專利名稱：對(duì)新孵化的家禽接種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及家禽接種疫苗，更具體地說(shuō)，是一種對(duì)家禽接種疫苗的新方法，包括用腸道致病菌的無(wú)毒活衍生菌來(lái)噴淋。
2．相關(guān)領(lǐng)域描述已知在食用了被人腸道菌致病原(如沙門氏菌spp.)污染的家禽肉和蛋將導(dǎo)致人患病。這種污染主要發(fā)生于屠宰后加工畜體過(guò)程中接觸含有高水平腸桿菌的腸內(nèi)容物所致。腸桿菌寄居腸道中但通常對(duì)家禽不致病。為了減少食物被腸道致病菌污染，理想的是減少上市童子雞腸道中人致病性腸道細(xì)菌的量。降低這種污染的努力著重于改良童子雞。降低這種污染的努力已著重于改善生產(chǎn)和加工過(guò)程中的環(huán)境衛(wèi)生(Bailey,J.s.,Poult.Sci.,72:1169-1173,1993)，但這些方法耗時(shí)費(fèi)用又高，而且對(duì)避免零量的(Sporadic)污染并不總是有效。(參見如Food Borne Disease Outlook Annual summary,1982；和SalmonellaSurveillance Annual survey 1992；均可從Center for Disease Control,U.S.Department of Health and Human Services,Atlanta,GA購(gòu)得)。依賴于加工過(guò)程中環(huán)境衛(wèi)生的方法必須經(jīng)常重復(fù)，因?yàn)榧庸さ难b置和人員會(huì)被每只加工的受污染家禽再污染。依賴于生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)境衛(wèi)生的方法要求堅(jiān)持防范，因?yàn)樯a(chǎn)環(huán)境污染的可能性很高。因此，一種控制家禽生長(zhǎng)過(guò)程中腸道致病菌的簡(jiǎn)單而價(jià)廉的方法是降低加工過(guò)程中畜體污染的關(guān)鍵性改進(jìn)。
Promosopone等人，J.Food Protect.,61(2):176-180,1998已報(bào)導(dǎo)了可通過(guò)給予鼠傷寒沙門氏菌特異性抗體聯(lián)合應(yīng)用禽特異性前生物期物質(zhì)(probiotic)來(lái)降低家禽腸道中鼠傷寒沙門氏菌的定居。用噬酸乳桿菌、屎鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌抗體噴淋給予1日齡的仔雞，然后通過(guò)飲水口服給予1-3天。在第一天口服給予鼠傷寒沙門氏菌攻擊仔雞，第31、38和43天用前生物期物質(zhì)處理后發(fā)現(xiàn)了明顯降低了盲腸和結(jié)腸鼠傷寒沙門氏菌的量。雖然在早至第1天齡給予前生物期物質(zhì)和抗體對(duì)降低腸中鼠傷寒沙門氏菌的定居可能非常重要，但從該報(bào)導(dǎo)中不能弄清楚初期噴淋給予前生物期物質(zhì)和抗體或更通常在第1-3天在飲水中口服給予是否能引起鼠傷寒沙門氏菌定居的降低。
已報(bào)導(dǎo)了預(yù)防家禽疾病用的疫苗和一些對(duì)沙門氏菌特異的疫苗(參見如美國(guó)專利No.5,294,441、5,389,368、5,468,485和5,387,744)。然而對(duì)不同家禽給予疫苗的方法不同，這取決于活性制劑作用的靶部位。事實(shí)上，通常認(rèn)為接種途徑應(yīng)按微生物定居和復(fù)制的偏愛位點(diǎn)而定。因此，對(duì)于在呼吸道中繁殖的新城疫和傳染性支氣管炎病毒，選擇的接種方法是經(jīng)仔雞眼、鼻道和呼吸系統(tǒng)的滴眼劑或噴淋途徑。(Giambrone,World Poultry-Misset 13:19-23,1997)。由于許多更重要的家禽疾病發(fā)生在呼吸道中，對(duì)這些疾病接種的研究已采用了噴淋給藥，因氣霧劑或噴淋劑易為禽類吸入，并接觸上呼吸道的粘膜表面。對(duì)非呼吸道疾病如組織、循環(huán)系統(tǒng)或腸疾病的疫苗，通常通過(guò)皮下注射或口服給予、或接種或飲水中給藥。
已發(fā)表的采用噴淋給予疫苗的參考文獻(xiàn)幾乎都涉及免疫接種來(lái)抵抗通過(guò)呼吸道入侵的病毒，例如，預(yù)防新城疫、禽腦脊髓炎、雞馬力克病、喉氣管炎、感染性支氣管炎等。
對(duì)家禽已用了細(xì)菌疫苗，尤其是從高毒力細(xì)菌親代株衍生的減毒活突變株(Roland,K.等人，表達(dá)大腸桿菌078脂多糖的鼠傷寒沙門氏菌株保護(hù)雞抵抗大腸桿菌攻擊的效力，Abstract of a presentation at Conf.Of Res.Workersin Animal Diseases,Chicago,IL,Nov.10,1997)。高毒力親代株的減毒突變株的衍生不僅可能增加了該減毒突變株在腸道的定居也可能增加了其在腸相關(guān)淋巴組織(GALT)中的定居，并引起保護(hù)性免疫力。(參見如Curtiss Ⅲ等人，對(duì)人腸道致病菌在家禽中定居的控制，Blankenship等人編輯，AcademicPress,Inc.,New York,1991 169-198)。相反，在腸中定居而不入侵GALT且不在GALT定居的細(xì)菌可能不引發(fā)免疫反應(yīng)。例如，小鼠研究表明鼠傷寒沙門氏菌表面上的脂多糖(LPS)0-抗原重復(fù)結(jié)構(gòu)不僅對(duì)抵抗非特異性宿主防御機(jī)理(微生物毒素，第5卷，Roantree等人編輯，Academic Press,New York,1971)非常重要，而且對(duì)有效入侵粘蛋白和多糖覆蓋的腸道非常重要。因此，當(dāng)口服給予LPSO抗原缺乏的粗糙型突變菌時(shí)，它們不能入侵和定居于GALT(見如Curtiss等人，1991，同上)。
一些參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了通過(guò)口服或皮下注射給予家禽細(xì)菌疫苗。例如，一種預(yù)防鴿子患副傷寒的商品疫苗含有皮下注射的死鼠傷寒沙門氏菌(VetafarmParatyphoid Vaccine,Vetafarm Pty.Ltd.Wagga Wagga,Australia)。另外，上述Curtiss等人，1991(同上)報(bào)導(dǎo)了用病原性沙門氏菌的無(wú)毒衍生株作為雞的口服疫苗。
也已報(bào)導(dǎo)了采用引起呼吸疾病的細(xì)菌疫苗作噴淋疫苗菌株。Hertman等人報(bào)導(dǎo)了對(duì)小雞和火雞口服和氣霧給予的多殺巴斯德菌疫苗，以預(yù)防呼吸道疾病的家禽霍亂癥(美國(guó)專利No.4,169,886)。Ley等人報(bào)導(dǎo)了滴眼和氣霧給予含有活雞枝原體(其導(dǎo)致呼吸道疾病)的疫苗(Ley等人，家禽疾病，41:187-194,1997)。一種商品疫苗推薦給予含大腸桿菌血清型078的無(wú)毒菌株的疫苗，以進(jìn)行抵抗大腸桿菌野生型親代株引起的呼吸疾病的免疫接種(見GARAVAX-T的產(chǎn)品說(shuō)明，Schering-Plough animal Health Corp.,Omaha,NE)。對(duì)所有這些疫苗可選擇采用氣霧劑給藥，因?yàn)榻邮芙臃N的家禽所患的以下疾病包括呼吸道感染。
另一參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了將含有非致病性大腸桿菌K-12 O-抗原缺乏性菌株的疫苗作為氣霧劑給予(美國(guó)專利No.4,404,186)。但K-12菌株只是一種實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性的菌株而不是腸致病性的，由于該微生物不能入侵和定居于腸相關(guān)淋巴組織，故任何由此疫苗引發(fā)的免疫力很可能是通過(guò)呼吸道免疫而產(chǎn)生的。
在一些參考文獻(xiàn)中曾建議細(xì)菌疫苗用局部噴淋法如鼻噴霧劑或眼噴霧劑(例如，見美國(guó)專利No.5,294,441)。但先前的研究沒(méi)有一個(gè)建議用全身噴淋給予腸道致病菌疫苗。
因此，雖然已報(bào)導(dǎo)了噴淋給予疫苗可用于控制家禽的呼吸疾病，但至今沒(méi)有建議用全身噴淋給予家禽疫苗來(lái)控制人病原體，這些病原體通常存在于家禽中并由它們傳播，但它們不是家禽呼吸疾病的病原體。
另外，希望有一種方法來(lái)降低由腸致病性微生物(尤其是沙門氏菌spp.，)導(dǎo)致的家禽污染，此方法在普通的商品家禽生產(chǎn)條件下應(yīng)易于實(shí)施和價(jià)廉；可給予新孵化的小雞而無(wú)需單個(gè)處理；且可降低或預(yù)防腸致病性微生物對(duì)家禽內(nèi)臟、淋巴組織和腸道的感染。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)可通過(guò)用疫苗全身噴淋家禽，從而將疫苗給予家禽。通過(guò)這種全身噴淋途徑給予的疫苗量能有效引發(fā)免疫應(yīng)答，即抗體和/或細(xì)胞免疫力。雖然事實(shí)上任何疫苗都可用這種方法送遞，但全身噴淋給藥對(duì)包含腸道致病菌的無(wú)毒活衍生菌疫苗特別有效。這些腸道致病菌宜為沙門氏菌屬。這種噴淋給予腸道致病菌的方法避免了其它給藥途徑的缺點(diǎn)，這種方法無(wú)需單個(gè)處理小雞，可在孵化日給予，且其在商品家禽生產(chǎn)的普通條件下易于操作。
其引發(fā)免疫應(yīng)答的有效劑量意想不到的低，約相當(dāng)于通過(guò)口服途徑給藥(如在飲用水中給藥)的有效劑量。通常用本發(fā)明活疫苗給藥的劑量約為105到108菌落形成單位。
疫苗的這種噴淋給藥適用于家禽(如雞)的疫苗接種，可在它們易接受疫苗有益效果的任何年齡(給予)，但尤其適用于3周齡或更小年齡的家禽，更佳的是不到1日齡的家禽。
在一些實(shí)施例中，可在噴淋給藥后再至少給予一次加強(qiáng)劑量疫苗。較佳地，該加強(qiáng)劑量可在噴淋給藥后的14天，通過(guò)飲水口服給予或噴淋給予。
較佳地，噴淋的近似霧滴直徑范圍約為50微米到150微米。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中涉及降低家禽微生物污染的方法。該方法包括通過(guò)全身噴淋給予免疫原性組合物，來(lái)免疫接種家禽使其抗微生物污染。這種微生物污染對(duì)家禽本身可能是或不是致病性的，但其存在于家禽中，當(dāng)人食用了這些家禽的肉或由其生產(chǎn)的其它食品后，這種微生物污染可能在人中產(chǎn)生疾病病癥。這種微生物污染物可以是任何污染物，尤其是定居在家禽腸胃道的微生物。
給予的免疫原性組合物的量應(yīng)有效地引發(fā)免疫應(yīng)答，即抵抗污染微生物的抗體和/或細(xì)胞免疫力。較佳地，該免疫原性組合物含有腸道致病菌的無(wú)毒活衍生菌。較佳地，這些腸道致病菌是沙門氏菌屬。
該免疫原性組合物以有效引發(fā)免疫應(yīng)答的量給予。該劑量約相當(dāng)于口服途徑給藥的劑量。通常用本發(fā)明活疫苗給藥的劑量約為105到108菌落形成單位。
本發(fā)明免疫原性組合物的噴淋給藥適用于家禽接種，可在它們易接受疫苗有益效果的任何年齡(給予)，但尤其適用于3周齡或更小年齡的家禽(如雞)，更佳的是小于1日齡的家禽。
在一些實(shí)施例中，可在噴淋給藥后再至少給予一次加強(qiáng)劑量疫苗，該加強(qiáng)劑量可通過(guò)飲水口服給予，較佳地在噴淋給藥后的14天。
較佳地，噴淋的近似霧滴直徑范圍約為50微米到150微米。
用本發(fā)明所達(dá)到幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)中要關(guān)注的是提供了用腸道致病菌疫苗接種家禽的一種新方法；提供了一種降低腸道致病性微生物在腸道、淋巴組織和內(nèi)臟組織中定居的方法；提供了一種降低家禽(用于人食用的)微生物污染的方法；提供了一種在普通商品家禽生產(chǎn)條件下易于操作且價(jià)廉的疫苗接種方法；和提供了一種接種幼禽而無(wú)需單個(gè)處理小雞(尤其是孵化日的小雞)的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了對(duì)孵化日的白來(lái)亨雞粗噴淋或直接口服送遞(a)105CFU、(b)107CFU或(c)109CFU鼠傷寒沙門氏菌χ3985疫苗株后7天，從脾、法氏囊組織、糞便和盲腸回收的χ3985的量；圖2顯示了在第1和14天對(duì)白來(lái)亨雞粗噴淋或直接口服送遞(a)105CFU、(b)107CFU或(c)109CFU鼠傷寒沙門氏菌χ3985疫苗株后20天，從脾、法氏囊組織、糞便和盲腸回收的χ3985的量；和圖3顯示了在第1和14天對(duì)白來(lái)亨雞粗噴淋或直接口服送遞免疫接種和加強(qiáng)接種(a)105CFU、(b)107CFU或(c)109CFU鼠傷寒沙門氏菌χ3985后20天，用純化的鼠傷寒沙門氏菌LPS檢測(cè)，血清IgM、IgA和IgG的應(yīng)答。
實(shí)施例詳述本發(fā)明的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)了可用全身噴淋給藥來(lái)對(duì)家禽送遞腸道致病菌無(wú)毒衍生菌的疫苗或免疫原性組合物，并有效引發(fā)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的全身噴淋給藥能將疫苗或免疫原性組合物送遞到家禽的腸胃道。本文所用的噴淋給藥或噴淋疫苗接種是指送遞含有疫苗或免疫原性組合物液體的霧滴。全身噴淋給藥是指將這種疫苗或免疫原性組合物霧滴送遞到家禽全身的大部分。這是與局部噴淋給藥(如人的鼻內(nèi)噴霧，其僅給藥于特定的、小的、局部靶位點(diǎn))截然不同。本發(fā)明給予腸道致病菌的全身噴淋方法均衡地(indiscriminately)將疫苗微生物送遞到家禽身體的大部分表面，其就是可接觸到噴淋裝置的全身表面的部分(參見例為美國(guó)專利4,316,464和4,449,968，全部納入本文作為參考)。本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物的全身噴淋給藥特別適用于同時(shí)對(duì)大量家禽給藥。
本發(fā)明的噴淋給藥宜包括將含有疫苗或免疫原性組合物的粗噴淋劑送遞該家禽。雖然不希望受特定理論的束縛，相信作為粗噴淋劑給予疫苗或免疫原性組合物使得噴淋的霧滴能接觸體表，而使吸入下呼吸系統(tǒng)的疫苗量最少。這不同于非常精細(xì)的霧滴或細(xì)霧(如霧滴直徑約小于40微米的通常稱為氣溶膠)。與氣溶膠噴霧不同，據(jù)信本發(fā)明的粗噴淋不能深深吸入，從而有助于避免呼吸系統(tǒng)感染的發(fā)生，而這見于一些噴霧疫苗接種時(shí)(參見例如美國(guó)專利No.4,449,968；Clarket等人，Austr.Vet.J.56:424-428,1980)。本文所用的粗噴淋是指由直徑足以基本防止霧滴被吸入家禽下呼吸系統(tǒng)，但仍然能使液態(tài)霧滴接觸家禽體表的液滴組成的噴淋。這種粗噴淋的稠密度可稱為“霧雨”，優(yōu)選的是大小12微米以下的霧滴不到1％的噴淋。優(yōu)選的粗噴淋是由平均直徑約為40-400微米的霧滴構(gòu)成的；較佳的為40-200微米；更佳的是約50-150微米；最佳的是約50-100微米。另外，粗噴淋中約80％霧滴的大小范圍約為90-190微米。
用于疫苗給藥的噴淋疫苗接種裝置的類型不是關(guān)鍵性的，可采用幾乎任何類型的能分送粗噴淋的噴淋疫苗接種裝置(參見例為美國(guó)專利No.4,316,464、4,449,968、4,674和5,312,353)。
本發(fā)明的噴淋給藥送遞含有腸道致病菌無(wú)毒活衍生菌的疫苗。這種疫苗微生物是能在家禽的腸道和腸相關(guān)淋巴組織(GALT)定居的腸桿菌。這些微生物作為疫苗或免疫原性組合物中的免疫原性組分，包括腸桿菌家族的成員如埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形菌屬、耶爾森氏菌屬和歐文氏菌屬。沙門氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌-埃希氏菌屬的雜交菌對(duì)本發(fā)明特別有用，較佳地包括大腸桿菌和沙門氏菌屬，如鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、雞沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌亞利桑那亞種和豬霍亂沙門氏菌。
腸道致病菌的無(wú)毒衍生菌也可作為載體桿菌將選定的抗原送遞到GALT。這些載體菌含有并表達(dá)病原微生物的重組基因，從而引發(fā)針對(duì)病原微生物通常產(chǎn)生的抗原基因產(chǎn)生的抗體和/或細(xì)胞免疫力。因此可以通過(guò)噴淋給予腸道致病菌的無(wú)毒衍生菌，將可以送遞各種各樣的微生物并引發(fā)家禽對(duì)微生物(無(wú)需是能在腸胃道(GI)定居的)的免疫應(yīng)答。
該無(wú)毒微生物還可作為載體來(lái)合成家禽的各種蛋白。因?yàn)樵趪娏芙o藥和進(jìn)入到家禽的腸胃道后，本發(fā)明的無(wú)毒微生物能穿過(guò)GALT，這些微生物可用于制造和送遞基因產(chǎn)物，如生長(zhǎng)因子或能刺激或抑制各種生理機(jī)能的免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)物或物質(zhì)。這些微生物含有和表達(dá)編碼所需蛋白的重組基因。
術(shù)語(yǔ)“腸道致病菌”是指能定居在家禽的腸道和腸相關(guān)淋巴系統(tǒng)的微生物。本文所用的“病原”是指能導(dǎo)致疾病病癥或損傷正常生理機(jī)能的微生物。本發(fā)明的疫苗含有腸道致病菌株的無(wú)毒衍生菌?！把苌被颉把苌木辍笔侵笍挠H代菌株經(jīng)基因修飾產(chǎn)生的菌株?！安≡浴蔽⑸锸侵改軐?dǎo)致基本或損傷正常生理機(jī)能的微生物?！盁o(wú)毒性”是指不能誘導(dǎo)全套疾病病癥(這通常與其毒性病原性對(duì)應(yīng)菌相關(guān))的特殊微生物菌株。因此無(wú)毒性包括毒力或產(chǎn)生疾病病癥能力的降低，無(wú)毒微生物不一定完全喪失損傷正常宿主生理機(jī)能的能力。另外，無(wú)毒微生物不一定不能起致病原的作用，而是所用的特定微生物對(duì)于待處理的特定個(gè)體而言是無(wú)毒的。較佳地，從無(wú)毒微生物衍生的腸道致病菌至少對(duì)孵化日的家禽是致病性的。
在本發(fā)明的一實(shí)施例中，腸道致病菌的無(wú)毒活衍生菌是鼠傷寒沙門氏菌如χ3985，其帶有△cya-12/△crp-11突變。美國(guó)專利No.5,294,441中詳細(xì)描述了這種菌株和其它的菌株的構(gòu)建。
在對(duì)感興趣組合物或疫苗的宿主的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)生了對(duì)該組合物或疫苗的免疫應(yīng)答。通常，這種應(yīng)答包括受驗(yàn)者產(chǎn)生針對(duì)感興趣組合物或疫苗中所含抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助性C細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
“疫苗”是指一種用于刺激個(gè)體免疫系統(tǒng)的制劑，從而向機(jī)體提供保護(hù)力抵御免疫系統(tǒng)識(shí)別作為非自身抗原的抗原?！懊庖呓臃N”是指誘導(dǎo)持續(xù)高水平抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的過(guò)程，在此過(guò)程中T淋巴細(xì)胞和/或個(gè)體中的其它活性細(xì)胞(如吞噬細(xì)胞)殺死侵入的微生物，是針對(duì)先前生物體曾接觸過(guò)的微生物或抗原。術(shù)語(yǔ)“免疫系統(tǒng)”是指解剖學(xué)特征和個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)抗原性物質(zhì)的抗體(其中所述的抗原性物質(zhì)侵入個(gè)體的細(xì)胞或個(gè)體的細(xì)胞外液)的機(jī)制，還包括細(xì)胞免疫應(yīng)答。在抗體的產(chǎn)生中，產(chǎn)生的抗體可屬于任何免疫類型，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特別感興趣的是能刺激產(chǎn)生免疫球蛋白A(IgA)的疫苗，因?yàn)槠涫菧匮獎(jiǎng)游锓置谙到y(tǒng)產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，雖然本發(fā)明的疫苗不限于刺激IgA產(chǎn)生的那些疫苗。例如，本文所述的天然疫苗除形成IgA外可能產(chǎn)生范圍廣泛的其它免疫應(yīng)答，例如細(xì)胞和體液免疫力。已很好的研究了對(duì)抗原的免疫應(yīng)答并有許多報(bào)導(dǎo)。在Elgert,Klaus D.,Immunology,wiley Liss,Inc.,(1996)；Stites等人，Basic&Clinical Immunology；第7版.,Appleton&Lange,(1991)中提供了免疫學(xué)的概述，本文全部納入作為參考。
用本發(fā)明疫苗處理的個(gè)體是指禽類，包括家禽，尤其是指那些有農(nóng)業(yè)價(jià)值的。本文所用的“家禽”包括各種馴化的家禽品種或這些品種的個(gè)體，如雞、火雞、鴨、鵝、鴿子、珍珠雞(guineas)、鴕鳥、鴯鹋等，尤其是指那些用于產(chǎn)肉或蛋的馴化家禽或個(gè)體。
疫苗的制備可通過(guò)將疫苗菌株在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后(直接)使用或?qū)⑸L(zhǎng)培養(yǎng)物或其中的細(xì)胞與適當(dāng)?shù)南♂寗┗旌现瞥梢呙缃M合物。適當(dāng)?shù)南♂寗┮藶橐后w，更佳的是對(duì)疫苗培養(yǎng)物的穩(wěn)定性和活力沒(méi)有副作用的液體，其粘度與水相似以便于形成粗噴淋的霧滴。較佳地，稀釋劑不含氯、抗生素、抗微生物劑或其它可能對(duì)活疫苗生物體有害的試劑。疫苗在稀釋劑中應(yīng)是可分散的，從而沒(méi)有疫苗殘留的固體團(tuán)?；虼髩K，且稀釋劑的溫度也應(yīng)對(duì)活疫苗微生物無(wú)害。適當(dāng)?shù)南♂寗├影ㄋ⒄麴s水、去離子水、脫脂乳、含Marek疫苗穩(wěn)定劑的水、帶明膠的緩沖鹽水、及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的類似組合物。較佳地，在稀釋劑的溫度約為室溫或更低時(shí)(更佳的是約34℃到約15℃)，將疫苗引入稀釋劑中。
在一實(shí)施例中，從鼠傷寒沙門氏菌UK-1△cya△crpχ3985制備疫苗。如本文所用，這種疫苗可稱為χ3985或Chi3985或χ3985，產(chǎn)品編碼19C1.01。可如上新鮮制備疫苗菌株，或從保存的培養(yǎng)物中，例如從冷凍干燥的培養(yǎng)物或冰凍的培養(yǎng)物(例如，-70℃的種子原液)等回收。然后37℃將這種培養(yǎng)物的接種物在Luria肉湯中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期。例如，在250ml的無(wú)菌燒瓶中，將-70℃的種子原種接種到50ml Luria肉湯中并用箔密封。37℃靜置培養(yǎng)該燒瓶過(guò)夜。約12-24小時(shí)后，37℃將此50ml靜置過(guò)夜的培養(yǎng)物移液至450ml預(yù)熱過(guò)的Luria肉湯中(在1L無(wú)擋板的燒瓶中)，置于New Brunswick培養(yǎng)搖床上(150rpm)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到OD600≥1.0后，室溫離心(在Centra MP4離心機(jī)上，IEC離心筒、3224轉(zhuǎn)子，4400rpm,15分鐘)沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞重懸浮于40ml為室溫的帶明膠的緩沖鹽水(BSG)中。可將該細(xì)胞懸液用BSG進(jìn)行10倍的連續(xù)稀釋測(cè)定疫苗組合物的滴定度，并將100μl的10-6和10-7稀釋液涂布在MacConkey瓊脂+1％麥芽糖板上。計(jì)數(shù)在這些平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)確定該疫苗菌株的滴度。以每單位體積疫苗組合物的疫苗微生物菌落形成單位表示滴度。
如上述制備用于家禽的疫苗，用適當(dāng)?shù)南♂寗⑴囵B(yǎng)物稀釋到所需的劑量密度或滴度。調(diào)節(jié)稀釋劑的緩沖性能(如果使用的話)以達(dá)到維持該疫苗株穩(wěn)定性和活性所需的pH和離子強(qiáng)度。然后將疫苗進(jìn)料到噴淋器中，準(zhǔn)備對(duì)家禽給藥。
也可以每只禽類特定的劑量方式進(jìn)行噴淋給藥。可用于送遞精確疫苗劑量的一種方法是在密閉的空間內(nèi)一段時(shí)間以已知的體積送遞速率噴淋禽類。通過(guò)了解要接種疫苗的禽類數(shù)量、每只禽類所需的劑量、疫苗的滴度和噴淋裝置的送遞速率，本領(lǐng)域技術(shù)人員易計(jì)算出對(duì)每只禽類送遞所需劑量需要的噴淋時(shí)間。另外，一些可購(gòu)得的噴淋裝置能預(yù)先選擇好送遞給已知數(shù)量禽類的液體的體積。
本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物可以有效劑量或有效量給予。本文所用的“有效量”是疫苗或免疫原性組合物的足以引發(fā)接種家禽產(chǎn)生針對(duì)靶微生物或抗原(家禽免疫接種所針對(duì)的)免疫應(yīng)答的量。這些免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生抗體和/或細(xì)胞免疫力。本發(fā)明的一重要方面是疫苗或免疫原性組合物給藥的劑量與口服給藥(如在飲用水中給藥)的有效劑量大致相當(dāng)。
較佳地，在禽類小于1日齡時(shí)(即在孵化日)進(jìn)行噴淋給藥。通常也需要在初次噴淋給藥的一段時(shí)間后給予一次或多次加強(qiáng)劑量的疫苗?？稍谇蓊愐捉邮芤呙缬幸孀饔玫娜魏螘r(shí)候進(jìn)行這種加強(qiáng)給藥。優(yōu)選地，可在5至21日齡之間給予這種加強(qiáng)給藥，較佳地可在6和15日齡之間，更佳的是在7和14日齡之間，最佳的是在7日或14日齡或在7日齡和14日齡兩天。
通常在飲水中口服給予加強(qiáng)劑量，雖然也可通過(guò)其它途徑(包括噴淋給藥)給予加強(qiáng)劑量?？捎帽绢I(lǐng)域已知的若干方法之一進(jìn)行飲水中的疫苗給藥。僅作為舉例，飲水中給藥可用以下方法進(jìn)行。在疫苗給藥前24小時(shí)，從要給予禽類的飲用水中除去所有的消毒劑、衛(wèi)生洗滌劑和抗微生物藥。在疫苗接種24小時(shí)后再次給予這種無(wú)消毒劑、衛(wèi)生洗滌劑和抗微生物藥的水。可將疫苗與不含衛(wèi)生洗滌劑或抗微生物藥的清水混合。將50升含疫苗的水用于500只禽類(如雞)，應(yīng)提供充足的空間使所有禽類都能輕易喝到水。含疫苗的水應(yīng)在2小時(shí)或2小時(shí)以內(nèi)用掉。為了確保所有禽類都喝到，應(yīng)在給予飲用水中疫苗前1-2小時(shí)停止給水。
由于噴淋給予疫苗或免疫原性組合物的劑量與在飲水中給予的口服劑量差不多相同，較佳地是這兩個(gè)劑量相同。因此，例如噴淋給藥每只禽類如果107菌落形成單位，則飲水給予每只禽類也約為107菌落形成單位。較佳地，初次噴淋給藥的劑量與后續(xù)在飲水中給予的加強(qiáng)劑量的區(qū)別應(yīng)小于100倍，較佳地應(yīng)小于10倍，更佳的是小于3倍，最佳的是小于10％。
較佳地，待免疫接種禽類的年齡是易于接受疫苗有益免疫原性作用的年齡。這隨禽類品種的不同而有所改變，已發(fā)現(xiàn)獲得這種有益作用的年齡從孵化日到104周齡的禽類都行。優(yōu)選的是孵化日到52周齡的禽類，較佳的是孵化日到3周齡的禽類，更佳的是孵化日到2周齡的禽類，還要佳的是孵化日到1周齡的禽類，最佳的是孵化日的禽類。本文所用的“孵化日”與術(shù)語(yǔ)“小于一日齡可互換。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可在商品禽類飼養(yǎng)的普通條件下進(jìn)行。通常，大規(guī)模商品雞或火雞飼養(yǎng)的特征為擁有或多或少自動(dòng)化喂食和供水系統(tǒng)的家禽大飼養(yǎng)場(chǎng)，每舍可關(guān)養(yǎng)1,000只以上禽類；通常每舍為5,000只以上的禽類；甚至每舍為20,000只以上禽類。
本方法可用于孵化場(chǎng)或家禽飼養(yǎng)場(chǎng)，在放養(yǎng)到孵雞場(chǎng)或家禽飼養(yǎng)場(chǎng)之前，噴淋小雞盤或其它小雞槽或盒中的剛孵化的小雞。另外，無(wú)論是小家禽或是老家禽都可在放養(yǎng)到飼養(yǎng)場(chǎng)前接受噴淋。(參見如Grieve,Poultry Times，第18頁(yè)，1997,9,22；和Giambrone,1997，同上)。
由于本發(fā)明方法易于實(shí)施，所以家禽疫苗接種的費(fèi)用很低。由于可同時(shí)疫苗接種許多小雞并可如此處理第二次，從而避免了單個(gè)小雞處理的高費(fèi)用。另外，對(duì)每只小雞可給予精確的疫苗劑量，使得疫苗劑量過(guò)量和無(wú)效施用減至最小。
以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員在參考了本文所公開的本發(fā)明的說(shuō)明書或?qū)嵗螅瑢?huì)明白本發(fā)明權(quán)利要求范圍以內(nèi)的其它實(shí)施例。本說(shuō)明書以及實(shí)施例僅作示范說(shuō)明，權(quán)利要求書才表明本發(fā)明的范圍和精神。
實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明了用鼠傷寒沙門氏菌活疫苗噴淋免疫接種小雞，與直接口服給予這種疫苗，在由疫苗微生物誘導(dǎo)的血清免疫力和產(chǎn)生的在腸道和內(nèi)臟組織中的定居以及誘導(dǎo)血清免疫力方面同樣有效。
為了確定無(wú)毒△cya△crp突變型鼠傷寒沙門氏菌活疫苗定居和誘導(dǎo)免疫力的效果，本例研究了以粗噴淋為手段對(duì)一日齡小雞送遞初次疫苗和加強(qiáng)疫苗接種。重復(fù)組的禽類口服接受疫苗。另外，兩個(gè)較小組的禽類通過(guò)噴淋和口服法接種野生型鼠傷寒沙門氏菌UK-1 MGN-054s，并測(cè)定LD50。在第7和20日齡，測(cè)定通過(guò)粗噴淋接受疫苗接種和通過(guò)直接口服方法送遞疫苗菌株組禽類的脾、囊、腸道和盲腸中疫苗菌株的定居。用ELISA測(cè)定從20日齡接種禽回收的血清確定血清抗體應(yīng)答。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋狙芯康哪康氖?)測(cè)定用粗噴淋方法免疫接種的小雞與直接口服免疫接種小雞相比，疫苗菌株的定居是否同樣有效，和2)評(píng)價(jià)由粗噴淋或口服給予遞增劑量的疫苗所引發(fā)的血清免疫力。由于在一日齡小雞(但在3日齡或更老的小雞中不能)能測(cè)得致死終點(diǎn)，包括用野生型鼠傷寒沙門氏菌親代株來(lái)測(cè)定這兩種送遞方法是否有效以及比較導(dǎo)致的疾病。
材料和方法鼠傷寒沙門氏菌UK-1△cya-12△crp-11χ3985是一減毒疫苗菌株(見CurtissⅢ等人，對(duì)人腸道致病菌在家禽中定居的控制，Blankenship等人編輯，Academic Press,New York,1991，第169-198頁(yè))。該菌株生長(zhǎng)成新鮮的、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Luria肉湯培養(yǎng)物，用含明膠的緩沖鹽水稀釋到所需的劑量密度。制備送遞遞增劑量105、107和108CFU(菌落形成單位)的疫苗用于4組1日齡的白來(lái)亨雞。用噴淋疫苗接種裝置(Preval Power Unit,Precision ValveCorporation,Yonkers,NY,10703)作粗噴淋(霧滴的直徑約為140微米)或用頂端帶3mm球的18號(hào)×7.5mm進(jìn)料針直接口服疫苗接種小雞。在球蟲抑制劑或抗生素的Purina Start and Grow上喂養(yǎng)禽類。
同時(shí)，用含明膠的緩沖鹽水從新鮮的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的Luria肉湯培養(yǎng)物制備遞增劑量的野生型鼠傷寒沙門氏菌親代株MGN-054，并以粗噴淋或直接口服送遞給予3日齡的白來(lái)亨雞。
所有在孵化日接受疫苗菌株的禽類組在第14天以相同的方法給予加強(qiáng)接種，每組的劑量如同初次接種的劑量。至7和20日齡，用CO2窒息處死禽類，無(wú)菌解剖尸體回收脾、囊、糞便和盲腸內(nèi)含物的樣品，用于疫苗菌株的計(jì)數(shù)。
從20日齡的尸體收集的血樣中分離出血清，并以1∶200稀釋用于ELISA。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用鼠傷寒沙門氏菌的純化LPS作為測(cè)試抗原。分別用1/5000稀釋的山羊抗雞IgA、IgM和IgG親和純化的多克隆抗體EC2-001、EC2-005和EC2-0011(從Immunovision,Springdale,AR得到)，來(lái)檢測(cè)結(jié)合于ELISA板上的純LPS抗原的雞IgM、IgA或IgG(Dynatech Laboratories Inc.,Alexandra,VA)。以P-硝基苯磷酸脂(Sigma,St.Louis,MO)(1mg/ml)的二乙醇胺緩沖液(pH9.8)作為底物，采用1/3000稀釋的兔抗山羊IgG(整個(gè)分子)堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Sigma,St.Louis,MO)。培養(yǎng)30分鐘后，用50μl 3M氫氧化鈉終止反應(yīng)。用自動(dòng)微孔板讀數(shù)儀(Bio-Tek,Winooski,VT)在405nm讀取吸光值。以每處理組的4只小雞的平均吸光值(405nm)表示ELISA結(jié)果。截?cái)帱c(diǎn)是非感染小雞血清平均吸光值的2倍，作為用ELISA檢測(cè)小雞免疫球蛋白同種型的基線。
結(jié)果與結(jié)論在第1和14天接受109CFU劑量疫苗的家禽組中未觀察到死亡。經(jīng)粗噴淋或口服方法對(duì)接受遞增劑量的野生型方毒力親代株(約103CFU)的一日齡小雞組測(cè)得的LD50，與先前通過(guò)口服接種的一日齡小雞測(cè)得的值相同。
圖1(a、b和c)顯示了在孵化日接受疫苗菌株的禽類7天后，從脾、囊組織、糞便和盲腸回收的疫苗菌株的量。圖2(a、b和c)顯示了在第1和14天接受疫苗菌株的禽類7天后，從脾、囊組織、糞便和盲腸回收的疫苗菌株的量。該疫苗菌株有效地定居于內(nèi)臟和淋巴組織以及腸道的100％禽類標(biāo)本中。比較這兩種疫苗送遞方法的其它研究中得到與添加有推薦水平桿菌肽(BMD-50)和球蟲抑制劑(Coban-100)的Purina Start and Gro上喂養(yǎng)的小雞相似的結(jié)果。對(duì)于所比較的所有劑量水平，數(shù)據(jù)均顯示用粗噴淋或直接口服對(duì)來(lái)亨雞或童子雞接種鼠傷寒沙門氏菌χ3985沒(méi)有明顯差異。
圖3顯示了用ELISA檢測(cè)用疫苗χ3985接種的小雞中，抗鼠沙門氏菌LPS的特異性IgM、IgA和IgG水平。用測(cè)試的兩種送遞方法，劑量范圍105-109CFU的疫苗都誘導(dǎo)了顯著的體液抗體。最高劑量(109CFU)與低劑量相比誘導(dǎo)了最大抗體應(yīng)答。20天齡時(shí)，在所有劑量組的所有測(cè)試動(dòng)物中，IgM是占優(yōu)勢(shì)的免疫球蛋白。已報(bào)導(dǎo)過(guò)口服途徑免疫接種3周后，IgM是占優(yōu)勢(shì)的同種型。(Hassan和Curtiss,Res.Microbil.,141:839-850,1990)。本研究中發(fā)現(xiàn)，較高的OD405測(cè)定值反映了與直接口服方法送遞107或109CFU家禽相比，噴淋給予禽類107或109CFU增加了抗體應(yīng)答。
實(shí)施例2本實(shí)施例顯示了噴淋疫苗接種無(wú)毒鼠傷寒沙門氏菌活疫苗對(duì)預(yù)防野生型鼠傷寒沙門氏菌在腸胃道和腸器官中定居的效力。
將55只用于本實(shí)驗(yàn)的1日齡SPF白來(lái)亨雞編上翅號(hào)。在一日齡，用PrevalPower Unit噴淋裝置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY10703購(gòu)得)，以1×107CFU/劑量粗噴淋接種30只雞，每只雞約0.3ml。該疫苗為χ3985,產(chǎn)品編號(hào)19C1.01(Maine Biological Laboratories,Inc.,Waterville,ME)。二十只雞粗噴淋蒸餾水，每只約0.3ml，作為對(duì)照。另外5只雞作為同期對(duì)照。將接過(guò)種的和對(duì)照雞分別關(guān)養(yǎng)在Horsfal隔離單元中。在二周齡，通過(guò)飲用水以1×107CFU/劑量的同一疫苗加強(qiáng)接種動(dòng)物。在6周齡，分別以口服劑量1×106CFU的0.1ml野生型鼠傷寒沙門氏菌攻擊兩個(gè)處理組的所有雞。
在攻擊前和處死時(shí)收集兩個(gè)處理組每只雞的泄殖腔棉拭子，用于檢測(cè)沙門氏菌(Salmonella sp.)。將棉拭子置于5ml TBGH肉湯中，42℃培養(yǎng)24-36小時(shí)。約36小時(shí)后，將肉湯劃線培養(yǎng)在亮綠瓊脂+35μg/ml新生霉素(BGAN)上，42℃培養(yǎng)。
在7周齡時(shí)，處死所有雞，收集組織，如下培養(yǎng)野生型鼠傷寒沙門氏菌無(wú)菌收集每只雞的脾、肝、腎和其它任何顯出可見病變的器官各5gm。將從同一只雞得到的脾、肝、腎組織合并。收集任何顯出可見病變的器官，并分別加工。另外，無(wú)菌收集每只雞10mm十二指腸、回腸和大腸組織(帶內(nèi)含物)樣品，并分別加工。另外，收集每只雞1克帶內(nèi)含物的盲腸，并基進(jìn)行類似的加工。
為了培養(yǎng)沙門氏菌，將組織置于浸在Stomacher攪拌器中的無(wú)菌Whirlpak袋中，將5ml連四硫酸鹽亮綠Hajna(TBGH)肉湯加到每個(gè)袋中。42℃培養(yǎng)這些組織袋24-36小時(shí)，隨后將各培養(yǎng)物一接種環(huán)劃線到BGAN上。42℃培養(yǎng)平板36小時(shí)后，鑒定BGAN瓊脂上的特征性CFU。培養(yǎng)上述袋約48小時(shí)后，將1ml袋培養(yǎng)物的TBGH轉(zhuǎn)移到含4ml新鮮TBGH肉湯的試管中，將該試管培養(yǎng)5天，然后劃線(培養(yǎng))到BGAN瓊脂上。42℃培養(yǎng)36小時(shí)后，檢驗(yàn)平板。用B組沙門氏菌抗血清對(duì)所有平板進(jìn)行凝集測(cè)試，每個(gè)平板至少測(cè)試一個(gè)菌落，以證明野生型攻擊菌株鼠傷寒沙門氏菌F98的存在。
表1．用無(wú)毒鼠傷寒沙門氏菌免疫接種和用野生型鼠傷寒沙門氏菌攻擊小雞的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
*疫苗或蒸餾水的給予在第1天通過(guò)粗噴淋，第14天在飲用水中給予。
結(jié)果免疫接種后，未觀察到對(duì)疫苗的臨床反應(yīng)。免疫接種后的第8天，從30只雞的1只中分離出疫苗菌株，但自攻擊日后不能從任何雞中回收到疫苗菌株。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生死亡。
下表2顯示了攻擊之前和之后泄殖腔棉拭子的培養(yǎng)結(jié)果。在免疫接種后的第8天，從30只雞的1只中分離出疫苗微生物，當(dāng)初次免疫接種后的第42天再次取樣時(shí)，所有免疫接種過(guò)的雞都培養(yǎng)陰性。攻擊后7天，從13％接受過(guò)免疫接種的雞的泄殖腔棉拭子培養(yǎng)出野生型鼠傷寒沙門氏菌，與此相比僅接受蒸餾水未免疫接種的雞40％培養(yǎng)出野生型鼠傷寒沙門氏菌。
表2．疫苗處理過(guò)的和未處理過(guò)的雞用野生型鼠傷寒沙門氏菌攻擊之前和之后泄殖腔棉拭子標(biāo)本陽(yáng)性培養(yǎng)數(shù)
小雞數(shù)1表示鼠傷寒沙門氏菌疫苗菌株培養(yǎng)陽(yáng)性小雞數(shù)/小雞總數(shù)。
小雞數(shù)2表示野生型鼠傷寒沙門氏菌攻擊培養(yǎng)陽(yáng)性小雞數(shù)/小雞總數(shù)。
3用卡方檢驗(yàn)顯示出未處理與攻擊對(duì)照相比有顯著性差異(P≤0.05)。
免疫接種過(guò)的和未免疫接種過(guò)的雞在腸胃道和脾、肝和腎中的定居程度也有差異(見表3)。從85％未免疫接種對(duì)照雞的合并器官組織培養(yǎng)出野生型鼠傷寒沙門氏菌與13％免疫接種雞的作比較(P≤0.05)。接種疫苗和未接種疫苗的雞發(fā)現(xiàn)回腸和大腸樣品的陽(yáng)性培養(yǎng)數(shù)明顯降低(P≤0.05)。同樣也在免疫接種過(guò)的和未免疫接種的雞中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性培養(yǎng)的回腸樣品數(shù)明顯降低(P≤0.05)。免疫接種過(guò)的和未免疫接種的雞十二指腸樣品陽(yáng)性培養(yǎng)數(shù)未測(cè)見差異。
表3．用無(wú)毒活鼠傷寒沙門氏菌疫苗接種并用野生型鼠傷寒沙門氏菌攻擊的童子雞的鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)。
1卡方檢驗(yàn)表明與未接受疫苗接種而用野生型微生物攻擊的組相比有顯著差異(P≤0.05)。
修飾過(guò)的鼠傷寒沙門氏菌活疫苗對(duì)免疫接種過(guò)的雞提供了抵抗侵襲性野生型鼠傷寒沙門氏菌的人為攻擊的保護(hù)力。本攻擊實(shí)驗(yàn)顯示在1和14日齡用鼠傷寒沙門氏菌活疫苗接種的雞比對(duì)照雞有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的優(yōu)勢(shì)。在兩處理組中內(nèi)臟中有野生型鼠傷寒沙門氏菌定居的童子雞數(shù)目明顯下降(P≤0.05)。對(duì)腸胃的保護(hù)作用是明顯的，與未接受免疫接種的雞相比，較少數(shù)目的接受免疫接種的雞的回腸、大腸和盲腸組織的測(cè)試樣品為培養(yǎng)陽(yáng)性(P≤O.05)。十二指腸似乎不是鼠傷寒沙門氏菌的靶組織，因?yàn)閮H有10％未接受疫苗接種的對(duì)照雞的十二指腸中有野生型菌定居。另外，經(jīng)未處理的雞相比，用疫苗處理的雞中觀察到顯示泄殖腔棉拭子野生型攻擊微生物培養(yǎng)陽(yáng)性的雞數(shù)目明顯降低。
本研究的數(shù)據(jù)證明在第一天通過(guò)粗噴淋給予和在第14天通過(guò)飲水給予鼠傷寒沙門氏菌疫苗，明顯降低了野生型鼠傷寒沙門氏菌在童子雞腸胃道的定居和對(duì)內(nèi)臟器官的侵入和定居。
實(shí)施例3本實(shí)施例說(shuō)明了噴淋給予無(wú)毒鼠傷寒沙門氏菌活疫苗，來(lái)預(yù)防用野生型腸炎沙門氏菌或海德爾堡沙門氏菌口服攻擊后細(xì)菌在內(nèi)臟器官中的定居。
表4顯示了對(duì)用海德爾堡沙門氏菌或腸炎沙門氏菌攻擊噴淋免疫接種的小雞的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
表4．用鼠傷寒沙門氏菌疫苗免疫接種并用海德爾堡沙門氏菌或腸炎沙門氏菌攻擊小雞的實(shí)驗(yàn)研究。
海德爾堡沙門氏菌的研究將63只用于本實(shí)驗(yàn)的1日齡SPF白來(lái)亨雞(SPAFAS Inc.,Storrs,CT)編上翅號(hào)。在1日齡，用Preval Power Unit噴淋裝置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY10703購(gòu)得)，以1×107CFU/劑量疫苗χ3985(產(chǎn)品編碼19C1.01)粗噴淋接種33只雞(組1)，每只雞約0.35ml。二十只雞(組2)粗噴淋蒸餾水，每只雞約0.3ml，作為對(duì)照。另外10只雞(組3)作為未接受疫苗接種、未攻擊的對(duì)照。將接過(guò)種的以及對(duì)照雞分別關(guān)養(yǎng)在Horsfal隔離單元中。
在二周齡，通過(guò)飲水以9.6×106CFU/劑量的同一疫苗加強(qiáng)接種動(dòng)物；每只雞消耗5.1ml水。在攻擊前先從六周齡的雞(組1和組2)中收集血清樣品，用ELISA評(píng)估沙門氏菌抗體。此時(shí)也從每只雞采集泄殖腔棉拭子作沙門氏菌培養(yǎng)。在6周齡時(shí)，組1和組2中的所有雞都以口服1.6×108CFU(1.0ml)野生型萘啶酮酸-抗性海德爾堡沙門氏菌進(jìn)行單個(gè)攻擊。四天后，取棉拭子、處死所有雞，回收組織，并如下培養(yǎng)野生型海德爾堡沙門氏菌。從每只雞上無(wú)菌采集脾、肝、腎和其它任何顯示可見病變的器官各約10gm。將從同一只雞得到的脾、肝、腎組織合并。采集任何顯示可見病變的器官，并分別加工。另外，從每只雞無(wú)菌收集10mm十二指腸、回腸和大腸組織樣品，并進(jìn)行類似的加工。另外，從每只雞收集10mm帶內(nèi)含物的盲腸，并進(jìn)行類似的加工。
為了培養(yǎng)沙門氏菌，將組織置于無(wú)菌的Whirl pak袋中，將25ml連四硫酸鹽亮綠Hajna(TBGH)肉湯加到每個(gè)袋中，并將樣品在Stomacher攪拌器中浸泡。42℃培養(yǎng)這些組織袋40小時(shí)，隨后將一接種環(huán)10μl各培養(yǎng)物劃線到亮綠瓊脂+35μg/ml新生霉素(BGAN)和木糖-賴氨酸-表面活性劑4瓊脂+100μl/ml萘啶酮酸(XLT4-Nal)上。42℃培養(yǎng)24小時(shí)后，檢驗(yàn)平板XLT4-Nal和BGAN瓊脂上的特征性菌落。濃縮的肉湯培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時(shí)。將對(duì)應(yīng)于陰性平板的培養(yǎng)物再劃線到XLT4-Nal和GBAN上，42℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察特征性菌落。用O群特異性(B群)沙門氏菌抗血清對(duì)所有平板作凝集測(cè)試，每個(gè)平板至少測(cè)試一個(gè)菌落，以證明野生型攻擊菌株海德爾堡沙門氏菌的存在。
在攻擊前和處死動(dòng)物時(shí)，從所有處理組的每只雞采集泄殖腔棉拭子以監(jiān)測(cè)沙門氏菌。將棉拭子置于5ml TBGH肉湯中，42℃培養(yǎng)24-40小時(shí)。40小時(shí)后，將肉湯劃樣到BGAN上，42℃培養(yǎng)。用O群特異性(B群)沙門氏菌抗血清對(duì)所有平板作凝集測(cè)試，每個(gè)平板至少測(cè)試一個(gè)菌落，以證明野生型攻擊菌株海德爾堡沙門氏菌的存在。
結(jié)果免疫接種后，未觀察到對(duì)疫苗的臨床反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生因接種的死亡。在實(shí)驗(yàn)的第49天，免疫接種組中的一只雞由于受外傷死亡。當(dāng)在免疫接種后的第42天采樣時(shí)，組1的任何一只雞都未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性泄殖腔培養(yǎng)物。
下表5顯示了攻擊之前和之后泄殖腔棉拭子的培養(yǎng)結(jié)果。在攻擊前組1中的任何一只雞中都未采集到疫苗微生物。接受野生型微生物攻擊后4天，50％接受過(guò)免疫接種的雞顯示出野生型微生物的陽(yáng)性泄殖腔培養(yǎng)物，而70％未接受疫苗菌株的對(duì)照雞為陽(yáng)性培養(yǎng)物。這些數(shù)據(jù)顯示兩組之間野生型微生物陽(yáng)性泄殖腔培養(yǎng)物無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
表5．用野生型海德爾堡沙門氏菌攻擊之前和之后，從處理過(guò)的和未處理過(guò)的雞中采集的泄殖腔棉拭子的培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)。
1表示鼠傷寒沙門氏菌疫苗菌株培養(yǎng)陽(yáng)性的小雞數(shù)/小雞總數(shù)。
2表示攻擊的野生型海德爾堡沙門氏菌培養(yǎng)陽(yáng)性的小雞數(shù)/小雞總數(shù)。
3用卡方檢驗(yàn)表明與未接種疫苗未受攻擊組相比有顯著性差異(P≤0.05)。
在6周齡時(shí)，用口服活野生型海德爾堡沙門氏菌攻擊免疫接種過(guò)的和未免疫接種過(guò)的雞，以評(píng)估其抵抗病菌侵入內(nèi)臟器官和腸道定居的保護(hù)作用(見表6)。用野生型海德爾堡沙門氏菌攻擊后，免疫接種過(guò)的和未免疫接種過(guò)兩組之間存在明顯差異；25％用野生型攻擊的免疫接種雞的合并器官組織為培養(yǎng)陽(yáng)性，而未接受免疫接種的對(duì)照雞為70％(P≤0.05)。與未接受免疫接種的雞相比，免疫接種雞中發(fā)現(xiàn)消化道混合樣品培養(yǎng)陽(yáng)性的數(shù)目明顯降低(P≤0.05)。在免疫接種過(guò)的和未免疫接種的雞之間發(fā)現(xiàn)盲腸樣品培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)目無(wú)差異。未處理的、未受攻擊的對(duì)照雞無(wú)沙門氏菌。
表6．用無(wú)毒鼠傷寒沙門氏菌活疫苗接種并用野生型海德爾堡沙門氏菌攻擊童子雞受保護(hù)情況。
1卡方檢驗(yàn)表明與未接受疫苗接種而受攻擊組相比有顯著性差異(P≤0.05)。
腸炎沙門氏菌的研究表4顯示了腸炎沙門氏菌效力研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將63只用于本實(shí)驗(yàn)的1日齡SPF白來(lái)亨雞(SPAFAS Inc.,Storrs,CT)編上翅號(hào)。在1日齡，用PrevalPower Unit噴淋裝置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY10703購(gòu)得)，以1×107CFU/劑量疫苗χ3985(產(chǎn)品編碼19C1.01)粗噴淋接種33只雞(組4)，每只雞約0.35ml。二十只雞(組5)粗噴淋蒸餾水，每只雞約0.3ml，作為對(duì)照。另外10只雞(組6)作為未接受疫苗接種、未受攻擊的對(duì)照。將接過(guò)種的以及對(duì)照雞分別關(guān)養(yǎng)在Horsfal隔離單元中。
在二周齡，通過(guò)飲水以9.6×106CFU/劑量的同一疫苗加強(qiáng)接種動(dòng)物；每只雞消耗5.1ml水。在攻擊前先從六周齡的雞(組4、組5和組6)中收集血清樣品，用ELISA評(píng)估沙門氏菌抗體。此時(shí)也從每只雞采集泄殖腔棉拭子作沙門氏菌培養(yǎng)。在6周齡時(shí)，組4和組5中的所有雞都以口服4.5×107CFU(1.0ml)野生型萘啶酮酸-抗性腸炎沙門氏菌進(jìn)行單個(gè)攻擊。七天后，取棉拭子、處死所有雞，并用以上海德爾堡沙門氏菌效力研究中所述的方法培養(yǎng)野生型腸炎沙門氏菌，但用0群特異性(D群)沙門氏菌抗血清取代B群抗血清，進(jìn)行凝集試驗(yàn)。
結(jié)果免疫接種后，未觀察到對(duì)疫苗的臨床反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生死亡。免疫接種組中一只雞死亡，可能由于心臟穿刺(收集用于血清抗體評(píng)估的血樣)后受傷而亡。
下表7顯示了攻擊之前和之后泄殖腔棉拭子的培養(yǎng)結(jié)果。在攻擊前4天，從組4中的任何一只雞中都未回收到疫苗微生物。接受野生型微生物攻擊后7天，41％接受過(guò)免疫接種的雞顯示出泄殖腔野生型微生物培養(yǎng)陽(yáng)性，而63％未接受疫苗菌株的對(duì)照雞培養(yǎng)陽(yáng)性。這些數(shù)據(jù)顯示出這兩組之間泄殖腔野生型微生物培養(yǎng)陽(yáng)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
表7．用野生型腸炎沙門氏菌攻擊之前和之后，處理過(guò)的和未處理過(guò)的雞采集的泄殖腔棉拭子培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)目。
1表示鼠傷寒沙門氏菌疫苗菌株培養(yǎng)陽(yáng)性的小雞數(shù)/小雞總數(shù)。
2表示攻擊的野生型海德爾堡沙門氏菌培養(yǎng)陽(yáng)性的小雞數(shù)/小雞總數(shù)。
3用卡方檢驗(yàn)表明與未接種疫苗未受攻擊組相比有顯著性差異(P≤0.05)。
表8中顯示了免疫接種過(guò)和未免疫接種過(guò)的雞沙門氏菌在腸胃道、脾、肝和腎中定居程度的差異。用野生型海德爾堡沙門氏菌攻擊后，免疫接種過(guò)的和未免疫接種過(guò)兩組雞之間發(fā)現(xiàn)有顯著性差異；9％用野生型攻擊的免疫接種雞的合并內(nèi)臟組織為培養(yǎng)陽(yáng)性，而未接受免疫接種的對(duì)照雞為58％(P≤0.05)。與未接受免疫接種的雞相比，免疫接種雞中發(fā)現(xiàn)消化道合并樣品培養(yǎng)陽(yáng)性的數(shù)目明顯降低(P≤0.05)。在免疫接種過(guò)的和未免疫接種的雞之間未發(fā)現(xiàn)盲腸培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)目的差異。未處理的、未受攻擊的對(duì)照雞無(wú)沙門氏菌。
表8．用修飾的鼠傷寒沙門氏菌活疫苗接種并用野生型腸炎沙門氏菌口服攻擊后童子雞受保護(hù)情況。
1卡方檢驗(yàn)表明與未接受疫苗接種而受攻擊組相比有顯著差異(P≤0.05)。
用ELISA篩選血清樣品中有無(wú)抗鼠傷寒沙門氏菌脂多糖(LPS)的IgG抗體。以1∶100稀釋樣品，并加入到包被有商品化的鼠傷寒沙門氏菌LPS的重復(fù)孔中。用1∶30,000偶聯(lián)了HRP的兔抗雞IgG檢測(cè)。用鼠傷寒沙門氏菌免疫接種的小雞中，52％對(duì)疫苗有強(qiáng)烈應(yīng)答(OD490值大于0.3)；9％有肯定應(yīng)答(OD490值在中等范圍0.2-0.3內(nèi))，39％的OD490值在低范圍0.05-0.1內(nèi)。對(duì)照雞的血清OD490平均值范圍為0.005±0.009，明顯低于所有免疫接種雞測(cè)得的值。
結(jié)論在孵化日用無(wú)毒鼠傷寒沙門氏菌活疫苗(χ3985，產(chǎn)品編碼19C1.01)噴淋接種，隨后在第14天通過(guò)飲用水口服給予疫苗，對(duì)小雞無(wú)任何不良作用。在6周齡或在用野生型腸炎沙門氏菌或海德爾堡沙門氏菌攻擊前采樣，噴淋免疫接種雞的泄殖腔棉拭子中沒(méi)有回收到疫苗菌株。與未免疫接種的雞相比，所有測(cè)試的免疫接種雞接觸鼠傷寒沙門氏菌疫苗后都有血清應(yīng)答升高。
本研究得到的數(shù)據(jù)表明鼠傷寒沙門氏菌疫苗提供了降低海德爾堡沙門氏菌或腸炎沙門氏菌在內(nèi)臟器官中定居水平的顯著保護(hù)作用。雖然，與未免疫接種的雞相比，在免疫接種雞的盲腸中未觀察到野生型攻擊菌株定居水平的明顯差異，但免疫接種賦予了抵抗海德爾堡沙門氏菌或腸炎沙門氏菌在消化道定居的明顯保護(hù)作用。
實(shí)施例4本研究表明用無(wú)毒鼠傷寒沙門氏菌活疫苗噴淋免疫接種保護(hù)童子雞抵抗野生型腸炎沙門氏菌攻擊后的內(nèi)臟器官定居。
將55只用于本實(shí)驗(yàn)的1日齡SPF白來(lái)亨雞(HyVac,Adel,IA)編上翅號(hào)。在1日齡，用Preval Power Unit噴淋裝置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY購(gòu)得)，以1×107CFU/劑量疫苗χ3985(產(chǎn)品編碼19C1.01)(由MaineBiological Laboratories,Inc.,Waterville,ME制造)粗噴淋接種30只雞(組1)，每只雞約0.3ml。二十只雞(組2)接受粗噴淋蒸餾水，每只雞約0.3ml，作為對(duì)照。另外5只雞(組3)作為同步對(duì)照。將接過(guò)種的以及對(duì)照雞分別關(guān)養(yǎng)在Horsfal隔離單元中。
表9．用鼠傷寒沙門氏菌疫苗接種，并用腸炎沙門氏菌攻擊的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
在二周齡，通過(guò)飲水以1×107CFU/劑量的同一疫苗加強(qiáng)接種動(dòng)物；每只雞劑量含在15ml水中。在六周齡時(shí)，所有接受疫苗接種處理和對(duì)照組中的雞都口服一劑4×107CFU(0.5ml)野生型腸炎沙門氏菌進(jìn)行單個(gè)攻擊。在攻擊前5天，從每只雞收集泄殖處棉簽，評(píng)估泄殖腔棉拭子的野生型菌數(shù)。攻擊后5天，處死所有雞，解剖并進(jìn)行組織樣品野生型腸炎沙門氏菌的培養(yǎng)(如實(shí)施例2所述)。
結(jié)果
免疫接種觀察中，未觀察到對(duì)疫苗的臨床反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生死亡。
在6周齡時(shí)，對(duì)口服活野生型腸炎沙門氏菌而受攻擊的免疫接種和未免疫接種組的雞，評(píng)估其抵抗細(xì)菌對(duì)內(nèi)臟器官組織侵入和腸胃道定居的保護(hù)作用(見表10)。受野生型腸炎沙門氏菌攻擊的，免疫接種過(guò)的和未免疫接種過(guò)的兩組之間發(fā)現(xiàn)有顯著性差異；95％用野生型腸炎沙門氏菌攻擊的未免疫接種對(duì)照雞，在攻擊后合并器官組織為培養(yǎng)陽(yáng)性，而接受免疫接種的雞為20％(P≤0.01)。免疫接種處理組和對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)十二指腸樣品培養(yǎng)陽(yáng)性的數(shù)目明顯降低(P≤0.01)。在免疫接種過(guò)的和未免疫接種的雞中，未發(fā)現(xiàn)回腸、大腸或盲腸樣品腸炎沙門氏菌培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)目有差異。
表10．口服野生型腸炎沙門氏菌攻擊后，經(jīng)修飾過(guò)的鼠傷寒沙門氏菌活疫苗接種的童子雞受保護(hù)情況。
1用卡方檢驗(yàn)顯示與未免疫接種、受攻擊對(duì)照相比有明顯差異(α=0.01)。
86％疫苗接種雞表現(xiàn)為泄殖腔野生型攻擊微生物培養(yǎng)陽(yáng)性，而未疫苗接種對(duì)照組為100％。
結(jié)論用活χ3985產(chǎn)品編碼19C1.01疫苗在孵化日進(jìn)行噴淋疫苗接種，然后在第14天飲水口服給予疫苗，對(duì)小雞無(wú)不良反應(yīng)。
雖然在疫苗接種雞的消化道和盲腸樣品中抗野生型菌定居的保護(hù)作用不明顯，但證明了免疫接種受攻擊的雞與未免疫接種受攻擊的雞相比，抵抗抗野生型腸炎沙門氏菌在內(nèi)臟器官定居有顯著的保護(hù)作用。
實(shí)施例5本實(shí)施例說(shuō)明用修飾過(guò)的活鼠傷寒沙門氏菌活疫苗噴淋接種小雞，對(duì)在普通大規(guī)模商品化家禽生產(chǎn)場(chǎng)地條件下降低沙門氏菌的污染是安全和有效的。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)的目的是為了評(píng)估χ3985產(chǎn)品編碼19C1.01疫苗，對(duì)在普通大規(guī)模商品化家禽生產(chǎn)條件下降低沙門氏菌污染的安全性和效率。通過(guò)測(cè)定雞生長(zhǎng)過(guò)程中小雞的存活率和產(chǎn)品的分散能力來(lái)監(jiān)測(cè)疫苗的安全性。通過(guò)測(cè)定加工后冷藏禽體淋洗液的細(xì)菌分析、加工中的平均體重和損失百分比來(lái)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)的效率。
材料和方法選擇了三個(gè)地理位置不同的農(nóng)場(chǎng)(具有配對(duì)的飼養(yǎng)場(chǎng))，每個(gè)家禽飼養(yǎng)場(chǎng)最少有16,000個(gè)家禽。這就可以用115,000多只家禽作三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中有對(duì)照家禽和用修飾的鼠傷寒沙門氏菌活疫苗處理的家禽。需鑒定實(shí)驗(yàn)家禽農(nóng)場(chǎng)是否曾有持續(xù)性沙門氏菌污染的歷史背景。表11表明了三個(gè)實(shí)驗(yàn)的位置和試驗(yàn)參數(shù)。
表11．疫苗現(xiàn)場(chǎng)安全性實(shí)驗(yàn)的說(shuō)明
產(chǎn)品許可前的序號(hào)(prelicensing serial)修飾的活χ3985(產(chǎn)品編碼19C1.01)疫苗許可前序號(hào)按生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的概況制定，并在1995年3月20日批準(zhǔn)。
實(shí)驗(yàn)步驟在所有農(nóng)場(chǎng)，如下制定對(duì)具體家禽的普通商品疫苗、飼料和水的供給方案。處于孵化的(家禽)接受Marek疫苗(卵上或在孵化日)，新城疫/支氣管炎疫苗在孵化日進(jìn)行噴淋疫苗接種。在本研究的16-18日，在各飼養(yǎng)場(chǎng)進(jìn)行支氣管炎疫苗的加強(qiáng)給藥。
鼠傷寒沙門氏菌疫苗給藥的步驟
1．在孵化日進(jìn)行噴淋給藥在孵化場(chǎng)設(shè)置可移動(dòng)的噴淋箱(由Merial Select,atlanta,GA提供并操作)，在將小雞置于飼養(yǎng)室地面前就給進(jìn)入箱中的小雞疫苗接種。疫苗以玻璃小瓶?jī)龈芍苿┨峁?。按包裝說(shuō)明將疫苗與清潔的、無(wú)氯氣的水混合。手動(dòng)將噴淋裝置事先校準(zhǔn)到，在1bar(15帕斯卡)壓力下對(duì)10,000只小雞送遞約700ml-1L，用4個(gè)粗鳥嘴砧(anvil)扇形噴淋嘴送遞50-100微米大小的微滴。從而對(duì)每只小雞送遞約0.07-0.1ml。
2．兩周齡時(shí)飲水給藥到每個(gè)農(nóng)場(chǎng)疫苗處理飼養(yǎng)房的雞接近疫苗水之前不給兩周齡的小雞喝水2-4小時(shí)。調(diào)節(jié)Merial Select Bag Boost系統(tǒng)以校準(zhǔn)疫苗的送遞。按包裝說(shuō)明混合所需量的鼠傷寒沙門氏菌疫苗至稀釋液最終體積，使足以在兩個(gè)小時(shí)中通過(guò)所有飼養(yǎng)房的飲水線給予每只小雞一個(gè)劑量。在這兩小時(shí)中，這種疫苗水是小雞唯一的飲水來(lái)源，從而確保所有小雞都有機(jī)會(huì)喝到足夠的疫苗。在飲用水疫苗接種前測(cè)試所有農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)房所用的水，發(fā)現(xiàn)不含氯殘氣，pH范圍為6.0-7.0。
實(shí)驗(yàn)中采樣和富集培養(yǎng)的步驟為了監(jiān)測(cè)環(huán)境和小雞中土著野生型沙門氏菌的存在，在孵化場(chǎng)收集仔雞紙盤上的胎糞基線樣品，同時(shí)如下所述收集飼養(yǎng)房?jī)?nèi)墊草的拭子、飼料和水的樣品作細(xì)菌分析。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定期收集墊草拭子、飼料和水的樣品。
1．小雞紙盤和拭子在疫苗接種前，從各細(xì)菌運(yùn)送盒中隨機(jī)收集代表每個(gè)種雞群的小雞紙盤(12-18只)和拭子樣品。將選出的含胎糞的各小雞紙盤置于一單獨(dú)的塑料袋中，密封并作標(biāo)記。用無(wú)菌脫脂乳潤(rùn)濕無(wú)菌紗布?jí)|來(lái)取得小雞紙盤的其它拭子，然后置于塑料WhirlPak袋中，密封并作標(biāo)記。迅速將所有樣品轉(zhuǎn)移到冰塊上，送到實(shí)驗(yàn)室分析沙門氏菌，以確定進(jìn)入飼養(yǎng)房小雞污染水平的基線。
2．飼料和水的樣品在研究開始之前，從每個(gè)農(nóng)場(chǎng)內(nèi)部推進(jìn)加料器的進(jìn)料流收集40g樣品。將這些樣品置于WhirlPak袋中并作標(biāo)記。另外，從每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)過(guò)濾過(guò)的水源收集100ml水，并從各飼養(yǎng)房飲水器收集100ml水。立即分析收集到的水中氯氣的殘留和pH范圍。每個(gè)農(nóng)場(chǎng)在整個(gè)試驗(yàn)期間，每?jī)芍苁占淮物暳虾退臉悠?，作好?biāo)記，置于冰塊上送到實(shí)驗(yàn)室作細(xì)菌分析。
3．飼養(yǎng)房墊草的拭子樣品在每次實(shí)驗(yàn)開始之前，收集每個(gè)農(nóng)場(chǎng)的每個(gè)飼養(yǎng)房墊草拭子的樣品，以確定沙門氏菌污染的基線水平。每個(gè)農(nóng)場(chǎng)的每個(gè)飼養(yǎng)房，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每?jī)芍苁占淮问米訕悠?。按?guó)家家禽改良方案及補(bǔ)充規(guī)定(National PoultryImprovement Plan and Auxiliary Provisions manual.United Statesdepartment of Agriculture,Animal and Plant Health Inspection Service(APHIS 92-55-017),April 1993)安裝好取樣拭子。將袋密封，作標(biāo)記并置于冰塊上，送至實(shí)驗(yàn)室作細(xì)菌分析。
4．培養(yǎng)步驟用蛋白胨緩沖水溶液(International Bioproducts Inc.,Redman,WA；Difco Inc.,Detroit,MI)預(yù)先富集飼料、水、小雞棉拭子、小雞紙盤和拭子(上的細(xì)菌)，并作為評(píng)估禽體上細(xì)菌負(fù)載的漂洗液。將連四硫酸鹽亮綠Hajna肉湯(Northeast Laboratories Inc.,Waterville,ME)作為富集沙門氏菌或疫苗菌的選擇性培養(yǎng)基。用添加有35μg新生霉素/ml(Sigma,St.Louis,MO)的連四硫酸鹽亮綠瓊脂鑒定沙門氏菌或疫苗菌的生長(zhǎng)。按FSIS樣品收集指南(FSIS Sample Collection Guidelines)和從生肉和家禽制品沙門氏菌的分離及其鑒定方法(Procedure for Isolation and Identification of Salmonellafrom Raw Meat and Poultry Products)進(jìn)行沙門氏菌的驗(yàn)證。將所有陽(yáng)性培養(yǎng)物送至國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(National Veterinary Services Laboratory)(Ames,IA)分析血清型。
5．整個(gè)禽體的細(xì)菌分析加工后，從每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)隨機(jī)選擇50個(gè)冷藏的禽體。按FSIS樣品收集指南和從生肉和家禽制品分離鑒定沙門氏菌的方法(Food Safety InspectionService Sample Collection Guidelines和Procedure for Isolation andIdentification of Salmonella from Raw Meat and Poultry Products,FederalRegister Vol.61,No.144,7/25/96，第38923頁(yè))收集整個(gè)禽體的漂洗液，并評(píng)估沙門氏菌和/或疫苗殘留菌存在與否。另外，用PCR(BACS系統(tǒng)，Qaulicom,Wilmington,DE)驗(yàn)證抗特異性沙門氏菌O組抗原抗血清(Difco Inc.,Detroit,MI)凝集陽(yáng)性的樣品，因該樣品不能得到純培養(yǎng)物。
統(tǒng)計(jì)方法用卡方檢驗(yàn)比較疫苗接種雞與對(duì)照雞之間的參數(shù)結(jié)果結(jié)果和討論位置1的實(shí)驗(yàn)1．基線樣品的分析在實(shí)驗(yàn)開始之前，分析由收集的小雞紙盤、紙盤拭子、水、飼料和飼養(yǎng)房墊草拭子組成的基線樣品，表明對(duì)照飼養(yǎng)房的飼料為姆班達(dá)卡沙門氏菌陽(yáng)性，三個(gè)種雞群中有兩個(gè)的小雞泄殖腔為海德爾堡沙門氏菌培養(yǎng)陽(yáng)性。三個(gè)種雞群中的一個(gè)泄殖腔為微生物(懷疑為O群抗原C3)培養(yǎng)陽(yáng)性，但未回收到純分離物。在該實(shí)驗(yàn)6個(gè)星期生長(zhǎng)期的其余時(shí)間，從農(nóng)場(chǎng)的任何一個(gè)飼養(yǎng)房的飼料、水或墊草拭子中沒(méi)有回收到其它沙門氏菌或疫苗菌。
2．存活率由養(yǎng)雞人每周記錄農(nóng)場(chǎng)每個(gè)飼養(yǎng)房存活率數(shù)據(jù)。表12顯示了在本實(shí)驗(yàn)雞的生長(zhǎng)期間死亡的雞數(shù)目。對(duì)照和疫苗處理飼養(yǎng)房之間家禽的死亡未見差異，兩個(gè)飼養(yǎng)房的總死亡百分比分別為2.8％。實(shí)驗(yàn)期間平均死亡率恰巧與位置#1所在地區(qū)的值一致，為4.4-4.7％(The Poultry Informed Professional,Department of Avian Medicine,University of Georgia,Athens,GA,January,1998)。
表12．位置#1實(shí)驗(yàn)的雞生長(zhǎng)期間的死亡率。
1用卡方檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P＞0.05)。
1996-1997年位置#1的歷史存活率范圍為95.5-99.6。對(duì)照和處理組家禽的存活率(97.3％)在此范圍中。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，此疫苗對(duì)家禽的存活率無(wú)任何不良作用。
3．FSIS監(jiān)察員的損失報(bào)告
表13列出了USDA監(jiān)察員對(duì)每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的損失報(bào)告。監(jiān)察員報(bào)告表明處理飼養(yǎng)場(chǎng)與對(duì)照飼養(yǎng)場(chǎng)相比，禽體的肺泡炎和炎性過(guò)程(IP)增加。從The PoultryInformed Professional得到了該地區(qū)實(shí)驗(yàn)中一星期的平均值。
表13．位置#1實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的損失百分比
1N/A表示未得到數(shù)據(jù)。
2用卡方檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比有明顯差異(P≤0.05)。
由共同研究者提供的歷史數(shù)據(jù)表明該試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)在過(guò)去的兩年中曾經(jīng)歷過(guò)呼吸系統(tǒng)疾病的循環(huán)發(fā)作，因?yàn)樵诙驹路葜蟹闻菅装俜直仍?。在疫苗接種實(shí)驗(yàn)前，該農(nóng)場(chǎng)種雞群的肺泡炎為1.71％，與之相比，實(shí)驗(yàn)中疫苗處理飼養(yǎng)場(chǎng)的雞為0.51％。沒(méi)有文件記錄導(dǎo)致肺泡炎或炎癥過(guò)程的沙門氏菌病例。另外，禽體檢查方法不像USDA主管監(jiān)察員所要求鑒定受處理禽類那么盲目。在該報(bào)告所述兩個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，肺泡炎和IP百分比在對(duì)照和疫苗接種處理的禽類之間無(wú)差異?；谶@些原因，不可能作出這些狀況的原因(歸因于采用了疫苗制品)的論斷。
4．加工中禽體重量的評(píng)定禽類在處理過(guò)程中的平均重量是家禽生長(zhǎng)階段狀況的指示物。位置#1的8輪生長(zhǎng)檢查顯示大于49日齡禽類的平均體重范圍為4.36到4.79lbs；在48日齡，與對(duì)照家禽(4.85lbs)相比，疫苗處理家禽的體重平均范圍為4.84lbs。根據(jù)這些平均體重的數(shù)據(jù)，疫苗接種家禽體重維持在生產(chǎn)者所期望的水平?jīng)]有影響。
5．禽體漂洗液的評(píng)估表14顯示了禽體漂洗液評(píng)估的結(jié)果。與對(duì)照組相比，疫苗處理組禽體漂洗液中沙門氏菌陽(yáng)性的樣品數(shù)(由PCR和O抗原抗血清凝集試驗(yàn)鑒定)明顯少(p≤0.05)。從50個(gè)處理組禽體漂洗液樣品中既未鑒定活的何修飾的鼠傷寒沙門氏菌也可土著沙門氏菌(由實(shí)驗(yàn)室分析)。而50個(gè)對(duì)照組禽體的8％漂洗液樣品為C組沙門氏菌陽(yáng)性，表明此疫苗能有效消除肉制品中土著沙門氏菌。
表14．位置#1禽體漂洗液的評(píng)估
1用卡方檢驗(yàn)表明與對(duì)照組相比有顯著差異(P≤0.05)。
位置No.2的實(shí)驗(yàn)1．基線樣品的分析分析收集的基線樣品表明對(duì)照飼養(yǎng)場(chǎng)的飼料和小雞盤的胎糞含有懷疑為O群抗源C3的細(xì)菌，但未回收到純分離物。在此實(shí)驗(yàn)6個(gè)星期生長(zhǎng)階段的其余時(shí)間，從農(nóng)場(chǎng)的任何一個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的飼料、水或墊草拭子中未鑒定到其它沙門氏菌或疫苗菌。
2．存活率定期收集農(nóng)場(chǎng)每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的存活率數(shù)據(jù)。表15顯示了本實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)期間死亡率數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)星期中，對(duì)照組比處理組死亡的禽類要少。在實(shí)驗(yàn)第一個(gè)星期后，兩組之間家禽的死亡數(shù)無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)所在地區(qū)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一星期的平均死亡百分比為5.0-6.2(The Poultry InformedProfessional,February,1998)。在這一期間每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的死亡率都低于該地區(qū)的平均值。表15．位置#2實(shí)驗(yàn)在雞成長(zhǎng)期間雞的死亡率。
1用卡方檢驗(yàn)表明與對(duì)照組相比有明顯差異(P≤0.05)。
處理組和對(duì)照組禽類在第一個(gè)星期死亡率的0.6％差異是在預(yù)計(jì)的孵化偏差中的。從第一個(gè)星期以后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，死亡率數(shù)沒(méi)有差異。在用此疫苗制品進(jìn)行的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的另兩個(gè)中沒(méi)有觀察到第一個(gè)星期中死亡率的這種差異。可能影響孵化存活率的因素包括種雞年齡的不同、種雞的質(zhì)量和孵化場(chǎng)的管理以及暴露于85°F以下溫度的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)在該實(shí)驗(yàn)?zāi)攴葜?0-42日齡家禽的存活百分比曾得到提高，存活率為94.7-97.5。對(duì)照組和疫苗處理組家禽的存活率在該范圍中(96.3-95.7)。
3．FSIS監(jiān)察員的損失報(bào)告表16列出了USDA監(jiān)察員對(duì)每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的損失報(bào)告。從the PoultryInformed Professional(1998年2月)得到了位置2同一地區(qū)的平均百分比數(shù)據(jù)。在該研究中未觀察到對(duì)照組和處理組損失家禽數(shù)的差異。
表16．位置#2實(shí)驗(yàn)中的死亡百分比
1N/A表示數(shù)據(jù)未得到。
2用卡方檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
4．加工中禽體重量的評(píng)定在位置#2的9輪生長(zhǎng)中，家禽的平均體重范圍為3.35到3.93lbs；在42日齡，疫苗處理組家禽的體重在該范圍中，平均為3.7lbs。在疫苗處理過(guò)程中，處理飼養(yǎng)場(chǎng)家禽的體重比對(duì)照組禽類的平均體重低6.1％。但處理組家禽的體重不能與對(duì)照組相比，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)的第4周期間發(fā)現(xiàn)處理飼養(yǎng)場(chǎng)中四條飲水線有兩條被阻塞了。從童子雞管理角度來(lái)看，這種體重的差異部分或全部是由于這個(gè)原因。
5．禽體漂洗液的評(píng)估表17顯示了從疫苗處理組的禽體漂洗液中沒(méi)鑒定到沙門氏菌陽(yáng)性樣品。兩組各100個(gè)漂洗液樣品中都沒(méi)有鑒定到疫苗菌或野生型沙門氏菌。
表17．位置#2禽體漂洗液的評(píng)估
位置No.3的實(shí)驗(yàn)1．基線樣品的分析分析收集的基線樣品表明從對(duì)照飼養(yǎng)場(chǎng)取得的墊草拭子含有懷疑為O群抗原C3的細(xì)菌，但未回收到純分離物。從兩種雞群培養(yǎng)的小雞為土著沙門氏菌培養(yǎng)陰性。在為時(shí)64天的該實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)期的其余時(shí)間中，未從農(nóng)場(chǎng)的任何一個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的飼料、水或墊草拭子中鑒定到其它沙門氏菌或疫苗菌。
2．存活率每周收集每個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的存活率數(shù)據(jù)。表18顯示了該實(shí)驗(yàn)的雞生長(zhǎng)期間收集的死亡率數(shù)據(jù)。
表18．位置#3實(shí)驗(yàn)雞成長(zhǎng)期間雞的死亡率。
1用卡方檢驗(yàn)表明與對(duì)照組相比有顯著性(P≤0.05)。
需要指出的是，對(duì)照組和疫苗處理組死亡率的差異僅在于5只家禽的偏差。我們推測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差是由于每天死亡率圖所得誤差數(shù)目較大，因此，實(shí)際死亡數(shù)不確定?？梢哉J(rèn)為低至0.03％的誤差界線對(duì)該統(tǒng)計(jì)學(xué)最終差異有很大影響。然而當(dāng)最終存活值與實(shí)驗(yàn)當(dāng)年該位置先前6個(gè)月生長(zhǎng)周期相比，百分比為90-95。本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組和處理組家禽的存活率分別為93.2和92.7，在此范圍中。
3．加工中FSIS監(jiān)察員的損失報(bào)告USDA監(jiān)察員無(wú)意中將位置#3兩個(gè)處理組的損失數(shù)據(jù)混合在一起。表19列出了監(jiān)察員對(duì)兩個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)的損失報(bào)告。包括位置#3地區(qū)的平均值是根據(jù)6周齡童子雞實(shí)驗(yàn)同期的值(The Poultry Informed Professional,1998年4月)。表19中本實(shí)驗(yàn)有五項(xiàng)的報(bào)廢率，與實(shí)驗(yàn)同期在位置#3地區(qū)一周測(cè)得的值相同或比其低。在觀察的任一項(xiàng)中未發(fā)現(xiàn)用疫苗處理家禽對(duì)損失百分比有任何不利影響。
表19．位置#3加工中的損失百分比
1N/A表示數(shù)據(jù)未得到。
4．加工中禽體重量的評(píng)定檢查了位置#3的3個(gè)生長(zhǎng)周期表明家禽的體重范圍為6.67到7.2lbs。本研究中，禽類在加工過(guò)程中的平均體重為7.33lbs。需要指出的是，雖然生產(chǎn)者在過(guò)去年份中經(jīng)歷了從種禽獲得的小雞質(zhì)量的降低(在實(shí)驗(yàn)的頭兩個(gè)星期的高死亡率)，在本研究加工中小雞的優(yōu)良狀況和加工中的最終體重是出乎意料的。根據(jù)這些平均體重的數(shù)據(jù)，此疫苗不影響家禽體重維持在生產(chǎn)者期望的水平。
5．禽體漂洗液的評(píng)估表20顯示了兩組家禽禽體漂洗液樣品分析的結(jié)果。50個(gè)疫苗處理飼養(yǎng)場(chǎng)的禽體漂洗液樣品中沒(méi)有鑒定出修飾的活鼠傷寒沙門氏菌或土著沙門氏菌。但對(duì)照組50個(gè)禽體中有20％漂洗液樣品的PCR和培養(yǎng)物為海德爾堡沙門氏菌和哈達(dá)爾沙門氏菌陽(yáng)性。
表20．位置#3禽體漂洗液的評(píng)估
1培養(yǎng)物鑒定為海德爾堡沙門氏菌或哈達(dá)爾沙門氏菌。
2卡方檢驗(yàn)表明與對(duì)照組相比有顯著性差異(P≤0.05)。
結(jié)論發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌活疫苗χ3985(產(chǎn)品編碼19C1.01)噴淋接種用于商品童子雞是安全的。在接觸此疫苗制品后，生產(chǎn)者可期望家禽能維持健康水平和狀況。立即進(jìn)行的環(huán)境檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)疫苗殘留。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)中發(fā)現(xiàn)，采用此疫苗能有效地完全消除接種組禽體中的土著沙門氏菌(與對(duì)照組相比)。在與三個(gè)商品家禽飼養(yǎng)場(chǎng)經(jīng)營(yíng)者合作進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)比疫苗是安全而有效的。
本說(shuō)明書中引用的所有參考文獻(xiàn)全部納入本文作為參考。本文就參考文獻(xiàn)所作的討論只是總結(jié)了其作者作出的斷言，任何參考文獻(xiàn)都未構(gòu)成已有技術(shù)。申請(qǐng)者保留對(duì)本文所引用的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和恰當(dāng)性表示異議的權(quán)利。
從上述可見，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的若干利益，并得到其它有益結(jié)果。
可對(duì)上述方法和組合物作各種改變均不脫離本發(fā)明的范圍，本文以上的描述以及附圖僅起說(shuō)明作用，無(wú)任何限制意義。
權(quán)利要求
1．一種家禽疫苗接種的方法，其特征在于，該方法包括通過(guò)全身噴淋，將有效劑量的含腸道致病菌無(wú)毒活衍生菌的疫苗給予禽類。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腸道致病菌是沙門氏菌。
3．如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的噴淋是以劑量約105到108菌落形成單位的腸道致病菌的無(wú)毒衍生菌給予的。
4．如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鼠傷寒沙門氏菌是χ3985。
6．如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的家禽為三周齡或更小。
7．如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的家禽小于1日齡。
8．如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的家禽是雞。
9．如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的噴淋給藥后還至少給予一次加強(qiáng)劑量的疫苗。
10．如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的加強(qiáng)劑量疫苗是在飲水中給予的。
11．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的加強(qiáng)劑量是在噴淋給藥后的14天后給予的。
12．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述噴淋是以霧滴直徑范圍為50微米到150微米的粗噴淋。
13．一種降低禽類微生物污染的方法，其特征在于，該方法包括通過(guò)全身噴淋給予含有腸道致病菌無(wú)毒活衍生菌的疫苗免疫接種家禽來(lái)抵御微生物污染。
14．如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的腸道致病菌是沙門氏菌。
15．如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的噴淋是以劑量約105到108菌落形成單位的腸道致病菌的無(wú)毒活衍生菌給予的。
16．如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
17．如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的鼠傷寒沙門氏菌是χ3985。
18．如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述的家禽小于104周齡。
19．如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述的家禽為3周齡或更小。
20．如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述的家禽小于1日齡。
21．如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的禽類是雞。
22．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述的噴淋給藥后還至少在飲水中給予一次加強(qiáng)劑量的疫苗。
23．如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述的加強(qiáng)劑量是在噴淋給藥后的第14天給予的。
24．如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述噴淋給藥包括噴淋直徑范圍為50微米到150微米的霧滴。
25．一種將蛋白質(zhì)送遞給家禽的方法，其特征在于，該方法包括通過(guò)全身噴淋給予所述家禽有效劑量的腸道致病菌的無(wú)毒活衍生菌，該衍生菌含有編碼表達(dá)所述蛋白的重組基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了家禽疫苗接種的一種方法,即用有效劑量的腸道致病性腸桿菌的無(wú)毒活衍生菌噴淋家禽。
文檔編號(hào)A61K39/112GK1314809SQ99810043
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月24日
發(fā)明者S·M·埃赫勒 申請(qǐng)人:梅根保健股份有限公司