專利名稱：殺菌/透性增加蛋白缺失類似物的制作方法
背景技術：
本發(fā)明提供新的具有生物活性的殺菌/透性增加蛋白(BPI)缺失類似物的制劑和含有這些制劑的藥物組合物，其中的新類似物特征在于具有更好的穩(wěn)定性與均一性以及增強的體內活性。
BPI是一種從對抵御入侵微生物至關重要的哺乳動物血細胞，稱為多形核白細胞(PMN或噬中性的細胞)顆粒中分離的蛋白。已知BPI結合脂多糖，一種刺激可導致膿毒性休克(septic shock)強大免疫反應的格蘭氏陰性細菌外膜蛋白的主要組分。通過酸提取結合離子交換層析[Elsbach，生物化學雜志，254:11000(1979)]或大腸桿菌[E.coli]親和層析[Weiss等，血液，69:652(1987)]，人BPI蛋白從PMNs中得到分離。用這種方式獲得的BPI在此稱為天然BPI并且已顯示其對廣譜格蘭氏陰性細菌具有強大的殺菌活性。人BPI的分子量大約55,000道爾頓(55kD)。完整的人BPI蛋白序列和編碼該蛋白的DNA核酸序列報導于Gray等，生物化學雜志，264:9505(1989)的

圖1中，在此摻入該文獻供參考。Gray等的氨基酸序列示于這里的SEQIDNO:1中。美國專利No.5,198,541(在此公開僅供參考)公開了編碼BPI蛋白，包括重組BPI全蛋白(稱為rBPI)和BPI重組片段的基因和用于表達這些蛋白的方法。
具有大約25kD分子量的蛋白水解性BPI N-末端具有雙親性特性，含有交替的疏水及親水區(qū)。人BPI的此N-末端擁有天然55kD人BPI全蛋白的抗菌活性[Ooi等，生物化學雜志，262:14891-14894(1987)]。與N-末端部分相反，分離的人BPI蛋白C-末端區(qū)域對格蘭氏陰性生物僅僅顯示出略微可檢測到的抗菌活性[Ooi等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med),174:649(1991)]。一種大約23kD的N-末端BPI片段，稱為“rBPI23”已由重組方法得到制備并且也維持對格蘭氏陰性生物的抗菌活性[Gazzano-Santoro等，感染。免疫(Infect.Immun.)60:4754-4761(1992)]。一種BPI的N-末端類似物，rBPI21，已按照Horwitz等在蛋白表達純化，8:28-40(1996)中所述得到了制備。
BPI的殺菌效應報導為對格蘭氏陰性菌種類是高度特異性的，例如，在Elsbach與Weiss，發(fā)炎基本原理與臨床相關性，Gallin等編，第30章，Raven出版有限公司(1992)中所述。此報導的靶細胞特異性認為是BPI對脂多糖(LPS)，格蘭氏陰性生物外膜(或包被)特異性成分的強烈吸收的結果。雖然BPI通常認為對其它微生物，包括酵母和更高等的真核細胞是無毒的，但是最近發(fā)現(xiàn)，如下文所討論的，BPI蛋白產物也對格蘭氏陽性細胞、支原體、分枝桿菌、真菌、原生動物和衣原體表現(xiàn)出活性。
雖然BPI殺死格蘭氏陰性細菌的確切機制尚未完全闡明，但認為BPI必須首先通過帶正電的BPI蛋白和LPS上帶負電的位點之間的靜電及疏水性相互作用而結合到該細菌的表面上。由于其刺激的強大炎癥反應，即由宿主炎癥細胞釋放(炎癥)介質，這可最終導致不可逆的內毒性休克，故LPS又稱為“內毒素”。BPI與報導為LPS最具毒性的并且生物活性最強的部分，脂質A結合。
在易感的格蘭氏陰性細菌中，BPI結合認為打斷了LPS結構，導致降解磷脂和肽聚糖的細菌酶的活化，從而改變細胞外膜的透性，并且啟動最終導致細胞死亡的事件。[Elsbach與Weiss(1992)，見上文]。BPI認為在兩個時期起作用。第一個稱為亞致死時期，其特征為立即生長停止，穿透外膜并且選擇性活化水解磷脂與肽聚糖的細菌酶類。此時期的細菌可培養(yǎng)于補充血清蛋白的培養(yǎng)基中而得到挽救[Mannion等，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.,)85:853-860(1990)]。在長時間將細菌暴露于BPI之后，定義為不能夠由血清蛋白所逆轉的生長抑制的第二個時期發(fā)生，其特征在于廣泛的生理與結構改變，包括對內膜的明顯損傷。
BPI與LPS的最初結合導致組織的變化，這可能是源于通過結合Mg++和Ca++而結合LPS的陰離子基團，該結合通常穩(wěn)定外膜。BPI附著到格蘭氏陰性細菌外膜導致疏水性藥物如放線菌素D迅速穿透外膜。BPI的結合以及隨后格蘭氏陰性細菌的殺死至少部分依賴于LPS多糖鏈的長度，其中具有較長O-鏈的“光滑型”生物較具有短O-鏈的“粗糙型”生物對BPI的殺菌效應具有更強的抗性[Weiss等，臨床研究雜志，65:619-628(1980)]。此BPI作用的第一個時期，格蘭氏陰性菌外包被的穿透在BPI解離(一種需要高濃度二價陽離子和新LPS合成的過程)時是可逆轉的[Weiss等，免疫學雜志，132:3109-3115(1984)]。然而，通過恢復包被的完整性，格蘭氏-陰性細菌的存活的喪失沒有得到逆轉，表明該殺菌作用由在靶生物中誘導的其它損傷所介導的，并且該損傷可能位于質膜上(Mannion等，臨床，研究雜志，86:631-641(1990))。對該可能性的特定研究已顯示在摩爾基礎上，BPI至少與多粘菌素B具有相同的質膜載體抑制功能(In′tVeld等，感染與免疫，56:1203-1208(1988))，但是確切的機制以及該載體與完整生物研究間的相關性還未得到闡明。
已經表明BPI蛋白產物(包括天然和重組制備的BPI蛋白；天然、合成和重組的具有生物學活性的BPI蛋白多肽片段；具有生物學活性的BPI蛋白或其片段的多肽變異體，包括雜交融合蛋白和二聚體；具有生物學活性的BPI蛋白或其片段或變異體的類似物，包括半胱氨酸替代的類似物；和BPI衍生肽)具有多種有利的活性。已知BPI蛋白產物對格蘭氏陰性細菌具有殺菌效應，如在美國專利Nos.5,198,541和5,523,288中所述，在此摻入二者供參考。同時已知BPI蛋白產物增強在格蘭氏陰性細菌感染中抗生素的效應，如在美國專利No.5,523,288和相應的國際公開No.WO 95/08344(PCT/US 94/11225)中所述，在此摻入供參考。同時已知BPI蛋白產物對格蘭氏陽性細菌和支原體具有殺菌效應，并且增強抗生素在格蘭氏陽性菌感染中的效應，如在美國專利No.5,578,572和相應的國際公開No.WO 95/19180(PCT/US95/00656)中所述，在此引用供參考。還進一步已知BPI蛋白產物顯示出抗真菌活性和增強其它抗真菌劑的活性，如在美國專利No.5,627,153和相應的國際公開No.WO 95/19179(PCT/US 95/00498)中所述，并且在共同擁有、共同未決的提交于1996年3月21日的美國申請系列No.08/621,259(其反過來又是提交于1994年7月20日的美國申請系列No.08/504,841的部分繼續(xù))和相應的國際公開Nos.WO 96/08509(PCT/US 95/09262)和WO 97/04008(PCT/US 96/03845)中進一步描述為抗真菌肽，引入所有文獻供參考。還進一步已知BPI蛋白產物顯示出抗原生動物活性，如在美國專利No.5,646,144和相應的國際公開No.WO 96/01647(PCT/US 95/08624)中所述，在此引入文獻供參考。已知BPI蛋白產物顯示出抗-衣原體活性,如在共同擁有的、共同未決的提交于1996年8月9日的美國申請系列No.08/694,843和相應的國際公開No.WO 98/06415(PCT/US 97/13810)中所述，在此引入的所有文獻供參考。最后，已知BPI蛋白產物顯示出抗分支桿菌活性，如在共同擁有、共同未決的提交于1996年4月1日的美國申請系列No.08/626,646(其反過來又是提交于1994年8月14日的美國申請系列No.08/285,803的部分繼續(xù)，后者又成為1993年3月12日提交的美國申請系列No.08/031,145的部分繼續(xù))和相應的國際公開No.WO 94/20129(PCT/US 94/02463)中所述，所有引入的文獻供參考。
BPI蛋白產物在人類中對循環(huán)中內毒素的效應，包括對TNF、IL-6和內毒素的效應描述于美國專利Nos.5,643,875和5,753,620以及相應的國際公開No.WO 95/19784(PCT/US 95/01151)中，引入所有文獻供參考。
同時已知BPI蛋白對于治療以下特異性病情中是有用的，例如人腦膜炎球菌血癥(meningococcemia)(如在共同擁有、共同未決的提交于1996年5月10日的美國申請系列No.08/644,287和相應的國際公開No.WO 97/42966(PCT/US 97/08016)中所述，在此引入供參考)，人創(chuàng)傷性出血(如在共同擁有、共同未決的美國申請系列No.08/862,785，提交于1996年5月23日的美國系列No.08/652,292的部分延續(xù)，現(xiàn)在的美國專利No.5,756,464和相應的國際公開No.WO 97/44056(PCT/US 97/08941)中所述，在此引用所有文獻供參考)，燒傷(如在美國專利No.5,494,896和相應的國際公開No.WO 96/30037(PCT/US 96/02349)中所述，在此引入該二篇文獻供參考)，局部缺血/再灌注(reperfusion)損傷(如在美國專利No.5,578,568中所述，在此引入供參考)和肝臟切除(如在共同擁有、共有未決的提交于1998年3月16日的美國申請序列No.08/582,230中所述，該申請是對提交于1996年1月3日的相同系列號的延續(xù)申請，其反過來又是提交于1994年10月5日的美國申請系列No.08/318,357的延續(xù)，后者又是提交于1993年10月5日的美國申請系列No.08/132,510的部分延續(xù)，以及相應的國際公開No.WO 95/10297(PCT/US 94/11404)，所有引入文獻供參考)。
同時已知BPI蛋白產物中和外源性肝素的抗凝劑活性，如在美國專利No.5,348,942中所述，在此引入供參考，以及對治療慢性炎癥疾病如類風濕和反應性關節(jié)炎是有用的，如在美國專利No.5,639,727中所述，在此引用供參考，并且用于抑制血管生成和治療血管生成有關的疾病包括惡性瘤，目鏡視網膜病(ocular retinopathy)和子宮內膜異位(endometriosis)，如在共同擁有的、共同未決的美國申請系列Nos.08/435,855,08/466,624和08/466,826和相應的國際公開No.WO94/20128(PCT/US 94/02401)中所述，所有引入文獻在此供參考。
同時已知BPI蛋白用于抗血栓形成的方法中，如在美國專利No.5,741,799和相應的國際公開No.WO 97/42967(PCT/US 97/08017)中所述，在此引入供參考。
美國專利Nos.5,420,019和5,674,834和相應的國際公開No.WO94/18323(PCT/US 94/01235)(所有引入文獻供參考)公開了在氨基酸位置132或135的半胱氨酸用其它氨基酸代替使得到的BPI多肽對二聚化和半胱氨酸加合化合物的形成具有抗性。其同時公開了在BPI氨基酸位置193終止N-末端BPI片段導致具有減少的羧基末端不均一性的表達產物。
令人感興趣的是Capodici和Weiss在免疫學，156:4789-4796(1996)中的報導，即編碼成熟BPI氨基酸殘基1到193(BPI1-193)和殘基13到193(BPI13-193)的DNA的體外轉錄/翻譯產物表現(xiàn)出對固定LPS類似的LPS-依賴性結合。
在本領域中仍然存在著這樣的必要，即(制備)具有更高生物學活性的BPI蛋白產物制劑，特別是那些具有增強的穩(wěn)定性、均一性和/或體內生物學活性的制劑。
本發(fā)明進一步提供了編碼這些BPI蛋白產物的新的純化且分離的多核苷酸序列(例如，DNA或RNA)；用于其重組制備的材料與方法，包括載體及包括該DNA的宿主細胞；包括這些BPI蛋白產物的更為穩(wěn)定的藥物組合物；單獨使用這些組合物或同時與其它治療劑施用的改進的治療方法。同時涉及的還有本發(fā)明BPI缺失類似物在制備用于治療將從施用BPI蛋白產物中獲益患者的藥劑中的使用。
本發(fā)明眾多的其它方面和優(yōu)勢在考慮到下面本發(fā)明詳述時對本領域中的技術人員將是顯而易見的，該詳述描述了目前其優(yōu)選的實施方案。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供由成熟人BPI氨基酸殘基10到193(列于SEQ ID NO:2)所組成的新的BPI缺失類似物，其中的BPI氨基酸位置132的半胱氨酸殘基由別的氨基酸，優(yōu)選為非極性氨酸如絲氨酸或丙氨酸所替代。其中的132位置半胱氨酸由丙氨酸所替代的優(yōu)選實施方案命名為rBPI(10-193)C132A或rBPI(10-193)ala1a132。
BPI蛋白產物rBPI21為編碼成熟人BPI氨基酸殘基1至193 DNA的表達產物，其中的132位殘基半胱氨酸由丙氨酸所替代，如在美國專利No.5,420,019中所述。用于通過達到更高細胞密度和更高rBPI21滴度重組方法制備rBPI21的發(fā)酵方法中的變化也導致了純化產物氨酸末端不均一性的明顯增加。在有些發(fā)酵循環(huán)中，觀察到高達大約20％的純化產物為具有BPI氨基酸10-193的種類，而不是編碼的1-193個氨基酸。500升發(fā)酵樣品在發(fā)酵循環(huán)過程中的SDS-PAGE凝膠顯示該10-193種類出現(xiàn)在該循環(huán)的最后2-3天，其中最大量出現(xiàn)于收獲當天。進一步研究表明rBPI21與CHO-K1細胞勻漿溫育產生消化產物，提示與該細胞有關的蛋白酶活性參與(該過程)。為了以控制的方式模擬蛋白酶活性，rBPI21與氨肽酶M和彈性蛋白酶溫育。rBPI21對氨肽酶M消化具有抗性，但彈性蛋白酶迅速將rBPI21轉換成40％的BPI(8-193)和60％的BPI(10-193)。
如這里所描述的，穩(wěn)定均一的rBPI(10-193)C132A制劑通過蛋白水解和重組方法得到制備。純化和測試該蛋白的生物學活性。在數(shù)個體外生物學測定、2個不同的動物效率模型和藥物動力學及毒理學研究中進行實驗以比較rBPI(10-193)C132A與rBPI21。如在實施例5-7中所述，rBPI(10-193)C132A和rBPI21在下面的比較中具有類似的體外活性，包括用大腸桿菌J5的徑向擴散和培養(yǎng)基微稀釋(microdilution)殺菌測定，用L-形金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的徑向擴散測定，用大腸桿菌J5 LPS的競爭結合測定，和用RAW與THP1細胞的LPS中和測定。描述于實施例5中的其它實驗顯示rBPI(10-193)C132A似乎在用速度濁度測定法(nephelometry)的LPS結合測定中大約是rBPI21強度的兩倍。如實施例8中所述，純化的rBPI(10-193)C132A和rBPI21在劑量達120mg/kg/天三天的大鼠GLP毒理學研究中具有類似的毒性分布并且在劑量為2mg/kg大鼠中具有類似的藥物動力學。實施例8中描述的實驗也顯示在小鼠內毒素接種模型中，rBPI(10-193)C132A在兩個研究中似乎至少較rBPI21活性強兩倍，而在小鼠致死菌血模型中，rBPI(10-193)C132A與rBPI21同樣有效。除了在有意識大鼠的體內實驗外，灌注rBPI2140與50mg/kg的劑量與載體對照相比導致血壓顯著的暫時下降，而相同劑量的rBPI(10-193)C132A與對照相比沒有導致血壓統(tǒng)計上顯著的暫時下降。因此，與灌注rBPI21相比，灌注rBPI(10-193)C132A似乎提供了血液中副作用的下降。
本發(fā)明進一步涉及rBPI(10-193)C132A與至少一種其它多肽的至少一部分的融合。這種雜交融合蛋白的實例描述于美國專利No.5,643,570和相應的國際公開No.WO 93/23434(PCT/US 93/04754)中(在此引入所有文獻供參考)并且包括雜交融合蛋白，其氨基末端包括BPI蛋白或其生物活性片段并且其羧基末端包括至少免疫球蛋白重鏈的一個恒定區(qū)或其等位變異體。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明新的BPI缺失類似物或融合蛋白的純化及分離的多核苷酸序列(例如，DNA或RNA)；含有該多核苷酸的表達載體，其中的多核苷酸優(yōu)選可操作地連接到內源或異源表達調控序列上；用本發(fā)明DNA或載體穩(wěn)定轉染或轉化的原核或真核宿主細胞；和用于本發(fā)明新的缺失類似物BPI蛋白產物重組制備的方法，例如，將其中的宿主細胞培養(yǎng)于適當營養(yǎng)的培養(yǎng)基中并且從該細胞或培養(yǎng)基中分離缺失類似物BPI蛋白產物的方法。這些多核苷酸序列或載體可任選編碼27-氨基酸BPI前導序列和小鼠輕鏈多腺苷酸化信號。
本發(fā)明重組制備的新BPI缺失類似物可根據描述于美國專利No.5,439,807和相應的國際公開No.WO 93/23540(PCT/US 93/04752)(在此引入供參考)中的方法加以制備。美國專利No.5,439,807公開了在培養(yǎng)物中純化表達并分泌于遺傳轉染哺乳動物宿主細胞中的重組BPI蛋白產物的方法，并且公開了人們如何制備大量適用于摻入穩(wěn)定、均一藥物制劑中的重組BPI產物。
本發(fā)明進一步提供了包括新BPI缺失類似物的更為穩(wěn)定的藥物組合物和單獨用這些組合物或與其它治療劑同時施用的改進的治療方法。預期這種組合物可用于已知BPI蛋白產物，包括上文所討論的那些產物的任何一種治療用途中。
一般地，施用BPI蛋白產物，包括BPI缺失類似物優(yōu)選以藥物組合物加以完成，該組合物包括BPI蛋白產物和藥物上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。BPI蛋白產物可單獨施用或與已知的表面活性劑、其它化療劑或別的已知抗-衣原體的藥物聯(lián)合施用。含有BPI蛋白產物(例如，rBPI23)的穩(wěn)定的藥物組合物包括檸檬酸緩沖鹽(5或20mM檸檬酸鹽，150mM NaCl,pH5.0)中1mg/ml濃度的BPI蛋白產物，其中包括0.1％重量的poloxamer 188(Pluronic F-68,BASF,Parsippany,NJ)和0.002％重量的聚山梨醇酯(polysorbate)80(Tween 80,ICIAmericas有限公司，Wilmington,DE或JT Baker,Phillipsburg,NJ)。另一種含有BPI蛋白產物(例如rBPI21)的穩(wěn)定藥物組合物包括在5mM檸檬酸鹽、150mM NaCl、0.2％poloxamer 188和0.002％聚山梨醇酯80中2mg/ml濃度的BPI蛋白產物。這種優(yōu)選的組合描述于美國專利Nos.5,488,034和5,696,090以及相應的國際公開No.WO 94/17817(PCT/US 94/01239)中，在此引入所有文獻供參考。如在1996年1月12日提交的美國申請序列No.08/586,133(其又是1995年9月19日提交的美國申請系列No.08/530,599的部分延續(xù)，后者又是1995年1月13日提交的美國申請系列No.08/372,104的部分延續(xù))和相應的國際公開No.WO 96/21436(PCT/US 96/01095)(在此引入所有文獻供參考)中所述，其它具有增強活性BPI蛋白產物的poloxamer制劑也可使用。
包括BPI蛋白產物的治療組合物可系統(tǒng)或局部施用。系統(tǒng)施用途徑包括口腔及腸道外施用，包括靜脈內、肌肉內或皮下注射(包括進存貯室(depot)中供長期釋放)、眼內及眼球后、鞘內、腹膜內(例如，腹膜內灌洗)、肺內(用粉狀藥物或霧化或噴霧化藥物溶液)、或經皮施用。改進的霧化制劑描述于共同擁有、共同未決的1997年10月31日提交的美國申請系列No.08/962,217和相應的國際公開No.WO98/19694(PCT/US 97/19850)中，在此引入二文獻供參考。
當腸道外給藥時，BPI蛋白產物組合物一般以下面的劑量注射，包括每天1μg/kg至100mg/kg，優(yōu)選每天0.1mg/kg至20mg/kg，更優(yōu)選1到20mg/kg/天且最優(yōu)選為2到10mg/kg/天。該治療可通過以相同劑量或減少或增加劑量每天連續(xù)灌注或間歇性注射或灌注，例如1到3天，并且另外由治療醫(yī)生決定該劑量。當靜脈內施用時，BPI蛋白產物優(yōu)選通過開始的簡單灌注后持續(xù)灌注而加以施用。優(yōu)選的靜脈內治療方案為1到20mg/kg簡單靜脈內灌注BPI蛋白產物后以20mg/kg/天劑量持續(xù)靜脈內灌注，持續(xù)達一周。尤為優(yōu)選的靜脈內劑量方案為1到4mg/kg起始簡單的靜脈內灌注后以1到4mg/kg/天的劑量持續(xù)靜脈內灌注，持續(xù)達72小時。
局部途徑包括以下面的形式施用，即軟膏、乳膏(cream)、凝膠、眼滴液或軟膏(如在共同擁有、共同未決的提交于1995年11月14日的美國申請系列No.08/557,289和美國專利No.5,686,414及相應的國際公開Nos.WO 97/17990(PCT/US 96/18632)及WO 97/17989(PCT/US 96/18416)中所述，所有引入文獻供參考)、耳滴液、栓劑、洗液(例如，洗傷口)或藥用香波。例如，對于液滴形式的局部施用，根據治療醫(yī)生的判定，可施用每天1次或多次大約10至200μL BPI蛋白產物組合物。
本領域技術人員根據良好的醫(yī)療實踐和單個患者的臨床病情可容易地優(yōu)化包括BPI蛋白產物治療組合物的有效劑量和施用方案。
通過下面的說明性實施例本發(fā)明其它方面和優(yōu)勢將會明了。實施例1描述編碼rBPI(10-193)C132A表達載體pING 1742的構建。實施例2描述用pING 1742對CHO細胞的轉化以及分泌rBPI(10-193)C132A最高產量克隆的篩選。實施例3描述在2-L和500-L發(fā)酵罐中rBPI(10-193)C132A的制備與純化。實施例4描述了對rBPI(10-193)C132A和rBPI21的生化特征分析。實施例5、6和7分別描述與rBPI21相比在下面測定分析中體外LPS-結合活性，包括競爭結合測定分析和用速度濁度測定法、殺菌活性和rBPI(10-193)C132A的LPS中和活性測定復合物形成速率的分析。實施例8強調了rBPI(10-193)C132A的體內活性。
實施例1表達載體pING1742的構建rBPI(10-193)C132A表達載體，pING 1742，按如下加以構建。首先通過連接以下片段構建表達載體pING 4115，包括含有pING 3174neo基因的BamHⅠ-BsaⅠ片段與含有CMV啟動子的BsaⅠ-XhoⅠ片段和來自pING 4144的rBPI21基因以及含有來自pING 4537小鼠(卡巴)輕鏈3′非翻譯區(qū)的XhoⅠ-BamHⅠ片段(pING 3174,pING 4144和pING4537描述于美國專利No.5,420,019中，在此引入供參考)。得到的pING4155載體含有融合到人IgG增強子、人CMV啟動子和小鼠(卡巴)輕鏈3′非翻譯區(qū)上的編碼rBPI21的基因。其同時含有編碼新霉素磷酸轉移酶的neo基因用于篩選對抗生素遺傳霉素(Geneticin)(G418)抗性的轉化子。
通過刪除含有人Ig增強子的pING4155 0.7kbp的HindⅢ-HindⅢ片段而制備載體pING 1732。然后，用下面的引物通過疊加PCR誘變從pING 1732中刪除編碼成熟rBPI21部分氨基酸1到9的27個核苷酸引物15′-CTGCTCTAAAAGCTGCTGCAG-3′(SEQ ID NO:3)引物25′-CCAGGCCCTTCTGGGAGGCCGCTGTCACGGCGG-3′(SEQ ID NO:4)引物35′-GCCGTGACAGCGGCCTCCCAGAAGGGCCTGGAC-3′(SEQ ID NO:5)引物45′-CTGGGAACTGGGAAGCTG-3′(SEQ ID NO:6)疊加的互補引物2和3摻入編碼氨基酸1到9的27bp核苷酸的缺失，而引物1和4分別編碼位于pING 1732特有的SaⅡ和EcoRⅠ位點上游和下游的核苷酸。首先，用寡核苷酸引物1與3及2與4的組合通過PCR擴增獲得這些片段。獲得這些單獨片段后，將其與引物1與4退火、延伸并再次擴增。此擴增的片段然后用SalⅠ和EcoRⅠ消化并克隆入SalⅠ-EcoRⅠ消化的pING 1732中從而得到質粒pING 1742。
為了證實PCR過程中無突變發(fā)生，測序pING 1742的SalⅠ-EcoRⅠ區(qū)域。在成熟的BPI編碼區(qū)沒有觀察到變化。然而，在編碼信號序列的DNA中發(fā)現(xiàn)兩堿基對改變(ACC-＞GCT)，從而導致相對于成熟蛋白-6位置的氨基酸由Thr轉換為Ala。
實施例2用pING 1742對CHO細胞的轉化按下述將CHO-K1細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)許可號No.CCL 61)適應于無血清的Ex-Cell 301培養(yǎng)基中生長。將培養(yǎng)于Ham′s F12培養(yǎng)基中的CHO-K1細胞用胰蛋白酶消化、離心并重懸于Ex-Cell 301培養(yǎng)基中。將細胞培養(yǎng)于100rpm的125ml培養(yǎng)瓶中并用125ml或250ml培養(yǎng)瓶每兩天到三天傳代一次。
將這些Ex-Cell 301-適應的CHO細胞通過電穿孔用pING 1742加以轉染。轉染前，用線性化該質粒的NotⅠ消化pING 1742?；厥蘸?8小時將細胞以大約104個細胞/孔種植于含有補充0.6mg/mL G418(Life Technologies,Gaithersburg,MD)Ex-Cell 301培養(yǎng)基的96孔平板中。大約2周時，用抗-BPI單克隆抗體通過ELISA篩選含有單個集落的大約250孔上清液中BPI-反應性蛋白的存在。
將具有最高表達水平的15個克隆轉移至含有Ex-Cell 301培養(yǎng)基的24孔平板中。為了篩選產率，將細胞培養(yǎng)于含有補充以2％FBS和40μL無菌S-Sepharose小珠Ex-Cell培養(yǎng)基的24孔平板中10天，然后取出小珠，以低鹽緩沖液(10mM乙酸鈉中0.1M NaCl,pH 4.0)沖洗，并在相同的緩沖液中用1.5M NaCl洗脫BPI。用ELISA測定分泌rBPI(10-193)C132A的水平。于12％非-還原性SDS凝膠中的洗脫物的Western印跡分析顯示出遷移較rBPI21略快的明顯條帶。
將產量最高的前八個集落轉移至無菌125mL三角瓶(Erlenmeyer)中并培養(yǎng)于Ex-Cell培養(yǎng)基中。通過將其培養(yǎng)于含有補充以2％FBS和1％(v/v)無菌S-Sepharose小珠Ex-Cell 301培養(yǎng)基的三角瓶中而再次評估其產率。從摻入培養(yǎng)基中的S-Sepharose小珠中洗脫rBPI(10-193)C132A并用HPLC測定rBPI(10-193)C132A的水平。挑選出位于最高產量中的克隆139用于進一步培養(yǎng)和產物制備。
實施例3rBPI(10-193)C132A的制備與純化通過在2或研究用發(fā)酵罐(Biolafitte,St.Germain en Laye,France)并且然后在500升ABEC發(fā)酵罐(ABEC,Allentown,PA)中培養(yǎng)克隆139細胞而制備大量的rBPI(10-193)C132A用于特征分析。獲自2升發(fā)酵罐的蛋白產物用于下述的體外研究中，而獲自500升發(fā)酵罐的產物用于動物毒理學及效率的研究。A．在2升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)將克隆139細胞于含有補充以1％FBS Ex-Cell培養(yǎng)基逐漸加大體積的旋轉培養(yǎng)瓶中傳代直到達到足夠的體積與細胞濃度從而以大約2×105個細胞/mL接種2升的生物反應器。將細胞于37℃,150rpm培養(yǎng)于三個2升的發(fā)酵罐中，其中的培養(yǎng)基補充了1％的FBS,pH為7.2,溶解的氧維持于5-10％。以1.5％(V/V)加入大型的無菌SP-Sepharose小珠(Pharmacia與Upjohn,Piscataway,NJ)。最初的葡萄糖水平大約為3.5g/L并且每天在發(fā)酵過程中將葡萄糖脈沖式補至3g/L。于238小時時終止發(fā)酵，此時細胞的生存力為63％,80％和84％。
發(fā)酵后，收獲每只發(fā)酵罐的小珠，使其沉積(settle)并用pH7.0的10mM磷酸鈉/0.15M NaCl沖洗數(shù)次從而去除小珠的細胞組分和微弱結合的雜質。將沖洗的小珠裝柱，用pH7.0的10mM磷酸鈉，0.25mMNaCl沖洗，并用含有0.8M NaCl,5mM甘氨酸的相同緩沖液洗脫。洗脫物然后用3倍體積的無菌注射水(WFI)洗脫，裝入CM-spherodex柱(Sepracor,Marlborough,MA)并用pH7.0的10mM磷酸鈉、0.25MNaCl沖洗，然后用pH4.0 20mM的乙酸鈉、0.2M NaCl沖洗，然后用pH4.0 20mM的乙酸鈉、0.3M NaCl沖洗，并將樣品于相同的緩沖液中加以洗脫。用10,000MW截斷的Centricon膜(Amicon,Beverly,MA)濃縮后，將來自CM柱的洗脫物裝入用pH5.0 5mM檸檬酸鈉、0.15M NaCl平衡的Sephacryl S-100柱(Pharmacia與Upjohn)中。將含有通過280nm處吸收值鑒定的rBPI(10-193)C132A的部分合并，并且用Amicon濾膜濃縮至1.9mg/mL并用0.002％聚山梨醇脂80(JT Baker,Phillipsburg,NJ)、0.2％poloxamer 188(PluronicF-68,BSAF,Parsippany,NJ)加以配制。最終制劑用0.2μm濾膜過濾除菌。B．于500升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)將克隆139細胞于含有1％FBS的無胎球蛋白Ex-Cell培養(yǎng)基的一系列逐漸增加體積的旋轉瓶中傳代從而提供用于35升Bellco旋轉瓶(Bellco Glass,Vineland,NJ)的接種物，后者反過來又為500L ABEC發(fā)酵罐提供接種物。將細胞培養(yǎng)于無胎球蛋白但補充以1％FBS、額外的葡萄糖(至10g/L)和谷氨酰胺(至10mM)的完整Ex-Cell培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐以補料-分批的方式運行，在其中的運行中以一個0.5％Primatone RL補充脈沖和一個葡萄糖/谷氨酰胺脈沖進行。500升發(fā)酵罐接種后24小時加入5至6升大型的SP-Sepharose小珠。用10％的碳酸氫鈉手工調節(jié)pH至7.0，氧氣控制在5％且溫度控制在37℃。用兩個三-刃的漿狀推進器維持25rpm的攪動。發(fā)酵運行于184小時時終止，此時細胞的生存力為90％。
如上述的2升發(fā)酵一樣，發(fā)酵后讓小珠沉積且然后用低鹽(0.1M)磷酸緩沖液沖洗數(shù)次。除了在S-Sepharose小珠洗脫后包括進pH3.0的病毒失活步驟和第二個CM-spherodex柱被包括進作為濃縮步驟外，純化步驟與上述用于2升樣品的條件類似。對于第二個CM柱，用三倍體積的WFI稀釋洗脫物，調節(jié)pH至5.0，用pH5.0的20mM乙酸鈉、0.3M NaCl平衡并沖洗該柱并且于相同的緩沖液中以1.0MNaCl洗脫樣品。用pH5.0的5mM檸檬酸鈉、0.15M NaCl從SephacrylS-100柱上洗脫rBPI(10-193)C132A，調節(jié)至2mg/mL，并且經過0.2μm濾膜過濾。然后用0.002％聚山梨醇酯80,0.2％poloxamer 188配制rBPI(10-193)C132A，無菌過濾，并裝入10mL Ⅰ型玻璃瓶中。
實施例4rBPI(10-193)C132A的生化特征分析A．來自2升發(fā)酵的蛋白觀察到實施例3中純化的rBPI(10-193)C132A產物在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)為遷移較rBPI21條帶稍快的單一條帶，這與rBPI21N-末端9個氨基酸缺失相一致。序列分析表明rBPI(10-193)C132A含有預計的N-末端序列SQKGLDYASQQGTAALQKEL。質譜分析(ESI-MS)時觀察到兩種組分，一個為20,470道爾頓的分子量，這與預計的rBPI(10-193)C132A的20,472道爾頓分子量相一致，并且第二個具有20,225道爾頓的分子量，這與預計的rBPI(10-191)的20,258道爾頓的分子量相一致。rBPI(10-193)C132A和rBPI21的離子-交換HPLC圖形(HeWlett-Packard,Model 1050,Palo Alto,CA)均表現(xiàn)出單一的峰且具有相同的滯留時間。B．來自500升發(fā)酵的蛋白進行SDS-PAGE時，rBPI(10-193)C132A為遷移較rBPI21條帶稍快的單一條帶。進行質譜(分析)時，有一個20,471道爾頓分子量的主要條帶，其與rBPI(10-193)C132A的預計的20,474道爾頓分子量相一致，以及兩個次要組分，一個分子量為20,668道爾頓，與添加N-乙酰己胺(預計分子量20,677道爾頓)相一致，并且另一個分子量為20,843道爾頓，與添加N-乙酰已胺加上己糖(預計分子量為20,839道爾頓)相一致。在制備rBPI21過程中，經常觀察到一個具有添加N-乙酰己胺的類似組分。
進行反相HPLC(Shimadzu，京都，日本)時，rBPI(10-193)C132A和rBPI21均洗脫成一個主要的峰和一個次要的峰。然而，rBPI(10-193)C132A峰較對照中的相應rBPI21峰稍早洗脫出來。rBPI(10-193)C132A圖形中的次要峰最有可能代表在質譜中鑒定出的糖基化形式。rBPI(10-193)C132A與rBPI21的離子-交換HPLC圖形均表現(xiàn)出單一的峰且具有類似的滯留時間。
根據傳統(tǒng)方法進行了胰蛋白酶作圖分析。丙酮沉淀的rBPI21或rBPI(10-193)C132A首先用二硫蘇糖醇(DTT)處理后用碘乙胺處理且然后用胰蛋白酶處理。胰蛋白酶處理的產物用C18柱(BeckmanUltrasphere)通過HPLC(Beckman Model 126)加以分析。在rBPI21中，有2條源自對前導序列不準確切割的N-末端胰蛋白酶片段(T1和Ala-T1)。如預計的，除了缺失N-末端片段外，rBPI(10-193)C132A的胰蛋白酶水解圖與rBPI21的類似。
實施例5rBPI(10-193)C132A的體外LPS-結合活性A．競爭結合分析中(的活性)在競爭結合分析中評估根據實施例3A制備的純化rBPI(10-193)C132A和rBPI21與標記的rBPI21競爭結合LPS的能力。簡言之，將固定濃度(0.5nM)的125I-標記的rBPI21與未標記的rBPI21或rBPI(10-193)C132A以DMEM中5μM到0.01nM的稀釋范圍混合，該DMEM中含有HEPES緩沖液和牛血清蛋白(BSA)[U.S.Biochemicals,Cleveland,OH]并且將100μL混合物加入到以2.5μg/mL大腸桿菌J5LPS預先包被的Immulon-Ⅱ平板孔(Calbiochem,San Diego,CA)中。將平板于4℃溫育5小時并用DMEM培養(yǎng)基洗3次。加入75μL0.1N的NaOH并且移出結合的125I-rBPI21并計數(shù)。結果表明兩種蛋白均類似地與放射性標記的rBPI21競爭。B．在測定復合物形成速率分析中的活性用速度濁度測定法比較rBPI(10-193)C132A與rBPl21的LPS結合活性、評估rBPI21結合LPS的方法測定由于溶液中LPS-BPI蛋白產物復合物的形成所造成的光發(fā)散增加速率。所有實驗用BeckmanArray 360速度濁度測定儀(Rate Nephelometer)進行，該儀器自動混合樣品，測定光發(fā)散并進行速度計算。
用該方法的前面實驗測定了最佳LPS種類和濃度、測定分析特異性、可重復性以及分析結果與殺菌測定的相關性。觀察到大腸桿菌J5LPS和脂質A與rBPI21形成可在濁度測定儀中測定到的復合物，但是大腸桿菌O111:B4 LPS沒有形成可測到的復合物。根據這些研究結果，依據LPS份額，挑選大腸桿菌J5 LPS以49.4到61.7μg/ml的濃度與5到30μg/ml的rBPI21濃度(細胞流中)聯(lián)合使用。必須對每個LPS份額加以測定的最佳rBPI21濃度范圍為大約15到25μg/ml，其代表該曲線的最線性的部分。聚集速率(RT)值的最佳范圍為從700到2000。當制劑緩沖液變成包括PLURONIC P103或當NaCl濃度增加時，需要更低濃度的rBPI21以達到相同的聚集速率。加入結合LPS的重組脂多糖結合蛋白(rLBP50)或結合BPI蛋白產物的肝素抑制rBPI21-LPS聚集物的形成，表明該相互作用的特異性。通過測定多份額的BPI和測定相同份額的rBPI21多次證實分析測定的可重復性。通過45℃處理一周而部分失活的rBPI21樣品的濁度測定分析與用大腸桿菌J5細胞的培養(yǎng)基微稀釋殺菌測定分析結果很好地一致。
比較rBPI(10-193)C132A和rBPI21的濁度測定實驗按如下進行。將超聲處理的LPS[來自List Biochemicals的大腸桿菌J5 LPS Lot No.30119B]與rBPI(10-193)C132A或rBPI21[兩者均用0.2％PLURONICF68(poloxamer 188)、0.002％TWEEN 80(聚山梨醇脂80)、5mMpH5.0的檸檬酸鹽、150mM NaCl加以配制]直接稀釋入由Beckman供應的PBS緩沖液(補充以PEG)中。固定LPS濃度但BPI蛋白產物濃度依每個實驗而改變。測定兩個濃度的LPS:24.7和49.4μg/mlLPS。通過加入60μl PBS-PEG緩沖液至細胞流后加入42μl BPI蛋白產物稀釋液而開始每個反應。建立基線后，加入42μl的大腸桿菌J5LPS溶液。加入最后一種組分后，根據光擴散的范圍濁度測定儀測定復合物形成的速率。通過用含有給定BPI蛋白產物濃度的每個測試樣品的RT值除以標準相應的RT值以產生百分對照值而分析數(shù)據。對于每個測定的BPI蛋白產物濃度，測定最大聚集速率并建立曲線。僅僅位于最大值左邊的數(shù)據點(等價數(shù)據點)用于比較分析不同的BPI蛋白產物樣品。通過比較用于測定的RT值與曲線線性區(qū)域的標準份額而測定樣品的相對活性?？墒褂命c到點或曲線適合方法(curve fitapproach)。
除了測試純化的rBPI(10-193)C132A和純化的rBPI21[含有大約7.8％rBPI(10-193)C132A]，還對這些蛋白的相等混合物以及具有16％rBPI(10-193)C132A的rBPI21進行評估(僅在49.4μg/ml LPS時)。這些結果顯示在49.4μg/ml LPS時，rBPI(10-193)C132A與大約25％更低濃度的rBPI21達到類似的聚集速率。rBPI(10-193)C132A在27.4和49.4μg/ml LPS時均較rBPI21達到更高的最大聚集速率。兩種分子的等量混合物產生介于rBPI21與rBPI(10-193)之間的曲線而7.8％份額的rBPI21與16％份額的10-193彼此表現(xiàn)一致。此結果的點到點分析(49.4μg/ml LPS)表明rBPI(10-193)在該分析中大約是rBPI21活性的兩倍。
實施例6rBPI(10-193)C132A的體外殺菌活性該實施例中的所有分析測定均以實施例3A中的2升發(fā)酵罐中制備的rBPI(10-193)C132A進行。A．放射擴散分析中大腸桿菌的效應該放射擴散分析比較純化的rBPI(10-193)C132A和rBPI21對大腸桿菌J5的殺菌效應，該大腸桿菌為光滑型大腸桿菌菌株011B4的UDP-半乳糖-4-差向異構酶的“粗糙型”突變子。將大腸桿菌J5細胞(Mannion等，臨床研究雜志，85:853-860(1990)；List BiologicalLaboratories,Campbell,CA)培養(yǎng)至指數(shù)時期，離心并用pH7.4的10mM磷酸鈉沖洗兩次并且以大約1×106CFU/ml的終濃度加入到補充以3％Trypticase Soy Broth(TSB,DIFCO Laboratories,Detroit,MI)、10mM磷酸鈉的熔解瓊脂糖中。在硬化的瓊脂糖中制備3mm直徑的小孔并將5μL序列稀釋的rBPI21或rBPI(10-193)C132A加入到小孔中。將平板于37℃溫育3小時從而使擴散發(fā)生，且然后加入含有6％TSB的熔解的瓊脂糖覆蓋層。將平板于37℃溫育過夜并以抑制的凈面積對濃度作圖。結果表明在該分析中rBPI(10-193)C132A與rBPI21表現(xiàn)類似。B．在放射擴散分析中對金黃色葡萄球菌L-形式的效應該放射擴散分析比較純化的rBPI(10-193)C132A與rBPI21對培養(yǎng)成L-形而無細胞壁的格蘭氏-陽性細菌金黃色萄萄球菌的殺菌效應。如在美國專利No.5,578,572(在此引入供參考)中所述，將金黃色葡萄球菌L-形細胞在補充以3.5％NaCl、10mM CaCl2和1000U/mL青霉素G的心臟灌注(HI)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。將細胞在含有補充NaCl的HI培養(yǎng)基的熔解0.8％瓊脂糖中稀釋至大約5×104或5×105個細胞/mL，并且將8ml細胞-瓊脂糖懸液倒入10cm平板中。制備3mm直徑的小孔，并將5μL系列稀釋的rBPI21或rBPI(10-193)C132A加入到該小孔中。將平板于37℃溫育24小時并且以抑制的凈面積對濃度作圖。結果顯示rBPI21和rBPI(10-193)C132A在該分析中均以類似的方式在細胞濃度約5×104和5×105時抑制金黃色萄萄球菌L-形式的生長。C．在培養(yǎng)基微稀釋分析中對大腸桿菌J5的效應該培養(yǎng)基微稀釋分析比較純化的rBPI(10-193)C132A與rBPI21對大腸桿菌J5的殺菌效應。按照以前Horwitz等在感染，免疫，63:522-527(1995)中所述將大腸桿菌J5細胞在胰化蛋白胨酵母提取物(TYE)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜且然后在TEA培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。將細胞從大約1×104和1×105個細胞/mL接種于心臟灌注(HI)培養(yǎng)基中，并將95μL加入到96孔平板中。在配制緩沖液中制備的5μL rBPI(10-193)C132A或rBPI21的各種稀釋液加入到每孔中并將平板于37℃溫育24小時。結果顯示rBPI(10-193)C132A和rBPI21在這些分析中具有類似的活性。
實施例7rBPI(10-193)C132A的體外LPS中和活性該實施例A部分的分析用在實施例3A中2升發(fā)酵罐中制備的rBPI(10-193)C132A進行，而該實施例B中的分析用實施例3B中500升發(fā)酵罐中制備的rBPI(10-193)C132A進行。A．在RAW細胞增殖分析中的活性
RAW細胞增殖分析用于比較rBPI21與rBPI(10-193)C132A的體外LPS中和活性。在該分析中，LPS抑制RAW細胞的增殖，并且rBPI21中和LPS的該效應。
在分析前24小時首先將維持于RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)中的小鼠RAW 264.7細胞(ATCC許可號T1B71)通過在5U/mL重組小鼠γ-干擾素(Genzyme,Cambridge,MA)存在下的溫育而加以誘導，其中的RPMI 1640培養(yǎng)基補充了10mM HEPES緩沖液(pH7.4)、2mML-谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)、0.075％碳酸氫鈉、0.15M 2-巰基乙醇和10％胎牛血清(Hyclone，有限公司，Logan,UT)。然后機械收集誘導的細胞并于4℃500×g離心且然后重懸于50mL RPMI 1640培養(yǎng)基(無補充物)中，再次離心并再次重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基(無補充物)中。計數(shù)細胞，將其濃度調整至2×105個細胞/mL并且加入100μL等份至96孔板的每個小孔中。
然后將這些細胞與大腸桿菌O113 LPS(Control Standard,Assoc.of Cape Code,Woods Hole,MA)溫育大約15小時，該LPS以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中1ng/mL的濃度(該濃度為其中的LPS濃度為50Pg/mL到100ng/mL的滴定實驗的結果)100μL/孔等份而加入。該溫育在25ng/mL到50ng/mL濃度的rBPI21或rBPI(10-193)C132A存在或不存在的情況下進行。重組的人rBPI21，也稱為rBPI21Δcys(為rBPI1-93，其中132位的丙氨酸為半胱氨酸所替代[見共同擁有的美國專利No.5,420,019])以1μg/mL的濃度用作對照。通過在分析開始后5小時加入1μCi/孔[3H]-胸腺嘧啶而定量測定細胞增殖。溫育15小時后，用細胞收獲器(cell harvesker)(Inotech Biosystems,INB-384，樣品處理及濾膜計數(shù)系統(tǒng)，Lansing,MI.)將標記的細胞收獲至玻璃纖維濾膜上。LPS-介導的對RAW 264.7細胞增殖的抑制依賴于作為血清成分或重組LBP(以1μg/mL的濃度)而加入到反應混合物中的LBP的存在。
在這些實驗中，rBPI21和rBPI(10-193)C132A兩者均類似地抑制LPS-介導的對RAW細胞增殖的抑制。B．在TNF抑制分析中的活性腫瘤壞死因子(TNF)抑制分析用于比較rBPI21和rBPI(10-193)C132A的體外LPS中和活性。在該分析中，LPS與純化的LBP(或含有LBP的血清)一起刺激THP-1細胞(人單核細胞系)的TNF合成，并且rBPI21中和LPS的該效應。
將THP.1細胞(ATCC許可號TIB-202)維持于具有10％FBS的RPMI(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中并且在用LPS處理前三天培養(yǎng)于具有10％FBS加50 ng/ml 1,25二羥基維生素D(BIOMOLResearch Laboratories有限公司，Plymouth Meeting,PA)的RPMI中從而誘導CD 14的表達。以LPS誘導前，將細胞用RPMI沖洗三次并懸于具有10％FBS的RPMI中或無血清的培養(yǎng)基[補充1％HB101的RPMI(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)]中。在96孔平板中以大約5×104個細胞每孔用1ng/ml大腸桿菌0128 LPS(Sigma,St.Louis,MO)誘導TNF的表達。將平板于37℃,5％CO2下溫育，然后取出上清液等分并且用CellTiter 96TMAQ(Promega公司，Madison,WI)通過WEHI 164毒性分析監(jiān)測細胞生存力。重組人TNFα(GenzymeDiagnostics,Cambridge,MA)用作陽性標準。rBPI21和rBPI(10-193)C132A二者均類似地抑制LPS-誘導的對TNF合成的刺激。
實施例8rBPI(10-193)C132A的體內生物學活性用在實施例3B中500升發(fā)酵罐中制備的純化rBPI(10-193)C132A進行下述的體內分析。A．在大鼠中的毒性研究比較在大鼠中rBPI21和rBPI(10-193)C132A的毒性分布，在該研究中，六只雄性和六只雌性Sprague-Dawley大鼠實驗組接受或者載體對照(配制緩沖液)，低劑量(50mg/kg/天)或高劑量(120mg/kg/天)的rBPI21或rBPI(10-193)C132A。通過以4.2mL/lkg/小時(100mL/kg/天)的灌注速率連續(xù)三天的植入的femoral導管(indwelling femoralcatheter)連續(xù)靜脈內灌注而施用這些劑量。臨床觀察結果每日至少記錄兩次并且每日記錄體重。接近結束時收集血尿樣品用于血液學、臨床化學及尿分析測定。結束時，稱量器官并收集組織用于組織病理學檢查。沒有死亡或顯著測試文章(test article)有關的效應。該數(shù)據表明當施以連續(xù)灌注時rBPI21與rBPI(10-193)C132A具有類似的毒性分布。B．藥物動力學2mg/kg的rBPI21與rBPI(10-193)C132A的藥物動力學在大鼠中進行了研究。rBPI21與rBPI(10-193)C132A的血漿清除通過三-指數(shù)藥物動力學處理函數(shù)(tri-exponential pharmacokinetic dispositionfunction)得到很好描述。沒有檢測到rBPI產物藥物動力學參數(shù)中的統(tǒng)計差異性(非參數(shù)Wicoxon rank檢驗，p＜0.05)。大多數(shù)施用的藥物(＞96％)在0.2-0.4分鐘的半壽期α期與3.9-4.3分鐘的β半壽期得到清除，而其余部分在27-33分鐘半壽期的γ期期間得到清除。中央部分(central compartment)分布的體積(Vc)為41-45mg/kg，并且清除速率(CL)為24-30mL/分鐘/kg。該分布的穩(wěn)定態(tài)體積為152-184mL/kg。C．在小鼠內毒素接種中的效率基本上按照Ammons等，在“治療膿毒病的新治療策略”，Morrison和Ryan編，Marcel Dekker，紐約(1996),55-69頁在小鼠致死內毒素血癥(endotoxemia)模型中進行兩次單獨的研究從而測定rBPI21與rBPI(10-193)C132A的相對活力。在兩個研究中，在每次處理及對照組中有14只小鼠。在第一個研究中，CD1小鼠靜脈內接種25mg/kg的大腸桿菌O111∶B4的脂多糖(LPS)。接種后立即將小鼠以15、20、25和30mg/kg的劑量的rBPI21或rBPI(10-193)C132A或對照載體(僅僅配制緩沖液)靜脈內處理。連續(xù)七天每日兩次記錄致死率。
示于下表1中的第一個研究結果表明用rBPI(10-193)C132A和rBPI21處理均較載體對照顯著增加了存活。此外，rBPI(10-193)C132A較rBPI21至少效率高兩倍，因為在較rBPI21低兩倍劑量的rBPI(10-193)C132A中見到與此劑量rBPI21類似的存活效率。
表1
1NA，不適用**，與對照比p＜0.01#，與rBPI21比p＜0.05##，與對照比p＜0.01在第二個研究中，研究了更寬范圍的rBPI(10-193)C132A的劑量(5、10、15、20、25、30mg/kg)。下表中所示的結果證實盡管與第一個研究一樣，rBPI21與rBPI(10-193)C132A兩者均較對照得到了明顯的存活效應，但是rBPI(10-193)C132A至少效率高兩倍，因為用低于2倍的劑量得到與rBPI21類似的效率。
表2
1NA，不適用；ND，沒有進行**，與對照比p＜0.05**，與對照比p＜0.01#，與rBPI21比p＜0.05D．在致死菌血癥鼠模型中的效率進行了兩個單獨的研究從而測定rBPI21與rBPI(10-193)C132A在致死菌血癥小鼠模型中的相對效率。在第一個研究中，CD 1小鼠通過靜脈內施用而接種以6.8×107個大腸桿菌07∶K1的菌落形成單位(CFU)。接種后立即用10、20和30mg/kg劑量的rBPI21或rBPI(10-193)C132A或對照載體(僅僅配制緩沖液)通過靜脈內處理小鼠。連續(xù)七天每日兩次記錄致死率。
示于下表3中的第一個研究結果表明用10和30mg/kg rBPI21處理的組別存活顯著增加(p＜0.05，與對照相比)。盡管與對照相比rBPI(10-193)C132A沒有觀察到存活明顯的增加，但在該研究中rBPI21與rBPI(10-193)C132A處理的組別間存活優(yōu)勢沒有顯著的差異。
表3
*，與對照相比p＜0.05為了更為充分地對rBPI21與rBPI(10-193)C132A在該模型中的效應進行特征分析，用更為廣泛的劑量范圍進行第二個實驗。在該研究中，CD 1小鼠通過靜脈內施用而接種2.57×108個大腸桿菌07∶K1菌落形成單位(CFU)。接種后立即用1.0、3.0、10和30mg/kg rBPI21以及0.3、1.0、3.0、10和30mg/kg rBPI(10-193)C132A靜脈內處理小鼠。示于下表4中的結果表明兩者均提供保護，并且在任何劑量兩種變異體之間的保護效應無明顯差異。
表4
1ND，沒有測定*，與對照相比p＜0.05**，與對照相比p＜0.01E．在有意識大鼠中的心血管效應進行一系列實驗從而測定rBPI21與rBPI(10-193)C132A對大鼠血壓的相對效應。用Ketamine(Fort Dodge Labs,Fort Dodge,IA)與Rompum(Bayer公司，Shawnee Mission,KS)的混合物麻醉每只大鼠。然后將一導管置于右carotid動脈中并與血壓傳導僅(pressuretransducer)連接以記錄血壓。將第二根導管置于右jugular靜脈中以注射rBPI或載體。然后在實驗開始前讓大鼠恢復。當大鼠變得警覺、可活動并且血壓穩(wěn)定于正常范圍內時開始實驗。然后將rBPI21、rBPI(10-193)C132A或對照載體(配制緩沖液)作為bolus而經15秒注射并記錄以后60分鐘的平均動脈壓(mmHg)。
在預實驗中，測得20和30 mg/kg劑量的rBPI21較載體對血壓沒有明顯的效應，但是40mg/kg的劑量在5分鐘內得到血壓的顯著的下降。此低血壓反應在注射后15分鐘達到最大，此時血壓降低48±12mmHg(平均值±SE；p＞0.05)。60分鐘后，rBPI21-處理動物的血壓恢復并且與載體處理動物的血壓沒有顯著差異。
為了比較rBPI21與rBPI(10-193)C132A的效應，5只大鼠的實驗組給以40mg/kg的每種藥物物質或載體對照，并將血壓反應分析為曲線下面積(AUC)。與以前觀察到的一樣，圖1顯示rBPI21導致血壓顯著的下降，表現(xiàn)為較對照載體升高的AUC。通過比較，與載體對照相比，rBPI(10-193)C132A對血壓無明顯影響。50mg/kg劑量的rBPI21(N=4只大鼠)較40mg/kg的劑量具有更大的低血壓效應，表現(xiàn)為圖1中AUC的進一步上升。在此更高的劑量時，雖然在施用rBPI(10-193)C132A的大鼠(N=3)中也出現(xiàn)一些血壓的下降，但此效應與載體對照相比不明顯。
對于本發(fā)明的技術人員來說對上述本發(fā)明的眾多修飾和變異預計會發(fā)生。因此，僅僅那些如出現(xiàn)在附屬權利要求中的限定才應置于其中。
序列表<110>XOMA技術公司Horwitz,Arnold(發(fā)明人)Carroll,Stephen F．(發(fā)明人)Burke,David(發(fā)明人)<120>殺菌/透性-增加蛋白(BPI)缺失類似物<130>29715/35765<140><141><150>09/099,725<151>1998-06-19<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1813<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(31)..(1491)<220><221>成熟肽<222>(124)..(1491)<220><223>rBPI<400>1caggccttga ggttttggca gctctggagg atg aga gag aac atg gcc agg ggc 54Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly-30 -25cct tgc aac gcg ccg aga tgg gtg tcc ctg atg gtg ctc gtc gcc ata 102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile-20 -15 -10ggc acc gcc gtg aca gcg gcc gtc aac cct ggc gtc gtg gtc agg atc 150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-5 -1 1 5tcc cag aag ggc ctg gac tac gcc agc cag cag ggg acg gcc gct ctg 198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10 15 20 25cag aag gag ctg aag agg atc aag att cct gac tac tca gac agc ttt 246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe30 35 40aag atc aag cat ctt ggg aag ggg cat tat agc ttc tac agc atg gac 294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp45 50 55atc cgt gaa ttc cag ctt ccc agt tcc cag ata agc atg gtg ccc aat 342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Set Met Val Pro Asn60 65 70gtg ggc ctt aag ttc tcc atc agc aac gcc aat atc aag atc agc ggg 390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly75 80 85aaa tgg aag gca caa aag aga ttc tta aaa atg agc ggc aat ttt gac 438Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90 95 100 105ctg agc ata gaa ggc atg tcc att tcg gct gat ctg aag ctg ggc agt 486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser110 115 120aac ccc acg tca ggc aag ccc acc atc acc tgc tcc agc tgc agc agc 534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser125 130 135cac atc aac agt gtc cac gtg cac atc tca aag agc aaa gtc ggg tgg 582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp140 145 150ctg atc caa ctc ttc cac aaa aaa att gag tct gcg ctt cga aac aag 630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys155 160 165atg aac agc cag gtc tgc gag aaa gtg acc aat tct gta tcc tcc aag 678Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170 175 180 185ctg caa cct tat ttc cag act ctg cca gta atg acc aaa ata gat tct 726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser190 195 200gtg gct gga atc aac tat ggt ctg gtg gca cct cca gca acc acg gct 774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala205 210 215gag acc ctg gat gta cag atg aag ggg gag ttt tac agt gag aac cac 822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His220 225 230cac aat cca cct ccc ttt gct cca cca gtg atg gag ttt ccc gct gcc 870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala235 240 245cat gac cgc atg gta tac ctg ggc ctc tca gac tac ttc ttc aac aca 918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Ash Thr250 255 260 265gcc ggg ctt gta tac caa gag gct ggg gtc ttg aag atg acc 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1791aacttctggt ttttttcatg tg 1813<210>2<211>487<212>蛋白質<213>人<400>2Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val-30 -25 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15 -10 -5 -1 1Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala5 10 15Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys20 25 30Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly35 40 45His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser50 55 60 65Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser70 75 80Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe80 90 95Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile100 105 110Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr115 120 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130 135 140 145Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys150 155 160Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val 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Glu Leu Lys His Ser Ash Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu390 395 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val405 410 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val420 425 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe435 440 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450 455<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>3ctgctctaaa agctgctgca g 21<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4ccaggccctt ctgggaggcc gctgtcacgg cgg 33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5gccgtgacag cggcctccca gaagggcctg gac 33<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>6ctgggaactg ggaagctg 18
權利要求
1．一種由成熟人BPI氨基酸殘基10到193所組成的殺菌/透性增加蛋白(BPI)缺失類似物，其中位置132的半脫氨酸殘基由不同的氨基酸所替代。
2．權利要求1的BPI缺失類似物，其中代替所述半胱氨酸殘基的氨基酸為選自丙氨酸或絲氨酸的非極性氨基酸。
3．權利要求1的BPI缺失類似物，其中的位置132的半胱氨酸殘基由丙氨酸所替代。
4．編碼權利要求1的BPI缺失類似物的多核苷酸。
5．編碼權利要求3的BPI缺失類似物的多核苷酸。
6．權利要求4的多核苷酸，進一步包括BPI的27個氨基酸的前導序列。
7．權利要求4的多核苷酸，它為DNA。
8．包括權利要求7DNA的表達載體。
9．宿主細胞，它以允許所述多核苷酸缺失類似物在所述宿主細胞中表達的方式用權利要求7的DNA穩(wěn)定轉化或轉染。
10．權利要求9的真核宿主細胞。
11．權利要求10的宿主細胞，它為CHO細胞。
12．制備BPI缺失類似物多肽的方法，包括在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求9的宿主細胞和從所述的宿主細胞或所述的培養(yǎng)基中分離所述的多肽。
13．權利要求12方法的多肽產物。
14．一種包括權利要求1的BPI缺失類似物和藥物上可接受稀釋劑、佐劑或載體的組合物。
15．一種包括權利要求3的BPI缺失類似物和藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體的組合物。
16．一種包括權利要求13的BPI缺失類似物和藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體的組合物。
17．一種改進的施用BPI蛋白產物至受試者的方法，包括施用權利要求14的組合物至所述的受試者。
18．一種改進的施用BPI蛋白產物至受試者的方法，包括施用權利要求15的組合物至所述的受試者。
19．一種改進的施用BPI蛋白產物至受試者的方法，包括施用權利要求16的組合物至所述的受試者。
全文摘要
本發(fā)明提供新的BPI缺失類似物,其由成熟的人BPI(10到193位)氨基酸殘基所組成,其中位于氨基酸位置(132)的半胱氨酸殘基由另一種氨基酸所替代。同時提供了包括這些類似物的融合蛋白、編碼這些產物的多核苷酸、用于其重組制備的材料與方法、這些產物的組合物及藥劑以及這些產物的治療用途。
文檔編號A61P31/04GK1312858SQ99809726
公開日2001年9月12日 申請日期1999年6月18日 優(yōu)先權日1998年6月19日
發(fā)明者A·霍爾維茨, F·S·卡羅爾, D·布爾克 申請人:愛克索馬技術有限公司