藥組1實施例8的基因制劑；給藥組2參考例5的組合物)。另外，將含有50μg的pCAHST-1磷酸緩沖液100μl也注入小鼠的右大腿部肌肉內(nèi)(給藥組3)。
為了調(diào)查活體內(nèi)的緩釋效果，利用了血液中pCAHST-1的檢測值、血液中及給藥部位的HST-1量及血液中的血小板數(shù)3個測定值。血液中pCAHST-1的檢測利用了PCR法；血液中及給藥部位的HST-1量用ELISA法進行了測定；血液中的血小板數(shù)在顯微鏡下進行了計數(shù)分析。并分析了它們隨時間的變化。
PCR法利用Ampridirect法(島津制作所)，使用了檢測pCAHST-1(約8kbp)中的262 bp的探針。測定極限Southern印跡法為1pg/5μl，采用溴化乙錠染色為2pg/5μl。ELISA法使用了FGF4試劑盒(R&D Systems公司，美國，檢量限為20pg/ml)。血小板數(shù)的測定是在采血后，將血小板以外的血球成分分解處理，然后在顯微鏡下計數(shù)進行實施的。
根據(jù)PCR法測得血中pCAHST-1的結(jié)果如圖10所示。給藥組1血中的pCAHST-1從給藥6小時后被檢測出來，并且在以后的38天內(nèi)一直可以檢出。給藥組2血中的pCAHST-1從給藥6小時后被檢測出來，在以后的18天內(nèi)一直可以檢出。而給藥組3的血中只在給藥后7日間檢出了pCAHST-1。
血中及給藥部位的HST-1的含量測定結(jié)果分別如圖11，圖12所示。圖11中各記號代表的內(nèi)容如下圓圈脂肪變性膠原/葡萄糖-pCAHST-1(給藥組1，實施例8)；黑圓脂肪變性膠原-pCAHST-1(給藥組2，參考例5)；黑正方形含有pCAHST-1的磷酸緩沖液(給藥組3，對照例)；正方形脂肪變性膠原/葡萄糖(參考例6)。
圖12中各記號代表的意思如下，圓圈脂肪變性膠原/葡萄糖-pCAHST-1(給藥組1，實施例8)；黑圓脂肪變性膠原-pCAHST-1(給藥組2，參考例5)；黑正方形含有pCAHST-1的磷酸緩沖液(給藥組3，對照例)；正方形脂肪變性膠原/葡萄糖(參考例6)。
給藥組1中，血中及給藥部位的HST-1含量在給藥后都增加了，30天達到最大后開始漸漸地減少，但60日后也有檢出。給藥組2中，與給藥組1同樣血中及給藥部位的HST-1含量在給藥后都增加了，30天達到最大后開始漸漸地減少，40天后幾乎達到檢出極限，總體上與給藥組1相比產(chǎn)生的HST-1的量少。給藥組3中血中及給藥部位的HST-1含量在給藥后都增加了，10天達到最大值后漸漸地減少，30天后沒能檢出。
血小板數(shù)值隨時間變化的測定結(jié)果(圖13)，在給藥組1中，血小板數(shù)在給藥后增加了，30天達到最大后漸漸地減少，但60天后也維持增加傾向。給藥組2的血小板數(shù)在給藥后漸漸地增加，14天達到最大后減少，28天以后一邊維持低值一邊維持增加的傾向。給藥組3的血小板數(shù)在給藥后增加，10天達到最大后漸漸地減少，25天內(nèi)恢復(fù)到正常值。
圖13中各記號代表的意思如下圓圈脂肪變性膠原/葡萄糖-pCAHST-1(給藥組1，實施例8)；黑圓脂肪變性膠原-pCAHST-1(給藥組2，參考例5)；黑正方形含有pCAHST-1的磷酸緩沖液(給藥組3，對照例)；正方形膠原/葡萄糖(參考例6)。
作為對照是將不含pCAHST-1的參考例6的組合物與上述方法同樣注入小鼠的右大腿部肌肉內(nèi)，給藥后，用ELISA法測定了血中及給藥部位的HST-1含量，及血小板數(shù)隨時間的變化。其結(jié)果，在測定期間血中及給藥部位的HST-1沒能檢出。并且，測定期間血小板數(shù)沒有增加。這一結(jié)果表明，使用實施例8的基因制劑得到的給藥組1及給藥組2的HST-1的產(chǎn)生及血小板數(shù)的增加是由于制劑中含有的pCAHST-1被導(dǎo)入細胞并在細胞內(nèi)表達了HST-1的遺傳信息所至。
從給藥組1和給藥組3的結(jié)果可以判斷，將pCAHST-1單獨給藥時，由HST-1的體內(nèi)表達及產(chǎn)生HST-1引起的生物學(xué)的效果是一時性的，與此相反，實施例8的基因制劑則長時間地緩釋pCAHST-1，同時，在體內(nèi)保持穩(wěn)定并延長HST-1的表達期，并且能長期間地維持由產(chǎn)生的HST-1引起的生物學(xué)效果。
從給藥組1和給藥組3的結(jié)果可以判斷，與將pCAHST-1單獨給藥相比，實施例8和參考例5的基因制劑均在緩釋pCAHST-1的同時還能夠延長HST-1的表達期。但是，含有葡萄糖的實施例8的基因制劑與參考例5的基因制劑相比，在體內(nèi)穩(wěn)定地保持pCAHST-1，以高產(chǎn)量延長維持HST-1的表達期，由此，能夠長時間地、以更高的狀態(tài)維持由HST-1引起的生物學(xué)效果。
以下，就實施例9-12制備的配制品進行了試驗例11-16，主要研究了在膠原存在或不存在的條件下氨基酸或糖類對基因穩(wěn)定性的貢獻。
實施例9
含有氨基酸的基因制劑(干燥狀態(tài))分別調(diào)制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的精氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、天門冬酰胺、天門冬酸鈉、谷氨酸、谷氨酸鈉、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或含有5mg/ml亮氨酸150mM NaCl、10mMTris-HCl(pH7.4)溶液，將調(diào)制的溶液1ml在-40℃下凍結(jié)后，在室溫以減壓的形式干燥液。根據(jù)這樣的凍結(jié)干燥工藝制備干燥狀態(tài)的基因制劑。
實施例10含有糖類的基因制劑(干燥狀態(tài))分別調(diào)制含有10μg/ml的pCAHST-1及10mg/ml的海藻糖、麥芽糖醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、山梨糖醇、硫酸鈉軟骨素或木糖醇的150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液。將調(diào)制的溶液1ml置于-40℃條件下凍結(jié)，然后在負壓、室溫下干燥一夜，經(jīng)過這樣凍結(jié)干燥后，可得到干燥狀態(tài)的基因制劑。
實施例11含有氨基酸的緩釋性基因制劑(海棉狀)分別調(diào)制在0.1w/w％脂肪變性膠原溶液中(500mg)混合了20μg/ml的pCAHST-1(1ml)及40mg/ml的精氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、天門冬酰胺、天門冬氨酸鈉、谷氨酰胺、谷氨酸鈉、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或20mg/ml的亮氨酸溶液(125ml)。將調(diào)制的溶液1ml置于-40℃條件下凍結(jié)，然后在負壓、室溫下干燥一夜，經(jīng)過這樣凍結(jié)干燥后，制備了海棉狀的基因制劑。
實施例12含有糖類的緩釋性基因制劑(海棉狀)分別調(diào)制在0.1w/w％脂肪變性膠原溶液中(500mg)混合了20μg/ml的pCAHST-1(1ml)及40mg/ml的海藻糖、麥芽糖醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、山梨糖醇、硫酸鈉軟骨素或木糖醇溶液(125μl)。將調(diào)制的1ml溶液置于-40℃條件下凍結(jié)，然后在負壓、室溫下干燥一夜，經(jīng)過這樣凍結(jié)干燥后，制備了海棉狀的基因制劑。
試驗例11
凍結(jié)干燥時氨基酸抑制基因分解的效果將實施例9的基因制劑及參考例1的組合物在凍干過后溶于水，按試驗例1的操作進行瓊脂糖電泳解析了pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。電泳后進行了溴化乙錠染色，然后在反轉(zhuǎn)施照器上進行了照相。其成相用掃描儀掃描，用解析軟件算出了一級結(jié)構(gòu)完好的超卷曲型pDNA(CC)和一處被切斷的松弛型pDNA(OC)、以及進一步被切斷、成開環(huán)狀的直線型DNA(LS)的譜帶強度，按下式計算了添加氨基酸引起的穩(wěn)定化度的變化。結(jié)果如圖14所示。圖14中的氨基酸順序為疏水親水度的順序(Hyte,J.&DOOLittel,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157,105-132)。結(jié)果表明添加精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸鈉、谷氨酰胺、谷氨酸鈉、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的制劑與未添加氨基酸的制劑相比pCAHST-1的分解被抑制了。 試驗例12凍結(jié)干燥時糖類抑制基因分解的效果將實施例10的基因制劑及參考例1的組合物在凍結(jié)干燥后溶解于水中，按試驗例11操作進行瓊脂糖電泳解析了pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。和試驗例11算出穩(wěn)定化度，其結(jié)果如表15所示。結(jié)果表明，添加糖類的制劑與未添加糖類的制劑相比pCAHST-1的分解被抑制了。
試驗例13含有膠原時氨基酸類抑制基因分解的效果將實施例11的海棉狀的基因制劑及參考例4的海棉狀組合物用150mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液加熱溶解，用膠原酶作了處理。處理后，按試驗例11操作進行瓊脂糖電泳評價了pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。和試驗例11同樣算出穩(wěn)定化度，其結(jié)果如表16所示。圖16中的氨基酸的順序是疏水親水度的順序(Kyte,J.&Doolittele,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157,105-132)。結(jié)果表明，與未添加氨基酸的制劑相比，制劑中添加氨基酸能大幅度地抑制pCAHST-1的分解。
試驗例14含有膠原時糖類抑制基因分解的效果將實施例12海棉狀的基因制劑及參考例4的海棉狀組合物用150mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.4)溶液加熱溶解，用膠原酶作了處理。處理后，按試驗例11操作進行瓊脂糖電泳評價了pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)。和試驗例11同樣算出穩(wěn)定化度，其結(jié)果如表17所示。與未添加糖類的制劑相比，制劑中添加糖類能大幅度地抑制pCAHST-1的分解。
試驗例1540℃保存時氨基酸及糖類抑制基因分解的效果將實施例9基因制劑中的天門冬氨酸鈉、谷氨酸一鈉、脯氨酸、谷氨酰氨處方的干燥狀態(tài)制劑和實施例10基因制劑中的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇處方的干燥狀態(tài)制劑，以及參考例1的組合物置于40℃條件下保存1、2及4周。保存后的pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)按試驗例1的操作利用瓊脂糖電泳進行了評價。結(jié)果表明，制劑中添加非疏水性氨基酸類或糖類與未添加的制劑相比，有關(guān)實施添加處理制劑子中的pCAHST-1保存穩(wěn)定性得到了大幅度改善。
試驗例16含有膠原基因制劑在40℃保存時氨基酸及糖類抑制基因分解的效果將實施例11海棉狀基因制劑中的賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、組氨酸處方的干燥狀態(tài)制劑和實施例12的海棉狀基因制劑中的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇處方的干燥狀態(tài)制劑，以及參考例4的海棉狀組合物置于40℃條件下保存1、2及4周。保存后的pCAHST-1的一級結(jié)構(gòu)按試驗例13的操作利用瓊脂糖電泳進行了評價。其結(jié)果如圖19所示。結(jié)果表明，制劑中添加氨基酸類或糖類與未添加的制劑相比，有關(guān)實施添加處理制劑子中的pCAHST-1保存穩(wěn)定性得到了大幅度改善。
發(fā)明效果將試驗例1到9得到的本發(fā)明制劑抑制基因分解的效果(穩(wěn)定化)整理列于表9。
表9本發(fā)明制劑中抑制基因分解的效果(1)凍結(jié)干燥時的穩(wěn)定性①無添加劑時a) b)對照72％(76％)氨基酸類 甘氨酸 79％丙氨酸 83％賴氨酸 84％天門冬氨酸 (91％)谷氨酸 96％(103％)c)對照78％糖類 葡萄糖 95％蔗糖 96％麥芽糖 95％乳糖 100％甘露醇 95％b)對照76％有機酸類 酒石酸 95％檸檬酸 102％②有添加劑時(膠原) d)對照85％
穩(wěn)定劑葡萄糖94％蔗糖 95％谷氨酸95％(DMRICE-C)e)對照 69％穩(wěn)定劑蔗糖 100％[注]a)試驗例1(表1)、b)試驗例3(表3)、c)試驗例2(表2)、d)試驗例8(表7)、e)試驗例4(表4)(2)凍結(jié)干燥制劑的保存穩(wěn)定性①無添加劑時 c)f)f)f)(40℃)(凍干時)一周后二周后四周后對照 (78％) 67％ 56％ 34％穩(wěn)定劑 葡萄糖(95％) 92％ 91％ 71％②有添加劑(DMRIE-C)時(37℃)e) g)(凍干時)四周后對照(69％) 8.5％穩(wěn)定劑蔗糖(100％) 67％[注]f)試驗例5(表5)、g)試驗例6(表6)(3)凝膠化·混煉時的穩(wěn)定性(將凍干品混煉制成棒狀制劑時)d) h)(凍干時)棒狀制劑形成后對照(85％) 66％穩(wěn)定劑蔗糖添加劑膠原(95％) 92％[注]h)試驗例8(表8)
(4)水溶液制劑的保存穩(wěn)定性I)(40℃) 四周后對照 載體消失穩(wěn)定劑葡萄糖添加劑DMRIE-C載體殘存[注]I)試驗例7(圖7)工業(yè)實用性含有增強了穩(wěn)定性的含有基因或?qū)肓嘶虻妮d體的、穩(wěn)定的基因制劑，將安全、簡單地用于今后利用頻度越來越高的基因治療。本發(fā)明制劑能為基因治療提供推廣、普及的基礎(chǔ)。特別是本發(fā)明制劑使基因或?qū)肓嘶虻妮d體在常溫下流通或保管成為可能，能夠在冷鏈設(shè)備不充分的地區(qū)提供可以使用的DNA疫苗。
權(quán)利要求
1．穩(wěn)定的基因制劑，含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體以及至少一種糖類和/或至少一種非疏水性氨基酸和/或至少一種具有兩個以上羧基的有機酸(氨基酸除外)。
2．如權(quán)利要求1所述的基因制劑，其中糖類為單糖、二糖、三糖以上的寡糖或其糖醇。
3．如權(quán)利要求2所述的基因制劑，其中其糖類為葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇或甘露醇。
4．如權(quán)利要求1所述的基因制劑，其中其非疏水性氨基酸類為谷氨酸、天門冬氨酸或其鹽。
5．如權(quán)利要求1所述的基因制劑，其中具有2個以上羧基的有機酸類為有2個羧基或3個羧基的有機酸或其鹽。
6．如權(quán)利要求5所述的基因制劑，其中有2個羧基或3個羧基的有機酸為檸檬酸或酒石酸。
7．如權(quán)利要求1至6是任意一項所述的基因制劑，其中導(dǎo)入了所需基因的載體為質(zhì)粒DNA。
8．如權(quán)利要求1所述的基因制劑，它是溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的基因制劑或經(jīng)溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)工序制造的基因制劑，其中，溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)中的糖類、非疏水性氨基酸及具有2個羧基以上的有機酸類(氨基酸類除外)的含量占全體總量約為1w/v％以上。
9．如權(quán)利要求1至8中任意一項所述的基因制劑，它進一步地含有促進基因向細胞導(dǎo)入的物質(zhì)。
10．如權(quán)利要求9所述的基因制劑，其中該制劑的促進基因向細胞導(dǎo)入的物質(zhì)為陽離子性脂質(zhì)、陽離子性聚合物或疏水性聚合物。
11．如權(quán)利要求1至10所述的基因制劑，進一步地包括醫(yī)學(xué)上允許的添加劑。
12．如權(quán)利要求11所述的基因制劑，其中該制劑的添加劑為生物體親和性材料。
13．如權(quán)利要求12所述的基因制劑，其特征在于該基因制劑以生物體親和性材料擔載所需的基因或?qū)肓怂杌虻妮d體。
14．如權(quán)利要求12或13所述的基因制劑，其生物體親和性材料為膠原、明膠或它們的混合物。
15．如權(quán)利要求1至14中任意一項所述的基因制劑，其中該制劑處于干燥狀態(tài)。
16．如權(quán)利要求1至15中任意一項所述的基因制劑，它是將含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體的溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的配制品經(jīng)干燥工藝而獲得的基因制劑。
17．如權(quán)利要求16所述的基因制劑，其中干燥工藝為凍結(jié)干燥。
18．使基因制劑穩(wěn)定化的方法，包括向含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體的基因配制品中添加至少一種糖類和/或至少一種非疏水性氨基酸類和/或至少一種具有兩個以上羧基的有機酸類(氨基酸除外)。
19．基因治療方法，包括將權(quán)利要求1至17中任意一項所述的基因制劑給予生物體。
20．穩(wěn)定的基因制劑，其中含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體、至少一種氨基酸、及膠原或明膠。
21．如權(quán)利要求20所述的基因制劑，在溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的基因制劑或經(jīng)溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的工藝制造的基因制劑中，溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)中的氨基酸含量相對于總體約為1％w/v以上。
22．如權(quán)利要求20或21所述的基因制劑，其中含有促進基因?qū)爰毎奈镔|(zhì)。
23．如權(quán)利要求22所述的基因制劑，其中促進基因向細胞導(dǎo)入的物質(zhì)為陽離子性脂質(zhì)、陽離子性聚合物或疏水性聚合物。
24．如權(quán)利要求20到23中任意一項所述的基因制劑，其特征在于膠原或明膠擔載所需的基因或?qū)肓怂杌虻妮d體。
25．如權(quán)利要求20至24中任意一項所述的基因制劑，處于干燥狀態(tài)。
26．如權(quán)利要求20至25中任意一項所述的基因制劑，它是將含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體的溶液狀態(tài)、凝膠狀態(tài)或懸濁液狀態(tài)的配制品制成干燥狀態(tài)而獲得的基因制劑。
27．如權(quán)利要求26所述的基因制劑，其中干燥工藝為凍結(jié)干燥。
28．使基因制劑穩(wěn)定化的方法，包括向含有所需基因或?qū)肓怂杌虻妮d體和膠原或明膠的基因配制品中添加至少一種氨基酸類。
29．基因治療方法，包括將權(quán)利要求20至27中任意一項所述的基因制劑給與生物體。
全文摘要
本發(fā)明以使基因治療用制劑在制造及保存期間保持其穩(wěn)定性為目的。本基團制劑中至少含有一種糖類和/或至少一種非疏水性氨基酸和/或至少一種具有兩個以上羧基的有機酸類(氨基酸除外),或者是含有膠原蛋白或明膠及至少含有一種氨基酸類。
文檔編號A61K48/00GK1310632SQ99808980
公開日2001年8月29日 申請日期1999年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月22日
發(fā)明者寺田雅昭, 落谷孝広, 佐野明彥, 久田明彥, 永原俊治 申請人:住友制藥株式會社, 株式會社高研