專利名稱：服用促胰島素肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療糖尿病和胰島素抗性患者的方法。具體地講，本發(fā)明涉及通過肺輸送胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其類似物，以便通過肺進(jìn)行系統(tǒng)性吸收，無需通過注射服用抗糖尿病化合物。
本發(fā)明背景胰高血糖素樣肽-1最早是在1987年作為腸降血糖素激素鑒定的，它是在攝取食物之后由腸道分泌的一種肽。胰高血糖素樣肽-1是在對(duì)160個(gè)氨基酸的前體蛋白——前胰高血糖素原——進(jìn)行蛋白酶解加工之后由腸道的L細(xì)胞分泌的。前胰高血糖素原的裂解首先產(chǎn)生活性較差的有37個(gè)氨基酸肽的胰高血糖素樣肽-1。隨后裂解殘基6和7之間的肽鍵，得到了具有生物學(xué)活性的胰高血糖素樣肽-1，被稱作GLP-1(7-37)。應(yīng)當(dāng)指出的是，本說明書采用圍繞該激素形成的命名方法。本領(lǐng)域通常的做法是，將GLP-1(7-37)的氨基末端編號(hào)為7，而羧基末端編號(hào)為37。在去掉末端甘氨酸殘基之后，大約80％在L細(xì)胞中合成的GLP-1(7-37)的C-末端是酰胺化的。游離GLP-1(7-37)和酰胺——GLP-1(7-36)NH2的生物學(xué)作用和代謝轉(zhuǎn)化是無法分辨的。在本文中，這兩種天然存在的形式總稱為GLP-1。
已知GLP-1能刺激胰島素分泌(促胰島素作用)，導(dǎo)致細(xì)胞攝取葡萄糖，由此降低血糖水平(例如，參見Mojsov,S.,國(guó)際肽蛋白研究雜志，40:333-343,1992)。本領(lǐng)域中已知有多種GLP-1類似物和具有促胰島素(insulintropic)作用的衍生物。還證實(shí)了N-末端的組氨酸殘基(His7)對(duì)于GLP-1的促胰島素活性來說是非常重要的(Szuki,S.,糖尿病研究；臨床實(shí)踐5(增卷1)S30,1988)。
多位作者已證實(shí)了實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)和哺乳動(dòng)物，特別是人之間外源服用GLP-1對(duì)促胰島素反應(yīng)的關(guān)系。例如，參見Nauck,M.A.等，糖尿病學(xué)，36:741-744(1993)；Gutniak,M.等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，326(20):1316-1322(1992)；Nauck,M.A.等，臨床研究雜志91:301-307(1993)；和Thorens,B.等，糖尿病，42:1219-1225(1993)。
基于GLP-1的肽極有可能作為胰島素治療的替代物，治療使用磺酰脲治療失敗的糖尿病患者。學(xué)術(shù)研究人員業(yè)已對(duì)GLP-1進(jìn)行了深入研究，該研究是為以下Ⅱ型糖尿病患者建立的，這些患者在使用磺酰脲治療時(shí)失敗1)GLP-1能刺激胰島素分泌，但僅僅是在高血糖期間。由于GLP-1的這一特征以及有關(guān)胰島素的分泌量與高血糖的程度呈正比的觀察結(jié)果，使得GLP-1的安全性與胰島素相比得到提高。另外，GLP-1治療會(huì)導(dǎo)致胰腺釋放胰島素，以及對(duì)肝臟的第一次通過的胰島素的作用。與皮下注射胰島素相比，這會(huì)導(dǎo)致在外周具有較低的胰島素循環(huán)水平。
2)GLP-1能抑制高血糖素分泌，而這再加上通過門靜脈進(jìn)行的胰島素輸送，有助于抑制糖尿病患者的過多的肝葡萄糖輸出。
3)GLP-1能延緩胃排空，這有利于延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物的吸收時(shí)間，降低飯后葡萄糖高峰。
4)若干報(bào)導(dǎo)者業(yè)已提出，GLP-1可以在諸如肌肉和脂肪的外周組織中提高胰島素的敏感性。
5)最后，業(yè)已證實(shí)GLP-1是潛在的食欲調(diào)節(jié)劑。
與胰島素治療相比，進(jìn)餐時(shí)使用基于GLP-1的肽具有若干優(yōu)點(diǎn)。胰島素治療需要血液葡萄糖監(jiān)測(cè)，這樣做既昂貴又痛苦。與胰島素相比，依賴于葡萄糖的GLP-1提供了一種強(qiáng)化的治療窗口，并且降低了監(jiān)測(cè)血液葡萄糖的必要性。強(qiáng)化胰島素治療的另一個(gè)問題是體重增加，這一問題在肥胖Ⅱ型糖尿病患者身上表現(xiàn)的最為明顯。
如果將天然GLP-1用于Ⅰ型糖尿病患者，其治療潛能可進(jìn)一步加強(qiáng)。有多項(xiàng)研究業(yè)已證實(shí)了天然GLP-1在治療胰島素依賴型糖尿病方面的效果。與Ⅱ型糖尿病患者相似，GLP-1可通過其胰高血糖素抗性降低空腹高血糖癥。其他的研究業(yè)已證實(shí)，GLP-1還能降低Ⅰ型糖尿病患者的飯后糖血移動(dòng)，最有可能是通過推遲胃排空。以上發(fā)現(xiàn)表明，GLP-1可用作Ⅰ型和Ⅱ型患者的治療劑。
迄今為止，服用臨床上證實(shí)過的肽激素和GLP-1一般是通過皮下注射完成的，這種方法既不方便又不完美。因此，許多研究者業(yè)已研究了服用肽激素的其他途徑，如口服、直腸、經(jīng)皮和鼻腔途徑。不過，到目前為止，這些服用途徑尚未構(gòu)成臨床上得到認(rèn)可的肽激素療法。
多年來就已經(jīng)知道，某些蛋白可以通過肺吸收。例如，通過吸入氣溶膠服用胰島素是由Gaensslen在1925年第一次報(bào)導(dǎo)的。盡管多項(xiàng)人和動(dòng)物研究業(yè)已證實(shí)某些胰島素制劑可以通過肺吸收，但肽激素的肺輸送并未得到有效應(yīng)用，因?yàn)槠渖锟衫眯詷O低。諸如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的通常超過150個(gè)氨基酸殘基的較大的蛋白，通常有利于通過肺的肺泡區(qū)的襯里細(xì)胞吸收。不過，較小蛋白的肺吸收更難以預(yù)測(cè)；盡管業(yè)已報(bào)導(dǎo)了胰島素(51個(gè)殘基)、降鈣素(32個(gè)殘基)和甲狀旁腺激素(34個(gè)殘基)能通過肺途徑系統(tǒng)地吸收。參見被收作本文參考文獻(xiàn)的US5,607,915。盡管肺可以系統(tǒng)地吸收某些小的蛋白激素，但與肺輸送肽相關(guān)的藥效學(xué)是不可預(yù)測(cè)的。
因此，有必要提供一種肺輸送GLP-1及其相關(guān)類似物的可靠方法，因?yàn)樗梢詾榛颊咛峁┮环N替代胰島素的誘人的、非侵害性的方案。這一需要的特別現(xiàn)實(shí)之處在于，胰島素具有很窄的治療指數(shù)，而GLP-1治療能提供一種僅應(yīng)答高血糖癥狀。血液葡萄糖正?；耐緩?，而沒有高血糖癥的威脅。
不是所有的蛋白激素都可以通過肺有效地吸收，并且，存在影響肺吸收的很多因素。肺對(duì)蛋白的吸收，在很大程度上取決于蛋白的物理特征。因此，盡管業(yè)已觀察到可以通過肺輸送某些蛋白激素，但GLP-1及某些相關(guān)肽的物理特性和短的長(zhǎng)度使得人們不清楚所述肽是否能夠通過肺途徑有效輸送。
有效的肺輸送取決于將蛋白輸送到生成肺泡上皮細(xì)胞的能力。沉積在呼吸道上皮上的蛋白顆粒被吸收的程度降低，因?yàn)槠浔砻娴恼骋浩鸬浇亓糇饔?，然后通過粘液轉(zhuǎn)運(yùn)將碎片從呼吸道上清除。這一機(jī)制也是生物可利用性低的主要原因。上述途徑中，蛋白不被吸收而是被清除的程度取決于其溶解度，其大小以及其他在很大程度上尚未鑒定的機(jī)制。
即使一種肽激素能夠可再現(xiàn)地輸送到深層肺泡上皮中，仍然難以預(yù)測(cè)它是否能快速吸收并轉(zhuǎn)移到血液中。業(yè)已計(jì)算出了某些蛋白通過肺輸送的吸收值，并且，在甲狀旁腺激素(1-34)的15分鐘到糖基化α1-抗胰蛋白酶的48小時(shí)范圍內(nèi)波動(dòng)。另外，在肺中存在多種內(nèi)源肽酶，它能在吸收之前降解肽。因此，溶解并吸收一種肽顆粒所需要的時(shí)間越長(zhǎng)，它被酶促失活的可能性就越大。因此，由于GLP-1的體積較小，及其所固有的易受某些酶作用的特征，有關(guān)氣溶膠化的GLP-1類似物能可再現(xiàn)地并且有效地通過肺輸送的發(fā)現(xiàn)是十分驚人的。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種服用胰高血糖素樣肽-1分子的方法，包括通過肺輸送給需要這種肽的患者服用有效量的所述肽。本發(fā)明還涉及一種治療糖尿病的方法，包括通過肺輸送給需要治療的患者服用有效劑量的胰高血糖素樣肽-1。本發(fā)明的另一方面涉及一種治療高血糖癥的方法，包括通過肺輸送給需要治療的患者服用有效劑量的胰高血糖素樣肽-1。優(yōu)選地，所述胰高血糖素樣肽-1分子是通過吸入方法輸送的，并且輸送到患者的下呼吸道。
胰高血糖素樣肽-1可以存在于載體中，作為溶液或懸浮液或干粉用適用于吸入服用的多種裝置中的一種輸送。優(yōu)選地，胰高血糖素樣肽-1是以能有效到達(dá)肺的下呼吸道的粒度輸送的。
本發(fā)明詳細(xì)說明術(shù)語(yǔ)“GLP-1”是指胰高血糖素樣肽-1，其序列和結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域中是公知的。參見被收作本文參考文獻(xiàn)的US5,120,712。如上文所述，存在兩種天然形式的人GLP-1--GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2僅在必要時(shí)對(duì)二者加以區(qū)分。
術(shù)語(yǔ)“GLP-1類似物”被定義為與GLP-1相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、倒位或添加的分子。本領(lǐng)域已知多種GLP-1類似物，并且，包括，例如，GLP-1(7-34),GLP-1(7-35),GLP-1(7-36),Val8-GLP-1(7-37),Gln9-GLP-1(7-37),D-Gln9-GLP-1(7-37),Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。優(yōu)選的GLP-1類似物是GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，這些類似物披露于被收作本文參考文獻(xiàn)的US5,118,666中。
術(shù)語(yǔ)“GLP-1衍生物”被定義為具有GLP-1或GLP-1類似物的氨基酸序列，并且在其氨基酸側(cè)面基團(tuán)，α-碳原子，末端氨基，或末端羧酸基團(tuán)上具有一種或多種化學(xué)修飾的分子。化學(xué)修飾包括，但不限于添加化學(xué)部分，形成新的鍵，和去掉化學(xué)部分。在氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上的修飾包括，但不限于賴氨酸-ε-氨基的酰化，精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基團(tuán)的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺化。末端氨基的修飾包括，但不限于脫氨、N-低級(jí)烷基、N-二-低級(jí)烷基、和N-?；揎棥Ｄ┒唆然男揎棸?，但不限于酰胺、低級(jí)烷基酰胺、二氨基酰胺、和低級(jí)烷基酯修飾。低級(jí)烷基是C1-C4烷基。另外，可以用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)末端基團(tuán)。氨基酸的a-碳原子可以是一-或二-甲基化。
術(shù)語(yǔ)“GLP-1分子”表示GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物。
GLP-1類似物的其他優(yōu)選基團(tuán)由下面的結(jié)構(gòu)式定義R1-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2(序列1)及其可以藥用的鹽，其中R1選自下列一組L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨-組氨酸、2-氨基-組氨酸、b-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基組氨酸、和α-甲基-組氨酸；X選自下列一組Ala、Gly、Val、Thr、Ile、和α-甲基-Ala；Y選自下列一組Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；Z選自下列一組Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；而R2選自下列一組NH2和Gly-OH；其前提是，當(dāng)R1是His、X是Ala、Y是Glu、而Z是Glu時(shí)，R2必須是NH2。
與本發(fā)明一致的化合物的其他優(yōu)選基團(tuán)披露于WO91/11457(US5,545,618，被收作本文參考文獻(xiàn))中，并且，主要包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、或GLP-1(7-37)、或其酰胺形式及其可以藥用的鹽，并具有選自下列一組的至少一種修飾(a)用甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、或D-賴氨酸取代26位和/或34位上的賴氨酸；或者用甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸或D-精氨酸取代36位上的精氨酸；(b)用一種抗氧化的氨基酸取代31位上的色氨酸；(c)至少進(jìn)行下列一種取代用酪氨酸取代16位上的纈氨酸；用賴氨酸取代18位上的絲氨酸；用天冬氨酸取代21位上的谷氨酸；用絲氨酸取代22位上的甘氨酸；用精氨酸取代23位上的谷氨酰胺；用精氨酸取代24位上的丙氨酸；以及用谷氨酰胺取代26位上的賴氨酸；和(d)進(jìn)行至少下列一種取代用甘氨酸、絲氨酸、或半胱氨酸取代8位上的丙氨酸；用天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸取代9位上的谷氨酸；用絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代10位上的甘氨酸；以及用谷氨酸取代15位上的天冬氨酸；和(e)用甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸或D-或N-?；蛲榛问降慕M胺酸取代7位上的組胺酸，其中，在(a)、(b)、(d)和(e)的取代中，被取代的氨基酸可以選擇性地為D-形式，而在7位上被取代的氨基酸可以選擇性地為N-?；騈-烷基化形式。
由于所述酶——二肽基-肽酶Ⅳ(DPP Ⅳ)有可能決定所觀察到的服用的GLP-1的快速失活[例如，參見Mentlein,R.等，歐洲生物化學(xué)雜志，214:829-835(1993)]，優(yōu)選服用能免受DPP Ⅳ活性作用的GLP-1類似物和衍生物，更優(yōu)選服用Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH,a-甲基-Ala-GLP-1(7-36)NH2、和Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH或其可以藥用的鹽。
優(yōu)選將US5,188,666(被收作本文參考文獻(xiàn))中要求保護(hù)的分子用于本發(fā)明。所述分子選自由具有以下氨基酸序列的肽組成的一組His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (序列2)其中X選自下列一組Lys和Lys-Gly；以及所述肽的衍生物，其中所述肽選自下列一組所述肽的可以藥用的酸加成鹽；所述肽的可以藥用的羧化鹽；所述肽的可以藥用的低級(jí)烷基酯；以及選自下列一組的所述肽的可以藥用的酰胺酰胺、低級(jí)烷基酰胺和低級(jí)二烷基酰胺。
用于本發(fā)明的另一種優(yōu)選類型的分子包括披露于被收作本文參考文獻(xiàn)的US5,512,549中的具有以下通式的化合物R1-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R3R2(序列3)及其可以藥用的鹽，其中R1選自下列一組4-咪唑丙酰、4-咪唑乙酰、或4-咪唑-a,a二甲基-乙酰；R2選自下列一組C6-C10無分支的?；蚴遣淮嬖?；R3選自下列一組Gly-OH和NH2；而Xaa是Lys或Arg，可將其用于本發(fā)明中。
用于本發(fā)明的序列3的更優(yōu)選的化合物是這樣的化合物，其中，Xaa是Arg，而R2是C6-C10無分支的酰基。
用于本發(fā)明的序列3的高度優(yōu)選的化合物是這樣的化合物，其中，Xaa是Arg，而R2是C6-C10無分支的酰基，而R3是Gly-OH。
用于本發(fā)明的序列3的更優(yōu)選的化合物是這樣的化合物，其中，Xaa是Arg，而R2是C6-C10無分支的?；鳵3是Gly-OH，而R1是4-咪唑丙酰。
用于本發(fā)明的序列3的最優(yōu)選的化合物是這樣的化合物，其中，Xaa是Arg，而R2是C8無分支酰基，而R3是Gly-OH，而R1是4-咪唑丙酰。
將被收作本文參考文獻(xiàn)的US5,705,483中要求保護(hù)的Val8-GLP-1(7-37)OH或其可以藥用的鹽用于本發(fā)明是高度優(yōu)選的。
用來制備用于本發(fā)明的GLP-1、GLP-1類似物、或GLP-1衍生物的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并容易為普通的蛋白質(zhì)化學(xué)家或生物化學(xué)家所掌握。用于本發(fā)明的所述活性化合物的氨基酸部分或其前體，可以通過固相合成化合法制備、從天然資源中純化GLP-1分子或重組DNA技術(shù)制備。常規(guī)的有機(jī)合成技術(shù)可以對(duì)GLP-1進(jìn)行烷基化和酰化。
術(shù)語(yǔ)“GLP-1相關(guān)的化合物”是指落入GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物定義范圍內(nèi)的所有化合物。
術(shù)語(yǔ)“防腐劑”是指添加到藥用制劑中起到抗微生物劑的作用的化合物。腸胃外使用的制劑必須滿足商業(yè)上有效的多用途制品的防腐劑有效的標(biāo)準(zhǔn)。本領(lǐng)域已知的可用于腸胃外制劑的有效的防腐劑有苯扎氯銨、芐索銨、氯己啶、苯酚、間-甲酚、苯甲醇、羥苯甲酯、三氯叔丁醇、鄰-甲酚、對(duì)-甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸、及其各種混合物。例如，參見Wallhauser,K.,Develop.Biol.Standard,24:9-28(Basel,S.Krager,1974)。
術(shù)語(yǔ)“緩沖物”或“可以藥用的緩沖物”是指已知用于蛋白質(zhì)制劑中是安全的并且具有將該制劑的pH值控制在理想水平上的作用的化合物。例如，用于將pH控制在中等酸性pH值到中等堿性pH值的可以藥用的緩沖物，包括諸如磷酸、乙酸、檸檬酸、Tris、精氨酸、或組氨酸的化合物。
術(shù)語(yǔ)“等滲劑”是指生理學(xué)上可以承受的并且能賦予一種制劑合適的滲透壓，以防止水通過細(xì)胞膜發(fā)生凈流動(dòng)的化合物。諸如甘油的化合物通常以已知濃度用于上述目的。優(yōu)選將US5,188,666(被收作本文參考文獻(xiàn))中要求保護(hù)的分子用于本發(fā)明。所述分子選自由具有以下氨基酸序列的肽組成的一組His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (序列2)其中X選自下列一組Lys和Lys-Gly；以及所述肽的衍生物，其中所述肽選自下列一組所述肽的可以藥用的酸加成鹽；所述肽的可以藥用的羧化鹽；所述肽的可以藥用的低級(jí)烷基酯；以及選自下列一組的所述肽的可以藥用的酰胺酰胺、低級(jí)烷基酰胺和低級(jí)二烷基酰胺。
用于本發(fā)明的另一種優(yōu)選類型的分子包括披露于被收作本文參考文獻(xiàn)的US5,512,549中的具有以下通式的化合物R1-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- (序列3)及其可以藥用的鹽，其中R1選自下列一組4-咪唑丙酰、4-咪唑乙酰、或4-咪唑-a,a二甲基-乙酰；R2選自下列一組C6-C10無分支的?；蚴遣淮嬖?；R3選自下列一組Gly-OH和NH2；而Xaa是Lys或Arg，可將其用于本發(fā)明中。
*(與前文不連續(xù))當(dāng)具有類似的粒度和類似的肺沉積水平時(shí)，不同的吸入裝置通常能產(chǎn)生類似的藥物動(dòng)力學(xué)。
根據(jù)本發(fā)明，GLP-1和GLP-1類似物及衍生物可以通過本領(lǐng)域已知的用于通過吸入服用治療劑的多種吸入裝置中的任一種輸送。所述裝置包括定量吸入器、噴霧器、干粉吸入器、噴灑器等。優(yōu)選地，GLP-1和GLP-1類似物及衍生物是通過干粉吸入器或噴灑器輸送的。用于服用GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的吸入裝置具有若干理想特征。例如，通過所述吸入裝置輸送是非?？煽康?、可再現(xiàn)的、并且準(zhǔn)確的。所述吸入裝置應(yīng)當(dāng)輸送小的顆粒，例如，低于大約10微米的質(zhì)量中等空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMAD)，優(yōu)選大約1-5微米(MMAD)，以利于呼吸。適用于本發(fā)明實(shí)踐的、市場(chǎng)上現(xiàn)有的吸入裝置或近期開發(fā)的裝置有TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)，由Inhale Therapeutics開發(fā)的裝置，AERxTM(Aradigm),Ultravent噴霧器(Mallinckrodt),AcornⅡ噴霧器(Marquest Medical產(chǎn)品)，Ventolin定量吸入器(Glaxo)，Spinhaler粉末吸入器(Fisons)等。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的劑型、該劑型的輸送量、以及服用單一劑量的持續(xù)時(shí)間，取決于所使用的吸入裝置的類型。對(duì)于諸如噴霧器的某些氣溶膠輸入系統(tǒng)來說，使用該系統(tǒng)的服用頻率和時(shí)間主要取決于GLP-1分子在該氣溶膠中的濃度，例如，在噴霧溶液中具有較高濃度的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物可以較短的時(shí)間服用。諸如定量吸入器的裝置可以產(chǎn)生較高的氣溶膠濃度，并可以用較短的時(shí)間輸送所需數(shù)量的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物。諸如粉末吸入器的裝置輸送活性劑，直到特定量的活性劑被從該裝置中排出。在這種類型的吸入器中，存在于特定量的粉末中的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的量決定了在一次服用中輸送的劑量。
通過吸入裝置輸送的所述制劑中GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的粒度，對(duì)于蛋白在肺，特別是在下呼吸道或肺泡中的沉積能力來說是重要的。優(yōu)選將GLP-1和GLP-1類似物及衍生物制備成至少被輸送的大約10％的肽能沉積在肺中，優(yōu)選大約10％-大約20％或更高。已知用嘴吸氣的人在服用大約2微米-大約3微米MMAD的粒度時(shí)獲得了最大的肺沉積效率。當(dāng)粒度超過大約5微米MMAD時(shí)，肺沉積明顯降低。低于大約1微米MMAD的粒度會(huì)導(dǎo)致肺沉積降低，并且難于輸送具有足夠治療效力的量的顆粒。因此，通過吸入輸送的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的顆粒的粒度，優(yōu)選低于大約10微米MMAD，更優(yōu)選在大約1-大約5微米MMAD的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在大約2-大約3微米MMAD的范圍內(nèi)。選擇GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑，以便在所選擇的吸入裝置中產(chǎn)生所需要的粒度。
為了作為干粉服用，優(yōu)選將GLP-1和GLP-1類似物及衍生物制備成顆粒形式，使得噴射的粒度小于大約10微米MMAD，優(yōu)選大約1-大約5微米MMAD，最優(yōu)選大約2-大約3微米MMAD。優(yōu)選的粒度能有效輸送到患者肺的肺泡中。所述干粉優(yōu)選主要由所產(chǎn)生的顆粒組成，以便所述顆粒的主要部分具有理想范圍的大小。理想的是，至少大約50％的干粉是由直徑小于大約10微米MMAD的顆粒組成。所述制劑可以通過對(duì)含有顆粒狀GLP-1分子及其他所需成分的溶液進(jìn)行噴霧干燥、研磨、或臨界點(diǎn)凝聚獲得。同樣適用于制備用于本發(fā)明中的顆粒的其他方法在本領(lǐng)域中是公知。
所述顆粒通常是從裝在一個(gè)容器中的干粉制劑分離的，然后通過運(yùn)載空氣流轉(zhuǎn)移到患者的肺中。通常，在現(xiàn)有的干粉吸入器中，用于分散固體的力僅僅是由患者的吸氣提供的。合適的干粉吸入器是Astra(Sodertalje，瑞典)生產(chǎn)的TurbohalerTM。在另一種類型的吸入器中，由患者吸氣所產(chǎn)生的空氣流啟動(dòng)一個(gè)推進(jìn)馬達(dá)，由它分散GLP-1分子顆粒。Dura SpirosTM吸入器就是這樣一種裝置。
用于通過干粉吸入器服用的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑，通常包括含有肽的細(xì)碎的干粉，不過該干粉還可以含有一種蓬松劑、載體、賦形劑、另一種添加劑等。可將添加劑加入GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的干粉制劑中，以便(例如)根據(jù)需要稀釋所述干粉，從而通過顆粒干粉吸入器輸送，有利于該制劑的加工，使該制劑具有理想的粉末特性，有利于該粉末從吸入裝置中分散，穩(wěn)定該制劑(例如，抗氧化劑或緩沖劑)，使該制劑具有好的口感等。所述添加劑優(yōu)選不會(huì)對(duì)患者的呼吸道產(chǎn)生不利影響。GLP-1和GLP-1類似物及衍生物可以與添加劑在分子水平上混合，或者固體制劑中可以包括與添加劑顆?；旌系碾念w?；蛘邔㈦念w粒包在添加劑顆粒上。常用的添加劑包括一糖、二糖和多糖；糖醇及其他多元醇，如乳糖、葡萄糖、棉籽糖、松三糖、乳糖醇、麥芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉或其組合；表面活性劑，如山梨糖醇、二磷酯酰膽堿、或卵磷脂等。通常，諸如蓬松劑的添加劑能實(shí)現(xiàn)上述目的的使用量，通常為占該制劑重量的大約50％-大約90％。還可將本領(lǐng)域已知可用于制備蛋白的其他試劑加入所述制劑中。
在本發(fā)明的另一方面，可以通過以下方法產(chǎn)生含有GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的霧氣在加壓條件下強(qiáng)制所述肽的懸浮液或溶液通過一個(gè)噴頭。可以對(duì)噴頭的大小和形狀、所施加的壓力、以及液體輸送速度加以選擇，以便獲得所需要的輸出量和粒度?？梢援a(chǎn)生電力噴霧，例如，通過將一個(gè)電場(chǎng)與毛細(xì)管或噴頭輸送裝置連接。理想的是，通過噴霧器輸送的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的推進(jìn)物所具有的吸入液滴體積，小于大約10微米MMAD，優(yōu)選在大約1-大約5微米MMAD，最優(yōu)選在大約2-大約3微米MMAD范圍內(nèi)。
適用于噴霧器的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑，通常為每毫升溶液含有大約1毫克至大約20毫克所述肽。所述制劑可以含有諸如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑和金屬陽(yáng)離子的試劑。所述制劑還可以含有一種賦形劑或用于穩(wěn)定所述肽的試劑，如緩沖劑、還原劑、蓬松蛋白或糖。用于配制GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的常用的蓬松蛋白包括白蛋白、魚精蛋白、等用于配制GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的常用的糖包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、或葡萄糖等。GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑還可以含有表面活性劑，這種表面活性劑能夠減弱或避免表面誘導(dǎo)的肽的聚集，這種聚集是在形成氣溶膠的過程中由于溶液的霧化而導(dǎo)致的?？梢圆捎枚喾N常見表面活性劑，如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。其用量通常占該制劑重量的0.001-4％。還可以使用諸如二磷脂酰膽堿或卵磷脂的其他表面活性劑。適用于本發(fā)明目的的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯山梨聚糖單油酸酯，polysorbate80、或polysorbate20等。在所述制劑中還可以添加本領(lǐng)域公知的用于制備蛋白的其他試劑。
可以通過諸如噴射噴霧器或超聲波噴霧器的噴霧器的服用GLP-1和GLP-1類似物及衍生物。通常，在噴射噴霧器上使用一個(gè)壓縮空氣源，通過一個(gè)出口產(chǎn)生高速空氣射流。當(dāng)氣體在噴頭外面膨脹時(shí)，形成一個(gè)低壓區(qū)，該低壓區(qū)通過一個(gè)連接在液體容器上的毛細(xì)管吸出所述肽的溶液。來自所述毛細(xì)管的液體流，在它離開該毛細(xì)管時(shí)被剪切成不穩(wěn)定的絲和液滴，形成氣溶膠?？梢允褂枚喾N類型的結(jié)構(gòu)、流速、和調(diào)節(jié)板，以便由特定的噴射噴霧器獲得所需要的性能特征。在超聲波噴霧器中，使用高頻電能產(chǎn)生振動(dòng)的機(jī)械能，通常使用一個(gè)壓電換能器。該能量被直接或通過一種連接液體傳遞給所述肽制劑，產(chǎn)生氣溶膠。通過噴霧器輸送的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的液滴的粒度小于大約10微米MMAD，優(yōu)選在大約1-大約5微米MMAD范圍內(nèi)，最優(yōu)選在大約2-大約3微米MMAD范圍內(nèi)。
適用于噴射噴霧器或超聲波噴霧器的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑通常包括所述肽的水溶液，其濃度每毫升溶液大約1-大約20毫克。該制劑可以含有諸如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑和二價(jià)金屬陽(yáng)離子的試劑。所述制劑還可以含有一種賦形劑或用于穩(wěn)定所述肽的試劑，如緩沖劑、還原劑、蓬松蛋白或糖。用于配制GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的蓬松蛋白包括白蛋白、或魚精蛋白等。用于配制GLP-1相關(guān)蛋白的常用的糖包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、或葡萄糖等。GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑還可以含有表面活性劑，該表面活性劑能減弱或避免在表面誘導(dǎo)的肽聚集，這種聚集是在形成氣溶膠的過程中由溶液的霧化導(dǎo)致的?？梢圆捎酶鞣N常用的表面活性劑，如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。其用量通常占該制劑重量的0.001-4％。還可以使用諸如磷脂酰膽堿或卵磷脂的其他表面活性劑。適用于本發(fā)明目的的特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧化乙烯山梨聚糖單油酸酯、polysorbate80、或polysorbate20等。在所述制劑中還可以添加本領(lǐng)域已知的用于制備諸如GLP-1相關(guān)分子的蛋白的其他試劑。
本發(fā)明的另一方面涉及一種定量吸入器(MDI)。在該實(shí)施方案中，將一種推進(jìn)劑、GLP-1和GLP-1類似物及衍生物、以及任何賦形劑或其他添加劑以一種含有液化壓縮氣體的混合物形式裝在金屬罐中。啟動(dòng)定量閥，可以氣溶膠形式釋放出所述混合物，優(yōu)選含有體積小于10微米MMAD的吸入顆粒，優(yōu)選大約1-大約5微米MMAD，最優(yōu)選大約2-大約3微米MMAD。通過由本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多種方法產(chǎn)生的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑，可以獲得所需要的氣溶膠粒度，所述方法包括噴射研磨、噴霧干燥、或臨界點(diǎn)凝聚。優(yōu)選的定量吸入器包括3M或Glaxo生產(chǎn)的吸入器，并且采用一種氟化烴推進(jìn)劑。
用于定量吸入器裝置的GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的制劑通常包括含有肽的細(xì)碎的粉末，它以懸浮液形式存在于無水介質(zhì)中，例如，在表面活性劑的幫助下懸浮在推進(jìn)劑中。所述推進(jìn)劑可以是用于該目的的任何常見材料，如含氯氟烴、氫氯氟碳化合物、氫氟碳化合物、或烴，包括三氯氟代甲烷、二氯二氟代甲烷、二氯四氟代乙醇和1,1,1,2-四氟代乙烷，HFA-134a(氟化烷烴134a)、HFA-227(氟化烷烴-227)等。所述推進(jìn)劑優(yōu)選為氫氟碳化合物?？梢赃x擇表面活性劑以便以在所述推進(jìn)劑中的懸浮液形式穩(wěn)定GLP-1分子，保護(hù)所述活性劑免受化學(xué)降解等。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些場(chǎng)合下，溶液氣溶膠優(yōu)選使用諸如乙醇的溶劑。還可以使用諸如二磷脂酰膽堿或卵磷脂的其他表面活性劑。在所述制劑還可以添加本領(lǐng)域已知用于配制蛋白的其他試劑。
本發(fā)明還涉及一種適于通過吸入服用的含有GLP-1和GLP-1類似物及衍生物的藥用組合物或制劑。根據(jù)本發(fā)明，可將GLP-1和GLP-1類似物及衍生物用于生產(chǎn)適于通過吸入服用的制劑或藥品。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)含有GLP-1相關(guān)分子、適于通過吸入服用的形式的制劑的方法，例如，可以用常規(guī)方法通過若干途徑生產(chǎn)干粉制劑?？梢酝ㄟ^霧化、噴霧干燥等產(chǎn)生適于在下呼吸道有最大沉積量的大小的顆粒。可以通過將所述肽溶解在諸如水的適當(dāng)pH的合適的溶劑中生產(chǎn)液體制劑，該制劑含有緩沖劑或其他賦形劑。
通過下面的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。這些實(shí)施例是用來說明本發(fā)明的特定實(shí)施方案的，而不是要限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例在通過肺服用之后，Val8-GLP-1在Beagle犬體內(nèi)的血清動(dòng)力學(xué)用常規(guī)重組DNA技術(shù)在大腸桿菌中制備GLP-1類似物Val8-GLP-1(7-37)OH(序列4)，并純化至均化。
NH2-His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Arg-Gly-OH
讓6只一組的雌性Beagle犬吸入Val8-GLP-1 15分鐘，平均氣溶膠濃度為77.2μg/升，是由Val8-GLP-1在無菌水中的溶液產(chǎn)生的。在吸入處理之后大約1周以后，通過皮下注射給所述動(dòng)物服用100μg/Kg的劑量。在吸入處理之前和期間，監(jiān)測(cè)潮氣量、呼吸速度、和分鐘量。采集血樣，以便分析在吸入和皮下服用之后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上血漿Val8-GLP-1的含量。在處理之后大約4小時(shí)，采集支氣管肺泡灌洗液(BAL)，并分析LDH總蛋白、細(xì)胞數(shù)、和白細(xì)胞分類。
Val8-GLP-1的輸送能很好地承受1198μg/Kg的吸入劑量，并且估計(jì)的肺沉積劑量為240μg/Kg。所有動(dòng)物也都能很好地耐受皮下服用100μg/Kg。Val8-GLP-1的吸入和皮下服用是用制備的材料輸送的。
沒有與治療相關(guān)的臨床表現(xiàn)；體重沒有受到Val8-GLP-1的不利影響。僅觀察到對(duì)肺的很小的影響。在為期15分鐘的吸入處理期間，觀察到潮氣量和分鐘量的增加，但有關(guān)數(shù)據(jù)的波動(dòng)性很大。沒有發(fā)現(xiàn)LDH、紅血細(xì)胞數(shù)、白血細(xì)胞數(shù)、嗜中性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜伊紅性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的改變。在氣溶膠輸送Val8-GLP-1之后，總蛋白有小的增加。
來自這一研究的結(jié)果表明，與皮下服用相比，通過吸入將Val8-GLP-1輸送到Beagle犬的肺部，具有很好的生物可利用性(40％，以AUC為基礎(chǔ))。在吸入至多15分鐘的時(shí)間之后，對(duì)Val8-GLP-1具有很好的耐受性，在1198μg/Kg的平均吸入劑量下，對(duì)肺只有很小的影響。在該研究中，這種影響是一種不能觀察到的不利影響水平(NOAEL)。
制備劑量溶液在用藥當(dāng)天，在無菌水中制備濃度為0.5毫克/毫升或8毫克/毫升的分別用于皮下服用和肺服用的Val8-GLP-1溶液。在活性周期的最后制備另一種Val8-GLP-1溶液(8毫克/毫升)，以便確定氣溶膠化的Val8-GLP-1的粒度分布。通過一個(gè)低蛋白結(jié)合0.22微米的金屬罐過濾器過濾該溶液。用氫氧化鈉溶液將該溶液的pH調(diào)整到7.47。
試驗(yàn)動(dòng)物在該研究中使用6只雌性Beagle犬(Marshall農(nóng)場(chǎng)，NorthRose,NY)。通過記錄在飼養(yǎng)籠標(biāo)牌上的5位數(shù)動(dòng)物編號(hào)和7位數(shù)紋身(位于耳朵里面)編號(hào)識(shí)別每一只動(dòng)物。在開始該研究之前，將所有動(dòng)物拴在飼養(yǎng)皮帶上。在該研究開始時(shí)所述動(dòng)物的體重為8.4-11.1kg。在該研究開始時(shí)所述動(dòng)物的年齡33-37周。
飼養(yǎng)動(dòng)物的圈養(yǎng)和護(hù)理將動(dòng)物成對(duì)地圈養(yǎng)在不銹鋼籠子中，在處理當(dāng)天例外。在處理當(dāng)天，對(duì)每一只動(dòng)物進(jìn)行單獨(dú)圈養(yǎng)，以便監(jiān)測(cè)其進(jìn)食方案。對(duì)房間進(jìn)行恒溫調(diào)節(jié)，以便溫度保持在70°F下，并將實(shí)際溫度保持在與設(shè)定值相差±8°F范圍內(nèi)。設(shè)計(jì)環(huán)境控制系統(tǒng)，以便保持20％的相對(duì)濕度，最大相對(duì)濕度為80％。進(jìn)行12小時(shí)的光照循環(huán)，光照時(shí)間為上午6點(diǎn)到下午6點(diǎn)。然后，在下午6點(diǎn)到第二天上午6點(diǎn)之間停止光照，在采集血樣時(shí)例外。每天用Hill’s科學(xué)飲食喂動(dòng)物一次。在處理之前，讓動(dòng)物禁食大約12小時(shí)。可以自由飲用自來水，在處理期間例外。
處理組和研究時(shí)間用氣溶膠化的Val8-GLP-1處理所有6只動(dòng)物15分鐘。Val8-GLP-1處理的肺的目標(biāo)沉積劑量為每公斤體重200μg。在肺服用Val8-GLP-1之后大約7天，通過皮下服用給所有的狗使用劑量為每公斤體重100μg的Val8-GLP-1。
處理系統(tǒng)狗站立，栓在帶子上進(jìn)行試驗(yàn)。將兩層0.03英寸的膠乳層放在動(dòng)物脖子周圍，以便形成非限制性的氣密性密封。將類似于Allen等(J Appl Toxicol1995；15:13-17)所披露的裝置的專用結(jié)構(gòu)--11-L頭盔套在狗的頭上，并固定在所述栓狗帶上。通過位于所述頭盔排氣一側(cè)的傳導(dǎo)裝置(transvector)呼吸氣流。由于所述頭盔是氣密性的，并且其脖子是密封性的，這樣能構(gòu)成一種僅僅是針對(duì)頭部的接觸系統(tǒng)。通過所述頭盔的總的流量為大約7.5升/分鐘。
氣溶膠產(chǎn)生氣溶膠是使用RespirgardⅡ噴霧器，以大約6.5升/分鐘的輸入量產(chǎn)生的。來自所述發(fā)生器的輸出物直接流入所述頭盔。
環(huán)境濃度取樣用于總的重量濃度分析的所有取樣，是用裝有A/E型玻璃纖維濾膜的聯(lián)機(jī)過濾裝置進(jìn)行的(Gelman儀器公司，Ann Arbor,MI)。從所述腔室中進(jìn)行濾膜取樣，是以1升/分鐘的額定取樣速度進(jìn)行的，用一臺(tái)便攜式質(zhì)量空氣流校正器校正的(8300,Sierra儀器，CarmelValley,CA)。取樣時(shí)間為15分鐘。粒度分析是用Sierra218K型Ambient Cascade Impactor(Anderson Samplers公司，亞特蘭大，GA)進(jìn)行的。從所述腔室中進(jìn)行級(jí)聯(lián)取樣是以3升/分鐘的額定取樣速度進(jìn)行的，用一臺(tái)便攜式質(zhì)量空氣流校正器校正(8300,Sierra儀器，Carmel Valley,CA)，取樣時(shí)間為31分鐘。在重新稱重之前讓濾膜干燥大約30分鐘。
劑量確定在15分鐘處理時(shí)間內(nèi)吸入的Val8-GLP-1的劑量是按以下方法估算的用在15分鐘處理期間的平均分鐘量(毫升)乘以處理時(shí)間，以便得到在該吸入處理期間所呼吸的總的空氣(升)。用該值乘以氣溶膠濃度(μg/升)，以便確定總的劑量(毫克)。吸入劑量(μg/Kg)是通過用總劑量(μg)除以動(dòng)物的體重(Kg)計(jì)算出來的。
沉積在肺里的Val8-GLP-1的劑量是按以下方法估算的吸入劑量(μg/Kg)乘以20％，得到估算的肺沉積劑量(μg/Kg)。MMEAD為1-2微米MMAD的氣溶膠，在肺中表現(xiàn)出的沉積效率大約為20％(Schlesinger RB,1985，吸入氣溶膠在試驗(yàn)動(dòng)物和人體內(nèi)沉積的比較綜述。J Toxicol Environ Health15:197-214)。
肺功能在第-5、0、和7天對(duì)所有動(dòng)物稱重。用一臺(tái)‘0’大小的連接在所述頭盔上的一個(gè)出口上的呼吸速度描記器監(jiān)測(cè)呼吸模式(潮氣量，呼吸頻率，以及分鐘量)。用一臺(tái)個(gè)人電腦，使用Buxco XA數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)(Buxco電子公司，Sharon,CT)收集信號(hào)。在處理開始之前，收集至少15分鐘的處理前數(shù)據(jù)，然后在15分鐘的處理時(shí)間內(nèi)收集數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)都是以5分鐘的平均值分析的。
支氣管肺泡灌洗在每一次用藥方案之后大約4小時(shí)，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)。在BAL處理之前，通過靜脈注射2％的Brevital將所述動(dòng)物麻醉。支氣管肺泡灌洗是用兒科纖維光學(xué)支氣管鏡(Olympus,ModelBF,10型，Lake Success,NY)完成的。將支氣管鏡的鏡頭插入肺下葉的呼吸道的第5至第7節(jié)。在右側(cè)和左側(cè)肺葉之間交替進(jìn)行BAL。滴入兩個(gè)10毫升的等分試樣，并輕輕地吸出。將回收到的灌洗液的等分試樣用于測(cè)定總的白細(xì)胞數(shù)、總的紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞分類、總蛋白、和乳酸脫氫酶。
細(xì)胞數(shù)量和分類用Technicon H1系統(tǒng)(Technicon儀器公司)測(cè)定未濃縮的BAL液體的全血計(jì)數(shù)。通過顯微鏡估算200Wright染色細(xì)胞，測(cè)定BAL的細(xì)胞分類。
血液采集為了分析Val8-GLP-1的血漿動(dòng)力學(xué)，在處理之前以及在處理之后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8和12小時(shí)將大約2-3毫升血樣采集到EDTA真空容器管中。為了獲得血漿，在10℃下以大約3000rpm的速度將每一只試管離心10分鐘。將血漿樣品放在-70℃下保存，直到送去分析。
處理濃度/粒度和肺劑量每一只狗用Val8-GLP-1處理的平均處理濃度為64.0-101.3μg/升。所有動(dòng)物的平均(±SD)濃度為77.2±16.9μg/升。以質(zhì)量中等等同的空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMEAD)衡量的粒度為0.91微米，幾何標(biāo)準(zhǔn)誤差(GSD)為2.37。
計(jì)算出的在6只用Val8-GLP-1處理的狗的肺中的Val8-GLP-1的沉積劑量為240±42μg/Kg(平均值±SD)。平均吸入劑量(就是進(jìn)入呼吸道的劑量，而不管是否沉積)為1198±208μg/Kg(平均值±SD)，每一只動(dòng)物的數(shù)據(jù)在下面的表中給出。
用Val8-GLP-1氣溶膠處理的動(dòng)物的估計(jì)的肺劑量
*沒有測(cè)定動(dòng)物27682和27684的氣溶膠濃度，因此，將平均氣溶膠濃度用于計(jì)算估計(jì)的吸入肺劑量(μg/Kg)。
在所述處理期間，未觀察到體重的明顯改變。起始體重(第-5天)和最終的體重(第7天)分別為9.5±0.9(平均值±SD；n=6)和9.7±0.9Kg。觀察到了呼吸頻率的明顯改變。測(cè)定到了潮氣量和分鐘量的小的增加，但有關(guān)數(shù)據(jù)是高度波動(dòng)的，這可能是由于在研究開始之前的適應(yīng)時(shí)間較短。每一只動(dòng)物的數(shù)據(jù)在下面的表中示出。
在接觸Val8-GLP-1期間肺功能的改變
*處理時(shí)間的分鐘數(shù)(數(shù)值表示5分鐘的平均值)**由n=5(而不是n=6)計(jì)算的平均值，因?yàn)樵谔幚碇暗?5分鐘里沒有記錄動(dòng)物#27689的值在皮下和肺服用Val8-GLP-1之后藥物動(dòng)力學(xué)的比較
*所有值是以平均值±SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)形式給出的。
(1)AUC0-，=血漿濃度曲線下面從0時(shí)間到t時(shí)間的面積，其中，t=用藥之后12小時(shí)通過競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫測(cè)定(RIA)測(cè)定免疫活性Val8-GLP-1的血漿濃度(表3)。對(duì)Val8-GLP-1的吸收在用藥之后15分鐘很快達(dá)到顯著的血漿濃度。皮下注射和吸入的血漿時(shí)間曲線相似。吸入的平均Tmax值大于皮下注射的值。另外，通過吸入所達(dá)到的較高Val8-GLP-1濃度(接近Cmax)，在該濃度水平上能比皮下注射保持更長(zhǎng)的時(shí)間。
根據(jù)所述平均AUC值，吸入Val8-GLP-1(平均吸入劑量為1198μg/Kg)相對(duì)皮下注射(100μg/Kg)為大約7.7％。根據(jù)肺沉積劑量估計(jì)為240μg/Kg，相對(duì)皮下注射的生物可利用性為40％。
序列表<110>Eli Lilly and Company<120>吸用胰高血糖素樣肽的方法<130>X-12013<140><141><150>US 60/098273<151>1998-08-28<150>US 60/100012<151>1998-09-11<160>4<170>PatentIn.Ver.2.0<210>1<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成序列<220><223>1號(hào)位置上的Xaa選自下列一組Ala,Gly,Val,Thr,Ile和alpha-甲基-Ala.<220><223>14號(hào)位置上的Xaa選自下列一組Glu,Gln,Ala,Thr,Ser.和Gly.<220><223>20號(hào)位置上的Xaa選自下列一組Glu,Gln,Ala,Thr,Ser和Gly.<400>1Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly Gln1 F5 10 15Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
2025<210>2<211>28<212>PRT<213>人類<220><223>人工序列描述合成序列<220><223>28號(hào)位置上的Xaa選自下列一組Lys和Lys-Glg<400>2His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210>3<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>19號(hào)位置上的Xaa選自Lys和Arg.<220><223>人工序列描述合成序列<400>3Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln1 5 10 15Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25<210>4<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成或半合成序列<400>4His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 510 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30
權(quán)利要求
1．一種服用胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)分子的方法，包括通過肺吸裝置給需要的患者服用有效量的選自下列一組的GLP-1分子GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物。
2．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述GLP-1分子被輸送到患者的下呼吸道。μ
3．如權(quán)利要求2的方法，其中，所述GLP-1分子沉積在肺泡中。
4．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述GLP-1分子是通過患者的口腔吸入的。
5．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述GLP-1分子是作為一種在可以藥用的載體中含有GLP-1分子的藥用制劑形式服用的。
6．如權(quán)利要求5的方法，其中，所述制劑選自下列一組含水介質(zhì)的溶液和無水介質(zhì)的懸浮液。
7．如權(quán)利要求6的方法，其中，所述制劑是作為氣溶膠服用的。
8．如權(quán)利要求5的方法，其中，所述制劑為干粉形式。
9．如權(quán)利要求5的方法，其中，所述GLP-1分子的粒度小于大約10微米MMAD。
10．如權(quán)利要求9的方法，其中，所述GLP-1分子的粒度小于大約1-大約5微米MMAD。
11．如權(quán)利要求10的方法，其中，所述GLP-1分子的粒度小于大約2-大約3微米MMAD。
12．如權(quán)利要求1的方法，其中，至少大約10％的被輸送的GLP-1分子沉積在肺里。
13．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述GLP-1分子是用適于肺服用的吸入裝置輸送的，并能夠?qū)LP-1分子沉積在患者的肺里。
14．如權(quán)利要求13的方法，其中，所述裝置選自下列一組噴霧器、定量吸入器、干粉吸入器、和噴灑器。
15．如權(quán)利要求14的方法，其中，所述裝置是干粉吸入器。
16．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述GLP-1選自由GLP-1類似物和GLP-1衍生物構(gòu)成的一組。
17．如權(quán)利要求16的方法，其中，所述GLP-1分子是GLP-1類似物。
18．如權(quán)利要求17的方法，其中，所述GLP-1類似物選自下列一組Val8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Asp8-GLP-1(7-37)OH。
19．如權(quán)利要求18的方法，其中，所述GLP-1類似物是Val8-GLP-1(7-37)OH。
20．如權(quán)利要求18的方法，其中，所述GLP-1類似物是Gly8-GLP-1(7-37)OH。
21．一種治療糖尿病的方法，包括通過肺輸送給需要治療的患者服用有效劑量的GLP-1分子。
22．如權(quán)利要求21的方法，其中，所述GLP-1分子是以在可以藥用的載體中含有所述GLP-1分子的藥用制劑形式服用的。
23．如權(quán)利要求21的方法，其中，所述GLP-1分子是Val8-GLP-1(7-37)OH。
24．如權(quán)利要求21的方法，其中，所述GLP-1類似物是Val8-GLP-1(7-37)OH。
25．如權(quán)利要求21的方法，其中，所述GLP-1分子是用適于肺服用的吸入裝置輸送的，并能夠?qū)LP-1分子沉積在患者的肺里。
26．如權(quán)利要求25的方法，其中，所述裝置是噴霧劑式干粉吸入器。
27．如權(quán)利要求25的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約40μg-大約4000μgGLP-1分子。
28．如權(quán)利要求25的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約80μg--大約2000μgGLP-1分子。
29．如權(quán)利要求25的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約160μg--大約1000μgGLP-1分子。
30．如權(quán)利要求25的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約320μg--大約500μgGLP-1分子。
31．一種治療高血糖癥的方法，包括通過肺吸裝置給需要治療的患者服用有效劑量的GLP-1分子。
32．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述GLP-1分子是以在可以藥用的載體中含有所述GLP-1分子的藥用制劑形式服用的。
33．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述GLP-1分子是Val8-GLP-1(7-37)OH。
34．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述GLP-1類似物是Gly8-GLP-1(7-37)OH。
35．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述GLP-1分子是用適于肺服用的吸入裝置輸送的，并能夠?qū)LP-1分子沉積在患者的肺里。
36．如權(quán)利要求35的方法，其中，所述裝置選自下列一組噴灑器和干粉吸入器。
37．如權(quán)利要求35的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約40μg--大約4000μgGLP-1分子。
38．如權(quán)利要求35的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約80μg--大約2000μgGLP-1分子。
39．如權(quán)利要求35的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約160μg--大約1000μgGLP-1分子。
40．如權(quán)利要求35的方法，其中，所述裝置啟動(dòng)一次可以服用大約320μg--大約500μgGLP-1分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過吸入方法服用胰高血糖素樣肽－1分子的方法,一種通過吸入服用胰高血糖素樣肽－1分子治療糖尿病的方法,以及一種通過吸入服用胰高血糖素樣肽－1分子治療高血糖癥的方法。
文檔編號(hào)A61K38/26GK1314818SQ99810174
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1999年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月28日
發(fā)明者B·L·胡赫斯, R·K·沃爾夫 申請(qǐng)人:伊萊利利公司