專利名稱：抗肥胖和降低內(nèi)臟脂肪蓄積的物質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在以脂肪酸和丙酮酸為基質(zhì)的能量代謝(呼吸)細(xì)胞中小器官的線粒體(以下記作MC)功能中，能使脫共軛蛋白(UCP)產(chǎn)生的脫共軛呼吸乃至MC內(nèi)膜的質(zhì)子泄漏(Proton leak，以下統(tǒng)稱為質(zhì)子泄漏)出現(xiàn)特異亢進(jìn)作用的新物質(zhì)；更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及含有共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì)，具有使包括人在內(nèi)哺乳動(dòng)物等的MC的質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用的新物質(zhì)，以及涉及作為有效成份含有該物質(zhì)的抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積，以下簡稱為內(nèi)臟脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)(以下簡稱為內(nèi)臟)脂肪蓄積用降脂肪劑，作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪蓄積)和減少脂肪蓄積功能的食品，作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪蓄積)和減少脂肪蓄積功能的飼料等用途。
生物體的能量代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，由攝食調(diào)節(jié)系統(tǒng)和能量消耗系統(tǒng)組成。本發(fā)明目的在于通過控制能量調(diào)節(jié)系統(tǒng)，抑制視為生活習(xí)慣病等發(fā)病多重危險(xiǎn)因子的內(nèi)臟脂肪的蓄積并使其減少。
能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以分為維持生命中基礎(chǔ)代謝所需能量消耗及其外的能量消耗。屬于后者范疇的主要有非寒栗熱產(chǎn)生(nonshivering thermogenesis，以下間記作nST)，關(guān)于該功能的作用可以舉出出生、暴露在寒冷中、冬眠醒來時(shí)等等以維持體溫，以及防止因消耗攝取的過量能量而導(dǎo)致肥胖和糖脂代謝障礙等。在nST產(chǎn)生的作用中，主要是線粒體(MC)的共軛呼吸乃至MC內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏，即與細(xì)胞的呼吸鏈和ATP的合成有關(guān)，其詳細(xì)情況如下。ATP是維持細(xì)胞功能所必須的，細(xì)胞向細(xì)胞內(nèi)的MC輸送脂肪酸和細(xì)胞質(zhì)分解糖系統(tǒng)中生成的丙酮酸，在其中氧化產(chǎn)生?；o酶A。這種?；o酶A在檸檬酸回路中被氧化，該氧化過程中生成二氧化碳和NADH，再由NADH產(chǎn)生高能電子。高能電子在MC內(nèi)膜的呼吸鏈(電子傳遞系統(tǒng))中與分子氧結(jié)合放出能量。該能量使質(zhì)子通過MC內(nèi)膜并由基質(zhì)吸到膜間部分。
結(jié)果內(nèi)膜兩側(cè)形成質(zhì)子電化學(xué)梯度。膜間部分的質(zhì)子遵循該梯度返回基質(zhì)時(shí)，使與膜結(jié)合的ATP合成酶起作用，由ATP+Pi生成ADP。
生物體為使ATP與ADP之比保持一定，將配合生物體狀態(tài)調(diào)節(jié)呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)的速度。ATP消耗一旦增加，就會(huì)使電子傳遞速度加快，因而必須供給質(zhì)子。激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，脂肪和糖以休息時(shí)5～10倍的速度氧化。
脂溶性弱酸2,4-二硝基酚(2,4-DNP)以質(zhì)子離子載體形式起作用，MC內(nèi)膜中除ATP合成酶之外，由于形成一種能質(zhì)子通過內(nèi)膜流過的路徑，所以使內(nèi)膜呼吸鏈中產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度消失，不能合成ATP。也就是說，2,4-DNP使呼吸鏈的電子傳遞系統(tǒng)與ATP的合成脫共軛，因而有脫共軛劑作用。因不能合成ATP，所以呼吸鏈中電子傳遞速度處于允許基質(zhì)供給的最大速度下(參見細(xì)田等，Mebio,14(11),30-31(1997))。
褐色脂肪組織(BAT)中存在由大約300個(gè)氨基酸組成的、分子量32kD的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)是能使該褐色脂肪細(xì)胞(BA)的MC內(nèi)的呼吸鏈電子傳遞體系與ATP合成脫共軛的特異蛋白質(zhì)，即脫共軛蛋白質(zhì)-1(UCP-1)。UCP-1是由大約100個(gè)氨基酸形成的區(qū)域重復(fù)三次而成，而且每個(gè)區(qū)域上各有兩處，共有六處膜貫通部位。
這些膜貫通部位形成通道。UCP-1是輸送質(zhì)子的載體，質(zhì)子沿著該質(zhì)子通道，按照電化學(xué)梯度自由透過，據(jù)發(fā)現(xiàn)有放出熱量的功能。這形成nST。ATP的合成因脫共軛作用而減少，MC內(nèi)的呼吸為維持ATP與ADP之比一定而變得活潑，結(jié)果大量脂肪和糖被氧化而發(fā)熱。
UCP-1功能的調(diào)節(jié)，由其出現(xiàn)的數(shù)量和活性兩方面進(jìn)行。也就是說，由交感神經(jīng)末端分泌出來的去甲腎上腺素，通過細(xì)胞膜上的β腎上腺素受體(β-AR)使腺苷酸環(huán)化酶活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度上升。
cAMP經(jīng)蛋白激酶A(PKA)活化、激素敏感脂肪酶(HSL)活化而分解中性脂肪，生成脂肪酸(FFA)。這種FFA與UCP-1結(jié)合使關(guān)閉的質(zhì)子通道打開，同時(shí)起生熱基質(zhì)的作用。另一方面，UCP-1的出現(xiàn)量主要由核內(nèi)基因的復(fù)制水平調(diào)節(jié)，UCP-1基因的出現(xiàn)隨cAMP濃度上升而增加(齋藤等人，最新醫(yī)學(xué)52,1095-1096(1997))。
UCP-1的生理意義，主要是出生或暴露在寒冷環(huán)境中時(shí)保持體溫，此外用試驗(yàn)鼠(trans genic mouse)研究說明，與防止肥胖也有關(guān)系。UCP-1與肥胖的產(chǎn)生、發(fā)展和維持之間的關(guān)系表明，各種肥胖模型中均出現(xiàn)UCP-1的降低。此外還證明，BAT減少導(dǎo)致試驗(yàn)鼠無過食性肥胖發(fā)生(Lowell BB等人，Nature366,740-742(1993))。另一方面，大量發(fā)現(xiàn)UCP-1時(shí)體脂肪減少的現(xiàn)象，利用使UCP-1強(qiáng)制出現(xiàn)的這種試驗(yàn)鼠證明，UCP基因被結(jié)合到脂肪細(xì)胞的特異基因aP2的啟動(dòng)子之中(Kopecky J.等人，J.Clin.Invest.96,2914-2923(1995))。
然而也有人認(rèn)為，成年人中存在的BAT量極少，因而難于考慮BAT特異UCP-1的生理意義。
另外，還有人(河田照雄、私信)支持此論點(diǎn)，他們認(rèn)為這種BAT的生理意義不僅對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，即使對人也適用，其論點(diǎn)有(1)可以測定UCP量，自新生兒(一日)到老人(86歲)體內(nèi)的BAT測定后發(fā)現(xiàn)，其腎臟周圍和腋下均存在該物質(zhì)。(2)15歲以下小孩體內(nèi)存在量多，成人體內(nèi)約存在50克，其活性降低可以使體重在一年中增加25公斤。(3)成年犬體內(nèi)的BAT，與成年人一樣因被白細(xì)胞化而不能檢出，但是一旦投藥β-3腎上腺素受體作用藥，未成熟或脫分化的褐色脂肪細(xì)胞就會(huì)活化，以分化的BA形式出現(xiàn)UCP及其基因mRNA。據(jù)說細(xì)胞內(nèi)能量消耗大約有20～40％發(fā)生在MC內(nèi)膜的質(zhì)子泄漏上。而且，在只有少量BAT的成人及其他動(dòng)物中，大部分nST是由骨骼肌和白色脂肪組織(WAT)產(chǎn)生的。由以上得出，UCP存在于BAT以外的組織中。1997年兩個(gè)小組依次報(bào)導(dǎo)了UCP-2的cDNA克隆(Fleury C.等人，NatureGenet.15,269-272(1997)；Gimeno R.等人，Diabetes 46,900-906(1997))。人體的UCP-2與人體的UCP-1表現(xiàn)有59％的同源性，與UCP-1同樣在其中有六處膜貫通部位，而且具有嘌呤核苷結(jié)合部位。UCP-2與UCP-1不同，能在全身組織中發(fā)現(xiàn)，肺臟、胰臟中濃度特別高，此外在心臟、肝臟、腦、腎臟、精巢、WAT、BAT中都能檢出。而且高脂肪進(jìn)食的試驗(yàn)鼠體內(nèi)的副睪周圍脂肪組織中也發(fā)現(xiàn)了UCP-2基因。
盡管骨骼肌是nST的主要組織，但是在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的UCP-2基因濃度卻比WAT中的高，因而可以推定UCP-2以外的UCP在骨骼肌中存在的濃度較低。骨骼肌中的這種新的UCP，首先是從大白鼠體內(nèi)分離出來的，鑒定證明由308個(gè)氨基酸組成，大白鼠體內(nèi)UCP-1和UCP-2的同源性，分別為57％和72％。而且在大白鼠組織中檢出的基因量，骨骼肌中濃度特別高，BAT中等，WAT和心臟濃度較低(Matsuda J.等人提供)。
據(jù)另外兩個(gè)小組報(bào)告，在人骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了高濃度UCP-3的cDNA克隆(Boss O.等人，F(xiàn)EBS Lett.408,39-42(1997)；Vidal-Puig A等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.235,79-82(1997))。上述大白鼠體內(nèi)的新穎UCP顯示出87％的同源性(細(xì)田等，Mebio,14(11),30-34(1997))。
鑒于在作為nST主要組織形式的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了新的、與已有不同的UCP基因，因而促進(jìn)了各種脫共軛蛋白的分離和鑒定及其功能評價(jià)，同時(shí)也促進(jìn)了對發(fā)現(xiàn)其亢進(jìn)方法的檢索，可以預(yù)期這將能夠在人類抗肥胖方面創(chuàng)造出劃時(shí)代的重要技術(shù)成就。
生物體內(nèi)多余的能量，首先以內(nèi)臟脂肪(特別是腸道粘膜脂肪)形式優(yōu)先蓄積，這種內(nèi)臟脂肪與其他部位的脂肪(特別是皮下脂肪)相比，容易受到脂肪動(dòng)員而被迅速分解消耗。這種內(nèi)臟脂肪(肥胖)被視為生活習(xí)慣病(成人病)發(fā)病的多重危險(xiǎn)因子，其理由是由WAT的白色脂肪細(xì)胞(WA)分泌出的脂肪酸，經(jīng)由門脈直接流入肝臟，使胰島素抗性和脂肪合成亢進(jìn)，結(jié)果導(dǎo)致耐糖性能異常，招致身患高血壓癥和高血脂癥，這些癥狀最終合并成動(dòng)脈硬化癥。
綜上所述，人們正期待著開發(fā)出抑制和降低內(nèi)臟脂肪蓄積，預(yù)防成人身患生活習(xí)慣病并在其治療上具有重大貢獻(xiàn)的物質(zhì)。
本發(fā)明提供一種具有抗肥胖和降低內(nèi)臟脂肪蓄積作用的物質(zhì)及其用途。
本發(fā)明涉及含有共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì)，其中含有能使包括人在內(nèi)哺乳動(dòng)物及鳥類的產(chǎn)生非寒栗熱(nonshivering thermogenesis)的主要組織的骨骼肌、白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Proton leak)產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用的共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸及其衍生物的物質(zhì)，作為有效成份含有上述物質(zhì)的抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪的蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積的降脂肪劑，作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪的蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積功能的食品，以及作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪的蓄積)和降低內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積功能的飼料。
本發(fā)明得到的上述物質(zhì)，對于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物及鳥類生物組織中的細(xì)胞內(nèi)、作為nST主要組織的骨骼肌、WAT及BAT等，例如含有BA、線粒體的細(xì)胞及WA等的MC的脫共軛呼吸乃至MC內(nèi)膜的質(zhì)子泄漏具有特異亢進(jìn)作用。
為了使引起成人生活習(xí)慣病(成人病)患病的多重危險(xiǎn)因子，即內(nèi)臟脂肪(特別是腸道粘膜脂肪)蓄積得到抑制和減少，基本上依賴于促進(jìn)生物體中能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)內(nèi)的nST(非寒栗熱產(chǎn)生)。本發(fā)明中，除了以前作為nST組織在相對較小的BAT內(nèi)MC的質(zhì)子泄漏亢進(jìn)之外，最近剛剛在基因水平確認(rèn)在視為主要nST組織的骨骼肌和WAT中發(fā)現(xiàn)了高濃度UCP小類，即UCP-3和UCP-2，并創(chuàng)造了使其功能亢進(jìn)的手段，因此可以預(yù)期能使其效率飛速提高。
本發(fā)明的主要課題是，著眼于在BAT中找到全部UCP小類mRNA，并用共軛異構(gòu)魚油使BAT內(nèi)UCP出現(xiàn)亢進(jìn)，重新導(dǎo)入U(xiǎn)CP小類中的各mRNA分析樣品，取出用共軛異構(gòu)魚油飼養(yǎng)的大白鼠的BAT，檢索整個(gè)小類的mRNA。
也就是說，本發(fā)明課題在于提供一種含有屬于能夠使包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物生物體內(nèi)能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要系統(tǒng)的作為nST主要組織的骨骼肌及WAT、組織量雖小但單位功能極大的BAT、各MC的質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特應(yīng)性亢進(jìn)，具有促進(jìn)nST功能的共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì)，作為有效成份含有該物質(zhì)的抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪蓄積)和內(nèi)臟脂肪蓄積降低劑，以及包含作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖和減少內(nèi)臟脂肪蓄積功能的特定保健食品(功能食品)的一般加工食品，和賦予該抗肥胖和減少內(nèi)臟脂肪蓄積功能的飼料。
本發(fā)明人等以解決上述課題為目的進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用以下事項(xiàng)能夠解決上述課題，因而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明以以下事項(xiàng)作為其基本構(gòu)成。(1)一種含有共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì)，其中含有能使包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物及鳥類的非寒栗熱產(chǎn)生(nonshivering thermogenesis；nST)主要組織、骨骼肌、白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Proton leak)產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用的共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸及其衍生物的物質(zhì)。(2)具有上述作用的成份是共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸(HUFA)類的上述(1)記載的物質(zhì)。(3)具有上述作用的成份是HUFA衍生物的氧化產(chǎn)物的呋喃HUFA衍生物的上述(1)記載的物質(zhì)。(4)能使作為主要nST組織的骨骼肌、白色脂肪組織、褐色脂肪組織等的含線粒體的細(xì)胞有特異作用，使該細(xì)胞中脫共軛蛋白同族體(UCPhomologue)的出現(xiàn)量產(chǎn)生顯著增大作用的上述(1)、(2)或(3)中記載的物質(zhì)。(5)作為有效成份，含有上述(1)、(2)或(3)記載的作為nST的主要組織的骨骼肌、WAT、BAT等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Proton leak)具有特異亢進(jìn)作用的物質(zhì)的抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積的降脂肪劑。(6)作為有效成份，含有上述(1)、(2)或(3)記載的作為nST主要組織的骨骼肌、WAT、BAT等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Proton leak)具有特異亢進(jìn)作用的物質(zhì)的賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積功能的食品。(7)作為有效成份，含有上述(1)、(2)或(3)記載的作為nST主要組織的骨骼肌、WAT、BAT等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Proton leak)具有特異亢進(jìn)作用的物質(zhì)的賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積功能的飼料。
以下對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明。
本發(fā)明的使NST組織的MC的質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特異性亢進(jìn)作用的物質(zhì)，是含有共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸和/或其衍生物的物質(zhì)。
本發(fā)明中所說的物質(zhì)，并不限于含有這些物質(zhì)的適當(dāng)?shù)呐浜衔?、組合物、混合物等，也可以是這些成份本身。
本發(fā)明的上述物質(zhì)，只要是具有與共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類同樣功能的，并不限于合成品，也可以是由自然界提取出來的共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類的濃縮物、提取物、精制品、分離產(chǎn)物和加工品等。
具體講，例如可以舉出來源于自然界的三價(jià)以上的高度不飽和脂肪酸(HUFA)及衍生物、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、雙高-γ-亞麻酸、花生油烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等高度不飽和脂肪酸及混合物，至少有一個(gè)?；鳛镠UFA及其混合物殘基的三?；视汀⒍；视图耙货；视图捌浠旌衔?，至少有一個(gè)?；鳛镠UFA及其混合物殘基的甘油類脂化合物，例如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺類、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇類、磷脂酰甘油類、心磷脂、磷脂酸、雙磷脂酸、焦磷脂酸、乙醇胺縮醛磷脂等類脂化合物型磷類脂化合物，溶血卵磷脂、溶血酰乙醇胺等溶血型磷類脂化合物，以及髓磷脂、神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺等神經(jīng)類脂化合物等及其混合物，鈉、鉀、鈣等安全的HUFA及其混合物的酯類和葡萄糖等單糖類、蔗糖等雙糖類及木糖醇等低聚糖等安全的HUFA及其混合物的酯類等，經(jīng)過適當(dāng)手段將其共軛異構(gòu)化的物質(zhì)和預(yù)期具有相同效果的物質(zhì)。
本發(fā)明中所說的共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類，具體是指例如共軛化HUFA和/或其混合脂肪酸，HUFA及其混合物結(jié)合型共軛化三酰基甘油，例如共軛化魚油、共軛化亞麻子油，1-和/或3-共軛化HUFA及其混合物結(jié)合型二酰基甘油，1-和/或2-共軛化HUFA及其混合物結(jié)合型二?；视?，1-和/或2-共軛化HUFA及其混合物結(jié)合型一酰基甘油，1-和/或2-共軛化HUFA及其混合物結(jié)合型甘油磷脂，例如、1-和/或2-共軛化HUFA及其混合物結(jié)合型卵磷脂等、共軛化HUFA及其混合物置換型溶血卵磷脂等、共軛化HUFA及其混合物的鈉鹽等、共軛化HUFA及其混合物的乙基酯類等以及共軛化HUFA及其混合物的蔗糖酯類等。
作為本發(fā)明上述物質(zhì)的原料，雖然可以舉出天然油脂，尤其是自然界存在的高度不飽和油脂，例如魚油等水產(chǎn)油脂，以及亞麻子油、紫蘇子油等天然植物油脂，大麻子油、亞麻子油、白蘇子油、菜籽油、奧提西卡油、核桃油、芥子油、石榴籽油、豆油、日本泡桐油、月見草籽油、橡膠核油、酸橙籽油、油菜籽油、亞麻子油、妥爾油、ほぅせんか油、沙丁魚油、鰻魚油、鰹魚油、大馬哈魚油、鯖魚油、秋刀魚油、青魚油、鲺魚油、竹莢魚油、金槍魚油、大馬哈魚油、大馬哈魚子油、鯡魚油、ジヤツクマツカレル油、鯊魚肝油、墨魚肝油、沙丁魚肝油、箭魚肝油、鰹魚肝油、明太魚肝油、鱈魚肝油、鲺魚肝油、金槍魚肝油、海豹油、海驢油、各種鯨魚油等，但是并不特別限于這些，只要是與這些同等或類似的，不限種類都可以適用。
使上述原料共軛異構(gòu)化的方法，可以舉出例如化學(xué)處理法、腔腸細(xì)菌發(fā)酵法、動(dòng)物腸內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵法、脫氫酶處理法和金屬觸媒法，例如在苛性鈉或苛性鉀存在下加熱法可以得到共軛化的HUFA及其鉀鹽，叔丁醇鈉或鉀鹽存在下加熱法可以得到該HUFA甘油酯類的共軛異構(gòu)體，利用反芻動(dòng)物的腔腸細(xì)菌，例如Butyrivibrio fibrisolvens和其他動(dòng)物無害腸道細(xì)菌使HUFA及其衍生物的共軛異構(gòu)化法，利用酶反應(yīng)、生物體反應(yīng)、細(xì)胞功能、基因功能等生物化學(xué)反應(yīng)的共軛異構(gòu)化法，以容易形成氫化物的鈀、鈦、鋯、鎂及其合金、Mg2Ni、LaNi5、TIFe等作為觸媒的熱處理法等，但是并不限于這些，只要是能有效實(shí)現(xiàn)共軛異構(gòu)化的方法，不論其種類如何都可以利用。
此外，本發(fā)明中有關(guān)共軛異構(gòu)體的定量測定，由于在該HUFA衍生物的共軛異構(gòu)體中，存在雙鍵位置異構(gòu)體及其各種立體異構(gòu)體(順式和反式異構(gòu)體)，確定其特定結(jié)構(gòu)及其生成量及其困難，所以決定定量測定其全部共軛雙鍵。
本發(fā)明中所說的共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類的衍生物，只要具有與上述高度不飽和脂肪酸類同樣功能的衍生物，不論是合成品還是天然品都可以使用。具體講，例如多元不飽和脂肪酸、共軛亞油酸及其混合物(以下簡記作CLA)、鈉鹽等鹽類、乙基酯等酯類、至少一個(gè)?；荂LA殘基的三酰基甘油類、同樣的二?；视皖悺⑼瑯拥囊货；视皖惣捌浠旌衔?、至少一個(gè)?；荂LA殘基的甘油磷脂及其混合物、以及上述共軛異構(gòu)化的HUFA及其混合物的衍生物，例如游離酸、鹽類、酯類、?；视皖惣捌浠旌衔?、甘油磷脂及其混合物等生物體內(nèi)及外因性氧化生成物的呋喃衍生物。例如，北海道產(chǎn)秋季大馬哈魚新鮮精巢中的內(nèi)因性呋喃衍生物，如表6中所示是六種異構(gòu)體的混合物，而且結(jié)構(gòu)最簡單的共軛脂肪酸的CLA被自氧化而成的外因性呋喃酸，也是包含與表6類似的數(shù)種異構(gòu)體(M.P.Yurawecz等人，Lipid,30,(7),595-598(1995))的物質(zhì)。
對共軛化的HUFA而言，已知有抗氧化功能，容易被氧化成呋喃衍生物，呋喃脂肪酸在包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物和魚類、植物體內(nèi)廣泛分布(M.P.Yurawecz等人，Lipids,30,(7),595-598(1995))。經(jīng)確認(rèn)，特別在魚類體內(nèi)存在的呋喃脂肪酸隨季節(jié)變化，而且在其肝臟和精巢類脂化合物中含量極高，約占全部脂類化合物的一半以上。此外，給大白鼠投藥后，呋喃脂肪酸經(jīng)確認(rèn)被小腸吸收進(jìn)入血液之中(D.M.Sand等人，Biochim.Biophys.Acta751,455-461(1983))。魚類精巢中的呋喃脂肪酸，在雌性產(chǎn)卵期前其含量達(dá)到最大，以后迅速消失(D.M.Sand等人，Biochim.Biophys.Acta793,429-434(1984))。關(guān)于該呋喃脂肪酸的生理作用，有人報(bào)告說，過氧化物能防止細(xì)胞損傷(M.P.Yurawecz等人，INFORM,7(2),156(1996))。
細(xì)菌的尿素酶(Urease)對呋喃脂肪酸的自氧化產(chǎn)物有阻礙作用(G.Rosenblat等人，J.Am.Oil.Chem.Soc.70,501-505(1993))，而且對脂氧合酶-1(Lipoxygenase-1)的氧化產(chǎn)物顯示生理作用(R.F.Boyer.等人，Chem.Phys.Lipids,25,237-246(1979))。
本發(fā)明的上述物質(zhì)由于可以作為例如醫(yī)藥品、食品、飼料等的有效成份使用，所以可以根據(jù)其用途精制到適當(dāng)水平。特別是對于特定保健食品(功能食品)等加工品而言，可以適用比較精制的原料，而對于用作飼料的場合下，原材料天然油脂，例如由沙丁魚油、亞麻子油、白菜籽油、菜籽油、鯡魚油、墨魚肝油、鰹魚肝油等，可以在粗制品水平下使用。
本發(fā)明的上述物質(zhì)，是含有上述共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類的物質(zhì)，例如可以是共軛化鰹魚油、共軛化金槍魚油、共軛化大馬哈魚卵油、共軛化亞麻子油、共軛化日本泡桐油、共軛化豆油、共軛化白菜籽油等，但是對于本身不是食用油脂的，以及與食用油脂有別的，例如棕櫚油、椰子油、豬油、牛油等一般食用油脂的作用，尚未被承認(rèn)。
本發(fā)明中為了闡明上述有效成份的有用性，如下文記載的實(shí)施例具體所示，病態(tài)試驗(yàn)鼠體內(nèi)給藥的共軛異構(gòu)化魚油，是共軛異構(gòu)化DHA結(jié)合型魚油，所以對各試驗(yàn)動(dòng)物給予作為典型ω-3HUFA的DHA共軛異構(gòu)體的典型氧化產(chǎn)物的呋喃酸結(jié)合型特殊魚油，然后測定了內(nèi)臟脂肪量和UCP以及UCPmRNA。
其結(jié)果，在對照豬油區(qū)(必須進(jìn)行脂肪酸強(qiáng)化)中，在顯著性水準(zhǔn)下，BAT的UCP的表達(dá)量多而且內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪量少，是糠基化油脂(含有呋喃脂肪酸)和共軛異構(gòu)型DHA結(jié)合中性油脂。
此外，對病態(tài)試驗(yàn)鼠投藥共軛異構(gòu)魚油后，在其BAT中發(fā)現(xiàn)的UCP小類mRNA濃度(在對照豬油區(qū))，UCP-2濃度高，但UCP-1和UCP-3的濃度低；若從主要nST組織中各mRNA一般的表達(dá)圖案的骨骼肌(3型濃度高，2型濃度中等，1型未發(fā)現(xiàn))、WAT(2型濃度較高，3型濃度較低，1型未發(fā)現(xiàn))和BAT(1型濃度高，2型和3型濃度低)考慮，則投予本發(fā)明有效成份的試驗(yàn)鼠體內(nèi)nST組織中發(fā)現(xiàn)UCP小類的mRNA濃度，可以推定在BAT中UCP-2濃度高，在WAT中UCP-2濃度高，而在骨骼肌中UCP-3濃度高。不用說給予共軛異構(gòu)化DHA結(jié)合魚油的試驗(yàn)鼠內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪，就連體重都有顯著性降低。此結(jié)果強(qiáng)烈暗示著上述推定是正確的。
為了使nST組織內(nèi)細(xì)胞的MC中的脂肪和糖燃燒，UCP族的表達(dá)是不可缺少的，本發(fā)明的有效成份，如上所述，由于具有能夠使該組織細(xì)胞內(nèi)的UCP族的量顯著增大的作用，所以從分子水平的觀點(diǎn)來看，可以證明能有效抑制內(nèi)臟脂肪蓄積和減少內(nèi)臟脂肪蓄積。
本發(fā)明的上述有效成份，對于包括人在內(nèi)哺乳動(dòng)物而言，能夠使與其nST有關(guān)的骨骼肌等非寒栗熱產(chǎn)生組織細(xì)胞中MC的內(nèi)膜貫通型蛋白的UCP同族體表達(dá)量顯著增大，具有使上述細(xì)胞中MC的質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特應(yīng)性亢進(jìn)的作用。本發(fā)明的上述物質(zhì)，是由天然脂肪中得到的、作為HUFA共軛異構(gòu)體及其氧化生成物的呋喃酸及其衍生物，如上所述，能使骨骼肌等nST組織細(xì)胞中UCP同族體表達(dá)量顯著增大的高濃度UCP表達(dá)物質(zhì)，可以以其表達(dá)活性為指標(biāo)進(jìn)行鑒定、分離和精制。
以本發(fā)明的上述成份作為有效成份，可以制備對于抗肥胖具有特別顯著效果的內(nèi)臟脂肪蓄積降低和內(nèi)臟脂肪蓄積抑制劑。作為所說的降脂肪劑和抑制劑的載體，根據(jù)其使用方式的不同，可以使用適當(dāng)?shù)奶畛鋭?、粘合劑、增量劑、崩解劑、表面活性劑、防潮劑、賦形劑、稀釋劑等。制劑形式可以根據(jù)其使用目的適當(dāng)選擇，沒有特別限制，例如可以舉出錠劑、顆粒劑、粉劑、丸劑、膠囊劑等固體劑型，以及液劑、懸浮劑和乳劑等。
這樣得到的內(nèi)臟脂肪蓄積降脂肪劑和內(nèi)臟脂肪蓄積抑制劑最好經(jīng)口給予，其給予量可以根據(jù)服藥者癥狀等適當(dāng)選擇。因此，關(guān)于給予量和給予次數(shù)沒有特別限制。
此外，以本發(fā)明的上述物質(zhì)為有效成份，可以制備通常食品和特定保健食品(功能食品)。而且，也可以將該物質(zhì)作為各種食品的添加劑使用。上述食品的種類并不限于特定保健食品，也能用于通常健康食品，例如蛋糕、點(diǎn)心、巧克力、日式點(diǎn)心、肉制品、冰淇淋、魚肉制品、調(diào)理食品等，以及原來視為增肥的食品等。
本發(fā)明上述物質(zhì)在上述食品中的添加量和添加形態(tài)等，可以根據(jù)食品種類和制品概念以及制品形態(tài)等適當(dāng)選擇。作為實(shí)例，在食品中的配入量，通常為一次攝取量優(yōu)選處于100～1000毫克左右。
此外，通過在飼料中配入本發(fā)明的上述物質(zhì)，可以制備賦予家畜等內(nèi)臟脂肪蓄積抑制功能乃至內(nèi)臟脂肪蓄積降低功能的飼料。
可以配入本發(fā)明上述物質(zhì)的飼料，可以舉出牛、豬、雞等家畜用飼料，特別是肉牛等家畜用飼料。本發(fā)明上述物質(zhì)在飼料中的配入量和配入形態(tài)等，可以根據(jù)飼料種類、家畜的飼養(yǎng)狀況等適當(dāng)選擇。例如，作為肉牛飼養(yǎng)飼料時(shí)，優(yōu)選配入50～500毫克左右。
以下用實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。此外，就含有上述其他共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì)也進(jìn)行同樣試驗(yàn)后，得到大體相同的結(jié)果。
以金槍魚眼窩油為原料，精制、制備了DHA含量為45～50％的高DHA含量的甘油三酸酯(TG)(以下簡記作金槍魚精制TG)。向制備的120克金槍魚精制TG中，加入二甲基甲酰胺制成200毫升。然后將其全量移入500毫升帶蓋錐形瓶中，向其中添加大約12克叔丁醇鉀((CH3)3COK)，將燒瓶中的空氣用氮?dú)庵脫Q后，30℃下培養(yǎng)1小時(shí)。
培養(yǎng)后將溶液調(diào)成酸性，反應(yīng)物用正己烷萃取。萃取物水洗后脫水，接著在減壓下盡可能完全地除去溶劑。將得到的反應(yīng)生成物供入硅酸色譜柱中，制備共軛異構(gòu)TG。其中硅酸柱中的溶劑，使用正己烷、含有5％乙醚的正己烷和含有20％乙醚的正己烷，回收20％乙醚級分。用這種操作得到的共軛異構(gòu)TG是原來樣品油脂(金槍魚精制TG)重量的大約40～50％。上述異構(gòu)化和精制操作進(jìn)行五次，得到了大約250克共軛異構(gòu)TG。
(2)共軛異構(gòu)TG的定量測定用標(biāo)準(zhǔn)方法(日本油化學(xué)會(huì)編《標(biāo)準(zhǔn)油脂分析試驗(yàn)法》2.4.15-71)，測定了上述操作得到的TG中共軛酸含量。在50毫升容量瓶中準(zhǔn)確取10～20毫克油脂，用環(huán)己烷將其稀釋到刻度后，在233、262、268、274、308、315和322nm下測定了其紫外吸收，按下式算出共軛酸含量。
kλ=Aλ/(b×c)(波長λ下的吸光度；b比色槽長度，厘米；c濃度，克/升)k2=k233-k0k3=2.8[k268-1/2(k262+k274)]k4=2.5[k315-1/2(k308+k322)]在酯的場合下，k0=0.07共軛二烯、共軛甲苯和共軛四烯的含量(％)可以由下式求出。
共軛二烯=0.91k2共軛甲苯=0.47k3共軛四烯=0.45k4
用上述公式分析了樣品油(金槍魚精制TG)和異構(gòu)TG的共軛酸含量后發(fā)現(xiàn)，樣品油中共軛二烯含量為3.3％，共軛三烯和共軛四烯含量均為0％。而且，異構(gòu)TG中，共軛二烯含量為27.3％，共軛三烯含量為6.8％，共軛四烯含量為4.4％，共軛酸總量為38.3％。
其中，對上述共軛異構(gòu)TG進(jìn)行反相HPLC分析后查明，DHA的共軛異構(gòu)體是共軛不飽和脂肪酸的主要脂肪酸。HPLC柱使用了ODS(野村科學(xué)，DevelosilODS-UG-5)，檢出是用UV檢出器測定235nm波長吸收的方法進(jìn)行的。
然后對樣品油和共軛異構(gòu)TG進(jìn)行了氣相色譜(GC)分析。GC柱使用了Omegawax320，在200℃柱溫度下進(jìn)行分析。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品油中DHA含量變成45％，高度不飽和脂肪酸幾乎都是DHA。另外，在共軛異構(gòu)TG中，僅檢出大約2％DHA，可以認(rèn)為樣品中的DHA幾乎均被異構(gòu)化。此結(jié)果與用UV吸收法測得的共軛酸總量(大約40％)大體一致。
2、試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)飼料用基礎(chǔ)飼料(F-2，船橋農(nóng)場株式會(huì)社)對7周齡的Sprague-Daeley系雄性大鼠進(jìn)行一周預(yù)備飼養(yǎng)后，劃分成三個(gè)區(qū)，使每區(qū)內(nèi)7只試驗(yàn)鼠的平均體重相等，作7周飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境調(diào)節(jié)到溫度22～24℃，濕度50～60％，明暗周期(明期8:00～20:00；暗期20:00～8:00)各為12小時(shí)。飼料限制供給，每周測定體重。
試驗(yàn)用飼料的基本組成示于表1之中。使蛋白質(zhì)和糖等成份同一，將各區(qū)的脂肪物質(zhì)均調(diào)節(jié)到10％。也就是說，作為必須的脂肪酸用的飼料調(diào)制如下各試驗(yàn)區(qū)使用含1％亞麻酸乙酯的，對照豬油區(qū)使用含9％豬油的，金槍魚精制TG區(qū)使用含2％金槍魚精制TG(其余的7％是豬油)的，共軛酸區(qū)使用含2％金槍魚精制TG(其余的7％是豬油)的共軛異構(gòu)化物的。
表1
*1:Qriental酵母工業(yè)社制*2金槍魚精制TG共軛異構(gòu)化3、動(dòng)物處理方法及分析方法經(jīng)過7周飼養(yǎng)后，使之絕食20小時(shí)，在乙醚麻醉下切開腑部，從大靜脈放血?dú)⑺?。接著取出腸道粘膜脂肪、腎四周脂肪、精巢四周脂肪及肩甲骨之間的褐色脂肪稱重。褐色脂肪供UCP量測定。用常法從血液中得到血漿，用和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制的臨床檢查用試劑，測定血清中的甘油三酸酯、膽固醇和磷脂濃度。采用以下記載的方法進(jìn)行UCP量測定。
UCP蛋白質(zhì)的萃取操作用300mM蔗糖(含有10mM Tris-HCl,pH7.5，和2mM EDTA)將從試驗(yàn)鼠肩甲骨之間摘出的BAT均化，使用冷卻臺(tái)式離心機(jī)以3100轉(zhuǎn)/分鐘速度于4℃下離心5分鐘后，再將其上清液以12000轉(zhuǎn)/分鐘速度于4℃下離心10分鐘。以得到的沉淀(線粒體級份)作樣品。
電泳和蛋白質(zhì)印跡聚丙烯酰胺凝膠電泳，在11％分離凝膠上進(jìn)行，將與各泳道相當(dāng)?shù)?0微克樣品蛋白質(zhì)共分析用。電泳條件100V下電泳10中，然后在200V下電泳1小時(shí)。向膜(Hybond-C，アマ一シヤム公司制造)轉(zhuǎn)移過程，以半干方式在135mA(2.5mA/厘米2)下進(jìn)行30分鐘。進(jìn)而，使膜與兔對鼠UCP的抗體(一次抗體，稀釋3000倍)反應(yīng)后，洗滌干凈，使之再與兔IgG-過氧化物酶標(biāo)識(shí)(二次抗體)反應(yīng)。洗凈后，用化學(xué)發(fā)光法檢出試劑(杜邦公司出品)和X-射線膠卷檢出UCP區(qū)域。用掃描儀讀取膠卷上區(qū)域的深淺，在計(jì)算機(jī)上將其數(shù)字化。
4、結(jié)果以僅對照UCP的豬油區(qū)為100，其他各試驗(yàn)區(qū)的測定值列于表2之中。盡管飼料攝取量在各試驗(yàn)區(qū)沒有差別，但是就飼養(yǎng)后的體重而言，金槍魚精制TG區(qū)和共軛酸(金槍魚精制TG的共軛異構(gòu)體)與豬油對照區(qū)相比，顯著降低。飼養(yǎng)期間在各試驗(yàn)區(qū)也沒能看到軟便和下瀉等癥狀，而且糞便數(shù)量也沒有發(fā)現(xiàn)差別。
與豬油對照區(qū)相比，UCP量在金槍魚精制TG區(qū)增加約1.5倍，在共軛酸區(qū)增加約2.0倍。而且與豬油對照區(qū)相比，腸道粘膜脂肪，以及腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪合劑形成的的腹腔內(nèi)脂肪總量，在體重中所說的相當(dāng)?shù)谋壤?，共軛酸區(qū)顯著減少，而在金槍魚精制TG區(qū)也能發(fā)現(xiàn)減少的趨勢。此外，就甘油三酸酯等血漿脂肪濃度而言，與豬油對照區(qū)相比，在共軛酸區(qū)和金槍魚精制TG區(qū)都有顯著降低的趨勢。
在DHA含量高的金槍魚精制TG(共軛酸含量為3.3％)中，BAT中UCP表達(dá)增加，可以發(fā)現(xiàn)具有抑制內(nèi)臟脂肪蓄積的作用，以此為原料制備的共軛異構(gòu)化油，顯著發(fā)現(xiàn)這種作用的事實(shí)是明確的。
表2
注數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差腹腔內(nèi)脂肪合計(jì)指腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪的總量UCP以豬油對照區(qū)為100時(shí)的相對值共軛酸組金槍魚精制TG的共軛異構(gòu)體無共同符號(hào)的文字間有顯著性差異(p＜0.05)*p＜0.01
為了查明，實(shí)施例1中闡明的事實(shí)，即含共軛異構(gòu)化HUFA的魚油引發(fā)的nST功能亢進(jìn)，是否是由UCP小類中任何物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)亢進(jìn)造成的，用河田等人的Northern印跡解析法，對容易引起餌料誘發(fā)性肥胖的C57BL系試驗(yàn)鼠投予與實(shí)施例1相同的共軛異構(gòu)化魚油后產(chǎn)生的UCP同族體各小類的基因濃度，進(jìn)行了定量測定(Biochem.J.293,807-812(1993))。
試驗(yàn)鼠的飼養(yǎng)條件和餌料條件記載在表3之中。
飼養(yǎng)條件將8周齡的C57BL/6系試驗(yàn)鼠(雄性)分為三組，每組8只，經(jīng)一周基礎(chǔ)飼料預(yù)飼養(yǎng)后，進(jìn)行5周試驗(yàn)飼養(yǎng)(pair-feedihg)至14周齡。
餌料條件以僅含油酸的餌料作為控制餌料(低脂肪餌料)，再添加豬油、共軛異構(gòu)化魚油制成豬油餌料和共軛異構(gòu)化魚油餌料(高脂肪餌料)。
表3飼料組成
體重和脂肪蓄積量等的測定結(jié)果總結(jié)在表4中。結(jié)果表明，腎周圍、副睪和腸道粘膜脂肪組織的重量，與豬油餌料相比，喂食共軛異構(gòu)化魚油餌料后顯著性降低。而且意味深長的是，這種共軛異構(gòu)化魚油的效果，與低脂肪食品(重量比2％)匹敵。此外，為了解吸這種共軛異構(gòu)化魚油效果的機(jī)理，比較研究了BAT內(nèi)UCP族中各小類(UCP-1、-2、-3)mRNA表達(dá)量。其中使用GAPDH作為mRNA分析用內(nèi)標(biāo)基因。附

圖1表明，共軛異構(gòu)化魚油中UCP-2基因的表達(dá)量顯著增大。以前認(rèn)為，UCP發(fā)現(xiàn)的增大由支配交感神經(jīng)末梢分泌的去甲腎上腺素控制，這主要使UCP-1增加。如上所述，本試驗(yàn)中查明，共軛異構(gòu)化魚油使UCP-2基因產(chǎn)生特異性增強(qiáng)，因而可以推知共軛異構(gòu)化魚油使BAT功能產(chǎn)生的亢進(jìn)作用，不是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)，而是共軛異構(gòu)化魚油成份對BAT直接作用的結(jié)果。
UCP-2與UCP-1不同，不僅在BAT中，而且在WAT和骨骼肌等nST的主要組織中廣泛分布，所以共軛異構(gòu)HUFA衍生物(魚油)對于人體抗肥胖來說是極為有效的物質(zhì)。
表4油脂對試驗(yàn)鼠脂肪組織重量和體重的影響
注數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(8只)同一行的數(shù)值中不同上標(biāo)符號(hào)間顯著性差異(p＜0.01)
培養(yǎng)后用2N鹽酸將反應(yīng)液調(diào)成酸性，正己烷萃取。萃取物水洗后脫水，接著在減壓下盡可能完全地餾去溶劑。將得到的濃縮液(反應(yīng)生成物)供入硅酸色譜柱中，制備共軛異構(gòu)化DHA甘油三酸酯。
其中，硅酸柱中的溶劑使用正己烷、含有5％乙醚的正己烷和含有20％乙醚的正己烷，回收20％乙醚級分。用這種操作得到的共軛異構(gòu)DHA乙酯的收率是49％。
(2)共軛異構(gòu)DHA乙酯的定量測定采用與實(shí)施例1同樣的標(biāo)準(zhǔn)方法，測定了上述操作得到的乙酯中共軛異構(gòu)酸的含量。
查明了原料DHA乙酯及其異構(gòu)乙酯、各種共軛異構(gòu)酸的含量，在原料DHA乙酯中，共軛二烯、共軛三烯和共軛四烯含量均為0％，另一方面異構(gòu)酯中，共軛二烯含量為83.0％，共軛三烯含量為9.7％，共軛四烯含量為7.0％，DHA總量(99％強(qiáng))均被共軛異構(gòu)化。
其中，對原料DHA乙酯及其共軛異構(gòu)DHA乙酯進(jìn)行反相HPLC(柱ODS(野村科學(xué)，DevelosilODS-UG-5))分析后查明，DHA乙酯的脂肪酸是DHA，乙酯異構(gòu)體中僅僅檢出了單峰，證明DHA乙酯中的DHA幾乎完全被共軛異構(gòu)化。此外，與UV吸收法測定共軛酸量的結(jié)果(大約100％)一致。
2、試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)飼料1)試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)方法與實(shí)施例1相同。
2)試驗(yàn)飼料除了在0.5％原料DHA乙酯中加入8.5％豬油作為對照區(qū)，以及在0.5％共軛DHA乙酯中加入8.5％豬油作為共軛DHA乙酯區(qū)之外，按照實(shí)施例1進(jìn)行。
3、動(dòng)物處理方法及分析方法經(jīng)過7周飼養(yǎng)后，絕食20小時(shí)，在乙醚麻醉下切開腑部，從大靜脈放血?dú)⑺?。接著取出腸道粘膜脂肪、腎四周脂肪、精巢四周脂肪及肩甲骨之間的褐色脂肪稱重。褐色脂肪供UCP量測定。
UCP量的測定與實(shí)施例1同樣進(jìn)行。
4、結(jié)果UCP以對照區(qū)為100，其他試驗(yàn)區(qū)的測定值列于表5。盡管飼料攝取量在各試驗(yàn)區(qū)間沒有差別，但是就飼養(yǎng)后的體重而言，與對照區(qū)相比，共軛酸(DHA乙酯的共軛異構(gòu)體)區(qū)顯著降低。飼養(yǎng)期間各試驗(yàn)區(qū)也沒看到軟便和下瀉等癥狀，糞便量也沒發(fā)現(xiàn)不同。
與對照區(qū)相比，UCP量在共軛異構(gòu)DHA乙酯區(qū)增加約1.8倍。而且與對照區(qū)相比，腸道粘膜脂肪，以及腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪總量的腹腔內(nèi)脂肪總量在體重中相當(dāng)?shù)谋壤曹椝嵋阴^(qū)顯著減少，共軛異構(gòu)DHA乙酯使UCP表達(dá)量增大，對腹腔內(nèi)脂肪顯示減肥功能，能夠抑制腸道粘膜脂肪蓄積和減少腸道粘膜脂肪蓄積。
表5
注數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差腹腔內(nèi)脂肪合計(jì)指腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪的總量UCP表示以對照區(qū)為100時(shí)的相對值無共同符號(hào)的文字間有顯著性差異(p＜0.05)*p＜0.01
將北海道秋產(chǎn)大馬哈魚(Oncorhynchus keta)的新鮮白子(精巢)冷凍干燥，用混合機(jī)充分粉碎后，浸漬在乙醇中搖蕩，濾出不溶物，得到乙醇萃取液。
用蒸發(fā)器從萃取液中蒸餾除去乙醇，得到油狀脂肪級分(收率2.5％)。將此油狀物倒入硅酸色譜柱中，與實(shí)施例1同樣操作，分離出F酸甘油三酸酯級分。
按照常法用酸觸媒將該級分乙酯化，使之通過上述色譜柱制成精制酯。將該酯溶解在乙腈中，按照太田等人的方法(Chromatography15,No.4,250-253(1994))供入反相HPLC(柱Zorbax ODS，野村科學(xué)出品)分離，得到F酸乙酯混合物。為了便于分析和其他目的，將F酸甘油三酸酯按照常法甲酯化，并且用太田等人的方法鑒定F酸。
結(jié)果查明，該乙酯的呋喃酸組成，按化學(xué)式1和表6中呋喃型脂肪酸結(jié)構(gòu)，其中F6為59％,F4為20％,F5為13％,F2為6％,F8為2％。
化學(xué)式1
表6呋喃型脂肪酸的結(jié)構(gòu)
(2)F酸自氧化產(chǎn)物的生成及其結(jié)構(gòu)人們知道，F(xiàn)酸甲酯容易遭受自身氧化，經(jīng)過dioxo-enoate，轉(zhuǎn)變成不飽和F酸甲酯(G.Rosenblat等人，J.Am.Oil.Chem.Soc.70,501-505(1993))。
采用Rosenblat等人的方法對該F酸乙酯進(jìn)行分析的結(jié)果說明，其中含有約8％的類似自氧化產(chǎn)物。
2、試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)飼料1)試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)方法與實(shí)施例1同樣實(shí)施。
2)試驗(yàn)飼料除了在0.5％F酸乙酯中加入8.5％豬油作為F酸乙酯區(qū)之外，按照
3、動(dòng)物處理方法及分析方法與實(shí)施例3同樣進(jìn)行。
4、結(jié)果UCP以對照區(qū)為100，其他試驗(yàn)區(qū)的測定值列于表7。盡管飼料攝取量在各試驗(yàn)區(qū)沒有差別，但是就飼養(yǎng)后的體重而言，與對照區(qū)相比，F(xiàn)酸乙酯區(qū)顯著降低。
飼養(yǎng)期間各試驗(yàn)區(qū)也沒看到軟便和下瀉等癥狀，糞便量也沒發(fā)現(xiàn)不同。
與對照區(qū)相比，UCP表達(dá)量在F酸乙酯區(qū)增加3倍弱。與對照區(qū)相比，腸道粘膜脂肪以及腹腔內(nèi)脂肪(腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪總量)的在體重中所相當(dāng)?shù)谋壤?，F(xiàn)酸乙酯區(qū)顯著減少，這表明F酸乙酯通過使UCP表達(dá)量增大，使腹腔內(nèi)脂肪降低功能，以及抑制腸道粘膜脂肪蓄積和減少腸道粘膜脂肪蓄積的功能亢進(jìn)。
表7
注數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差腹腔內(nèi)脂肪合計(jì)腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪的總量UCP表示以對照豬油區(qū)為100時(shí)的相對值無共同符號(hào)的文字間有顯著性差異(p＜0.05)*p＜0.01
(2)二十碳五烯酸(EPA)乙酯共軛異構(gòu)體的制備和分析按照實(shí)施例3的方法，由EPA乙酯(Sigma公司出品)制備了其共軛異構(gòu)體。利用UV吸收法和HPLC分析法證明幾乎完全被共軛異構(gòu)化。
2、試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)飼料1)試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)方法與實(shí)施例1同樣實(shí)施。
2)試驗(yàn)飼料除了在1.0％α-亞麻酸乙酯中加入8％豬油作為ALA乙酯區(qū)，以及在1.0％共軛EPA乙酯中加入8％豬油作為共軛EPA乙酯區(qū)之外，其余按照實(shí)施例1進(jìn)行。
3、動(dòng)物處理方法及分析方法與實(shí)施例3同樣進(jìn)行。
4、結(jié)果UCP以豬油對照區(qū)為100，其他試驗(yàn)區(qū)的測定值列于表8。盡管飼料攝取量在各試驗(yàn)區(qū)沒有差別，但是飼養(yǎng)后的體重，與對照區(qū)相比，共軛ALA乙酯區(qū)和共軛EPA乙酯區(qū)都顯著減小。
飼養(yǎng)期間各試驗(yàn)區(qū)也沒看到軟便和下瀉等癥狀，糞便量也沒發(fā)現(xiàn)不同。
與對照區(qū)相比，UCP表達(dá)量在ALA乙酯區(qū)增加約1.7倍，在共軛EPA乙酯區(qū)增加約2.4倍。而且兩個(gè)共軛酸區(qū)與豬油區(qū)相比，腸道粘膜脂肪，以及腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪合計(jì)組成的腹腔內(nèi)脂肪在體重中相當(dāng)?shù)谋壤@著減少。這表明α-亞麻酸乙酯和EPA乙酯各自的共軛異構(gòu)體，均具有使包括腸道粘膜脂肪在內(nèi)的腹腔內(nèi)脂肪的蓄積得到抑制的功能。
表8
注數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差腹腔內(nèi)脂肪合計(jì)腸道粘膜脂肪、精巢周圍脂肪和腎周圍脂肪的總量UCP表示以對照豬油區(qū)為100時(shí)的相對值無共同符號(hào)的文字間有顯著性差異(p＜0.05)產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明得到的上述物質(zhì)，具有使包括人在內(nèi)哺乳動(dòng)物和鳥類生物體組織的細(xì)胞內(nèi)，作為nST主要組織的骨骼肌、WAT和BAT等的，例如含有BA、線粒體的細(xì)胞及WA等MC的脫共軛呼吸乃至MC內(nèi)膜的質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特異性亢進(jìn)的作用。本發(fā)明可以提供作為有效成份含有該物質(zhì)的、抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪(特別是腸道粘膜脂肪)蓄積)和抗內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積的降脂肪劑，作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪(特別是腸道粘膜脂肪)蓄積)和內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)蓄積脂肪減少功能的食品(功能食品)，以及作為有效成份含有該物質(zhì)并賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪(特別是腸道粘膜脂肪)蓄積)和內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)蓄積脂肪減少功能的飼料。
權(quán)利要求
1.一種含有共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì)，其中所說的物質(zhì)能使包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物及鳥類的非寒栗熱產(chǎn)生(nonshivering thermogenesis；nST)主要組織、骨骼肌、白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏(Proton leak)產(chǎn)生特異性亢進(jìn)作用。
2.按照權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其中具有上述作用的成份是共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸(HUFA)類。
3.按照權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其中具有上述作用的成份是HUFA衍生物氧化生成物的呋喃HUFA衍生物。
4.按照權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中所說的物質(zhì)能使作為主要nST組織的骨骼肌、白色脂肪組織、褐色脂肪組織等含線粒體的細(xì)胞產(chǎn)生特異作用，具有使該細(xì)胞中脫共軛蛋白同族體(UCPhomologue)的表達(dá)量顯著增大的作用。
5.一種抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積的降脂肪劑，作為有效成份其中含有權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)所述的物質(zhì)，所說的物質(zhì)能使作為nST的主要組織的骨骼肌、WAT、BAT等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用。
6.一種賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積功能的食品，作為有效成份其中含有權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)中所述的物質(zhì)，所說的物質(zhì)能使作為nST主要組織的骨骼肌、WAT、BAT等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Proton leak)產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用。
7.一種賦予抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪，特別是腸道粘膜脂肪蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積功能的飼料，作為有效成份其中含有權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)中所述的物質(zhì)，所說的物質(zhì)能使作為nST主要組織的骨骼肌、WAT、BAT等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有共軛異構(gòu)化的高度不飽和脂肪酸類和/或其衍生物的物質(zhì),其中含有能使作為包括人在內(nèi)哺乳動(dòng)物及鳥類產(chǎn)生非寒栗熱(nonshivering thermogenesis)的主要組織的骨骼肌、白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)等細(xì)胞中線粒體(MC)的脫共軛呼吸乃至內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(Protonleak)產(chǎn)生特異亢進(jìn)作用的共軛異構(gòu)化高度不飽和脂肪酸及其衍生物的物質(zhì),作為有效成份含有上述物質(zhì)的抗肥胖(抑制內(nèi)臟脂肪,特別是腸道粘膜脂肪的蓄積)和減少內(nèi)臟(特別是腸道粘膜)脂肪蓄積的降脂肪劑,食品,以及飼料。
文檔編號(hào)A61K31/20GK1315859SQ99810428
公開日2001年10月3日 申請日期1999年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月1日
發(fā)明者名達(dá)義剛, 古賀憲治, 水野雅之 申請人:Jan食品和飼料技術(shù)公司