專利名稱：使用羥基二苯基醚類化學(xué)試劑,以二氯苯氧氯酚作為示例,作為抗瘧藥及對脂肪酸合成靶確認的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的領(lǐng)域本發(fā)明涉及羥基二苯基醚類化學(xué)試劑，以二氯苯氧氯酚[2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯基醚]作為示例，用作對新靶的確認及用于治療人類falciparum瘧疾療法中的應(yīng)用。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
人類的瘧疾是由于瘧原蟲falciparum引起的高熱感染。估計每年在發(fā)展中國家有3-4億新感染瘧疾、并有1.5-2.7百萬人死于瘧疾，參見世界健康組織瘧疾，WHO Fact Sheet 94，1-3(1995)。這種疾病還消耗了大量的人力和藥療費用。由于寄生蟲的抗藥性的廣泛發(fā)展，在傳染媒質(zhì)中的對殺蟲劑的抗性，并且在近期都沒有一個有效的瘧疾疫苗可用，這些需要新靶的確認和較好抗瘧疾藥物的開發(fā)。
瘧原蟲(Plasmodium)是一個屬于Apicomplexa門，Plasmodium屬的寄生原蟲，是通過按蚊(Anopheles)屬的雌蚊傳播的。人類的瘧疾由四類瘧原蟲引起的，即瘧原蟲falciparum，瘧原蟲vivax，瘧原蟲ovale和瘧原蟲malariae。該疾病的特征是在感染的紅細胞階段周期性的發(fā)熱并伴有裂殖子(merozoites)的釋放，在瘧原蟲malariae的情況下該發(fā)熱每72小時出現(xiàn)一次，而對于其它種類的瘧原蟲是每48小時出現(xiàn)一次。在所有的種類中，都有一個紅細胞外的裂殖生殖，在瘧原蟲falciparum和malariae中，這個階段延續(xù)5～15天。瘧原蟲falciparum引起惡性間日瘧，是最常見和最嚴重的瘧疾形式。這種感染是急性的、并且寄生蟲傾向吸附在內(nèi)皮層細胞，可引起堵塞和大腦的損害，通常會導(dǎo)致死亡。
瘧原蟲vivax引起良性間日瘧，是第二嚴重的感染，瘧原蟲ovale引起ovale間日瘧，集中在西部非洲。
瘧原蟲malariae引起三日瘧，感染可能延續(xù)30年或更長。后三種寄生蟲感染，盡管會造成衰弱，但很少導(dǎo)致死亡。引起大腦的瘧疾的瘧原蟲falciparum，已經(jīng)對氯喹有抗藥性。
人類寄生蟲，除瘧原蟲malariae外，并不能自然地傳染給其它動物，所以靈長目動物和嚙齒動物的瘧疾寄生蟲在為它們自身利益和做為人類感染的模型方面都引起了相當(dāng)?shù)淖⒁?。大約20種在非人類長目動物的瘧原蟲cynomlgi，與瘧原蟲vivax相似，被進行了廣泛地研究。來自獼猴類的另一種瘧原蟲knowlesi是目前在實驗室研究中被廣泛應(yīng)用的。嚙齒動物的瘧疾寄生蟲比其它任何種類被進行了更廣泛的研究。這些主要集中在兩個主要群體，瘧原蟲berghei，yoelii及它們的亞種和瘧原蟲vinckei，chabaudi及它們的亞種。瘧原蟲berghei-yoelii群有代表性地侵襲未成熟的紅細胞。它們都有24小時的周期性，不太明顯的能夠提供關(guān)于瘧疾寄生蟲的豐富的生物學(xué)信息，這些信息通過其他的途徑是不可獲得的。
抗瘧疾藥物對瘧疾的治療包括使用藥物，如喹啉、氯喹、青蒿素、甲氟喹(mefloquine)、伯氨喹(primaquine)等治療，根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和它們在瘧疾生命循環(huán)不同階段的活性，把目前使用的抗瘧疾藥物可分為三個組是可能的，它們是(a)抗代謝物(b)8-氨基喹啉類(c)血液殺裂殖體劑(d)另外，可能被承認的另外一組是具有抗瘧疾活性的抗菌的抗生素。
(a)抗代謝物這些藥物作用于葉酸循環(huán)，被分為類型I和類型II抗葉酸物。瘧疾寄生蟲進行嘧啶全合成，在該過程中還原葉酸衍生物是一個至關(guān)重要的輔因子。盡管它們擁有嘌呤的補救途經(jīng)，但是它們不能利用提供的嘧啶，使用象哺乳動物細胞的補救途經(jīng)，所以它們對這些抗葉酸物敏感。
類型I抗葉酸物，包括磺胺和砜(sulphones)(比如磺胺多辛(sulfadoxine)和氨苯砜)是對氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物 苯甲酸與這些抗代謝物競爭二氫蝶啶酯合成酶(enzyme dihydropteroate)的活性位點，將PABA連接到蝶啶形成二氫蝶啶酯。一個進一步的二氫葉酸合成酶連接谷氨酸到二氫蝶啶酯給出二氫葉酸酯(二氫蝶酰谷氨酸酯)。從PABA到二氫葉酸的路徑對微生物是唯一的。在哺乳動物細胞中，二氫葉酸酯通過飲食的葉酸的減少得到，這說明磺胺類和氨苯砜類藥劑對微生物的選擇性毒性，和在哺乳動物寄生體中相對安全。
第二類抗葉酸物(如，乙胺嘧啶、甲氧芐氨嘧啶和環(huán)氯胍，氯胍的代謝物)與葉酸物有相似的結(jié)構(gòu)，與這個代謝物競爭二氫葉酸還原酶(四氫葉酸酯脫氫酶)。哺乳動物宿主通過一個相似的酶產(chǎn)生四氫葉酸酯。乙胺嘧啶和環(huán)氯胍的選擇性毒性的基礎(chǔ)是這些化合物比哺乳動物對瘧原蟲的酶有高的親合性，并且寄生蟲與宿主細胞相比進行快速的增殖。
(b)8-氨基喹啉8-氨基喹啉，特別地，是這組中毒性最小的，伯氨喹(primaquine)是殺配子體劑(gametocytocides)和hypnozoitocide。8-氨基喹啉對無性血液階段也有活性，盡管它有明顯的毒性。眾所周知，對這種抗瘧效應(yīng)的方式，8-氨基喹啉需要代謝激活。伯氨喹(primaquine)激活代謝的許多工作需要指明作用的實際方式，但有提示說使用8-氨基喹啉的治療會引起瘧疾寄生蟲線粒體的腫漲，參見R.L.Beaudoin and M.Aikawa Science 160，1233-1234(1968)。
(c)血液殺裂殖體劑(schizonotocides)血液殺裂殖體劑，包括最老的喹嚀(quinine)至今仍然是不可缺少的，它在瘧疾寄生蟲的紅細胞階段是有活性的。它們被用在激活抗瘧疾治療以及抑制的預(yù)防中。對這些藥物易感性的血紅蛋白消化的重要性是眾所周知的。
這些血液殺裂殖體劑，根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和對紅細胞內(nèi)的寄生蟲的作用效果分為兩組。
i)第一組由合成的4-氨基喹啉，氯喹和吖啶米帕林(acridine mepacrine)等組成。這些藥物對含有紅細胞內(nèi)的寄生蟲的消化囊的血紅蛋白有顯著的、快速的作用。
ii)第二組殺裂殖體劑是芳香氨基醇，如奎寧(quinine)和甲氟喹(mefloquine)，這里的芳基可能是或也可能不是氮雜環(huán)。它們不象第一組藥物，不會引起明顯的和快速的效應(yīng)，盡管它們能有競爭性地抑制由此類藥產(chǎn)生的自噬液泡(autophagicvacuole)的形成。
氯喹40多年來，氯喹(CQ)一直是被選用作抗瘧疾藥物，因為它對感染人類的四種瘧原蟲(瘧原蟲falciparum，瘧原蟲vivax，瘧原蟲ovale和瘧原蟲malariae)都有抵抗活性。另外，CQ是唯一已知的對兒童和孕婦安全的抗瘧疾藥物。由于瘧原蟲falciparum的CQ抗藥株系的出現(xiàn)，CQ的價值已大大降低了。因此，盡管CQ是安全的，但是對CQ抗性使瘧疾發(fā)病率和死亡率增加，參見A.A.Asindi等，Trop.Geogr.Med.45，110-113(1993)。這導(dǎo)致了其它抗瘧疾藥物的廣泛使用(甲氟喹(mefloquine)，鹵泛群(halofantrine)，青蒿素(artemisnin)衍生物和乙胺嘧啶-磺胺多辛(fansidar)。
盡管在過去CQ起過杰出的作用，它的作用方式一直存有爭議，參見S.R.Meshnick An.Trop.Med.Parasitol.90，367-372(1996)。有關(guān)CQ的抗性機理也存有爭議，盡管由于CQ抗性和CQ作用和抗性的機理理論的不確定性造成的實際應(yīng)用中的限制，仍然有理由不得不考慮與CQ相似的氨基喹啉(AQs)做為潛在的抗瘧疾藥物。如果這些AQs對人類有效，它們能夠在發(fā)展中國家用與生產(chǎn)CQ的親核取代反應(yīng)相似的方法合成它們，參見D.De等，J.Heterocycl.Chem.34，315-320(1997)。AQs能夠提供一種目前治療CQ抗性瘧疾的昂貴的抗瘧藥物的經(jīng)濟的替代物。盡管乙胺嘧啶-磺胺多辛是相對經(jīng)濟的，但是它做為第一線抗瘧疾藥物的廣泛使用可能快速的選擇抗性寄生蟲，參見O.C.Nwanyanwu等，Trop.Med.Intl.Health 21，231-235(1996)。
CQ作用的方式對于氯喹作用的機理被提出了很多，它們包括i)DNA相互作用(interacalation)；ii)液泡(vacuolar)中pH的升高；iii)CQ與自由血紅素的結(jié)合；iv)天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶活性的抑制；v)寄生蟲蛋白質(zhì)合成的抑制。
CQ處理的寄生蟲的形態(tài)學(xué)觀察
據(jù)報道，CQ在寄生蟲食物液泡中產(chǎn)生形態(tài)的變化。暴露給CQ后，對CQ易感的瘧疾寄生蟲的食物液泡變大，并與未處理的對照相比瘧疾色素的數(shù)量有所減少。另外，寄生蟲細胞質(zhì)證明核糖體的聚積，線粒體的腫漲和粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫漲。這些效應(yīng)是特殊階段的，只有在滋養(yǎng)體成熟時，它能干擾食物液泡的正常功能，這時這些效應(yīng)才能被觀察到。
食物液泡的功能和CQ在瘧疾寄生蟲中的累積瘧疾寄生蟲的食物液泡做為次級溶酶體的功能，主要含有血紅蛋白的紅血細胞(RBC)的細胞質(zhì)被內(nèi)吞作用內(nèi)在化，而且到達食物液泡中，在這里血紅蛋白通過天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶(plasmepsins、falcipain)降解釋放肽和氨基酸，寄生蟲利用這些肽和氨基酸合成蛋白質(zhì)。參見S.E.Francis等，Annu.Rev.Microbiol.51，97-123(1997)。在蛋白質(zhì)合成最大時，這個過程在滋養(yǎng)體中是最活躍的。寄生RBC的瘧疾比未寄生RCB的瘧疾積累更多的CQ，已經(jīng)知道CQ的累積對它抗瘧原蟲活性是必須的?？傊?，由于CQ在食物液泡中的積累，CQ抑制寄生蟲成熟這樣的觀點被提出。寄生蟲食物液泡是獨特的靶，因為它在哺乳動物細胞中不存在。
CQ可能干擾食物液泡功能的機理CQ干擾食物液泡功能至少有四種機理i)提高液泡pH已經(jīng)提出氯喹，由于弱堿性效應(yīng)或轉(zhuǎn)移機理，引起食物液泡的堿化，參見C.A.Homewood等，Nature 235，50-52(1972)，D.J.Krogstad等，J.Cell.Biol.101.2302-2309(1985)，P.H.Schlesinger等，Antimicrob.Agents Chemother.32，793-798(1988)。
ii)抑制天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶活性瘧原蟲falciparum食物液泡含有至少三種蛋白酶水解寄主的血紅蛋白成亞鐵血紅素和珠蛋白，半胱氨酸蛋白酶falcipain，參見P.J.Rosenthal等，J.Clin.Invest.82，1560-1566(1988)，I.Y.Gluzman等，J.Clin.Invest.93，1602-1608(1994)和天冬氨酸蛋白酶plasmepsin I和plasmepsinII，參見J.L.Hill等，F(xiàn)EBS Lett.352，155-158(1994)。這些酶中的每一個都參加珠蛋白的水解，因為通過寄生蟲和食物液泡提取物的血紅蛋白的水解被天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑以另外一種方式抑制了。
在血紅蛋白降解中三個食物液泡蛋白酶的精確的作用還不清楚，部分由于食物液泡氧化還原狀態(tài)的不確定性。半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶的抑制作用有抗瘧疾效應(yīng)，但是它們似乎作用的方式不同。
天冬氨酸及半胱氨酸蛋白酶抑制劑做為潛在的抗瘧疾藥物正在研究之中。有效抗瘧疾蛋白酶抑制劑應(yīng)該是理想地抑制寄生蟲蛋白酶但不抑制寄主類似物，比如，半胱氨酸蛋白酶Cathepsins L和B，天冬氨酸蛋白酶Cathepsin D等。
在食物泡液中半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶降解血紅蛋白，而且，這兩類酶的抑制劑呈現(xiàn)出抗瘧疾效應(yīng)，優(yōu)選的化學(xué)治療法可能涉及有兩類蛋白酶抑制劑的組合治療方法。
iii)結(jié)合游離亞鐵血紅素已經(jīng)提出了CQ形成有亞鐵血紅素的毒性復(fù)合物，這樣，防止亞鐵紅血素被解毒。
iv)瘧原蟲色素形成受阻血紅蛋白的降解紅細胞瘧疾寄生蟲寄居在細胞內(nèi)環(huán)境，它屏敝它們免受免疫系統(tǒng)的攻擊，同時使它們和已準備好的血液中循環(huán)供給的營養(yǎng)分離，寄生蟲已發(fā)展了從紅細胞胞液中獲取營養(yǎng)的方法。在酸性食物液泡中紅細胞寄生蟲吸收和降解了大量的血紅蛋白成為亞鐵血紅素和珠蛋白，參見P.J.Rosenthal.And S.R.Meshnick，Mol.Biochem.Parasitol.83，131-139(1996)。球蛋白的進一步地水解提供了大量的寄生蟲蛋白質(zhì)合成所需的氨基酸。在處理過程中血紅蛋白產(chǎn)生大量濃度的自由亞鐵血紅素，為了避免寄生蟲毒性，必須被修改或隔離，這些自由的亞鐵血紅素被聚合成瘧原蟲色素做為排毒機理。瘧原蟲色素的組成有一定的爭議?？雌饋懑懺x色素以β-正鐵血紅素——每一個亞鐵血紅素三價鐵的部分和相鄰亞鐵血紅素分子的羧基側(cè)鏈結(jié)合的非共價配位復(fù)合物形式的聚合亞鐵血紅素組成。是否亞鐵血紅素聚合是由亞鐵血紅素聚合酶催化的還是非酶催化的反應(yīng)是有爭議的另一個領(lǐng)域。參見A.F.G.Slater和A.Cerami，Natnure 355，167-169(1992)和K.Raynes等，Biochem.Pharmacol.52，551-559(1996)。
大部分這些假說不可能充分解釋氯奎的抗瘧疾作用，理由如下a)氯喹的藥理濃度引起pH的變化可能太小，不能充分解釋藥物的作用，氯喹堿化食物液泡的相對能力不能和它們的抗瘧疾效能相關(guān)。
b)在處理過的寄生蟲中，沒有形成毒性亞鐵血紅素氯喹復(fù)合物所必需游離的亞鐵血紅素的數(shù)量的直接證據(jù)。
c)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的形態(tài)上影響不同于氯喹引起的那些，參見，P.J.Rosenthal，Exp.Parasitol.75，255-260(1995)。
CQ抑制寄生蟲生長的可選機理i)與DNA相互作用多年來，這個假說被認為是CQ對瘧疾寄生蟲效用的的最可能解釋。對這個假設(shè)的爭論因素是依賴于CQ抗寄生蟲活性的專一性和濃度。在細菌、病毒和哺乳動物細胞中，CQ以毫摩爾濃度抑制DNA合成。這個毫摩爾CQ濃度(抑制DNA合成)比抑制寄生蟲生長納摩爾的濃度高5到6個數(shù)量級(CQ對寄生蟲作用的最顯著的方面是在納摩濃度的專一性)。
ii)寄生蟲蛋白合成的抑制作用發(fā)明者之一(Namita Surolia)提出CQ在治療濃度通過隔離亞鐵血紅素抑制寄生蟲蛋白質(zhì)的合成，因為亞鐵血紅素對于最佳的蛋白質(zhì)合成是必需的。參見N.Surolia和G.Padmanaban，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4786-4790(1991)。這樣引起的亞鐵血紅素的不足導(dǎo)致eIF2α激酶或亞鐵血紅素調(diào)節(jié)抑制劑(HRI)的增強的自動磷酸化，接下來，通過磷酸化翻譯起始因子的最小亞單元(eIF-2α)抑制蛋白質(zhì)合成。發(fā)明都者提出寄生蟲蛋白質(zhì)合成的抑制作用是寄生蟲的死亡的一個早期事件(其它的機制是基于和藥物溫育和處理24小時后 CQ的效用的基礎(chǔ)上的，鑒于蛋白質(zhì)合成的抑制在藥物和寄生蟲溫育15-20分鐘能被觀察到)此外，CQ在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，起作用的位點是蛋白質(zhì)的合成，它到達食物液泡前，是其它提出的作用機理的位置。
發(fā)明者也證明了酶的活性，即蛋白質(zhì)合成所需從頭生物合成亞鐵血紅素涉及的ALA脫水酶和ALA合成酶和象細胞色素P-450和細胞色素C氧化酶的血蛋白質(zhì)中的輔助因子，參見N.Surolia和G.Padmanaban，Biochem.Biophys.Res.Commun.197，562-569(1993)。
不同藥物的作用機理a.奎寧奎寧是喹啉甲醇。喹啶是奎寧的純的d型異構(gòu)體，更為有效。象其它很多抗瘧疾藥物，奎寧被認為影響瘧原蟲色素——瘧色斑的形成。自從1937年就已經(jīng)知道亞鐵血紅素與奎寧的作用。
b.青蒿素(Artemisinin)(Qinghaosu)奎寧后，青蒿素(artemisinin)保留了抗瘧疾藥物的基本的成分。Artemisia annua(甜苦艾)做為青蒿而為中草藥行醫(yī)者所知至少有2000多年了?；钚缘摹⑺蝗艿某煞旨此^的青蒿素(qinghaosu)或artemisinin。兩個青蒿素的衍生物是artemether和artesunate。這些中藥不適用于除中國以外的其它國家研究所用，因為它們僅能在中國被培養(yǎng)，而且許多中國的原始研究不被西方政府接受(因為它們沒有遵循臨床實驗所要求的許多標準實踐)。
青蒿素的作用的機理涉及亞鐵血紅素和中心碳原子自由基產(chǎn)生的作用機理越來越得到一致的認同。假設(shè)青蒿素通過產(chǎn)生自由基起作用。從青蒿素產(chǎn)生的自由基被發(fā)現(xiàn)是依賴于鐵的。提出通過青蒿素使寄生蟲專一蛋白質(zhì)的烷基化是青蒿素的作用的機理。蛋白質(zhì)烷基化如何導(dǎo)致寄生蟲死亡？青蒿素靶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的進一步闡明將回答這個問題。
正在開發(fā)中的藥品(Drugs in the pipeline)對私人藥物公司進行抗瘧疾藥物的開發(fā)幾乎沒有經(jīng)濟上的驅(qū)動?？汞懠菜幍陌l(fā)現(xiàn)和設(shè)計過程極端費時和復(fù)雜，我們直接關(guān)心的是下一代的抗瘧疾藥物。目前開發(fā)的藥物如下圖所示。
來自Milhous，W.K.and Kyle，D.E.瘧疾寄生蟲生物學(xué)，發(fā)病機制，和保護，I Sherman，Eds.，ASM出版社，Washington，D..(1998)pp 303-316對本發(fā)明的總結(jié)一個羥基二苯基醚類化合物——二氯苯氧氯酚在體外有效地抑制人類瘧疾寄生蟲(瘧原蟲falciparum) 的生長。也說明了感染瘧原蟲berghei(嚙齒瘧疾寄生蟲)的小鼠注射二氯苯氧氯酚能夠消減寄生物血癥并延長它們的生存時間。尤其本發(fā)明提供了證據(jù)(1)羥基二苯基醚(以二氯苯氧氯酚為例)消除在體內(nèi)和體外瘧疾寄生蟲的生長，認定這類化合物能做為有前途的治療藥物。(2)提供了二氯苯氧氯酚抑制在脂肪酸合成中[14C]或[3H]丙二酸單酰CoA的結(jié)合的證據(jù)。(3)從用在瘧疾寄生蟲脂肪酸合成過程中前體物[14C]或[3H]丙二酸單酰CoA合成的脂肪酸鏈的縮短，提供了證明二氯苯氧氯酚把脂烯酰ACP還原酶(FabI)做為靶的證據(jù)。
因為在瘧疾寄生蟲中脂肪酸合成涉及的酶不同于人類寄生體中的，所以本發(fā)明為以瘧疾寄生蟲生存機理的基本元素(FabI)為靶的藥物開發(fā)鋪平了道路。
圖的簡要說明

圖1.說明體外不同濃度二氯苯氧氯酚和瘧原蟲falciparum溫育后寄生物血癥抑制的百分數(shù)。
圖2.照片說明二氯苯氧氯酚對24小時溫育后培養(yǎng)體中瘧原蟲falciparum生長和的形態(tài)的影響。
圖3.說明體內(nèi)在瘧原蟲berghei感染小鼠中二氯苯氧氯酚控制寄生物血癥的效力，其中二氯苯氧氯酚是在感染后1和2天進行皮下注射配給的。結(jié)果表明第一次和第二次注射后的寄生物血癥，每一點代表用4～5個動物的一個分立實驗。
圖4.照片說明分別是一劑和兩劑二氯苯氧氯酚配給后(3mg/kg體重)，在體內(nèi)在瘧原蟲berghei感染小鼠中，二氯苯氧氯酚對寄生蟲生長的效應(yīng)。
圖5.通過不同濃度二氯苯氧氯酚及通過培養(yǎng)體中[35S]蛋氨酸的減少說明蛋白質(zhì)合成的抑制作用圖6a.0.15、0.3、0.6、1.2和4.8μg二氯苯氧氯酚對在無瘧原蟲falciparum脂肪酸合成體系的細胞中[14C]丙二酸單酰CoA結(jié)合的影響圖6b.說明以上濃度二氯苯氧氯酚對體外瘧原蟲falciparum合成脂肪酸類型影響的薄層層析(TLC)結(jié)果專業(yè)用語的描述定義涂片，指在一塊片上提供薄的或厚的血液膜，這個膜空氣干燥的，在甲醇中固定，染色后被用來在顯微鏡下檢查寄生蟲的形態(tài)學(xué)特征。
RPMI 1640，指在組織培養(yǎng)物中用于培養(yǎng)寄生蟲和其它細胞的合成培養(yǎng)基。
CRPMI，指的是完整的RPMI培養(yǎng)基，將25mM Hepes緩沖液，0.2％NaHCO3和10％人類血清加入到RPMI 1640中。
酸化的檸檬酸葡萄糖(ACD)，提供檸檬酸溶液，一種抗凝血劑，用于收集紅血細胞，ACD的組成如下檸檬酸三鈉 22.0g檸檬酸 8.0g葡萄糖 24.59使用1000ml蒸餾水。每50.0ml完整的血液，7.5mlACD。它可在4℃時貯存至4周，Webster等，Application of Genetic Engineering to Research on TropicalDisease Pathogens with Special Reference to Plasmodia.A laboratory manual ofselected techniques.S.Panyim，P.Wilairat和Yuthavong，Eds.WHO，Geneva(1985)pp.437.
寄生物血癥，指每100個紅血球中寄生蟲的數(shù)目，表達為10個不同區(qū)域1000個紅血球中寄生蟲的計數(shù)，并取平均值后的寄生百分數(shù)。涂片用吉姆薩(Giemsa)染色。
IC50，指殺死50％寄生蟲的藥物濃度。
血細胞比容，指堆積的紅血球的體積，用％表達。
MIC，提供抑制寄生蟲生長藥物/抑制劑/分子的最小濃度(以摩爾濃度或絕對重量/毫升)。
體外，提供在玻璃容器中做的實驗，在完整的活的有機體或身體之外，所有的組分和條件都要求模擬完整的系統(tǒng)。
體內(nèi)，提供在整個身體/有機體內(nèi)進行的實驗。
放射自顯影通過使照相膠片保持在黑暗中，和被分離的放射性組分的薄層色譜接觸而變黑，檢測放射性化合物，例如合成和薄層色譜分離的放射性標記的脂肪酸，參見F.Turnowsky等，J.Bacteriol.171，6555-6565(1989)。
紅血細胞中瘧原蟲的不同階段瘧疾寄生蟲的生命循環(huán)由二個階段組成1)發(fā)生在人體中的無性階段，2)發(fā)生在蚊子中的有性階段。在無性階段，寄生蟲通過分裂繁殖，一個稱為分裂生殖過程。在人體中，分裂生殖發(fā)生在二個地方，在紅血細胞中(紅細胞分裂生殖)和肝細胞(紅細胞外的分裂生殖)中。無論在紅細胞的還是在紅細胞外的分裂生殖的產(chǎn)物都叫裂殖子。
人類階段當(dāng)人被一只感染的雌性按蚊咬后，人被感染了。存在于蚊子的唾液腺中的孢子體(sporozoites)注入人的血液中。注入后的一個小時內(nèi)，孢子體到達肝，進入肝細胞，這些孢子體進行重復(fù)的核分裂，被稱為裂殖體階段。在5.5到15天間，裂殖體成熟并破裂，釋放出成千的裂殖子，進入血液，感染紅血細胞。寄生蟲在它的紅血細胞生長期間有下列階段。
環(huán)階段在紅細胞內(nèi)，裂殖子聚攏，失去它的內(nèi)部細胞器官。它看起來是一個圓形體，在中心有液泡，細胞質(zhì)被推到外圍，核位于一個極上，用(吉姆薩)Giemsa染色時，環(huán)的細胞質(zhì)染為蘭色，核為紅色，這給出寄生蟲環(huán)型的或圖章戒指的外形。這些幼小的寄生蟲因而被稱為環(huán)形式。
滋養(yǎng)體(原蟲)階段隨著環(huán)的發(fā)展，尺寸增加，形狀上變?yōu)椴灰?guī)則的，表現(xiàn)出變形蟲的運動性。這被叫做變形蟲形式，然后達到一定的發(fā)育階段，開始分裂，叫做滋養(yǎng)體。這些滋養(yǎng)體也含有正鐵血紅素色斑，瘧色斑或瘧原蟲色素。
裂殖體階段從核開始分裂時，紅細胞內(nèi)寄生蟲叫做裂殖體。首先，只有核分裂成易變的大量的小核，細胞質(zhì)保持完整和不分裂，這個階段叫做早期裂殖體。每一個子核被細胞質(zhì)所圍繞時，叫做后期裂殖體。成熟的裂殖體是完全生長形式，其中的可見的10-13個細胞核被細胞質(zhì)所環(huán)繞。成熟的裂殖體破裂釋放裂殖子，進入循環(huán)。成熟裂殖體的破裂也釋放大量的熱原，導(dǎo)致熱病的發(fā)作，是瘧疾的特征。
同步化瘧原蟲falciparum的體外培養(yǎng)通過使用5％的D-山梨醇做為含有后期滋養(yǎng)體和裂殖體的細胞的裂解劑后，從混合階段被同步化(調(diào)整到同一階段)，參見C.Lambros & J.Vanderberg，J.Parasitol 65，418-420(1979)。含有環(huán)和早期滋養(yǎng)體(裂殖子侵入后24小時)的細胞允許同步生長。
主要含有環(huán)的的培養(yǎng)體(7-8％)以1300rpm離心7分鐘，棄上清。5倍體積的5％的D-山梨醇加到堆積的紅細胞中，混合物在室溫下培養(yǎng)5分鐘，然后，在1300rpm離心7分鐘，棄上清，用CRPMI洗掉未感染的紅細胞來制備一50％細胞懸浮液，并且培養(yǎng)物根據(jù)寄生物血癥來稀釋，以保持最初的寄生物血癥為0.5-1％。
在48小時后重復(fù)對培養(yǎng)物的山梨醇處理，以“微調(diào)”同步，這個由環(huán)、滋養(yǎng)體和裂殖體的同步培養(yǎng)物可在山梨酸處理后，分別可在0～18小時，24～36小時和36～45小時收獲。
從寄生的紅細胞中的游離的寄生蟲的分離從培養(yǎng)體來的感染細胞在3000g，4℃離心7分鐘，棄上清，堆積細胞用5～10倍體積的磷酸鹽緩沖液洗四次，在3000g，離心3分鐘。洗過的堆積細胞懸浮在一已知體積的PBS中。為了從感染的紅細胞中釋放分離的寄生蟲，加入等體積的0.15％皂角苷(在PBS中)，懸浮液在37℃培養(yǎng)在振蕩水浴中以15分鐘間歇振蕩以使紅細胞完全裂解。10倍體積冷的PBS加入到培養(yǎng)混合物中，在10,000g旋轉(zhuǎn)10分鐘，棄上清，用PBS充分清洗含有游離寄生蟲的褐色的沉淀顆粒。寄生蟲的沉淀顆?？少A存在-70℃?zhèn)溆?，參見Application of Genetic Engineering toResearch on Tropical Disease Pathogens with Special Reference to Plasmodia；Alaboratory manual of selected techniques；S.Panyim，P Wilairat and Yuthavong，編輯，WHO，Geneva(1985)pp.394所描述的。
ApicoplastApicoplast是一種最近在人類瘧疾寄生蟲和弓漿蟲gondii中描述的細胞器官，參見G.I.Mc Fadden等Nature 381，482(1996)。它是同類的細胞器官質(zhì)體(在藍綠藻類、植物、腰鞭毛蟲等中發(fā)現(xiàn))。推測在上述原生動物寄生蟲中的Apicoplast是由這些3～4層膜包裹的細胞器官引起的一級內(nèi)共生的內(nèi)共生起源的。已經(jīng)證實了這些二級內(nèi)共生失去大部分宿主細胞核的基因。這樣的核編碼基因的產(chǎn)物在瘧原蟲中靶向apicoplast(結(jié)果大多apicoplast蛋白質(zhì)是在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的細胞溶質(zhì)。然后，它們被轉(zhuǎn)運到apicoplast)。在這些寄生蟲中脂肪酸合成體系涉及到了Apicoplast，參見G.I.Mc Fadden等Proc.Natl.Acad.Aci.(USA)95，12352-12357(1998)。此外，這些寄生蟲的Apicoplast中脂肪酸合成體系是細菌體系的reminescent，即它是分離類型。的確，F(xiàn)ab H基因產(chǎn)物，β-酮脂-ACP合成酶III，縮合乙酰-CoA與丙二酸單酰ACP成為乙酰乙酰ACP在瘧疾寄生蟲(瘧原蟲falciparum)及弓漿蟲gondii兩種情況下都已經(jīng)被確認，參見G.I.McFadden等Proc.Natl.Acad.Aci.(USA)95，12352-12357(1998)。
脂肪酸的生物合成脂肪酸是構(gòu)成膜的磷脂和糖脂類的基本單元，限定了細胞和它們的細胞器官的邊界。它們還做為燃料的貯存，并且它們的一些衍生物還作為細胞內(nèi)和細胞之間的信使，及維生素和輔酶的前體物。在脂肪酸合成中，中間體和酰基基團共價地連接到?；d體蛋白質(zhì)(ACP)上。從乙酰CoA中衍生順序增加兩個碳單元以增長生長的脂肪酸鏈，在這里丙二酸單酰ACP是兩個碳單元激活的供體。從乙酰CoA，丙二酸單酰CoA和NADH或NADPH的催化飽和脂肪酸的合成的全部酶被稱為脂肪酸合成酶，參見L.Stryer(1995)inBiochemistry W.H.Freeman and Company，San Francisco，Chapter 24。
在脂肪酸生物合成中涉及的酶在活的體系中被組織成兩個有本質(zhì)不同的方式，參見L.Stryer(1995)in Biochemistry W.H.Freeman and Company，SanFrancisco，Chapter 24和C.O.Rock and J.E.Cronan，Biochim.Biophys.Acta 1302，1-16(1996)。真菌、哺乳動物和一些支原菌通過多功能蛋白質(zhì)完成脂肪酸合成，每一個反應(yīng)都是通過這些巨大的蛋白質(zhì)的一個特定區(qū)域(域)來催化。這類脂肪酸合成酶被分為類型I的脂肪酸合成酶，也可以描述為聯(lián)合類型的脂肪酸合成酶，脂肪酸合成反應(yīng)的連續(xù)步驟發(fā)生在這些域如同一個線上的玻珠一樣是“硬線的”。另一方面，植物和許多細菌利用類型II或分離的脂肪酸合成酶，這是細菌大腸桿菌(Escherichia Coli)很好被標識特征。與哺乳體系單一多功能酶相對比，在E.Coli和植物中脂肪酸合成的每一個個別反應(yīng)是通過分離的從其它蛋白質(zhì)中獨立地純化酶進行的。乙?；鵆oA和丙二酸單?；蛞阴CP和丙二酸單酰ACP在β-酮脂酰ACP合成酶III(FabH)或脂酰丙二酸單酰ACP縮合酶(FabB或FabF)分別催化的縮合反應(yīng)中形成乙酰乙酰ACP。緊跟縮合反應(yīng)的是還原，脫水和由β-酮脂酰ACP還原酶(FabG)，β-羥基乙酰還原酶(FabA或FabZ)和脂烯酰ACP還原酶分別催化的第二個還原反應(yīng)，它們轉(zhuǎn)乙酰乙酰ACP成為丁酰ACP。正在進行循環(huán)的產(chǎn)物末端和丙二酸單酰ACP縮合開始了延長循環(huán)的重復(fù)，導(dǎo)致棕櫚酸ACP的形成，它水解成游離的棕櫚酸。這樣生成的棕櫚酸可通過另一套酶延長或通過另外的途徑形成磷脂，參見L.Stryer(1995)in Biochemistry W.H.Freeman andCompany，San Francisco，Chapter 24。
優(yōu)選實施例的詳細描述本發(fā)明證實二氯苯氧氯酚和其它羥基二苯基醚在體外及體內(nèi)擁有抗瘧疾活性。
A.1.人類瘧疾寄生蟲的培養(yǎng)為檢測羥基二苯基醚的效力，本發(fā)明者提供了培養(yǎng)瘧原蟲falciparum檢驗。這些寄生蟲能夠保存在體外，在CRPMI 1640培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)的人類紅細胞中，如W.Trager和J.B.Jensen，Science 173，673-674(1976)中描述的方法。
2.洗過的紅細胞50％懸浮液的制備正常人類紅細胞[O+類型血液，在檸檬酸、檸檬酸鹽和葡萄糖(ACD)中收集]，以1000g離心10分鐘，除去上清和暗黃色的包被，細胞以等體積的完全RPMI(CRPMI)培養(yǎng)基沖洗兩次，在3000g離心5分鐘，最后在完全培養(yǎng)基中制備了洗過細胞的50％的懸浮液。
有5-6％寄生物血癥的瘧原蟲falciparum培養(yǎng)體用洗過的紅細胞的50％懸浮液和CRPMI稀釋，這樣使起始的寄生物血癥變?yōu)?％，血細胞比容為2％。1.5毫升這種稀釋的感染的細胞懸浮液放在平底小瓶中，保存在帶活塞的干燥器中。點燃一只蠟燭，蓋上打開活塞的干燥器的蓋。蠟燭熄滅后，關(guān)上活塞。這是一個簡單但有效的產(chǎn)生低氧氣(1-5％)和高CO2(7％)氣氛的方法。每天除去上層漂浮物，補充1.25ml CRPMI的細胞以提供新鮮的培養(yǎng)基。當(dāng)寄生物血癥達到6～8％時，每3～4天加入新鮮的紅細胞后使其下降到1％。在培養(yǎng)體中，在任一時刻能夠看到無性循環(huán)的所有階段，因為培體失去了部分在人體中瘧原蟲falciparum同步的特性。帶有兩個染色質(zhì)點的精細環(huán)是平常的。裂殖體或片段表現(xiàn)15～18裂殖子，在人類感染瘧疾的材料中看到了相同數(shù)目。
B.寄生蟲的形態(tài)學(xué)檢查這通過在顯微鏡下觀察油浸中的感染紅細胞的染色涂片來實現(xiàn)?？梢钥吹骄哂刑卣魈匦缘寞懺xfalciparum的下列階段，這些階段如下1.環(huán)它有圖章狀的環(huán)型外觀的特征。核被染為紅色，而細胞質(zhì)為藍色呈現(xiàn)為細環(huán)。
2.滋養(yǎng)體在這個階段，稠密的寄生蟲細胞質(zhì)占據(jù)了大部分的寄主紅血細胞，滋養(yǎng)體有特征的褐色黃的瘧疾色斑和食物液泡。后期的滋養(yǎng)體有3-4個核和未分裂的細胞質(zhì)。
3.裂殖體在寄生蟲的這個階段，大部分紅血細胞被12～13核占據(jù)，每個核都被細胞質(zhì)所環(huán)繞，染色涂片也包含有宿主紅血細胞(RBC)，其不被染色，也沒有核。
瘧原蟲berghei涂片有另外的網(wǎng)狀細胞，瘧原蟲berghei更傾向于侵襲網(wǎng)狀細胞。不同類型的白血細胞比如淋巴細胞、中性粒細胞等也在瘧原蟲berghei的涂片中出現(xiàn)。一般地，它們比紅細胞或網(wǎng)狀細胞大，并在染色后呈現(xiàn)深藍色。
C.測定寄生蟲生長抑制的IC502-羥基二苯基醚(以二氯苯氧氯酚為例)作為體外抗瘧疾藥物的證明是本發(fā)明的一個方面。必需評價這些化合物在體外殺死寄生蟲的能力。藥物的IC50可在有96個孔的滴淀板中測定，參見R.E.Desjardins等，Antimicrob.Agents Chemother.16，710-718(1979)。將二氯苯氧氯酚以適當(dāng)?shù)臐舛热芙庠谶m當(dāng)?shù)娜軇┲?。根?jù)需要在孔中等分有4-7％寄生物血癥和1.5～2％血細胞比容的感染的紅血細胞200μl試樣。具有最高濃度的藥劑用吸液管加到第一個液池中。經(jīng)過板上的一系列雙倍稀釋后，25μl稀釋藥物的溶液被加到其余的需要數(shù)量的孔中。每一濃度在三份孔中試驗。這些板被放在干燥器中，在37℃培養(yǎng)24小時。如果打算在48小時或72小時時研究藥物的效應(yīng)，則在每24小時加入新鮮的培養(yǎng)基和藥劑。
D.同位素的制備和寄生蟲標記攝取[35S]蛋氨酸，NEN，DuPont，(專一的活性1175Ci/mmol)被用作寄生蟲生長的指示。最終加到每一個孔中的同位素濃度是100μCi/ml培養(yǎng)物。總培養(yǎng)期(24、48或72小時)的一小時前，把20μl的在培養(yǎng)基中同位素的加到每個孔中，再培養(yǎng)另外一小時。培養(yǎng)后，孔中的物質(zhì)被吸取到微型離心管中，保存在冰中。樣品在3000g，旋轉(zhuǎn)離心10秒，棄上清，沉淀顆粒用1ml 0.9％的NaCl溶液洗滌二次。沉淀顆粒用50μl蒸餾水裂解，點在Whatman 3號紙盤上(用有冷的蛋氨酸的10％TCA預(yù)浸并干燥)。點板后，這些紙盤被干燥，用熱的TCA、冷的TCA(都是10％)、醇/醚(2∶1，v/v)、及最后用醚處理。在熱TCA處理期間，為漂白的目的將過氧化氫溶液(30％，v/v)加到最后濃度為3％，每一處理期是7分鐘。這些紙盤用醚處理后，空氣干燥，用Wallacβ計數(shù)器(Model 1409，F(xiàn)inland)在Optiphase高安全閃爍流體(Wallac閃烯產(chǎn)品，U.K.)中計數(shù)。
E.體內(nèi)二氯苯氧氯酚的效應(yīng)本發(fā)明還涉及羥基二苯基醚用做體內(nèi)抗瘧疾藥劑。在被瘧原蟲berghei感染的小鼠中監(jiān)控各種濃度二氯苯氧氯酚對于控制寄生物血癥的影響。
1.瘧原蟲berghei感染通過一系列的血液傳遞，瘧原蟲berghei寄生蟲保存在Swiss雄性小鼠中。
2.二氯苯氧氯酚處理用大約106個感染的紅血細胞(IRBC)同一天感染Swiss小鼠(5只/組)。觀察并記錄這些動物的寄生物血癥和死亡率，通過計數(shù)用吉姆薩(Giesma)染色的薄血液涂片中103個紅細胞測定寄生物血癥，并把它表示為每100個紅細胞中寄生的細胞數(shù)目。只給DMSO(dimethylsulfoxide)的動物作為對照，并被當(dāng)作未處理的動物。在用二氯苯氧氯酚處理的第一天寄生物血癥大于1％。寄生物血癥每24小時監(jiān)控一次，連續(xù)7～8天。未處理的動物在感染后8天之內(nèi)死亡，然而在處理過的動物中觀察的延遲的死亡率與劑量有關(guān)。
F.羥基二苯基醚類化合物作為抗瘧疾劑本發(fā)明揭示二氯苯氧氯酚(參見以下結(jié)構(gòu))和其它羥基二苯基醚，這類廣泛應(yīng)用的抗菌劑做為開發(fā)有效的抗瘧疾試劑的主要化合物以及抗瘧疾治療的脂肪酸生物合成過程的靶。
二氯苯氧氯酚另外，F(xiàn)ab I被認定為瘧疾中的酶，二氯苯氧氯酚的靶，一種羥基二苯基醚。間接證據(jù)強力地指出在瘧疾寄生蟲中分立類型脂肪酸合成酶的存在，參見，G.I.McFadden，等，Proc.Natl.Acad.Aci.(USA)95，12352～12357(1998)。所以，提出了在瘧疾寄生蟲及類似的細菌體系中脂肪酸合成的延長循環(huán)由下列方案所示反應(yīng)組成。
它們是β-酮脂酰ACP合成酶III(FabH)催化的縮合反應(yīng)，用還原酶(FabG)把β-酮脂酰ACP還原成β-羥基脂?；鵄CP，它被β-酮脂脫水酶(FabZ)脫水，形成的脂烯酰ACP通過脂烯酰ACP還原酶(FabI)還原。這樣，脂烯酰ACP的每一個延長循環(huán)的終端都加上了兩個亞甲基，即-(CH2)2-。棕櫚酰CH3(CH2)14CS-ACP形成時，這種延長的循環(huán)終止。通過水解酶從棕櫚酰ACP釋放出棕櫚酸CH3(CH2)14COOH。脂肪酸合成酶延長循環(huán)的四個反應(yīng)，它們中的兩個，F(xiàn)abH和FabZ在基因中存在，最近在瘧原蟲falciparum中已被證明。
然而，如同在縮合反應(yīng)和脫氫反應(yīng)中可能涉及的幾個基因產(chǎn)物，F(xiàn)abH和FabZ，盡管對脂肪酸合成是很重要的，但或許并不是必需的，參見C.O.Rock和J.E.Cronan，Biochim.Biophys.Acta 1302，1～16(1996)。
很有說服力地表明在細菌體系中脂烯酰ACP的還原反應(yīng)中涉及一種酶，即FabI基因產(chǎn)物，脂烯酰ACP還原酶。更多地，已經(jīng)建立了在脂肪酸延長的完整循環(huán)中，脂烯酰ACP還原酶，是速率決定因素，參見，R.J.Heath和C.O.Rock，J.Biol.Chem.270，26538-26542(1995)和R.J.Heath和C.O.Rock，J.Biol.Chem.271，1833-1836(1996)。所以，在任何分離脂肪酸合成酶體系中它是一個關(guān)鍵的調(diào)整元素。此外，也表明在E.Coli中二氯苯氧氯酚把FabI做為靶，參見L.M.McMurray等，Nature394，531-532(1998)和R.J.Heath等，J.Biol.Chem.273，30316-30320(1998)。正如瘧疾寄生蟲的脂肪酸合成體系是分離類型的，脂烯酰ACP還原酶的抑制劑證明是有效的抗瘧疾試劑。
2-羥基二苯基醚是一類表現(xiàn)廣譜抗菌活性的化合物，大量的這類化合物廣泛地應(yīng)用在包括對于紡織品處理的消費品中，這些化合物中，二氯苯氧氯酚是最有效的微生物殺菌劑，被應(yīng)用在牙膏、肥皂、除臭劑、漱口劑、皮膚油膏和一定范圍的兒童玩具的塑料中，參見H.N.Bhargava和P.A.Leonard Am.J.Infect.Control.24，209-218(1996)。
然而，本發(fā)明很清楚地表明二氯苯氧氯酚展現(xiàn)了很有效的抗瘧疾活性。
G.二氯苯氧氯酚對瘧疾寄生中脂肪酸合成的抑制在前幾節(jié)中說明了二氯苯氧氯酚很效地抑制人類瘧疾寄生蟲的生長。為了進一步闡明它的作用方式，說明了它對在沒有瘧疾寄生蟲系統(tǒng)細胞中在脂肪酸中，一個脂肪酸合成所需的關(guān)鍵性中間體[14C]丙二酸單酰CoA結(jié)合的影響。參見P.W.Majerus等(1968)，Methods in Enzymol.14，43-52。
這些實驗清楚地表明二氯苯氧氯酚抑制在寄生蟲中沒有脂肪酸合成體系的細胞中的[14C]丙二酸單酰CoA在脂肪酸中的結(jié)合。在二氯苯氧氯酚存在下較長鏈脂肪酸的遞減清楚地表明瘧疾寄生蟲的FabI做為靶，因為它在脂肪酸合成的延長循環(huán)中起一個決定性的作用。本發(fā)明也包含了羥基二苯基醚，如二氯苯氧氯酚或其它這類化合物在將來被開發(fā)用作這個酶的抑制劑起到抗瘧疾劑作用以及影響這個酶活性的其它類分子。
實施例實施例1在體外二氯苯氧氯酚對瘧原蟲falciparum生長的影響在特定階段(即山梨醇處理后獲得的環(huán)(ring)或滋養(yǎng)體)將10％寄生物血癥的200μl瘧原蟲falciparum培養(yǎng)體在96孔微滴淀板中按需要孔數(shù)量等分。在DMSO中制備二氯苯氧氯酚儲備(Stock)溶液，進一步稀釋用DMSO∶甲醇∶水為1∶1∶3組成的溶劑混合物完成，藥物用完全的RPMI進一步稀釋，DMSO的最終濃度是0.005％。這個DMSO濃度對寄生蟲的生長沒有任何抑制作用。10μl的藥物(0.5μg～0.0019μg/200μl培養(yǎng)體)通過一系列的雙倍稀釋加到每一個孔中。滴淀板放在干燥器中，按照J.B.Jensen和W.Trager，Science 173，673-675(1796)的方法在37℃培養(yǎng)。每一個藥物濃度在三個孔中檢驗。對照孔加0.005％DMSO溶劑或不加溶劑，也可以認為是未處理的培養(yǎng)物。培養(yǎng)基每24小時換一次，加入含有藥物的新鮮培養(yǎng)基，檢驗(吉姆薩)Giemsa染色的涂片的寄生物血癥及寄生蟲的形態(tài)學(xué)特征。
實施例2[35S]蛋氨酸攝取的測量，做為寄生蟲生長抑制作用的指示根據(jù)需要數(shù)目的孔在96孔的滴淀板中等分藥物和寄生蟲，如示例1中描述的。在需要收獲時間點(24、48或者72小時)前1小時，將[35S]蛋氨酸(20μCi/孔)加到每一個孔中。每個孔中的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到微型離心管，保存在冰中，以3000g旋轉(zhuǎn)離心10秒鐘。棄上清，感染的紅血細胞(IRBC)沉淀顆粒用0.5ml 0.9％NaCl洗滌四次。洗過的沉淀顆粒用50μl蒸餾水裂解，在3號Whatman紙盤上點板(在有冷蛋氨酸的10％TCA中預(yù)浸，干燥)。干燥后，這些紙盤用熱的TCA、熱的有3％用來漂白的過氧化氫的TCA、冷的TCA、醇∶醚(2∶1，V/V)，及最后是醚來處理(按此順序)，每次7分鐘。在醚處理后，紙盤被干燥，放在來自Wallac閃爍流體相III中用Wallacβ計數(shù)器計數(shù)。
實施例3在體內(nèi)二氯苯氧氯酚配給后，小鼠的抗瘧疾保護用瘧原蟲berghei感染雄性Swiss小鼠。這些動物被置于觀察之下，每天記錄寄生物血癥。在DMSO中的二氯苯氧氯酚(分別是0.8、1.6、3.0、8.0、14.0和28.0mg/kg小鼠體重)，在寄生物血癥大于1％被感染的第一天及隨后的6天被皮下注射。用一組五個動物進行二氯苯氧氯酚實驗，每一個用以上提到的劑量。DMSO被用于對照動物組(6)并被作為未處理的動物參考。記錄寄生物血癥和死亡率直到未處理的小鼠死亡。典型地在對照組內(nèi)的全部6只小鼠在感染的9天內(nèi)死亡，而用0.8、1.6、3.0mg二氯苯氧氯酚/kg(體重)處理的5只中的3、3和4只小鼠生存至14天。而用8.0、14.0和28.0mg二氯苯氧氯酚/kg(體重)處理時，所有的小鼠(5只中的5只)在14天時都存活。
實施例4在體外脂肪酸中[14C]丙二酸單酰CoA的結(jié)合和二氯苯氧氯酚對它的抑制作用在后環(huán)(ring)階段通過在3000g離心5分鐘收獲呈現(xiàn)10-12％寄生物血癥的瘧原蟲falciparum的同步培養(yǎng)物。沉淀顆粒用冷的磷酸鹽緩沖液洗滌四到五次。洗滌后，沉淀顆粒懸浮在3ml磷酸鹽緩沖液中，加入等體積的0.15％的皂代苷分離游離的寄生蟲。(參見特定的具體體現(xiàn))。這樣分離的后ring階段(滋養(yǎng)體)的寄生蟲用PBS充分洗滌一次，細胞懸浮在0.4ml 1mM磷酸鉀緩沖液中(pH7.0)，聲波降解15秒。這樣制備的溶解細胞與含有70μM乙酰基CoA、8mM葡萄糖-6-磷酸、3mMNADH和NADPH、0.4mM EDTA、4單位葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、45μM[14C]丙二酸單酰CoA(專一活性54.2mCi/mmol，DuPont)和3mM二硫代蘇糖醇(DTT)的200μl200mM的磷酸鉀緩沖溶pH7.0混合。加入來自E.Coli(Sigma)的200μg DTT還原?；d體蛋白(ACP)的25μl 75mM的磷酸緩沖溶液。反應(yīng)混合物在37℃培養(yǎng)30分鐘，在相同條件下在加入還原ACP溶液前加入0.15、0.225、0.3、0.6、1.2μg的二氯苯氧氯酚至反應(yīng)混合物進行反應(yīng)。5ml 4M HCl加入到反應(yīng)混合物，樣試在100℃培養(yǎng)2小時，用氯仿萃取得到的游離的脂肪酸，溶劑蒸發(fā)后，殘余物溶解在醚中，在4℃用重氮甲烷在醚中甲基化。蒸發(fā)醚，甲基醚溶解在75μl甲醇中，25μl的試樣在硅烷化的硅酸鹽薄層板(E.Merck.AG，Germany)上點板，混合物用丙酮∶甲醇∶水∶乙酸(70∶50∶35∶1，v/v/v/v)色層分離。用放射自顯影觀看空氣干燥的板。在二氯苯氧氯酚存在和不存在的情況下，用閃爍計數(shù)測定25μl甲醇中的樣品中[14C]丙二酸單酰CoA在脂肪酸中的結(jié)合程度。
這些實驗表明二氯苯氧氯酚不僅抑制[14C]丙二酸單酰CoA在脂肪酸中的結(jié)合，還以一個顯著的方式把脂肪酸合成的延長反應(yīng)做為靶。
權(quán)利要求
1.羥基二苯基醚類化合物(以二氯苯氧氯酚為示例)和藥理上可以接受的衍生物，在體內(nèi)和體外抑制人類瘧疾寄生蟲的生長(Plasmodium Falciparum)中的用途。
2.通過檢測后證實在使用了羥基二苯基醚類化合物后人體的瘧疾寄生蟲確被抑制的檢測方法如下a)將對寄生蟲的體外培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)特征的涂片檢驗作為其生長的指示標志；或b)將監(jiān)控蛋白質(zhì)中的[35S]蛋氨酸的結(jié)合作為抑制寄生蟲生長的定量指標。
3.一種含有羥基二苯基醚類化合物(以二氯苯氧氯酚為示例)或其藥學(xué)上可接收的衍生物，及藥學(xué)上可接收的佐藥，稀釋劑或載體的組成的合成物，該合成物適合用任何方法引入血內(nèi)。
4.權(quán)利要求3的權(quán)利要求中的合成物，用于一動物模型，如被P.Berghei感染的小鼠中抑制寄生蟲生長的用途。
5.一種確定通過如權(quán)利要求4所述的注射后動物寄生蟲的生長被抑制的方法，包括a)通過檢驗從動物體內(nèi)取出的血的涂片來監(jiān)控對于寄生物血癥抑制的程度；或b)測定經(jīng)處理的小鼠對未經(jīng)處理小鼠的死亡率的降低。
6.一種確定任何化合物抑制在瘧疾寄生蟲中脂肪酸合成的延長的方法，是通過估測在脂肪酸中結(jié)合的放射標記的丙二酸單酰CoA的量，或通過使用層析法來分析所合成脂肪酸的類型來證實在沒有脂肪酸合成系統(tǒng)的瘧疾寄生蟲的細胞中脂肪酸合成。
7.一種抑制瘧疾寄生蟲脂肪酸合成的延長反應(yīng)的方法，包括羥基二苯基醚與所說的寄生蟲、培養(yǎng)物、動物模型的培養(yǎng)中，或在來源于任何種類瘧疾寄生蟲沒有脂肪酸合成系統(tǒng)的的細胞中，或包含F(xiàn)abII酶的瘧疾寄生蟲制備作為測試系統(tǒng)中。
8.如權(quán)利要求6或7權(quán)利要求的方法中，其中的樣品是來源于人或動物的瘧疾寄生蟲。
9.通過任何注射途徑—肌肉、皮內(nèi)、腹膜、靜脈、動脈或皮下注射在體內(nèi)通過羥二苯基醚抑制瘧疾寄生蟲的生長的任何應(yīng)用。
10.使用上述方法抑制瘧疾寄生蟲脂肪酸的延伸的任何其它種類的化合物。
全文摘要
我們報道了以二氯苯氧氯酚[2，4，4″－三氯－2′－羥基二苯基醚]作為示例的羥基二苯基醚類化學(xué)試劑作為治療及瘧疾治療療法應(yīng)用的用途。更特別之處在于，本發(fā)明是關(guān)于脂肪酸合成作為這種化合物靶的確認，同時也涉及參與合成脂肪酸的一種關(guān)鍵性酶的確認。
文檔編號A61K35/00GK1630525SQ99810238
公開日2005年6月22日 申請日期1999年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月23日
發(fā)明者蘇羅拉·南米塔 申請人:蘇羅拉·南米塔, 賈瓦哈拉爾尼赫魯高級科學(xué)研究中心