專利名稱：Gbs毒素受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供與GBS毒素受體多核苷酸和多肽有關(guān)的組合物及方法。本發(fā)明涉及從細(xì)菌來源分離的多糖受體。
背景B組β溶血性鏈球菌(GBS)是普遍存在的微生物。除嬰幼兒外，尚不知道GBS可引起人的什么有害感染。GBS肺炎(也稱為“早期發(fā)作性疾病”)與新生兒的高發(fā)病率和死亡率有關(guān)。
在Carl G.Hellerqvist博士及其同事(Vanderbilt大學(xué)醫(yī)學(xué)院，Nashville,Tennessee)進(jìn)行的一系列研究工作中，已鑒定了一種多糖GBS毒素。確定該毒素為GBS肺炎的主要致病因子，并發(fā)現(xiàn)其可作治療劑，通過抑制血管形成來對抗腫瘤(美國專利5,010,062)。
另外，如美國專利5,858,991和國際專利WO 98/32453中所述，GBS毒素可減小瘢痕形成并加速傷口愈合，同時減緩傷口相關(guān)腫瘤進(jìn)展。
WO 98/32452和WO 98/32448描述了使用GBS毒素作為治療劑用于治療慢性炎性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬，并用于增強(qiáng)神經(jīng)損傷的修復(fù)。
在本發(fā)明之前，尚沒有鑒定出GBS毒素的受體。本發(fā)明人相信GBS毒素受體存在于上述狀況中經(jīng)受血管生成的組織的發(fā)展著的脈管系統(tǒng)細(xì)胞上，為此進(jìn)行了一系列實驗并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的另一方面是提供編碼GBS毒素受體或其片段的多核苷酸，以及可與這些多核苷酸雜交的多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸是長度至少10個堿基，并包括編碼編碼哺乳動物GBS毒素受體或其多肽片段的核酸序列或互補(bǔ)于這樣的核酸序列。
本發(fā)明的第三個方面是包括與哺乳動物毒素受體或其片段結(jié)合之GBS毒素的復(fù)合體。還提供了形成這種復(fù)合體的方法。該方法包括在允許GBS毒素與多肽特異性結(jié)合并形成復(fù)合體的條件下，使GBS毒素與包括哺乳動物GBS毒素受體的多肽或其可與GBS毒素結(jié)合的片段接觸。
本發(fā)明的再一個方面是純化可與GBS毒素受體結(jié)合的化合物的方法。該方法包括提供含哺乳動物GBS毒素受體的多肽，或其可結(jié)合GBS毒素的片段，在允許化合物與多肽特異性結(jié)合的條件下使多肽與含有化合物的樣品接觸，并將結(jié)合的化合物與樣品的殘留物分離開。
本發(fā)明的再一個方面是確定樣品中是否存在GBS毒素的方法。該方法包括在允許GBS毒素與GBS毒素受體特異性結(jié)合的條件下，使樣品與包括哺乳動物GBS毒素受體的多肽或其可結(jié)合GBS毒素的片段接觸，并確定是否已發(fā)生了GBS毒素的特異性結(jié)合。新生兒的樣品中存在GBS毒素是早期發(fā)作性疾病的指征。
本發(fā)明的第六個方面是檢測哺乳動物組織中病理性脈管系統(tǒng)的方法?？墒褂迷摲椒z測或監(jiān)測與血管生成或新血管形成有關(guān)的各種醫(yī)學(xué)狀況，如檢測癌性腫瘤轉(zhuǎn)移、或監(jiān)測經(jīng)受腫瘤治療的哺乳動物體內(nèi)的腫瘤界限。
本發(fā)明的再一個方面是提供鑒定用于治療以病理性和/或缺氧促使的血管生成或新血管形成為特征的醫(yī)學(xué)狀況的候選藥物的方法。一個實例是鑒定可與哺乳動物GBS毒素受體特異性結(jié)合的化合物的方法。該方法包括在允許發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，使試驗化合物與哺乳動物GBS毒素受體或其可與GBS毒素結(jié)合的片段結(jié)合，然后檢測試驗化合物與多肽之間形成的復(fù)合體。另一個具體實例是確定試驗嵌合化合物的細(xì)胞毒性的方法。該方法包括使表達(dá)哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素之片段的細(xì)胞，與包括偶聯(lián)到GBS毒素上之細(xì)胞毒性劑的試驗嵌合化合物接觸，并檢測毒性征記。再一個具體實例是鑒定GBS毒素受體抑制劑的方法，該方法包括在有及沒有試驗化合物存在下，并在沒有試驗化合物存在時培養(yǎng)的細(xì)胞能夠增殖或遷移的條件下，保溫表達(dá)GBS毒素受體或其片段的試驗細(xì)胞，并比較有及沒有試驗化合物存在時保溫的試驗細(xì)胞的增殖或遷移，其中在有試驗化合物存在時增殖或遷移更少即是試驗化合物為GBS毒素受體抑制劑的指征。可用上述方法鑒定內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移抑制劑，其中當(dāng)有試驗化合物存在時試驗細(xì)胞的增殖或遷移率較低，即是試驗化合物為內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移抑制劑的指征。可以用上述方法鑒定用于治療或預(yù)防以病理性血管生成或新血管形成為特征的醫(yī)學(xué)狀況的治療化合物，其中當(dāng)存在試驗化合物時試驗細(xì)胞的增殖或遷移率較低，即表明試驗化合物可以作為用于治療或預(yù)防所說的醫(yī)學(xué)狀況的候選治療化合物。
本發(fā)明還提供鑒定可抑制GBS毒素與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合之化合物的方法。該方法包括模擬并選擇哺乳動物GBS毒素受體的最可能的構(gòu)象，設(shè)計實質(zhì)上模擬該多肽的能量上最可能的三維結(jié)構(gòu)的化學(xué)改性類似物，化學(xué)合成類似物，并估測類似物的生物活性。另外還提供鑒定可與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合之化合物的方法。該方法包括模擬并選擇哺乳動物GBS毒素受體的最可能的構(gòu)象，推測多肽的最可能的結(jié)合區(qū)，設(shè)計可與多肽形成能量上最可能之復(fù)合體的化合物，化學(xué)合成該化合物，并估計化合物的生物活性。
本發(fā)明的再一個方面涉及經(jīng)投用GBS毒素與人GBS毒素受體結(jié)合的抑制劑，以預(yù)防或治療新生兒的新生兒發(fā)作性疾病的方法。
本發(fā)明的再一個方面涉及抑制哺乳動物組織中病理性或缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移的方法。該方法包括使分子與組織中至少一個細(xì)胞的表面上存在的GBS毒素受體特異性結(jié)合，該分子選自下組當(dāng)與哺乳動物中的GBS毒素受體結(jié)合后即可引發(fā)炎性反應(yīng)的化合物，包括與可特異性結(jié)合GBS毒素受體的化合物偶聯(lián)之細(xì)胞毒性化合物的嵌合化合物，GBS毒素受體磷酸化抑制劑、GBS毒素受體活性抑制劑。
本發(fā)明還提供用于人或動物的治療方法或用于治療以病理性或缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管生成為特征之醫(yī)學(xué)狀況的藥物的制備中的GBS毒素受體或其片段、GBS毒素受體抑制劑、GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的抑制劑。還提供用于治療人或動物體之方法中的，包括與可結(jié)合GBS毒素受體的化合物偶聯(lián)之細(xì)胞毒性劑的嵌合化合物。
本發(fā)明還提供包括GBS毒素受體抑制劑和/或嵌合化合物，以及藥用載體的藥物組合物，其中所述嵌合化合物包括與可結(jié)合GBS毒素受體的化合物偶聯(lián)的細(xì)胞毒性劑。
本發(fā)明還提供包括GBS毒素受體或片段和/或用于檢測GBS毒素受體或其多肽片段之存在的試劑，或檢測其多核苷酸編碼序列之存在的試劑盒。
圖2A和2B顯示使用實施例4中所述的抗體Pab55，分別對癌性和正常卵巢組織中的GBS毒素受體表達(dá)進(jìn)行免疫組化分析的結(jié)果。
圖3A和3B顯示使用實施例4中所述的抗體Pab57，分別對癌性和正常人卵巢組織中的GBS毒素受體表達(dá)進(jìn)行免疫組化分析的結(jié)果。
圖4A-4C顯示嵌合化合物向?qū)嵤├?中所述之癌性組織中表達(dá)的GBS毒素受體的定向送遞。
發(fā)明的詳細(xì)描述一般說來，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的意義。本文使用的命名法和細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及下述雜交等方面的實驗室方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。用于核酸重組、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化(如電穿孔、脂染法)的方法均為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法。生產(chǎn)商提供的酶促反應(yīng)和純化步驟都是按照生產(chǎn)商提供的說明書進(jìn)行的。一般都按照本領(lǐng)域及各種常用參考文獻(xiàn)(如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A laboratory Manual,2nd Ed.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中所述的常規(guī)方法完成各種技術(shù)和操作步驟。本文所使用的術(shù)語及下述的分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)及藥物配制中的實驗室方法均為本領(lǐng)域已知和常用的?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物配制與送遞，以及治療病人。除另外指出者外，本文通編使用的術(shù)語均具有下述含義“GBS毒素受體”是指能夠與B組β溶血性鏈球菌，如CM101的毒素(GBS毒素)結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。自然界中GBS毒素受體通常見于細(xì)胞表面上。可以用本領(lǐng)域已知的實驗室技術(shù)生產(chǎn)膜結(jié)合和可溶性的重組GBS毒素受體。
術(shù)語“分離的多核苷酸”是指已經(jīng)受過操作的多核苷酸，從而該分離的多核苷酸不再與其正常與之天然關(guān)聯(lián)的染色體或細(xì)胞相聯(lián)系。例如“分離的多核苷酸”是基因組、重組或合成來源的多核苷酸，或它們的某些組合。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”是指不再與正常蛋白質(zhì)天然與之聯(lián)系的細(xì)胞相聯(lián)系的蛋白質(zhì)。例如(1)至少沒有某些同樣來源之其他蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)；(2)由來自不同種的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)；(3)非天然存在的蛋白質(zhì)，(4)由cDNA、重組DNA或合成來源或其組合方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“多肽”作為上位概念術(shù)語，是指天然蛋白質(zhì)、片段或多肽序列的類似物。這里，天然蛋白質(zhì)、片段及類似物均為多肽屬的種。
術(shù)語“天然存在的”是指自然界發(fā)現(xiàn)的。例如，存在于天然生物體(包括病毒)中的，并且未在實驗室中被人為修飾的多肽或多核苷酸序列即為天然存在的。
術(shù)語“可操作地連接的”是指其中所述的成分處于一種允許它們以預(yù)期方式發(fā)揮功能的鄰接關(guān)系?？刂菩蛄小翱刹僮鞯剡B接到”編碼序列上，是指兩者的連接方式使得編碼序列的表達(dá)可在與控制序列相配合的條件下實現(xiàn)。
術(shù)語“控制序列”是指對其所連接的編碼序列的表達(dá)起必要作用的多核苷酸序列。這些控制序列的性質(zhì)根據(jù)宿主生物體而有所不同；在原核生物中，這樣的控制序列一般包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，這樣的控制序列一般包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“控制序列”傾向于至少包括表達(dá)所必要的所有成分，并可包括其存在帶來益處的附加序列，例如前導(dǎo)序列和融合對象序列。
術(shù)語“多核苷酸”是指長度至少為10個堿基的聚合形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其修飾形式，且包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
術(shù)語“寡核苷酸”是指通過天然存在的及非天然存在的寡核苷酸鍵連接在一起的天然存在的和修飾的核苷酸。寡核苷酸通常是長度為200個堿基或更短的多核苷酸。優(yōu)選的寡核苷酸長度為10至60個堿基，最好為15至35個堿基。寡核苷酸通常為單鏈的，例如用作探針；但也可能是雙鏈的，例如用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。術(shù)語“天然存在的核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸?！靶揎椀暮塑账帷卑◣в行揎椀幕蛉〈奶腔鹊暮塑账?。術(shù)語“核苷酸鍵”包括寡核苷酸鍵如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、氨苯基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、氨苯基磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯等。需要的話，寡核苷酸可包括檢測標(biāo)記。
“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)體”是指當(dāng)腺嘌呤出現(xiàn)于第一核苷酸序列中時，“互補(bǔ)”序列中就出現(xiàn)胸腺嘧啶或尿嘧啶，反之亦然，并且當(dāng)鳥嘌呤出現(xiàn)于第一核酸序列中時，“互補(bǔ)”序列中即可見有胞嘧啶，反之亦然。
術(shù)語“序列相同性”是指兩個核酸序列之間的堿基匹配比例，或兩個氨基酸序列間的氨基酸匹配比例，即兩個序列間的相同性程度。當(dāng)序列相同性以百分?jǐn)?shù)表示時，例如50％，即代表與某些其他序列相比，GBS毒素受體序列的總序列中準(zhǔn)確匹配的比例。可使用各種計算機(jī)比對程序確定序列相同性。在其最簡單形式中，％相同性是將兩個核酸序列間或兩個氨基酸序列間的準(zhǔn)確匹配數(shù)除以參考序列中的核苷酸或氨基酸總數(shù)而計算出來的。例如，長度為400個氨基酸的序列間有300個匹配，則序列就有75％相同性。當(dāng)將核糖核苷酸序列與脫氧核糖核苷酸序列比較時，認(rèn)為尿嘧啶與胸腺嘧啶是同樣的。
當(dāng)用于多核苷酸時，術(shù)語“實質(zhì)上相同”是指當(dāng)最佳比對時，如使用程序BLAST(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)分析時，兩個核酸序列同有至少約85％，較好至少約90％，最好約95％或更大的序列相同性。當(dāng)使用計算機(jī)比對程序時，可在兩序列中任何一條上造成缺口以達(dá)到最大匹配；通常使用15個堿基或更小的缺口，較好是6個堿基或更小的缺口，最好是2個堿基或更小的缺口。當(dāng)使用寡核苷酸作為探針或用于治療時，靶核酸和寡核苷酸之間的序列相同性一般是20個可能的堿基配對中有不少于17個靶堿基匹配(85％)，較好為9/10(90％)，最好為19/20(95％)個靶堿基匹配。
優(yōu)選不相同的堿基為該氨基酸位置上編碼同一氨基酸之簡并密碼子的一部分?；蛘撸幌嗤膲A基是編碼該氨基酸位置上保守氨基酸取代之簡并密碼子的一部分。
當(dāng)用于多肽時，術(shù)語“實質(zhì)上相同”是指兩個肽序列當(dāng)按BLAST計算機(jī)程序最優(yōu)比對時，兩個序列至少有約80％，較好有至少約86％，更好有至少約95％，最好有至少約99％，甚至為100％的序列相同性?？稍试S兩匹配序列中任何一條序列上存在缺口以利于最大匹配；缺口長度較好為5個氨基酸以下，最好為2個氨基酸以下。不相同的殘基位置最好是因保守氨基酸取代造成的不同。保守氨基酸取代是指具有相似側(cè)鏈的殘基間的可交換性。例如，一組具有脂族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂族羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸，一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸。優(yōu)選的組內(nèi)保守氨基酸取代是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
術(shù)語“可在高度嚴(yán)格條件下雜交”是指能夠在只有彼此間實質(zhì)性相同性大于95％的核酸序列才能雜交的雜件下發(fā)生特異性結(jié)合。這些條件是本領(lǐng)域已知的并在本文中討論。
術(shù)語“簡并密碼子”是指按照遺傳密碼編碼所需氨基酸的任何核苷酸密碼子三聯(lián)體?？筛鶕?jù)宿主生物體如大腸桿菌中已知的優(yōu)選密碼子用法來選擇密碼子。
術(shù)語“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但殘留的氨基酸序列相同于例如從全長度DNA序列推斷的天然存在之序列中的相應(yīng)位置的多肽。片段一般至少為3個氨基酸長，較好為5-10個氨基酸長，更好為10-50個氨基酸長，最好為50個以上氨基酸長，并且包括至少一個GBS毒素受體的胞外結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選的片段包括GBS毒素受體的整個胞外結(jié)構(gòu)域，還包括足以維持多肽片段在細(xì)胞表面、脂質(zhì)膜、脂質(zhì)體、微膠粒及其他親脂結(jié)構(gòu)上呈功能性立體化學(xué)構(gòu)象的跨膜部分和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語“免疫學(xué)反應(yīng)性”是指具有抗原性質(zhì)或能夠被可特異地結(jié)合GBS毒素受體的抗體特異性結(jié)合。當(dāng)一種物質(zhì)在本領(lǐng)域已知有利于產(chǎn)生可識別并結(jié)合特定抗原的抗體的條件下投用于動物時，如果能夠產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體，則該物質(zhì)即具有抗原性質(zhì)。
“異源多肽”是不同于特定細(xì)胞正常產(chǎn)生之多肽的多肽。例如，由正常情況下并不產(chǎn)生GBS毒素受體多肽或其片段的細(xì)胞重組產(chǎn)生的這種GBS毒素受體多肽或其片段即為異源多肽。如果連接到GBS毒素受體多肽或其片段上的第二種多肽并不是天然與之連接的，則這樣的連接多肽也是異源多肽。
術(shù)語“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”是指例如摻入放射標(biāo)記的氨基酸或連接到可用標(biāo)記的抗生物素蛋白(例如含有可用光學(xué)或比色方法檢測的熒光標(biāo)記或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白)檢測的帶生物素基部分的多肽上，以摻入可檢測標(biāo)記?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法。多肽的標(biāo)記物包括但不只限于放射性同位素(如3H、14C、35S、125I、131I)、熒光標(biāo)記(如FITC、羅丹明、鑭系磷光體)、酶促標(biāo)記(如辣根過氧化物酶、β半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、生物素基、由第二報導(dǎo)分子識別的預(yù)定的多肽表位(如亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合區(qū)、表位標(biāo)簽)。在某些具體實施中，由不同長度的間隔臂連接標(biāo)記物，以減少可能的空間位阻。
術(shù)語“化合物”是指肽、擬肽(peptidomimetic)、有機(jī)或其他化學(xué)分子，以及核酸分子或其化學(xué)衍生物?；衔锟梢允且槐景l(fā)明多核苷酸或多肽或者可與其相互作用。
除特別指出者外，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“該”也包括多數(shù)事物。
下列表1中總結(jié)了本文所述核酸和氨基酸序列的SEQ ID NOs:
表1核酸和氨基酸序列

本文給出的題頭描述所討論的一般性課題，并且不排除其他部分中討論的信息。有關(guān)信息、方法、組合物及其他方面可應(yīng)用于不只一個發(fā)明的具體實施方案，并且可以相互組合。引言GBS可與經(jīng)受病理性的、缺氧驅(qū)使的，和胚胎學(xué)的血管生成或新血管形成的組織結(jié)合。本發(fā)明人至少鑒定了如本文討論的兩種哺乳動物GBS毒素受體。實施例1和2描述了某些GBS毒素受體的克隆和特征。本發(fā)明人已將GBS毒素受體分類為帶有七個跨膜區(qū)的整合膜蛋白。表7中顯示了預(yù)測的各片段。該蛋白質(zhì)有幾個cAMP依賴性激酶、蛋白激酶C(PKC)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)的推測的磷酸化位點(diǎn)。通常，這樣的整合膜蛋白在結(jié)合分子(如配體或細(xì)胞外信使)后，經(jīng)受一次有利于在如上文討論的磷酸化位點(diǎn)磷酸化的構(gòu)象改變。蛋白質(zhì)在這些位點(diǎn)的磷酸化可能觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，從而常常使已暴露于結(jié)合分子的細(xì)胞發(fā)生增殖或其他核應(yīng)答。血管生成或新血管形成包括有內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。如在實施例4和5中詳細(xì)討論的，GBS毒素受體表達(dá)與涉及病理性的、缺氧驅(qū)使的、和胚胎學(xué)的血管生成或新血管形成的醫(yī)學(xué)狀況相關(guān)聯(lián)。GBS毒素受體多肽可用于各種不同的目的，其中包括篩選可抑制由GBS毒素受體介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或遷移的化合物、篩選可結(jié)合并破壞表達(dá)GBS毒素受體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性嵌合化合物。另外，例如可使用GBS毒素受體多核苷酸設(shè)計反義多核苷酸，用以阻斷編碼GBS毒素受體的信使RNA的翻譯，還可用于其它目的。多核苷酸本發(fā)明的一個方面涉及至少10個堿基長的分離的多核苷酸，其編碼GBS毒素受體或其片段或者互補(bǔ)于其編碼核酸序列。GBS毒素受體是哺乳動物GBS毒素受體，尤其是綿羊、?；蜇圙BS毒素受體，最好是人GBS毒素受體。分離的多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。分離的多核苷酸可包括DNA序列或RNA序列(其中每個T均被U取代)。為了確定相同性百分比，T被視為等同于U。多核苷酸最好包括綿羊、牛、貓或人GBS毒素受體的等位基因，并可包括其他哺乳動物GBS毒素受體的等位基因?？梢园凑障率龇椒ǎ褂醚苌赟EQ ID NO:1、3、7、9和11的多核苷酸分離這些多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸及片段可在與非特異性核酸發(fā)生最小量的可檢測結(jié)合的雜交和洗滌條件下，選擇性地與核酸鏈雜交。多核苷酸可在高度嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的至少20個連續(xù)核苷酸，較好至少30個連續(xù)核苷酸之核酸序列的核酸分子，甚至含有SEQ ID NO:1、3、7、9或11的核酸序列或它們的互補(bǔ)序列的核酸分子雜交。這樣的多核苷酸可用于完成選擇性的高度嚴(yán)格雜交，并特別適用于以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增核酸以確定樣品中是否存在GBS毒素受體，分離天然存在的編碼GBS毒素受體的核酸(參見實施例3)，以及作為反義分子以阻斷GBS毒素受體mRNA的翻譯。特別優(yōu)選的是在高度嚴(yán)格條件下與具有包括SEQ ID NO:7之核苷酸266-1870(除起始密碼子外的推測的全長度人GBS毒素受體編碼區(qū))、SEQ ID NO:7之核苷酸266-1870(包括起始密碼子的，推測的全長度人GBS毒素受體編碼區(qū))、SEQ ID NO:1之核苷酸61-1542(除起始密碼子外的人GBS毒素受體部分編碼區(qū))、SEQ ID NO:1之核苷酸58-1542(包括起始密碼子的人GBS毒素受體部分編碼區(qū))、SEQ IDNO:3之核苷酸87-1568(除起始密碼子外的綿羊GBS毒素受體編碼區(qū))、SEQ ID NO:3之核苷酸84-1568(包括起始密碼子的綿羊GBS毒素受體編碼區(qū))的核酸序列或其互補(bǔ)核酸序列的核酸序列的核酸分子可雜交的多核苷酸。
多核苷酸與SEQ ID NO:1、3或7中相應(yīng)區(qū)域的核酸序列或SEQ IDNO:1、3或7相應(yīng)區(qū)域的互補(bǔ)序列具有大約85％至100％，較好大于約87％，最好大于約95％，特別是大約99％至100％的相同性。特別優(yōu)選的多核苷酸包括SEQ ID NO:7中核苷酸266-1870、或SEQ ID NO:3中核苷酸87-1568、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11的核酸序列或其互補(bǔ)核酸序列。
優(yōu)選多核苷酸包括編碼與GBS毒素受體片段的氨基酸序列有大約85-100％、較好大于86％、更好大于95％，最好為99-100％相同性之多肽的核酸序列或者與這樣的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。優(yōu)選片段可結(jié)合GBS毒素。優(yōu)選的片段包括SEQ ID NO:2中殘基1-495或SEQ IDNO:8中殘基1-536的全部或一部分。特別優(yōu)選的是包括編碼與SEQ IDNO:4之殘基1-495、SEQ ID NO:2之殘基1-495、SEQ ID NO:8之殘基1-536的氨基酸序列有100％相同性之多肽的核酸序列的多核苷酸。
可按本文所述方法從產(chǎn)生GBS毒素受體的不同種的各種組織來源或細(xì)胞培養(yǎng)物，例如腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織，或喪失或限制血流的缺氧組織如再灌注損傷或受傷組織中分離編碼天然存在之GBS毒素受體的多核苷酸?？梢岳锰结樢噪s交方法，或利用寡核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)方法，以及借助本領(lǐng)域已知的其他分子生物學(xué)技術(shù)分離這樣的多核苷酸。所利用的探針和寡核苷酸一般包括SEQID NO:1、3、7、9或11，特別是SEQ ID NO:1、3或7所示序列的各個區(qū)域，或者編碼SEQ ID NO:2、4、8、10或12，特別是SEQ ID NO:2、4或8所示序列的各個區(qū)域。
可以通過同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列，確定可用于克隆編碼各種生物體之GBS毒素受體的基因的多核苷酸(見表4)。例如可以定位保守區(qū)，以合成用作雜交或核酸擴(kuò)增之探針的寡核苷酸或簡并寡核苷酸(詳見下文和實施例3)?？梢愿淖儑?yán)格度以達(dá)到選擇性雜交條件，實現(xiàn)相互間有小于95％相同性的核酸序列能彼此雜交。這些條件是本領(lǐng)域已知的，在本文中將進(jìn)行討論并提供實例。一般說來，本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸和片段與感興趣的核酸序列間的核酸序列相同性至少約為85％，最好有漸增的相同性，即至少約為90％、95％、99％和100％。
如本領(lǐng)域所知，可在高度嚴(yán)格洗滌條件和相應(yīng)的雜交條件下使用多核苷酸作為探針。本領(lǐng)域中，小的多核苷酸，例如200堿基或更短的多核苷酸常常被稱為寡核苷酸。使用多核苷酸作為探針以檢測同一或相關(guān)核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(例如參見Sambrook等人的上述文獻(xiàn)，特別是第11章，該文獻(xiàn)全文引入作為參考)。通?？捎砷L度為10-200個堿基的多核苷酸制得探針。較好從長度為10-60個堿基，最好12-40個堿基的多核苷酸制得探針?？梢园凑誔earson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448,1988)的方法，利用可顯示相比較之序列間的相同性程度的核酸同源性計算機(jī)程序如FASTA，基于序列比較得到的結(jié)果設(shè)計特異性探針。探針的大小取決于其與之雜交的基因的相應(yīng)區(qū)域。探針的大小隨著與不希望的核酸序列間的同源性程度增加而增加。可使用長度為10-50個核苷酸，較好50個以上核苷酸，最好100個以上核苷酸的探針。最好使用由GBS毒素受體的整個編碼區(qū)制得的探針。為了減少假陽性的數(shù)目，最好使用兩個探針鑒定出在雜交和洗滌條件下可與兩個探針結(jié)合的克隆?？梢园凑丈a(chǎn)商提供的使用說明書，在Applied BioSystems寡核苷酸合成儀上合成寡核苷酸。
通常按照常規(guī)雜交方法進(jìn)行雜交和洗滌。篩選噬斑復(fù)制物的典型雜交條件(Benton and Davis,Science 196:180,1978)可以是50％甲酰胺、5×SSC(NaCl、檸檬酸鈉)或SSPE(NaCl、磷酸鈉、EDTA)、1-5×Denhardt’s溶液、0.1-1％SDS、100-200μg剪切的異源DNA或tRNA、0-10％硫酸葡聚糖、1×105-1×107cpm/ml變性探針(比活性約為1×108cpm/μg)，并于42℃保溫大約6-36小時。除了不包括探針并且保溫時間通常縮短外，預(yù)雜交的其他條件基本上與雜交條件相同。洗滌條件一般是1-3×SSC、0.1-1％SDS、42-70℃，每約5-30分鐘換一次洗滌溶液?？梢园催@種方式得到包括等位基因序列在內(nèi)的同族細(xì)菌序列。對高度嚴(yán)格性雜交條件來說，可以改變各種參數(shù)，例如提高與標(biāo)記探針的保溫溫度，以增加雜交的嚴(yán)格性。為使實驗設(shè)計有更大的靈活性，最好可以在較低溫度下如室溫下與探針雜交，并可通過改變鹽濃度和洗滌溶液的溫度來修飾嚴(yán)格性。為達(dá)到高度嚴(yán)格條件，可使用大于或等于42℃的洗滌溫度(例如68℃)，并使用鹽濃度小于3×SSC例如0.1×SSC的洗滌緩沖液。在某些情況下，可使用TMACL(特別是對于富含G-C堿基對的多核苷酸)，以減少非特異性結(jié)合?？梢允褂玫蛧?yán)格性洗滌條件，以使其有較低相同性的多核苷酸或長度小于60堿基對的多核苷酸雜交。對于低嚴(yán)格性洗滌，可在鹽濃度大于或等于2×SSC的洗滌緩沖液中使用小于或等于42℃的溫度洗滌。
本發(fā)明包括擴(kuò)增靶核酸的方法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)技術(shù)?？衫肞CR技術(shù)鑒定各種生物體基因組中的相關(guān)序列，并檢測可疑樣品中的核苷酸序列，其中均使用彼此分隔開的、并且基于本文所示基因序列的寡核苷酸引物。引物互補(bǔ)于雙鏈DNA分子的相反鏈，并且隔開大約50-450或更多個核苷酸(通常不超過2000個核苷酸)。該方法包括制備特異性寡核苷酸引物，然后重復(fù)靶DNA變性、引物結(jié)合及用DNA聚合酶延伸的循環(huán)，以得到具有基于引物間隔而定的預(yù)期長度的DNA片段。由一個引物產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物作為另一個引物的附加靶序列。靶序列擴(kuò)增的程度受所完成的循環(huán)次數(shù)控制并且可按簡單公式2n(其中n是循環(huán)次數(shù))從理論上計算出來。如果每次循環(huán)的平均效率為大約65％至85％，25次循環(huán)即產(chǎn)生0.3-4.8×106個靶序列拷貝。許多出版物中都描述了PCR方法，例如可參見Saiki等人(Science 230:1350-1354,1985；Nature 324:163-166,1986)和Scharf等人(Science233:1076-1078,1986)的文章，也可參見美國專利4,683,194、4,683,195和4,683,203，各專利內(nèi)容均引入本文作為參考。另外，PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,ed.HA Erlich,Freeman Press,New York,NY(1992)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,eds.Innis,Gelfland,Snisky and White,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Mattilaet al.,Nucleic Acids Res.19:4967(1991)；Eckert,K.A.andKunkel,T.A.,PCR Methods and Applications 1:17(1991)；PCReds.McPherson,Quirkes and Taylor,IRL Press,Oxford(各文獻(xiàn)均引入本文作為參考)中還描述了RCR擴(kuò)增的其他附加方法。
在另一個具體實例中，可給哺乳動物投用反義多核苷酸以治療或預(yù)防涉及病理性和/或缺氧驅(qū)使的血管生成的醫(yī)學(xué)狀況。可用已知的化學(xué)寡核苷酸合成方法合成本發(fā)明的反義寡核苷酸(例如參見Winnacker,From Genes to Clones:Introduction to GeneTechnology,VCH Verlagsgesellschaft mbH(H.Ibelgaufts trans.1987))。可利用任何一種已知的寡核苷酸合成方法制備本發(fā)明的反義寡核苷酸。最好利用可從市場上購得的自動核酸合成儀制備反義寡核苷酸。用于制備本文所述寡核苷酸的設(shè)備Applied Biosystems 380B型DNA合成儀是利用氰乙基亞磷酰胺化學(xué)合成法。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的寡核苷酸合成方法制備可與mRNA轉(zhuǎn)錄本的任何部分雜交的反義寡核苷酸。雖然本發(fā)明的實踐中可利用任何長度寡核苷酸，但短于12個堿基的序列可能在與靶GBS毒素受體mRNA雜交中的特異性較小，而且可能更容易受到酶促消化而破壞。因此，最好是含有12個或更多個核苷酸的寡核苷酸。由于長度在18-21個核苷酸以上的序列被靶細(xì)胞攝入減少，所以有時在抑制GBS毒素受體翻譯中效果較差。因此，在本發(fā)明的實踐中優(yōu)選12-21個核苷酸，特別是12-18個核苷酸的寡聚體。原則上，與GBS毒素受體mRNA轉(zhuǎn)錄本的任何部分互補(bǔ)并可與之雜交的寡核苷酸均可有效地抑制轉(zhuǎn)錄本的翻譯，并能夠誘導(dǎo)本文所述的作用。在起始密碼子處或附近阻斷mRNA可最為有效地抑制翻譯過程。因此，優(yōu)選互補(bǔ)于GBS毒素受體mRNA轉(zhuǎn)錄本之5′區(qū)的寡核苷酸。在這個區(qū)域中可能干擾雜交的二級或三級結(jié)構(gòu)是最小的。另外，在3′方向距離起始位點(diǎn)太遠(yuǎn)的序列由于“通讀”現(xiàn)象而可能使核糖體松解反義/有義雙鏈從而允許信息翻譯，所以其與mRNA轉(zhuǎn)錄本雜交的效率可能較差(參見Shakin,J.Biochemistry 261,16018(1986))。反義寡核苷酸最好是針對蛋白質(zhì)合成的ATG起始密碼子處位點(diǎn)或其附近。優(yōu)選互補(bǔ)于GBS毒素受體mRNA中包括起始密碼子的部分的寡核苷酸。雖然優(yōu)選互補(bǔ)于GBS毒素受體轉(zhuǎn)錄本的5′區(qū)域特別是包括起始密碼子之區(qū)域的反義寡聚體，但應(yīng)理解有用的反義寡聚體不只限于那些與mRNA轉(zhuǎn)錄本中翻譯區(qū)域內(nèi)的序列互補(bǔ)者，而且也包括與5′和3′非翻譯區(qū)域內(nèi)包含的或延伸到其中的核苷酸序列互補(bǔ)的寡聚體。因為GBS毒素受體的不適當(dāng)表達(dá)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖，所以可將反義核苷酸或反義表達(dá)構(gòu)建體用于治療或預(yù)防與病理性的或缺氧驅(qū)使的血管生成及新血管形成有關(guān)的疾病。
在一個具體實例中，本發(fā)明的多核苷酸可能是線性形式的。在另一個具體實例中，多核苷酸可以以環(huán)形形式作為質(zhì)粒的一部分存在。
在另一個具體實例中，探針或PCR引物包括一組在不同位置上含有不同的簡并密碼子的多核苷酸，這些多核苷酸編碼全部或部分GBS毒素受體或互補(bǔ)于其編碼序列。這樣的多核苷酸可用于分離那些編碼與綿羊或人GBS毒素受體的氨基酸序列有至少約85％相同性之多肽(如其他生物體的GBS毒素受體)的核酸序列。可以使用程序化處理的合成儀，在某些位置上摻入特定組合的核酸殘基，以化學(xué)合成這些多核苷酸。
下列表2中顯示了典型常用的代碼。
表2堿基代碼符號 含義AA；腺嘌呤CC；胞嘧啶GG；鳥嘌呤TT；胸腺嘧啶UU；尿嘧啶MA或CRA或GWA或T/USC或GYC或T/UKG或T/UVA或C或G；不是T/UHA或C或T/U；不是GDA或G或T/U；不是CBC或G或T/U；不是ANA或C或G或T/U多肽本發(fā)明的另一個方面提供下列多肽(1)全長度GBS毒素受體蛋白或其天然存在的等位基因變體，(2)包括SEQ ID NO:2、4、8、10或12所示氨基酸序列中至少3個氨基酸的片段，以及(3)與SEQ IDNO:2、4或8之相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列有大約80％至100％氨基酸相同性的GBS毒素受體蛋白、多肽或多肽片段。優(yōu)選SEQ ID NO:2、4、8、10或12所示氨基酸序列的片段至少有5、6、7、8或9個氨基酸長并且是免疫學(xué)活性的，即免疫原性的，更優(yōu)選長度至少25個氨基酸的片段，以及包括SEQ ID NO:2的殘基181-419或SEQ ID NO:4的殘基1-240的氨基酸序列。最優(yōu)選的是能夠與GBS毒素結(jié)合的片段。優(yōu)選GBS毒素受體蛋白質(zhì)、多肽或多肽片段與SEQ ID NO:2、4或8之相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列至少有約86％、較好是至少約95％、更好是至少約99％相同性直至只有1個氨基酸差異，最好有100％氨基酸相同性。優(yōu)選的多肽與SEQ ID NO:2中殘基181-419、SEQ ID NO:4中殘基1-495構(gòu)成的氨基酸序列具有至少約89％、較好是至少約95％、更好是至少約99％相同性直至只有1個氨基酸差異，且最好有100％相同性。優(yōu)選全長度GBS毒素受體蛋白包括SEQ ID NO:2中殘基1-495、SEQ IDNO:4中殘基1-495、或SEQ ID NO:8中殘基1-536的氨基酸序列或其等位基因變體。本發(fā)明的多肽除GBS毒素受體蛋白、多肽或多肽片段外還可包括其它氨基酸。這樣的多肽一般包括與衍生于GBS毒素受體的第二種多肽連接的異源多肽。附加氨基酸最好共價連接到GBS毒素受體蛋白、多肽或多肽片段的氨基末端或羧基末端上。
可以按照已知方法制備GBS毒素受體的片段或類似物。片段或類似物的優(yōu)選的氨基和羧基末端出現(xiàn)在功能區(qū)邊界附近。例如，這樣的功能區(qū)包括當(dāng)GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合后提供誘導(dǎo)炎性反應(yīng)性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。GBS毒素被表達(dá)GBS毒素受體之內(nèi)皮細(xì)胞的C3結(jié)合并受其調(diào)理。這樣的結(jié)構(gòu)域可包括全部或部分GBS毒素的結(jié)合位點(diǎn)，或?qū)τ贕BS毒素受體結(jié)構(gòu)和/或功能必需的結(jié)構(gòu)域。最好使用計算機(jī)化比較方法鑒定出現(xiàn)于已知結(jié)構(gòu)和/或功能的其他蛋白質(zhì)中的序列基元或推斷的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。鑒定那些折迭成已知三維空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是已知的(Bowie et al.,Science 253:164,1991)?？墒褂糜嬎銠C(jī)化預(yù)測方法，例如PC/GENE中“Soap”程序所提供的親水性圖，鑒定推測的結(jié)構(gòu)和功能性區(qū)域。本發(fā)明人已使用Klein、Kanehisa和Delise(Biochim,Biophys.Acta 815:468-476,1985)的方法分類鑒定了一種可能具有七個跨膜區(qū)的整合膜蛋白，即綿羊GBS毒素受體SP55。這種蛋白質(zhì)也被俗稱為“7-spanner”。下列表3中列示了預(yù)測的各區(qū)段。
表3 SP55推測的跨膜結(jié)構(gòu)域

*相對于外周序列疏水性的整合序列疏水性。
有較高疏水性數(shù)值的整合序列很可能是跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分。
計算機(jī)化對比各種生物體GBS毒素受體的氨基酸序列為制備優(yōu)選的片段提供了進(jìn)一步的指南。例如參見表4，其中比較了人GBS毒素受體(HP59)(SEQ ID NO:8的殘基42-536)和綿羊GBS毒素受體(SP55)之殘基42-536的氨基酸序列。
表4人和綿羊GBS毒素受體氨基酸序列的比對SP55MKSPVSDLAPSDGEEGSDRTPLLQRAPRAEPAPVCCSARYNLAFLSFFGF 50| ||| ||| |||| |||||| ||||| |||||||||||| | ||||HP55MRSPVRDLARNDGEESTDRTPLLPGAPRAEAAPVCCSARYNLAILAFFGF 50SP55FVLYSLRVNLSVALVDMVDSNTTAKDNRTSYECAEHSAPIKVLHNQTGKK 100| | |||||||||||||||||| ||||| | |||||||| |||||||HP55FIVYALRVNLSVALVDMVDSNTTLEDNRTSKACPEHSAPIKVHHNQTGKK 100SP55YRWDAETQGWILGSFFYGYIITQIPGGYVASRSGGKLLLGFGIFATAIFT 150| ||||||||||||||||||||||||||||| ||| |||||| || |HPS5YQWDAETQGWILGSFFYGYIITQIPGGYVASKIGGKMLLGFGILGTAVLT 150SP55LFTPLAADFGVGALVALRALEGLGEGVTYPAMHAMWSSWAPPLERSKLLS 200|||| ||| ||| | |||||||||||| |||||||||||||||||||||HP55LFTPIAADLGVGPLIVLRALEGLGEGVTFPAMHAMWSSWAPPLERSKLLS 200SP55ISYAGAQLGTVVSLPLSGVICYYMNWTYVFYFFGIVGIIWFILWICLVSD 250||||||||||| |||||| ||||||||||||||| || || ||| ||||HP55ISYAGAQLGTVISLPLSGIICYYMNWTYVFYFFGTIGIFWFLLWIWLVSD 250SP55TPETHKTITPYEKEYILSSLKNQLSSQKSVPWIPMLKSLPLWAIVVAHFS 300|| || | |||||||||| ||||||||||| | |||||||||||||||HP55TPQKHKRISHYEKEYILSSLRNQLSSQKSVPWVPILKSLPLWAIVVAHFS 300SP55YNWTFYTLLTLLPTYMKEVLRFNIQENGFLSAVPYLGCWLCMILSGQAAD 350|||||||||||||||||| |||| ||||||| |||| ||||||||||||HP55YNWTFYTLLTLLPTYMKEILRFNVQENGFLSSLPYLGSWLCMILSGQAAD 350SP55NLRARWNFSTLWVRRVFSLIGMIGPAIFLVAAGFIGCDYSLAVAFLTIST 400|||| |||||| ||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||HP55NLRAKWNFSTLCVRRIFSLIGMIGPAVFLVAAGFIGCDYSLAVAFLTIST 400SP55TLGGFCSSGFSINHLDIAPSYAGILLGITNTFATIPGMIGPIIARSLTPE 450|||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || || ||||HP55TLGGFCSSGFSINHLDIAPSYAGILLGITNTFATIPGMVGPVIAKSLTPD 450SP55NTIGEWQTVFCIAAAINVFGAIFFTLFAKGEVQNWAISDHQGHRN 495|| ||||||| ||||||||||||||||||||||||| || |||HP55NTVGEWQTVFYIAAAINVFGAIFFTLFAKGEVQNWALNDHHGHRH 495HP55-SEQ ID NO:2SP55-SEQ ID NO:4因此，前述實施例證明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識別那些可用于確定GBS毒素受體序列中的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的序列基元及結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
雖然一類優(yōu)選的片段是具有相當(dāng)于功能區(qū)邊緣附近之氨基酸位置的氨基和/或羧基末端的片段，但也可以制備另外可替代的片段。對這些片段的氨基和羧基末端的選擇將由實踐者來決定，并且將取決于各種實驗需要，如易于構(gòu)建、對蛋白水解作用的穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、免疫反應(yīng)性、氨基或羧基末端殘基修飾等。多肽片段通常含有至少九個氨基酸并可含有任何數(shù)目的氨基酸，條件是肽片段與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的相應(yīng)片段有至少約80％相同性。與綿羊GBS毒素受體相比，人GBS毒素受體在N末端有41個附加氨基酸(SEQID NO:4和SEQ ID NO:8相比較)。類似物可以包括這41個N末端氨基酸的全部或部分加入或缺失。也可包括可用于如純化和/或抗體識別的N末端和C末端加入。例子包括組氨酸標(biāo)簽、FLAG(苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、鳥氨酸)表位、融合對象如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶、β半乳糖苷酶等。也可包括非保守氨基酸的缺失，條件是沒有實質(zhì)損害GBS毒素受體的結(jié)構(gòu)完整性和/或結(jié)合特性。
類似物也可包括氨基酸取代，特別是保守取代。另外優(yōu)選的是在種間具有較少相同性的區(qū)域中的保守和/或非保守取代。例如，GBS毒素受體的變體可包括相當(dāng)于SEQ ID NO:4之殘基2,6,10,11,16,17,24,31,44,46,52,53,55,74,75,81,82,84,93,102,132,133,137,144,145,148,149,155,159,163,165,166,179,212,219,235,236,239,242,246,253,254,257,259,260,271,283,285,319,324,332,333,338,355,362,366,377,439,442,445,450,453,461,487,488,491和495的氨基酸的保守和/或非保守取代。最好是存在于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的相應(yīng)位置中的氨基酸取代。例如參照圖4中的序列比對圖，相當(dāng)于SEQ ID NO:4之位置152的氨基酸可以是精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)或者R或Q的保守或非保守取代，并且最好是R或Q?？筛鶕?jù)氨基酸序列對比圖表(如表4所示)鑒定這些區(qū)域。優(yōu)選的氨基酸取代能(1)降低對蛋白水解作用的敏感性，(2)降低對氧化作用的敏感性，(3)改變對GBS毒素的結(jié)合親和性；(4)賦予或修飾這些類似物的其他物理化學(xué)或功能性質(zhì)。類似物可包括天然肽序列以外的其他各種突變序列，如帶有單一或多個氨基酸取代的序列。
保守氨基酸取代一般不會實質(zhì)上改變親代序列的結(jié)構(gòu)特征(例如取代的氨基酸并不會破壞親本序列中存在的螺旋結(jié)構(gòu)，不會破壞親本序列中特有的二硫鍵或其他類型的二級結(jié)構(gòu))。下列文獻(xiàn)中描述了本領(lǐng)域熟知的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的例子Proteins,Structures andMolecular Principles(1984)Creighton(ed.),W.H.Freeman andCompany,Nen York；Introduction to Protein Structure(1991),C.Branden and J.Tooze,Garland Publishing,New York,NY；Thornton et al.,(1991)Nature 354:105(引入本文作為參考)。保守取代是“多肽中的氨基酸被具有相似特征的氨基酸所取代”(McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms,Fifth Edition,1994,Sybil P.Parker,Editor in Chief)。天然存在之氨基酸的結(jié)構(gòu)和特征早已為人們所知(Biochemistry,2nd.Eds.,Albert L.Lehninger,p.71-76,1975)。例如，因其疏水性R基而表現(xiàn)出相似性的氨基酸是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。因其脂族R基而相似的是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。因其芳族R基而相似的是苯丙氨酸和色氨酸。因其不帶電荷的極性R基而相似的是甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。因其小分子量而相似的是甘氨酸和丙氨酸。因其R基團(tuán)中的羥基而相似的是絲氨酸和蘇氨酸。天冬酰胺和谷氨酰胺不同只在于一個甲基。同樣，天冬氨酸和谷氨酸不同也只是一個甲基，而且它們還因酸性R基團(tuán)而相似。賴氨酸、精氨酸和組氨酸因其堿性R基團(tuán)而相似。另外，賴氨酸和精氨酸因R基團(tuán)中脂族鏈末端上的氨基而相似。酪氨酸和苯丙氨酸因芳族基團(tuán)而相似。常見的氨基取代包括纈氨酸取代亮氨酸或異亮氨酸、丙氨酸取代甘氨酸、絲氨酸取代蘇氨酸、天冬酰胺取代谷氨酰胺、天冬氨酸取代谷氨酸，賴氨酸取代精氨酸，酪氨酸取代苯丙氨酸，以及反方向替代。
一般本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)盡量不改變那些GBS毒素受體中的保守氨基酸，而只對其進(jìn)行合理地保守取代。例如，表4中指出了應(yīng)避免在相當(dāng)于SEQ ID NO:4下述殘基的氨基酸處發(fā)生取代，特別是非保守取代1,3-5,7-9,12-15,18-23,26-30,32-43,45,47-51,54,56-73,76-80,83,85-92,94-101,103-131,134-136,138-143,146-147,150-154,156-158,160-162,164,167-178,180-211,213-218,220-234,237-238,240-241,243-245,247-252,255-256,258,261-270,272-282,284,286-318,320-323,325-331,334-337,339-354,356-361,363-365,367-376,378-438,440-441,443-444,446-449,451-452,454-460,462-486,489-490和492-494，所述殘基在表4所示的GBS毒素受體之間是保守的。
表5和6分別列示了HP59和SP55內(nèi)推測的酰胺化、N-糖基化、cAMP磷酸化、CK2磷酸化、十四烷基化(加入不飽和脂肪酸分子)及PKC磷酸化位點(diǎn)(Omega 1.1序列分析程序)的序列。這些表中給出的信息為本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計GBS毒素受體變體及片段提供了指導(dǎo)。例如，當(dāng)設(shè)計多肽變體時，可避免這些區(qū)域中的全部或部分取代。又如，當(dāng)設(shè)計除免疫原性多肽片段以外的多肽片段時，可以選擇地包括這些區(qū)域的全部或部分取代。

根據(jù)上述結(jié)果可見，優(yōu)選的多肽包括下式的氨基酸序列AAl-AAn-AAm其中AAl不存在或者是M；
AAn是SEQ ID NO:8中0～100個氨基酸，較好0-41個氨基酸，最好為殘基2～42的連續(xù)鏈，并且AAm是包括AA43至AA536的494個氨基酸的連續(xù)鏈，其中(1)AA43,AA47,AA51,AA52,AA57,AA58,AA65,AA66,AA72,AA85,AA87,AA93,AA94,AA96,AA115,AA116,AA122,AA123,AA125,AA134,AA143,AA173,AA174,AA178,AA185,AA186,AA189,AA190,AA196,AA200,AA204,AA206,AA207,AA220,AA253,AA260,AA276,AA277,AA280,AA283,AA287,AA294,AA295,AA298,AA300,AA301,AA312,AA324,AA326,AA360,AA365,AA373,AA374,AA379,AA396,AA403,AA407,AA418,AA480,AA483,AA486,AA491,AA494,AA502,AA528,AA529,AA532和AA536是基本氨基酸或修飾的氨基酸，并且最好是分別相當(dāng)于(a)SEQ ID NO:8的殘基43,47,51,52,57,58,65,66,72,85,87,93,94,96,115,116,122,123,125,134,143,173,174,179,185,186,189,190,196,200,204,206,207,220,253,260,276,277,280,283,287,294,295,298,300,301,312,324,326,360,365,373,374,379,396,403,407,418,480,483,486,491,494,502,528,529,532和536,(b)SEQ ID NO:4的殘基2,6,10,11,16,17,24,25,31,44,46,52,53,55,74,75、81,82,84,93,102,132,133,137,144,145,148,149,155,159,163,165,166,179,212,219,235,236,239,242,246,253,254,257,259,260,271,283,285,319,324,332,333,338,355,362,366,377,439,442,445,450,453,461,487,488,491和495,(c)其保守取代；(2)AA44-AA46,AA48-AA50,AA53-AA56,AA59-AA64,AA67-AA71,AA73-AA84,AA86,AA88-AA92,AA95-AA97-AA114,AA117-AA121,AA124,AA126-AA133,AA135-AA142,AA144-AA172,AA175-AA177,AA179-AA184,AA187-AA188,AA191-AA195,AA197-AA199,AA201-AA203,AA205,AA208-AA219,AA221-AA252,AA254-AA259,AA261-AA275,AA278-AA279,AA281-AA282,AA284-AA286,AA288-AA293,AA296-AA297,AA299,AA302-AA311,AA313-AA323,AA325,AA327-AA359,AA361-AA364,AA366-AA372,AA375-AA378,AA380-AA395,AA397-AA402,AA404-AA406,AA408-AA417,AA419-AA478,AA481-AA482,AA484-AA485,AA487-AA490,AA492-AA493,AA495-AA501,AA503-AA527,AA53-AA531知AA533-AA535
分別是(a)SEQ ID NO:8的殘基44-46,48-50,53-56,59-64,67-71,73-84,86,88-92,95,97-114,117-121,124,126-133,135-142,144-172,175-177,179-184,187-188,191-195,197-199,201-203,205,208-219,221-252,254-259,261-275,278-279,281-282,284-286,288-293,296-297,299,302-311,313-323,325,327-359,361-364,366-372,375-378,380-395,397-402,404406,408-417,419-478,481-482,484-485,487-490,492-493,495-501,503-527,530-531和533-535，或者是(b)其保守取代；以及(3)也可能沒有AA315至AA367。
優(yōu)選的多肽包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或只在綿羊GBS毒素受體(SEQ ID NO:4)和人GBS毒素受體(SEQ ID NO:8)之間非保守的特定殘基上有所不同的氨基酸序列。在這些變異中，最優(yōu)選的變異是產(chǎn)生由SEQ ID NO:11編碼之多肽的變異。更為優(yōu)選的變異是SEQ ID NO:4之氨基酸序列相應(yīng)位置上的氨基酸變異。特別優(yōu)選的是包括與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的氨基酸序列不同不超過約20％，較好為不超過大約10％、5％、1％氨基酸殘基，甚至只有1個至0個氨基酸差異之氨基酸序列的多肽。
除了定向改變特定氨基酸外，還可以利用活性選擇如噬菌體展示、定向進(jìn)化、DNA改組及原核或真核生物體之不同種基因的同源重組等技術(shù)(例如參見美國專利5,605,793、5,830,721、5,811,238、5,837,458、5,093,257、5,223,409、5,403,484、5,571,698和5,837,500，其引入本文作為參考)制備GBS毒素受體類似物。
可以檢測本文描述的人和綿羊GBS毒素受體的變體或片段是否可與GBS毒素結(jié)合，以試驗其必要的活性。
當(dāng)在細(xì)胞特別是被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上表達(dá)時，這些多肽可用于各種體外試驗，并可作為藥物開發(fā)和純化的試劑。例如，可使用結(jié)合試驗法，根據(jù)化合物與GBS毒素受體結(jié)合的能力篩選多糖等試驗化合物?？梢允褂眠@些方法鑒定某些可阻斷GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的候選藥物。這些藥物可用于預(yù)防和/或治療新生兒的早期發(fā)作性疾病。某些多肽可用于競爭性抑制GBS毒素與GBS毒素受體的結(jié)合。
可使用本發(fā)明的多肽親和純化GBS毒素、GBS毒素嵌合化合物，及其他可與GBS毒素受體結(jié)合的多糖或化合物。
也可使用多肽發(fā)展向表達(dá)GBS毒素受體的細(xì)胞定向送遞細(xì)胞毒性劑的方法。例如，可將細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)到可結(jié)合GBS毒素受體的分子上，以使選擇性地向生長著的腫瘤的新生脈管系統(tǒng)送遞細(xì)胞毒性劑。這種送遞系統(tǒng)可以高度濃縮地定位攻擊正在生長的腫瘤，同時最大限度地減小一般化學(xué)治療常常遇到的全身性副作用。在一例子中，細(xì)胞毒性劑可以是GBS毒素，當(dāng)其與GBS毒素受體結(jié)合后，即可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)(參見Hellerqvist et al.,Angiogenesis:Molecular Biology,Clinical Aspects,M.E.Maragoudakis等編，Plenum Press,NewYork 1994,pp.265-269)。可以按相似方法，向表達(dá)GBS毒素受體的細(xì)胞選擇性地送遞治療劑，以有利地治療腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或神經(jīng)損傷，或促進(jìn)傷口愈合。
也可使用本發(fā)明的多肽篩選和/或設(shè)計改善了治療性質(zhì)如改善了抑制缺氧誘發(fā)的新血管形成或血管生成能力的GBS毒素模擬藥物。這樣模擬化合物可用于治療和預(yù)防缺氧誘發(fā)的新血管生成或血管形成相關(guān)的病理狀況，如腫瘤生長、傷口愈合期間的斑痕形成、神經(jīng)損傷修復(fù)期間的神經(jīng)膠質(zhì)增生、再灌注損傷、再狹窄、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬，以血管生成為特征的其他慢性炎性疾病等。可以通過提高生物學(xué)穩(wěn)定性、對GBS毒素受體的親和性、補(bǔ)體結(jié)合活性、降低抗原性等來改善治療性質(zhì)。
也可使用本發(fā)明的多肽產(chǎn)生用于各種治療及研究目的的抗體?？墒褂帽景l(fā)明的多肽免疫兔、小鼠、山羊、雞或本領(lǐng)域已知適于這種免疫的其它動物。一般優(yōu)選單克隆抗體，但如果能夠檢測GBS毒素受體抗體與GBS毒素受體的結(jié)合，則也可以使用多克隆抗體。生產(chǎn)非人單多克隆抗體如鼠類單克隆抗體的方法是已知的(如參見Harlow et al.,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,pp.139-240,1989，將其引入本文作為參考)。因為可能難以產(chǎn)生抗人受體或結(jié)合區(qū)多肽的人單克隆抗體，所以可以用重組DNA技術(shù)將非人單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)，如F(ab′)2或鼠單克隆抗體的高變區(qū)轉(zhuǎn)移到人恒定區(qū)(Fc)或構(gòu)架區(qū)上，以產(chǎn)生實質(zhì)上的人分子(參見美國專利4,816,397和4,946,778，以及歐洲專利申請公開EP 173,494和239,400?；蛘?，可以按照WO 90/14430中介紹的一般方法篩選人B細(xì)胞的DNA文庫，以分離編碼可與受體蛋白特異性結(jié)合的人單克隆抗體或其部分的DNA序列，然后克隆并擴(kuò)增編碼具有所需特異性之抗體(或結(jié)合片段)的序列。
用于生產(chǎn)抗體的多肽通常是從推測的胞外結(jié)構(gòu)域設(shè)計的全長度受體或受體片段，其中胞外結(jié)構(gòu)域可用各種已知方法，包括基于其一級氨基酸序列預(yù)測多肽之二級或三級結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序鑒定。設(shè)計抗原性肽的另一種方法是利用預(yù)測特定一級氨基酸序列內(nèi)親水性高點(diǎn)的計算機(jī)程序。例如使用Happ和Woods(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3824-3829,1981)的方法，本發(fā)明人通過PC/GENE中的“抗原”程序鑒定了三個高親水性區(qū)域(如表7所示)，并使用該結(jié)果設(shè)計用于制備抗GBS毒素受體之抗體的抗原性肽(參見實施例4)。
表7SP55中的親水性高點(diǎn)

可使用識別完整GBS毒素受體各個部分的抗體進(jìn)一步研究受體的結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明的多肽可以引發(fā)產(chǎn)生能識別各種形式的GBS毒素受體的抗體。這些受體形式包括但不只限于在細(xì)胞表面上表達(dá)的完整的GBS毒素受體、變性的或未變性的GBS毒素受體，以及從細(xì)胞成分中純化的GBS毒素受體或包含在細(xì)胞溶解物中的GBS毒素受體?？墒褂肎BS毒素受體抗體研究種間差異及各種類型細(xì)胞中的GBS毒素受體表達(dá)水平。
識別全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域的抗體特別適合作為診斷劑用于監(jiān)測腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、檢測或鑒別類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬等慢性炎性狀況，以及檢測因缺氧驅(qū)使的血管生成引起的其他醫(yī)學(xué)狀況如再狹窄。這種抗體可應(yīng)用于各種標(biāo)準(zhǔn)的研究與診斷技術(shù)如Western印跡、免疫沉淀、ELISA、放射免疫試驗(RIA)、BIACOR、酶聯(lián)免疫試驗(EIA)、免疫熒光、熒光激活的細(xì)胞分選法(FACS)，及磁共振成象(MRI)、核磁共振(NMR)、計算機(jī)化軸向斷層顯象攝影(CAT)掃描和方位發(fā)射斷層顯象(position emission tomography,PET)等體內(nèi)診斷性顯象系統(tǒng)。
另外，可使用能阻斷GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的抗體治療或預(yù)防新生兒的早期發(fā)作性疾病。這些抗體可直接或間接封閉GBS毒素受體上的GBS毒素結(jié)合位點(diǎn)。
在一個具體實例中，GBS毒素受體蛋白是天然存在的，并且可用本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)如離子交換柱層析、高效液相層析(HPLC)、反相HPLC或利用可識別GBS毒素受體之抗體的親和層析法從細(xì)胞提取物中分離之。
或者，可使用適于在哺乳動物細(xì)胞，也可以是適于在細(xì)菌、昆蟲或酵母細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體，利用與適當(dāng)?shù)目刂菩蛄腥鐔幼涌刹僮鞯剡B接的編碼本發(fā)明之多肽的多核苷酸表達(dá)分離的蛋白質(zhì)和多肽。
通常可以在哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)GBS毒素受體多核苷酸或其片段。這種表達(dá)一般要依賴于哺乳動物啟動子，即能夠結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶并啟動下游編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子具有通常位于編碼序列之5′末端附近的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
適于在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的載體是本領(lǐng)域已知的，并可包括病毒復(fù)制子，或可確保編碼PAK65的序列整合到宿主基因組中的序列。適用的載體可包括衍生于SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛乳頭狀病毒、痘苗病毒及腺病毒的載體。
例如一種適用的載體是衍生于痘苗病毒的載體。在這種情況下，異源DNA被插入到痘苗病毒基因組中。將外來DNA插入到痘苗病毒基因組中的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例用可利用同源重組技術(shù)。一般將外源DNA插入到天然非必要的基因如可提供選擇性標(biāo)志的胸苷激酶基因(tk)中。已描述了極有利于重組病毒構(gòu)建的質(zhì)粒穿梭載體(如參見Mackett et al.(1984)；Chakrabarti et al.(1985)；Moss(1987))。然后在已用活的重組痘苗病毒免疫的細(xì)胞或個體中可發(fā)生外源多肽的表達(dá)。
這樣的合適哺乳動物表達(dá)載體通常含有一個或多個可促進(jìn)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄單位至少由介導(dǎo)外源DNA序列轉(zhuǎn)錄的啟動子元件組成。哺乳動物細(xì)胞適用的啟動子是本領(lǐng)域已知的，并包括如衍生于猿猴病毒40(SV40)(Subramani et al.,Mol.Cell.Biol.1:854-864,1981)、巨細(xì)胞病毒(CMV)(Boshart et al.,Cell41:521-530,1985)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)(Kaufmanand Sharp,Mol.Cell.Biol.2:1304-1319,1982)和牛乳頭瘤病毒(BPV)的啟動子，以及細(xì)胞啟動子如小鼠金屬硫蛋白1啟動子(美國專利No.4,579,821)、小鼠VK啟動子(Bergman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7041-7045,1993；Grant et al.,Nuc.AcidsRes.15:5496,1987)和小鼠VH啟動子(Loh et al.,Cell 33:85-93,1983)。
可以存在與本文所述的啟動子元件組合的增強(qiáng)子元件(增強(qiáng)子)，借以提高表達(dá)水平。增強(qiáng)子是當(dāng)與內(nèi)源或外源啟動子連接，在正常mRNA起始位點(diǎn)開始合成時可刺激轉(zhuǎn)錄效率提高達(dá)1000倍的任何調(diào)節(jié)性DNA序列。當(dāng)其位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游或下游，處于正?；虻罐D(zhuǎn)方向，或距離啟動子達(dá)1000多個核苷酸以上時，增強(qiáng)子仍是有活性的(Maniatis et al.,Science 236:1237,1987；Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,2nd ed.)。因為病毒有較寬的宿主范圍，所以病毒衍生的增強(qiáng)子元件可能是特別有用的?？捎糜诓溉閯游锛?xì)胞的增強(qiáng)子包括SV40早期基因增強(qiáng)子(Dijkema et al.EMBO J.4:76l,1985)和衍生于勞氏肉瘤病毒之長末端重復(fù)區(qū)(LTR)的增強(qiáng)子/啟動子(Gorman et al.,PNAS,79:6777,1982b)、衍生于人巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子(Boshart et al.,Cell 41:521,1985)以及小鼠μ增強(qiáng)子(Gillies,Cell 33:717-728,1983)。另外，有些增強(qiáng)子是可以調(diào)節(jié)的，并且只有存在誘導(dǎo)劑如激素或金屬離子時才成為有活性的(Sassone-Corsi and Borelli,Trends Genet.,2:215,1986；Maniatiset al.,Science 236:1237,1987)。
此外，轉(zhuǎn)錄單位還可包括與GBS毒素受體編碼序列可操作連接的終止序列和多聚腺苷酸化信號。多聚腺苷酸化信號包括但不只限于SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信號(Kaufman and Sharp)、腺病毒5EiB區(qū)的多聚腺苷酸化信號及人生長激素基因終止子(DeNoto et al.,Nuc.Acids Res.9:3719-3730,1981)。
可引起基因擴(kuò)增的序列也可能是必要的，編碼可選擇標(biāo)志的序列可能也是需要的。適于哺乳動物細(xì)胞的可選擇標(biāo)志在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括胸苷激酶、二氫葉酸還原酶(與氨甲喋呤一起作為DHFR擴(kuò)增劑)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、天冬酰胺合成酶、腺苷脫氨酶及抗生素(如新霉素)抗性基因。
可以在細(xì)胞表面上或以可溶或分泌形式表達(dá)GBS毒素受體或其片段。例如可以在編碼所需受體片段和至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列上可操作連接分泌性前導(dǎo)序列，以實現(xiàn)在細(xì)胞表面上的表達(dá)。分泌前導(dǎo)序列可以是由GBS毒素受體基因編碼的，或者可以是本領(lǐng)域通用的異源性前導(dǎo)序列，例如非洲粟酒裂殖酵母pho1+酸性磷酸酶的前導(dǎo)序列(Braspenning et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.245:166-171,1998)、人白介素2基因的前導(dǎo)序列(Sasada et al.,Cell Struc.Funct.13:129-141,1988)。例如，通過從基因構(gòu)建體中切掉編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列即可完成可溶或分泌形式的表達(dá)。在某些情況下，可以利用融合對象，例如易于在選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β半乳糖苷酶或其他基因等，實現(xiàn)可溶性和/或分泌。
可以使用編碼GBS毒素受體的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)牟溉閯游锼拗骷?xì)胞。可以用已知的任何方法將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，包括在病毒中包裝多核苷酸并用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或按已知方法轉(zhuǎn)染(如參見美國專利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455等，將其引入本文作為參考)宿主細(xì)胞。使用的轉(zhuǎn)化方法取決于待被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法是已知的，其中包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、在脂質(zhì)體中包裹多核苷酸及向核內(nèi)直接顯微注射DNA。
可用作表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的，并包括可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的許多無限增殖化的細(xì)胞系，其中包括但不只限于中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、Hela細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、NIE-115(Liles et al.,J.Biol.Chem.261:5307-5313,1986)、PC12人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如HepG2)及許多其他細(xì)胞系，如昆蟲來源的細(xì)胞系IF9和IF21。特別優(yōu)選的細(xì)胞系是組成型結(jié)構(gòu)表達(dá)重組GBS毒素受體構(gòu)建體的細(xì)胞系、繼后建立被轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征的細(xì)胞系，及優(yōu)先在細(xì)胞表面上表達(dá)GBS毒素受體或片段的細(xì)胞系。特別優(yōu)選的是ECV細(xì)胞(原來在科學(xué)文獻(xiàn)中稱為內(nèi)皮細(xì)胞系的膀胱癌細(xì)胞系)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，及牛、綿羊和人腎上腺髓質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞。
可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中和適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)表達(dá)GBS毒素受體或其片段的宿主細(xì)胞，以生產(chǎn)重組受體或其片段。可以根據(jù)特殊宿主細(xì)胞系的需要來改變培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，這在本領(lǐng)域是眾所周知的。一般在有固定量CO2(通常為5-10％)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)細(xì)胞。
在另一個具體實例中，可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如固相肽合成技術(shù)(Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco(1963)；Merrifield,J.Am.Chem Soc.85:2149-2154(1963))化學(xué)合成多肽片段。美國專利3,862,925、3,842,067、3,972,859和4,105,602中也舉例描述了這些及其他一些肽合成方法。可以手工合成，或者使用Applied Biosystems 430A或431A型肽合成儀(Foster City,California)，按照生產(chǎn)商提供的說明書進(jìn)行自動化合成。肽合成領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解到，在合成本發(fā)明類似化合物過程中構(gòu)建的中間體本身是新的和有用的化合物，因此也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
除了僅由天然氨基酸構(gòu)成的多肽外，還提供了肽模擬物。肽類似物通常是作為與模板肽有相似性質(zhì)的非肽藥物用于醫(yī)藥工業(yè)的。這些類型的非肽化合物被稱為“肽模擬物”(Fauchere,J.,Adv.Drug Res.15:29,1986；Veber and Freidinger,TINS p.392,1985；Evans etal.,J.Med.Chem.30:1229,1987，各文獻(xiàn)均引入本文作為參考)，并且通常是借助于計算機(jī)化的分子建模而開發(fā)的。可使用結(jié)構(gòu)上與治療有用的肽相似的肽模擬物產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防效果。一般說來，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與范式多肽(即具有生化特性或藥學(xué)活性的多肽)相似，但其中有一個或多個肽鍵任選地被選自下列一組的鍵所取代-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-(有關(guān)方法參見Spatola,A.F.,"Chemistry andBiochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins",B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)；Vol.1,Issue 3,"Peptide Backbone Modifications"(一般評述)；Morley,J.S.,Trends,Pharm.Sci.(1980)pp.463-468(一般評述)；Hudson,D.et al.,Int.J.Pept.Prot.Res.(1979)14:177-185(-CH2NH-,-CH2CH2-)；Spatola,A.F.et al.,Life Sci.(1986)38:1243-1249(-CH2-S-)；Hann,M.M.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I(1982)307-314(-CH-CH-，順式和反式)；Almquist,R.G.et al.,J.Med.Chem.(1980)23:1392-1398(-COCH2-)；Jennings-White,C.etal.,Tetrahedron Lett.(1982)23:2533(-COCH2-)；Szelke,M.et al.，歐洲專利申請EP 45665(1982)CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay,M.W.et al.,Tetrahedron Lett.(1983)24:4401-4404(-C(OH)CH2-)；Hruby,V.J.,Life Sci.(182)31:189-199(-CH2-S-)；各文獻(xiàn)均引入本文作為參考)。特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。這些肽模擬物可比前述多肽有明顯的優(yōu)點(diǎn)，例如更易于經(jīng)濟(jì)化生產(chǎn)、有更高的化學(xué)穩(wěn)定性、提高了藥學(xué)性質(zhì)(半壽期，吸附，潛力，效力等)、改變了特異性(例如有更寬的生物學(xué)活性譜)、降低了抗原性等。標(biāo)記肽模擬物通常包括將一個或多個標(biāo)記直接或通過間隔子(如酰胺基團(tuán))共價連接到肽模擬物的非干擾位置上，其中所說的位置是根據(jù)定量結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)和/或分子模擬推測的。這種非干擾位置一般是并不與GBS毒素形成直接接觸的位置(例如不是GBS毒素受體之GBS毒素結(jié)合區(qū)中的接觸點(diǎn))。肽模擬物的衍生化(如標(biāo)記)不應(yīng)在實質(zhì)上干擾肽模擬物的所需生物學(xué)或藥學(xué)活性。
可以用同一類型的D-氨基酸系統(tǒng)取代共有序列中的一個或多個氨基酸(如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)，以產(chǎn)生更為穩(wěn)定的肽。另外，可用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生包括共有序列或?qū)嵸|(zhì)上相同的共有序列變異的受限肽(參見Rizo and Gierasch,Ann.rev.Biochem.61:387,1992，將其引入本文作為參考)，例如可以加入內(nèi)部半胱氨酸殘基，以形成可使肽分子環(huán)化的分子內(nèi)二硫鍵。
本發(fā)明還提供包括與哺乳動物GBS毒素受體或其片段結(jié)合之GBS毒素的復(fù)合體。復(fù)合體最好包括與上述可結(jié)合GBS毒素的GBS毒素受體多肽結(jié)合的GBS毒素。復(fù)合體一般是在可使GBS毒素與多肽特異性結(jié)合的條件下，使GBS毒素與這種多肽接觸而形成的。GBS毒素可以是被標(biāo)記或者未被標(biāo)記的。多肽可以存在于細(xì)胞表面上，或固定于小孔內(nèi)或微球上，或者是存在于溶液中。檢測方法本發(fā)明的另一個方面提供檢測或監(jiān)測以病理性和/或缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管形成為特征的各種醫(yī)學(xué)狀況的方法。這些醫(yī)學(xué)狀況包括但不只限于新生兒早期發(fā)作性疾病和腫瘤進(jìn)展。
可以通過檢測病人體內(nèi)是否存在GBS毒素來診斷早期發(fā)作性疾病。一種檢測方法是競爭法，其中包括確定可疑樣品對GBS毒素與GBS毒素受體或其片段間之復(fù)合體形成的影響。例如，該方法包括在有及沒有疑含有GBS毒素的樣品存在下和允許GBS毒素與多肽特異性結(jié)合的條件下，使對照GBS毒素與GBS毒素受體多肽接觸，并將存在有可疑樣品時復(fù)合體形成的量與沒有可疑樣品時復(fù)合體形成的量相比較。對照GBS毒素最好是實質(zhì)上純化的并已知濃度。對照GBS毒素最好還包括有標(biāo)記。適用的標(biāo)記包括但不只限于放射性同位素、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、生物素、抗生物素蛋白及其他常用標(biāo)記。另一種方法是直接檢測可疑樣品中存在的GBS毒素與GBS毒素受體多肽間復(fù)合體的形成，而不是經(jīng)對照GBS毒素競爭進(jìn)行測定。
可以通過檢測腫瘤區(qū)域內(nèi)是否存在GBS毒素受體來確定哺乳動物組織中的病理性脈管系統(tǒng)，存在GBS毒素受體即為病理性脈管系統(tǒng)的指征。可用該方法監(jiān)測腫瘤生長或轉(zhuǎn)移。一種檢測方法包括使用可與GBS毒素受體，最好是GBS毒素受體之胞外區(qū)域特異性結(jié)合的分子，如抗體。該方法一般包括向哺乳動物組織如患有癌性腫瘤的哺乳動物體內(nèi)投用可識別GBS毒素受體的抗體，并檢測抗體的特異性結(jié)合?？贵w一般是標(biāo)記的抗體。觀察的結(jié)果最好是定量的并且是可以看見的。
在外科手術(shù)期間，可使用本領(lǐng)域已知的及上述的顯象技術(shù)觀察腫瘤的邊界。腫瘤的顯象是通過檢測標(biāo)記的抗體或其他分子與腫瘤病理性脈管系統(tǒng)上的GBS毒素受體的結(jié)合而達(dá)到的。這種外科也稱為虛擬外科，因為進(jìn)行手術(shù)時，外科醫(yī)生是在成象屏上間接觀察腫瘤。
藥物開發(fā)本發(fā)明的第四個方面提供使用本發(fā)明的多肽鑒定用于治療以缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管形成為特征的醫(yī)學(xué)狀況的候選藥物的方法。優(yōu)選的化合物是GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的競爭性抑制劑或抑制GBS毒素受體活性的化合物。特別優(yōu)選的是抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中第一個磷酸化步驟的化合物?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種隨機(jī)藥物設(shè)計方法生產(chǎn)這些化合物。所說的方法例如包括組合化學(xué)法(美國專利5,646,285、5,639,603)、肽文庫(美國專利5,591,646、5,367,053、5,747,334)、噬菌體展示(美國專利5,403,484、5,223,409)、SELEX(美國專利5,773,598、5,763,595、5,763,566)，以及組合糖類化學(xué)法(Hirschmann et al,J.Med.Chem.(1996)39:2441-2448；Hirschmann et al.,J.Med.Chem.(1998)41:1382-1391；SofiaMJ,Mol.Divers(1998)3:75-94；美國專利5,780,603和5,756,712)。
另外的方法是旨在生產(chǎn)改善了治療性質(zhì)的GBS毒素模擬物或GBS毒素受體模擬物的合理藥物設(shè)計方法，包括X射線結(jié)晶法、核磁共振(NMR)相關(guān)光譜法(美國專利5,698,401)、計算機(jī)輔助的分子建模(美國專利5,579,250、5,612,895、5,680,331,Cooper et al.,J.Comput.-Aided Mol.Design 3:253-259(1989)；Brent et al.,J.Comput.-Aided Mol.Design 2:310-311(1988))及本領(lǐng)域已知的其他合理藥物設(shè)計方法。

圖1顯示了本發(fā)明的某些合理藥物設(shè)計方法中主要步驟的全面觀。例如，合理藥物設(shè)計的一種方法包括使用計算機(jī)程序如INSIGHTⅡ(可購自Biosym Technologies,10065 BarnesCanyon Road,San Diego,California)，根據(jù)同源性建模來鑒定蛋白質(zhì)中的活性位點(diǎn)。這種方法有利于使用已知結(jié)構(gòu)的相似蛋白質(zhì)繪制蛋白質(zhì)模型。例如可從Day Light Information Systems公司(Irvine,California 92714)和Molecular Design有限公司(2132 FaraltonDrive,San Leandro,California 94577)等供應(yīng)商購得包含進(jìn)行三維數(shù)據(jù)比較的檢索算法的商業(yè)軟件。
在一個具體實例中，化合物能夠結(jié)合GBS毒素受體并以相似于GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的方式誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。例如，可使用這些化合物作為藥物將炎性反應(yīng)控制在腫瘤中正在發(fā)展著的脈管系統(tǒng)中。
在另一個具體實例中，化合物可以在誘導(dǎo)或不誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，特別是不誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的情況下與GBS毒素受體結(jié)合。在一種情況下，可使用化合物作為載體，以將用于治療的細(xì)胞毒性劑導(dǎo)向病理性新脈管系統(tǒng)部位。例如，可以將細(xì)胞毒性劑化學(xué)偶聯(lián)到化合物上，以形成嵌合藥物。這些嵌合藥物可用于治療腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、傷口愈合、脊髓損傷，和以缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管形成為特征的其他狀況。在另一個例子中，可直接使用化合物競爭性抑制GBS毒素與GBS毒素受體的結(jié)合?？墒褂眠@樣的化合物治療新生兒的早期發(fā)作性疾病。
在第三個具體實例中，化合物可與GBS毒素結(jié)合并可用于治療新生兒的早期發(fā)作性疾病。
可在隨機(jī)誘變系統(tǒng)如噬菌體展示或酵母雙雜交系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸，以合成并鑒定可與GBS毒素結(jié)合的突變肽GBS毒素受體多肽?；蛘撸墒褂帽景l(fā)明的固相化或可溶性GBS毒素受體片段篩選組合肽文庫和組合化學(xué)文庫、非隨機(jī)的重組體和合成肽及其他化合物(如非肽分子)與GBS毒素受體結(jié)合的情況。然后可在功能試驗中進(jìn)一步定性可與GBS毒素或GBS毒素受體結(jié)合之化合物的任何上述活性，以鑒定可用于治療涉及血管生成或新血管形成之醫(yī)學(xué)狀況的候選藥物。
可以在允許GBS毒素與GBS毒素受體或片段結(jié)合的條件下，使試驗化合物與能夠結(jié)合GBS毒素的哺乳動物GBS毒素受體或其片段合并，并確定該化合物對GBS毒素與GBS毒素受體或片段結(jié)合的抑制水平，以鑒定能抑制GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的化合物。
在一個優(yōu)選實例中，由細(xì)胞特別是在細(xì)胞表面上表達(dá)GBS毒素受體或其片段。在有或沒有試驗化合物存在下，使細(xì)胞與標(biāo)記的GBS毒素接觸。然后確定GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的改變?；蛘撸珿BS毒素是未標(biāo)記的，而可識別GBS毒素的抗體是被標(biāo)記的。使用標(biāo)記的抗體檢測化合物對GBS毒素與GBS毒素受體或其片段之結(jié)合的抑制作用。在另一個實例中，GBS毒素受體或其片段與細(xì)胞沒有聯(lián)系，而是偶聯(lián)到基質(zhì)如微量滴定板的小孔或微球上。其他適用的固相支持物包括膠乳、聚苯乙烯小珠(Interfacial Dynamics Corp.Portland,Oreg.)、磁性顆粒(Advanced Magnetics,Cambridge,Mass.)及尼龍球(Hendry et al.,J.Immunological Meth.35:285-296,1980)。可以將受體或其片段直接偶聯(lián)到基質(zhì)上，或者通過可與受體片段結(jié)合的抗體間接偶聯(lián)到基質(zhì)上。在第三個具體實例中，GBS毒素受體或片段是可溶的，并可以用識別受體或片段的抗體免疫沉淀之。
鑒定可結(jié)合哺乳動物GBS毒素受體之化合物的優(yōu)選方法包括以下步驟(1)使試驗化合物在得以發(fā)生特異性結(jié)合的條件下與GBS毒素受體或其片段合并，(2)檢測試驗化合物與GBS毒素受體或片段間形成的復(fù)合體。一種優(yōu)選的方法是競爭試驗，其中檢測試驗化合物競爭結(jié)合GBS毒素受體或其片段的能力。在這一試驗中，在有或沒有試驗化合物存在下，使GBS毒素與GBS毒素受體或其片段合并。有試驗化合物時比沒有時降低了GBS毒素的特異性結(jié)合，即表明試驗化合物有能力與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合。另一種方法包括在如試驗化合物相同的條件下使對照化合物與GBS毒素受體或片段合并，并比較試驗化合物或?qū)φ栈衔锱cGBS毒素受體或其片段之間形成的復(fù)合體的量。試驗化合物和/或?qū)φ栈衔镒詈檬潜粯?biāo)記的。試驗化合物可以是任何一類的化合物，例如小的有機(jī)分子(如用于組合化學(xué)法的和以組合化學(xué)方法得到的)、多糖、多肽、RNA、抗體及單鏈抗體。在一優(yōu)選實例中，多肽是由細(xì)胞表達(dá)的，最好是由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)的，且最好在細(xì)胞表面上表達(dá)。這樣一個系統(tǒng)特別適于試驗包括細(xì)胞毒性劑之嵌合化合物的效力?？梢酝ㄟ^使在細(xì)胞表面上表達(dá)GBS毒素受體的細(xì)胞與試驗嵌合化合物接觸并檢測細(xì)胞毒性征象，以確定化合物的細(xì)胞毒活性?？梢酝ㄟ^細(xì)胞存活性染色、檢測細(xì)胞凋亡(例如DNA梯度試驗或TUNELTM(其與斷裂的DNA結(jié)合)染色)、檢測細(xì)胞內(nèi)氚標(biāo)記的胸苷摻入、定量分析激酶依賴性磷酸化(如使用磷酸抗體或各種磷酸顯象技術(shù))等方法檢測這些征象。
在另一個具體實例中，本發(fā)明提供鑒定GBS毒素受體抑制劑的方法。該方法包括在有或沒有試驗化合物存在下保溫試驗細(xì)胞。試驗細(xì)胞表達(dá)GBS毒素受體或其具有GBS毒素受體活性的片段(如相對于并不表達(dá)這些片段的相同細(xì)胞類型的對照細(xì)胞而言，可增加表達(dá)細(xì)胞的增殖或遷移的片斷)。在沒有試驗化合物時被保溫的細(xì)胞也能增殖或遷移的條件下保溫試驗細(xì)胞。并不表達(dá)GBS毒素受體或其片段的對照細(xì)胞的增殖或遷移比表達(dá)GBS毒素受體或片段的細(xì)胞更小。比較有或沒有試驗化合物存在時保溫的檢測細(xì)胞的增殖或遷移(本文中也稱“遷移率”)。有試驗化合物時比沒有試驗化合物時的增殖或遷移小，表明試驗化合物是GBS毒素受體的抑制劑。為了確定試驗化合物是否特異地抑制GBS毒素受體，還比較有或沒有試驗化合物時對照細(xì)胞的增殖和遷移。在有或沒有試驗化合物時被保溫的對照細(xì)胞的增殖或遷移沒有差別的情況下，與試驗化合物接觸的試驗細(xì)胞比不接觸試驗化合物的試驗細(xì)胞的增殖或遷移率低，表明試驗化合物特異性地抑制GBS毒素受體。很顯然，該方法的對照部分不需要與方法的試驗部分同時完成。例如，可以將對照細(xì)胞與一組試驗化合物保溫，以便在試驗細(xì)胞與試驗化合物保溫之前確定試驗化合物的細(xì)胞效應(yīng)。可以檢測細(xì)胞在培養(yǎng)皿上的運(yùn)動來確定細(xì)胞的游動和遷率?？梢杂迷S多方法檢測細(xì)胞增殖，例如檢測氚標(biāo)記的胸苷摻入、細(xì)胞計數(shù)、凋亡試驗及存活性試驗。優(yōu)選的細(xì)胞包括GBS毒素受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，特別是GBS毒素受體轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞，最好是血管內(nèi)皮細(xì)胞或微血管內(nèi)皮細(xì)胞。表達(dá)GBS毒素受體的原代細(xì)胞，例如已在細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代不超過8或9次的，匯合的內(nèi)皮細(xì)胞也是優(yōu)選的。一類優(yōu)選的試驗化合物包括激酶抑制劑，優(yōu)選cAMP依賴型激酶抑制劑、PKC抑制劑及CK2抑制劑，它們可作為開發(fā)更特異的GBS毒素受體抑制劑之起始點(diǎn)。另一類化合物包括GBS毒素受體特異性抗體。特別優(yōu)選的是單鏈抗體，特別是識別GBS毒素受體上各種表位的單鏈抗體。其次是對GBS毒素受體配體的結(jié)合位點(diǎn)特異的雙價抗體，因為它們在二聚化后可激發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。
本發(fā)明的另一個具體實例是鑒定作為血管生成之基本成分的內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移抑制劑的方法。該方法基本上包括前示段落中所述的步驟并使用內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個具體實例是鑒定用于治療或預(yù)防以病理性或缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管形成為特征的醫(yī)學(xué)狀況的治療化合物的方法。該方法基本上包括上述步驟并使用衍生于受上述醫(yī)學(xué)狀況影響之哺乳動物組織的細(xì)胞，或作為受影響組織之模型的細(xì)胞。
設(shè)計可抑制GBS毒素與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合之化合物的優(yōu)選方法包括以下步驟(1)模擬并選擇GBS毒素受體或其片段的最可能的構(gòu)象，(2)設(shè)計實質(zhì)上模擬GBS毒素受體或其片段能量上最可能的三維結(jié)構(gòu)的化學(xué)改性類似物，(3)以化學(xué)方法合成該類似物，(4)估測該類似物的生物活性。步驟(a)和(b)最好是借助計算機(jī)程序完成的。
設(shè)計與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合之化合物的優(yōu)選方法包括下列步驟(1)模擬并選擇GBS毒素受體或其片段的最可能的構(gòu)象，(2)推測受體或片段的最可能的結(jié)合區(qū)，(3)設(shè)計可與受體或片段形成能量上最可能的復(fù)合體的化合物，(4)化學(xué)合成該化合物，(5)估測該化合物的生物活性。步驟(a)-(c)最好是借助計算機(jī)程序來完成。
用于上述篩選試驗的多肽最好是與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有GBS毒素受體活性的片段至少有約85％，較好有至少約95％，最好有大于約99％的序列相同性的多肽。最優(yōu)選的是具有SEQ ID NO:2、4或8的氨基酸序列的多肽或其具有GBS毒素受體活性的片段。純化方法本發(fā)明的另一方面是純化能結(jié)合GBS毒素受體的化合物，例如天然配體、其他多糖或GBS毒素受體特異性抗體的方法。該方法包括提供包括哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素的片段的多肽，使該多肽與含有化合物的樣品在允許化合物與多肽特異性結(jié)合的條件下接觸，并從樣品的殘留物中分離出結(jié)合的化合物。多肽可以是水溶性的，但最好是固定在基質(zhì)上，如小珠、膜或細(xì)胞表面上，特別是固定在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的表面上。治療方法可使用GBS毒素受體多肽和干擾GBS毒素結(jié)合的抗體治療人或動物體。例如，可給病人投用這種GBS毒素結(jié)合抑制劑，以治療或預(yù)防涉及GBS毒素與GBS毒素受體的結(jié)合的醫(yī)學(xué)狀況，如新生兒的早期發(fā)作性疾病。
可使用可結(jié)合和/或抑制GBS毒素受體的GBS毒素模擬物或其他化合物(有些可以用本發(fā)明的藥物發(fā)現(xiàn)方法鑒定)治療人或動物體，或者可用于制造治療或預(yù)防涉及病理性和/或缺氧驅(qū)使之血管生成的醫(yī)學(xué)狀況，如癌性腫瘤、慢性炎性疾病、傷口愈合或神經(jīng)損傷修復(fù)期間的癍痕形成等的藥物。
在一優(yōu)選實例中，這些化合物如GBS毒素一樣，通過結(jié)合GBS毒素受體并引發(fā)炎性反應(yīng)而發(fā)揮其治療作用。這些化合物最好包括可用于結(jié)合補(bǔ)體C3的硫氫基、羥基或氨基。
在另一個優(yōu)選實例中，化合物是GBS毒素活性的抑制劑。優(yōu)選的抑制劑包括但不只限于激酶抑制劑、GBS毒素受體特異性單鏈抗體，及在高度嚴(yán)格條件下可與GBS毒素受體核酸序列，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的核酸序列特異性雜交的反義多核苷酸。
在另一優(yōu)選實例中，化合物發(fā)揮其治療作用而不引發(fā)炎性反應(yīng)。可使用化合物向接近于表達(dá)GBS毒素受體之細(xì)胞的組織，如經(jīng)受血管生成的腫瘤送遞細(xì)胞毒性劑?；衔镒詈门c細(xì)胞毒性劑共價連接，并可以與細(xì)胞毒性劑非共價結(jié)合，如結(jié)合到脂質(zhì)體、微膠?；蚱渌H脂性藥物包裹結(jié)構(gòu)的外表面上。優(yōu)選的細(xì)胞毒性劑包括本領(lǐng)域已知的抗腫瘤劑，如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、異環(huán)磷酰胺及其他烷基化劑、氨甲喋呤及其他葉酸拮抗劑、6-巰基嘌呤及其他嘌呤拮抗劑、5-氟尿嘧啶及其他嘧啶拮抗劑、阿糖胞苷、硫酸長春堿(ovinblastine)、硫酸長春新堿(vincustine)及其他長春花堿(vincas)、依托伯苷及其他鬼臼毒素、多柔比星(doxorubicin)、博來霉素、絲裂霉素及其他抗生素、卡莫司汀、洛莫司汀及其他亞硝基脲、順鉑、干擾素、天冬酰胺酶(asparaginase)、他莫昔芬、氟他胺及紫杉酚。其他優(yōu)選的生物劑包括衍生于特異性腫瘤啟動子或抑制基因的有義和/或反義RNA或DNA序列，所述特異性腫瘤啟動子或抑制基因例如是p53和TGF基因家族，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族成員如ras和myc，以及生長因子受體激酶如flt2和flk1、Tai1、Tai2和neuropholin，及參與瘤性疾病和其他病理性血管生成相關(guān)疾病的其他基因。
在另一個具體實例中，可作為誘餌給病人投用GBS毒素受體多肽或其片段，以減低存在于患病組織(如腫瘤組織)中的GBS毒素受體的受刺激作用，從而降低導(dǎo)致受影響組織中細(xì)胞增殖和遷移的細(xì)胞反應(yīng)。最好以可溶形式，特別是無跨膜區(qū)的形式投用GBS毒素受體多肽或其片段。藥物組合物可以使用具有預(yù)期的生物可利用性、穩(wěn)定性及體內(nèi)藥物動力學(xué)方面的其他重要參數(shù)的，包括GBS毒素結(jié)合所必需之結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明多肽作為GBS毒素結(jié)合的競爭性抑制劑，用于治療其中GBS毒素結(jié)合不合乎需要的醫(yī)學(xué)狀況，例如新生兒早期發(fā)作性疾病。適用的多肽可以包括具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示之部分或全部氨基酸序列的片段或其類似物。
可以使用借助本發(fā)明的多肽確定的能結(jié)合GBS毒素受體和/或誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，并具有預(yù)期的藥物動力學(xué)性質(zhì)的化合物，治療其中GBS毒素結(jié)合可能有治療作用的醫(yī)學(xué)狀況，例如涉及病理性或缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管形成的醫(yī)學(xué)狀況。
本發(fā)明的藥物組合物包括可含有各種成分的藥學(xué)上可接受的載體，其中所說的成分可提供調(diào)節(jié)藥物濃度、調(diào)節(jié)可溶性、化學(xué)穩(wěn)定化、調(diào)節(jié)粘度、增強(qiáng)吸收率、調(diào)節(jié)pH等功能。例如，水溶性配方中的藥物組合物優(yōu)選包括緩沖液如磷酸緩沖液或pH在約7-8之間的其他有機(jī)酸鹽。其他成分可包括抗氧化劑如抗壞血酸、親水性聚合物如單糖、二糖及包括纖維素或其衍生物、糊精在內(nèi)的其他碳水化合物、螯合劑如EDTA，以及醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域中已知的其他成分(參見Remington’sPhamaceutical Science，最新版，Mack Publishing Company,Easton,PA)。
如GBS毒素受體多肽、模擬物或類似物，或者GBS毒素模擬物或類似物等活性化合物在特定應(yīng)用中的有效量取決于幾個方面的因素，包括多肽、模擬物或類似物的化學(xué)性質(zhì)、被治療的疾病、給藥方法等。為達(dá)到有效量，優(yōu)選多肽或模擬物在細(xì)胞表面上靶GBS毒素受體處的濃度約為0.0001至100μM，較好低于10μM，最好低于1μM。
可以將活性化合物與各種藥用可接受的惰性載體合并制成不同的劑型，如根據(jù)選用的給藥途徑可制成片劑、膠囊劑、錠劑、糖錠、硬糖果、粉末、噴霧劑、酏劑、糖漿、可注射或滴眼溶液等口服或胃腸道外給藥制劑。胃腸道外給藥包括下列途徑靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、滑膜內(nèi)、經(jīng)皮(包括透皮、眼內(nèi)、舌下、頰部)、局部(包括眼、皮膚、眼內(nèi)、直腸、經(jīng)吹入和氣霧劑鼻吸入)及直腸系統(tǒng)。
可將活性化合物與例如惰性稀釋劑或可食用載體混合口服給藥，可將其裝入硬或軟殼明膠膠囊、壓成片劑，或直接摻入到食物中。為了口服給藥，可以將活性化合物摻入賦形劑，并以可攝入的片劑、含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑等劑型使用。這些組合物和制劑應(yīng)至少含有0.1％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比例可以有所變化，并可以在相應(yīng)劑型單位的大約2-6％重量之間。這些治療有用的組合物中活性化合物的量應(yīng)能保證病人獲得適當(dāng)?shù)膭┝?。制備本發(fā)明的優(yōu)選組合物或制劑時，應(yīng)使口服劑量單位含有大約1-1000mg活性化合物。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可含有下列成分聚乙烯吡咯烷酮、黃耆膠、阿拉伯膠(acacia)、蔗糖、玉米淀粉或明膠等粘結(jié)劑，磷酸鈣、檸檬酸鈉和碳酸鈣等賦形劑，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、甘些復(fù)合硅酸鹽、海藻酸等崩解劑，十二烷基硫酸鈉、滑石粉和硬脂酸鎂等潤滑劑，蔗糖、乳糖或糖精等甜味劑，薄荷、冬青油或櫻桃香精等香味劑。也可以使用相似類型的固體組合物作為軟和硬明膠膠囊的填充劑；這方面的優(yōu)選材料包括乳糖或高分子量聚乙二醇。當(dāng)劑量單位為膠囊時，其可另外含有液體載體。可以作為包衣而存在各種其他材料，或借以修飾劑量單位的物理形態(tài)。例如，可以用蟲膠、糖或兩者包被片劑、丸劑或膠囊。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的羥苯甲酸甲酯或丙酯、染料、櫻桃或桔橙香味劑、乳化劑和/或懸浮劑、以及水、乙醇、丙二醇、甘油等稀釋劑，以及各種組合。當(dāng)然，用于制備任何劑型的任何材料都應(yīng)是藥品純的，并且在所使用的量下基本上是無害的。此外，可以將活性化合物摻入到緩釋制劑或配方中。
活性化合物也可以經(jīng)胃腸道外或腹膜內(nèi)給藥。為了經(jīng)胃腸道外給藥，可以使用在芝麻油或花生油，或含水丙二醇中制成的溶液，以及相應(yīng)水溶性堿金屬或堿土金屬鹽的無菌水溶液。必要時，這些水溶液應(yīng)是經(jīng)過適當(dāng)緩沖的，并用足夠的鹽水或葡萄糖將液體稀釋劑制成等滲液。活性化合物作為游離堿或藥用可接受鹽的溶液，可在水中與適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┤缌u丙基纖維素混合制成。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其混合物和油中制成分散劑。在常規(guī)儲存和使用條件下，這些制劑可含有防止微生物生長的防腐劑。這些特殊的含水溶液特別適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射。在這方面，所使用的無菌含水介質(zhì)都可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地得到。
適于注射使用的藥物劑型包括無菌水溶液或分散劑，或用于臨時配制無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末。各種劑型都必須是無菌的，并且必須以易于注射的流體存在。其在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并必須防腐保存以防止細(xì)菌和真菌等微生物的污染。載體可以是含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、其適當(dāng)?shù)幕旌衔锛爸参镉偷娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)?？梢允褂寐蚜字韧繉?、保持分散劑中顆粒的所需大小及使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴？梢杂酶鞣N抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物污染。在許多情況下，優(yōu)選應(yīng)包括等滲劑例如糖或氯化鈉?？梢允褂醚舆t吸收的藥劑，如一硬脂酸鋁和明膠來延長可注射組合物的吸收。
將必需量的活性成分摻入到含上述各種其他成分的適當(dāng)溶劑中，然后過濾除菌即制得無菌注射液。一般說來，將無菌的活性成分摻入含有基本分散介質(zhì)和上述其他必要成分的無菌載體中，即制得分散劑。為了得到用于配制無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選用真空干燥或冷凍干燥技術(shù)由前述無菌過濾溶液得到活性成分加上所需附加成分的粉末。
為了局部給藥，可以在適于滴眼給藥的容器內(nèi)制成相似于上述非胃腸道給藥溶液的無菌稀水溶液(通常濃度約0.1-5％)。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或與藥用載體合并用于哺乳動物。如上所述，活性化合物和載體的相對比例是根據(jù)化合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、選擇的給藥途徑、選用的特定化合物及被治療病人的生理特征等因素確定的。試劑盒本發(fā)明的再一個方面是用于完成上述方法的試劑盒。優(yōu)選的試劑盒包括GBS毒素受體或其片段。受體或其片段最好是固相化的?？墒褂脙?yōu)選的試劑盒鑒定可與GBS毒素受體結(jié)合的化合物，并至少包括一種表達(dá)GBS毒素受體的細(xì)胞。
另一個具體實例是用于監(jiān)測腫瘤生長或轉(zhuǎn)移的，包括檢測GBS毒素受體表達(dá)之試劑的試劑盒。這種試劑的例子包括但不只限于可與GBS毒素受體核酸序列雜交的多核苷酸探針，及可與GBS毒素受體結(jié)合的化合物，例如可特異性識別GBS毒素受體的抗體、GBS毒素、GBS毒素模擬物，或用上述篩選方法鑒定到的其他化合物。
第三個具體實例是純化可與GBS毒素受體結(jié)合之化合物的試劑盒，其中包括可與該化合物結(jié)合的GBS毒素受體或其片段。優(yōu)選的化合物包括GBS毒素、GBS毒素模擬物、可特異性結(jié)合GBS毒素受體的抗體，以及用上述篩選方法鑒定到的其他化合物。
試劑盒的附加成分包括但不只限于檢測所必需的附加試劑、參考標(biāo)準(zhǔn)、使用說明書等。適用的參考標(biāo)準(zhǔn)包括陽性對照、陰性對照、這些對照的照片、這些對照的表格或圖解數(shù)據(jù)等。試劑盒中還可包括完成上述方法的說明書，最好是印刷的說明書。
實施例實施例1綿羊GBS毒素受體的克隆綿羊肺內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物將從7周齡綿羊身上切下的小塊原始肺組織放入含有10mM HEPES緩沖液(Life Technology)、1％青霉素/鏈霉素和0.1％慶大霉素的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中，并于37℃在綿羊肺完全培養(yǎng)基(LifeTechnology)中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，根據(jù)Cobblestone形態(tài)學(xué)鑒定綿羊肺內(nèi)皮細(xì)胞的克隆并使用克隆環(huán)收獲到24孔組織培養(yǎng)板(Falcon)中。當(dāng)細(xì)胞生長至連片時，用胰酶制劑離散細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到60mm組織培養(yǎng)皿或T25組織培養(yǎng)瓶(Falcon)中。當(dāng)細(xì)胞再次生長至成片時，分散細(xì)胞并轉(zhuǎn)入少數(shù)幾個100mm組織培養(yǎng)板(Falcon)中培養(yǎng)。每次分散細(xì)胞都認(rèn)為是一代。重復(fù)該方法直到有足夠分離mRNA的細(xì)胞(約108個)為止。
mRNA的分離及cDNA文庫的構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Pharmacia)從9.2×107個綿羊肺內(nèi)皮細(xì)胞(8和9代)中分離poly(A)+RNA。總共得到16μg poly(A)+RNA。使用2.5μgmRNA構(gòu)建cDNA文庫。poly(A)+RNA是用Oligo(dT)引發(fā)(帶有NotⅠ限制性位點(diǎn))并轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA。加入BstXⅠ/EcoRⅠ銜接子后，將cDNA單方向克隆到pCDNA3.1(+)(Invitrogen)的BstXⅠ和NotⅠ位點(diǎn)中。使用大腸桿菌Top10F′(Invitrogen)作為擴(kuò)增的宿主菌株。產(chǎn)生5.38×106個原始克隆應(yīng)是合適的。將細(xì)胞鋪在50個含有氨芐青霉素(100μg/ml)的大LB瓊脂板上以擴(kuò)增文庫。刮取平板上的克隆并分成若干等份，以使每個等份代表10個平板。用Qiagen Max柱(Qiagen)純化DNA。
從cDNA文庫中篩選編碼GBS毒素受體的基因使用獨(dú)特的比色方法篩選cDNA文庫中編碼GBS毒素受體的基因。使用各個cDNA文庫池的5μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。在4-8個96孔組織培養(yǎng)板(Falcon)上培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以進(jìn)行瞬時表達(dá)。每個孔于DMEM培養(yǎng)基(Life Technology)中含有約20,000個被轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用pCDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞作為對照。表達(dá)3天之后，小心去掉培養(yǎng)基。各個孔用含有Mg2+和Ca2+的HPSS緩沖液(洗滌緩沖液)(LifeTechnology)淋洗3次。
然后將細(xì)胞與生物素化的毒素(50μl/孔；1-1.5μg/ml)在室溫下保溫1小時。保溫后，棄去生物素化的毒素并用洗滌緩沖液將各孔洗3次。將細(xì)胞與鏈霉抗生物素蛋白-β-gal溶液溫育，并用洗滌緩沖液洗孔3次。然后加PNPG(50μl/孔；在底物緩沖液中1mg/ml)37℃保溫細(xì)胞。分別在1和20小時時用ELISA讀數(shù)器測出405nm吸光值。收獲給出最高OD值的細(xì)胞。用Hirt提取法分離質(zhì)粒DNA。在大腸桿菌中擴(kuò)增質(zhì)粒DNA以用于下一步的轉(zhuǎn)染(富集)。
以此比色法富集8次。在后幾次富集中加入各孔中的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少，并向各孔中加入未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以使每孔的細(xì)胞總數(shù)為20,000個，以利細(xì)胞成片生長并減小3天表達(dá)后的本底。最后一次富集時，各孔只有1-10個被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。收獲給出最高OD值的細(xì)胞。分離DNA并在大腸桿菌中擴(kuò)增。
用此比色方法個別檢測許多分離的克隆。測定與CM101有較高結(jié)合率之克隆的序列。
序列分析對帶有2.1kb插入片段的克隆pFU102進(jìn)行DNA序列分析，揭示出編碼部分內(nèi)在糖蛋白的序列。用5′RACE方法(Life Technology)得到N末端序列，并將全長度基因定名為SP55。三段連接得到含有SP55之整個編碼區(qū)的pCD55。
SP55的mRNA有2844個核苷酸，編碼預(yù)測分子量55KDa的長495個氨基酸的蛋白質(zhì)(SP55)。用Klein等人(Klein et al.,Biochim.Biophys.Acta 815:468-476,1985)的方法分析證明，SP55為具有七個跨膜區(qū)的膜內(nèi)在蛋白。SP55具有N糖基化和激酶磷酸化位點(diǎn)。對SP55進(jìn)行Swiss-Prot.檢索，未發(fā)現(xiàn)與已知人蛋白質(zhì)有高度同源性。然而，SP55與人、兔、小鼠和大鼠的腎鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有一定的相同性(約30％)。此外，SP55與C.elegans的假設(shè)蛋白(HYP50和HYP63)有一定的相同性(約30-39％)。實施例2人GBS毒素受體的克隆綿羊GBS毒素受體序列與C.elegans的兩種假設(shè)蛋白質(zhì)HYP50和HYP63分別有大約37％和33％的相同性。在相當(dāng)于SEQ ID NO:2的氨基酸殘基180-186和443-449的區(qū)域中，七氨基酸序列段中的5個氨基酸在這三種蛋白質(zhì)之間是絕對保守的。
設(shè)計第一個簡并寡核苷酸CMR3-S:5′-CGGGATCCCGCCNGCNATGCAYRSHRTSTGG-3′(SEQ ID NO:5)，以包括編碼SP55、HYP50和HYP63之180-186區(qū)域中氨基酸序列的所有可能的密碼子。設(shè)計第二個簡并寡核苷酸CMR4-AS2:5′-GGAATTCCDGGDGCRATKTCNARRTRRTT-3′(SEQID NO:6)，以包括編碼SP55、HYP50和HYP63之443-449區(qū)域中氨基酸序列的所有可能密碼子的互補(bǔ)序列。
使用這些寡核苷酸并以人胚肺cDNA文庫作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。反應(yīng)產(chǎn)生了三個長度約400bp，包括SEQ ID NO:3之部分核酸序列的交迭序列。然后使用這些序列作為探針，克隆基因的其余部分，得到HP59(SEQ ID NO:7)。實施例3抗GBS毒素受體之抗體的制備用表8中所示的合成肽免疫兔。在0.01M磷酸鹽緩沖液中制備肽加KLH的1mg/ml溶液。為了進(jìn)行第一次免疫，充分乳化200μg肽加KLH(200μl)和等體積弗氏完全佐劑，然后在兔的頸和肩部背側(cè)面的3-4點(diǎn)注射。兩周后，第二次免疫(加強(qiáng)免疫)使用同樣濃度的，但在弗氏不完全佐劑中乳化的免疫原。加強(qiáng)免疫的注射部位與第一次免疫相同。兩周后，采血并用ELISA方法檢測動物對無KLH之肽的反應(yīng)。必要時可進(jìn)行再次加強(qiáng)注射，以進(jìn)一步提高抗體滴度。
表8免疫原性肽肽氨基酸序列 長度 序列對照p56a APSDGEEGSDRTPLLQRAPRAEPAPVC 27aaSEQ ID NO:4的殘基8-35p55a LAPSDGEEGSDRTPL 15aaSEQ ID NO:4的殘基7-22p57a NTTAKDNRTSYECA 14aaSEQ ID NO:4的殘基71-84肽p55是GBS毒素受體之胞外結(jié)構(gòu)域的片段。肽p57a是GBS毒素受體之胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。用這些肽免疫動物分別產(chǎn)生多克隆抗體Pab55和Pab57。實施例4檢測GBS毒素受體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)該實施例顯示可以在腫瘤細(xì)胞中檢測到GBS毒素受體。使用兔多克隆抗體Pab55和Pab57對成雙的正?；蚰[瘤來源的人和小鼠組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
在10％中性福爾馬林中固定小鼠和人腫瘤組織。然后將組織脫水、石蠟包埋并切成10-20×8微米切片以進(jìn)行免疫組化染色。
按照生產(chǎn)商推薦的方法(Ventana,Tucson,Arizona)，使用自動Ventana免疫組化染色器進(jìn)行免疫組化分析。用二甲苯體對切片脫蠟。然后用在30％含水甲醇中制備的1％過氧化氫將切片室溫下處理20分鐘，以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用PBS洗切片，用溶于PBS的5％BSA和5％山羊血清封閉，再次洗滌后與適當(dāng)稀釋的(1∶100)抗體37℃保溫30分鐘。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗。加DAB/H2O2保溫切片以便觀察結(jié)果。最后將切片與銅增強(qiáng)劑(Ventana)保溫4分鐘，洗滌并用蘇木精復(fù)染，然后在無甲苯的封固劑中封固。照相并保存影象以備分析。結(jié)果如表9中所示。數(shù)字是指載玻片號。
腫瘤和正常組織的免疫組織化學(xué)人組織抗體放大倍數(shù)信號1．卵巢瘤(95-02V016)高度乳頭狀癌Pab 55 400x +2．卵巢瘤(95-02V016)高度乳頭狀癌Pab 55 400x +3．正常卵巢(96-08Z008)對照組織 Pab 55 400x -4．卵巢瘤(95-02V016)高度乳頭狀癌Pab 57 400x +5．卵巢瘤(95-02V016)高度乳頭狀癌Pab 57 400x +6．卵巢瘤(95-02V016)高度乳頭狀癌Pab 57 400x +7．正常卵巢(96-08Z008)對照組織 Pab 57 400x -8．結(jié)腸癌(95-14664)分化差的腺癌 Pab 55 400x +9．正常結(jié)腸(9708V008)對照 Pab 55 400x -10．結(jié)腸癌(95-14664)分化差的腺癌Pab 57 400x +11．結(jié)腸癌(95-14664)分化差的腺癌Pab 57 400x +12．正常結(jié)腸(9708V008)對照 Pab 57 400x -13．女性乳腺腫瘤(97-I0V03a) Pab 55 400x +侵入性乳腺癌14．男性乳腺腫瘤(無編號)乳腺癌 Pab 55 400x +15．正常女性乳腺(97-12V020-3)對照 Pab 55 400x -16．女性乳腺腫瘤(97-I0V03a) Pab 57 400x +侵入性乳腺癌17．男性乳腺腫瘤(無編號)乳腺癌 Pab 57 400x +18．正常女性乳腺(97-12V020-3)對照 Pab 57 400x -19．肺癌(97-10V022-5)分化差的NOJPab 55 400x +小細(xì)胞癌20．正常肺(98-01V011)對照 Pab 55-21．肺癌(97-10V022-5)分化差的NOJPab 57 400x +小細(xì)胞癌22．肺癌(97-10V022-5)分化差的NOJ Pab 57400x +小細(xì)胞癌23．正常肺(98-01VO11)對照Pab 57 -小鼠組織抗體 放大倍數(shù) 信號24．未CM101療的Madison肺癌 Pab 55 +(MLT)25．未用CM101療的MLT Pab 55 +26．正常小鼠肺 Pab 55 -27．未CM101療的MLT Pab 57 +28．正常小鼠肺 Pab 57 -Pab55抗體著染人卵巢癌組織切片中的血管內(nèi)層細(xì)胞，但這種著染在正常人卵巢組織則不明顯(見圖2A和2B)。用Pab57抗體染色可得到相似的結(jié)果(見圖3A和3B)。如上列表中和圖2A-3B中所示，抗GBS毒素受體片段的抗體可特異地結(jié)合腫瘤組織，但不與正常組織結(jié)合，提示GBS毒素受體是在腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞中表達(dá)的。實施例5檢測GBS毒素受體在患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)的表達(dá)本實施例顯示可在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)哺乳動物模型的細(xì)胞中檢測到GBS毒素受體。用CM101或載體治療患有膠原蛋白誘發(fā)之關(guān)節(jié)炎的小鼠。CM101可逆轉(zhuǎn)炎性損傷并抑制血管翳形成。殺死用CM101治療的8號和15號小鼠及兩只對照小鼠(未用CM101治療的)以進(jìn)行免疫組化分析。
表10類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠的免疫組織化學(xué)

如上所示，Pab55和Pab57特異地結(jié)合血管翳中的病理性新脈管系統(tǒng)，提示患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠體內(nèi)表達(dá)GBS毒素受體。關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)的生長板中正常新脈管系統(tǒng)內(nèi)未見有CM101結(jié)合。實施例6向表達(dá)GBS毒素受體的組織定向送遞嵌合化合物本實施例顯示向表達(dá)GBS毒素受體的組織定向送遞嵌合化合物。嵌合化合物是CM101-生物素綴合物。給患Madison肺癌(MLT)的小鼠靜脈內(nèi)灌注生物素化的CM101。
用肼基化的生物素處理CM101以在多糖CM101的還原性末端形成生物素腙。簡單地說，將25μg凍干的CM101溶解在250μl標(biāo)記緩沖液(100mM乙酸鈉、0.02％疊氮鈉)中。加入含水偏高碘酸(30mM,125μl)并在暗處室溫下氧化30分鐘。向溶液中加入80mM Na2SO3以終止反應(yīng)。使所得到的醛與125μl 5mM NHS-LC-生物素(分子量556.58)于室溫下反應(yīng)1小時以形成生物素化的CM101。于4℃對1升PBS透析4次，以除去過量的生物素。在Ultrahydrogel 1000HPLC柱上凝膠過濾純化產(chǎn)物，凍干并于-70℃儲存?zhèn)溆谩?br> 輸注CM101后5分鐘回收組織并進(jìn)行免疫組化分析。用小鼠抗CM101 mAb(7A3)，再用第二mAb-HRP綴合物(圖4B中稱之為MLTCM101-Biot.5′+McAb)，或與HRP綴合的抗生物素蛋白(其特異性地結(jié)合生物素)(圖4A中稱之為MLT CM101-Biot.5′+Strep.HRP)分析腫瘤和正常小鼠組織切片的CM101結(jié)合。
圖4A-4C顯示取自同一腫瘤的，并包括靠近圖中心之同一血管縱切面的不同的切片。圖4A中的深染色顯示血管被覆細(xì)胞中生物素成分的定位。同樣，圖4B顯示CM101成分在血管被覆細(xì)胞中的定位。圖4C為未接觸CM101的陰性對照組織。分析結(jié)果明確表明，7A3和抗生物素蛋白與腫瘤組織中的同一血管結(jié)合。因此，生物素已借助其與可結(jié)合GBS毒素受體之化合物(CM101)的物理結(jié)合被送遞到腫瘤組織的血管上。
這些研究表明，嵌合化合物可被送遞到經(jīng)受病理性和/或缺氧驅(qū)使的血管生成或新血管形成的組織。作為嵌合化合物的一部分，細(xì)胞毒性分子可被導(dǎo)向這些組織，如腫瘤組織?？梢詫⒓?xì)胞毒性分子直接偶聯(lián)到可與GBS毒素受體結(jié)合的分子如GBS毒素上?；蛘?，可以將可結(jié)合GBS毒素受體的分子偶聯(lián)到生物素上，將細(xì)胞毒性分子偶聯(lián)到抗生物素蛋白上。實施例7提高表達(dá)GBS毒素受體之細(xì)胞對GBS毒素依賴性細(xì)胞毒性的敏感性本實施例顯示相對于對照組細(xì)胞，提高了GBS毒素受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對GBS毒素依賴性細(xì)胞毒性的敏感性。雖然不拘泥于理論，但本發(fā)明人相信，補(bǔ)體可結(jié)合細(xì)胞上的GBS毒素受體結(jié)合的GBS毒素，從而使細(xì)胞被白細(xì)胞(WBC)殺死。
將人膀胱癌細(xì)胞(ECV細(xì)胞)用人GBS毒素受體基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。所得到的細(xì)胞系是ECV711。只用載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞稱為V23。將ECV711和V23按每孔5,000個細(xì)胞接種于96孔平板中。
按下述方法從健康供體身上收集白細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)靜脈切開放血法將血液收集到肝素化試管(30U/ml)中并以2000rpm離心20分鐘。將界面層小心轉(zhuǎn)移到新的試管中并用培養(yǎng)基(RPMI-1640)離心洗滌兩次。將細(xì)胞重新懸浮在加有5％胎牛血清(FBS)和γ干擾素(IFN)(100U/ml)的RPMI 1640中，并在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃保溫過夜。然后將細(xì)胞重新懸浮在加有5％FBS的新鮮培養(yǎng)基中。
將WBC制劑的5,000個細(xì)胞加到含有被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的各小孔中。向小孔內(nèi)加入終濃度為1μg/ml的CM101及適配人供體的人血清。將細(xì)胞37℃保溫6小時。
使用Promega公司的Cyto Tox96非放射性檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶以確定細(xì)胞毒性(Nachlas et al.,Anal.Biochem.1:317,1960；Korzeniewski et al.,J.Immunol.Methods 64:313,1983；Deckeret al.,J.Immunol.Methods 115:61；Brander et al.,Eur.J.Immunology 23:3217,1993；Behl et al.,Cell 77:817,1994；Lappalainen et al.,Pharm.Research 11:1127,1994；Allen et al.,Promega Notes 45:7,1994；Sinensky et al.,Toxicol.Letters75:02,1995；Moravec,Promega Notes 45:11,1994)。按生產(chǎn)廠商推薦的方法計算細(xì)胞毒性百分比。結(jié)果如表11中所示。
表11

當(dāng)ECV711細(xì)胞與CM101、WBC和人血清(C3來源)一起保溫時，細(xì)胞毒性比細(xì)胞未加CM101保溫時增加39％。用單獨(dú)載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞V23沒有顯示出細(xì)胞毒性的CM101依賴性增加。
本說明書中提到的所有出版物和專利申請除特別指出者外，均單獨(dú)地全文列為本文參考文獻(xiàn)。
現(xiàn)已全面描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解到，可以在不背離本發(fā)明待批權(quán)利要求的精神和范圍的前提下，對本發(fā)明作出許多改動和改進(jìn)。
序列表<110>Hellergvist,CarlFu,Changlin<120>GBS毒素受體<130>CARB-008/01WO<140><141><150>60-093,843<151>1998-07-22<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2602<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(58)..(1542)<400>1tcgggccggc gctcccttct ctgccaggtg gcgagtacac ctgctcacgt aggcgtc 57atg agg tct ccg gtt cga gac ctg gcc cgg aac gat ggc gag gag agc 105Met Arg Ser Pro Val Arg Asp Leu Ala Arg Asn Asp Gly Glu Glu Ser1 5 10 15acg gac cgc acg cct ctt cta ccg ggc gcc cca cgg gcc gaa gcc gct 153Thr Asp Arg Thr Pro Leu Leu Pro Gly Ala Pro Arg Ala Glu Ala Ala20 25 30cca gtg tgc tgc tct gct cgt tac aac tta gca att ttg gcc ttt ttt 201Pro Val Cys Cys Ser Ala Arg Tyr Asn Leu Ala Ile Leu Ala Phe Phe35 40 45ggt ttc ttc att gtg tat gca tta tgt gtg aat ctg agt gtt gcg tta 249Gly Phe Phe Ile Val Tyr Ala Leu Arg Val Asn Leu Ser Val Ala Leu50 55 60gtg gat atg gta gat tca aat aca act tta gaa gat aat aga act tcc 297Val Asp Met Val Asp Ser Asn Thr Thr Leu Glu Asp Asn Arg Thr Ser65 70 75 80aag gcg tgt cca gag cat tct gct 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495<210>12<211>495<212>PRT<213>人工序列<400>12Het Xaa Xaa Pro Val Xaa Asp XaaAla Xaa Xaa Xaa Gly Glu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Asp Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Arg Xaa Glu Xaa Ala20 25 30Pro Xaa Cys Cys Ser Ala Arg Tyr Asn Xaa Ala Xaa Leu Xaa Phe Phe35 40 45Gly Phe Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Leu Xaa Val Asn Leu Xaa Val Xaa Xaa50 55 60Val Xaa Met Xaa Asp Set Xaa Thr Thr Xaa Xaa Asp Asn Arg Xaa Set65 70 75 80Xaa Xaa Cys Xaa Glu His Ser Ala Pro Ile Lys Val Xaa Xaa Xaa Gln85 90 95Thr Gly Xaa Lys Tyr Xaa Trp Asp Ala Glu Thr Gln Gly Trp Ile Leu100 105 110Xaa Xaa Phe Xaa Tyr Gly Tyr Ile Ile Thr Xaa Ile Pro Gly Gly Tyr115 120 125Val Ala Ser Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Leu Gly Xaa Gly Ile Xaa130 135 140Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Thr Leu Phe Thr Pro Xaa Ala Ala Asp Xaa Gly145 150 155 160Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ala Leu Glu Xaa Leu Gly Glu Gly165 170 175Xaa Thr Xaa Pro Ala Met His Ala Met Trp Ser Xaa Trp Ala Pro Pro180 185 190Leu Glu Arg Ser Xaa Leu Xaa Xaa Ile Xaa Tyr Ala Gly Ala Xaa Leu195 200 205Gly Thr Val Xaa Ser Leu Pro Leu Ser Gly Xaa Ile Cys Tyr Tyr Met210 215 220Asn Trp Thr Tyr Val Phe Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Trp225 230 235 240Phe Xaa Xaa Trp Ile Xaa Leu Val Ser Xaa Thr Pro Xaa Xaa His Lys245 250 255Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Glu Lys Xaa Xaa Ile Leu Ser Ser Leu Xaa Asn260 265 270Gln Xaa Ser Ser Gln Lys Ser Val Pro Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa275 280 285Leu Pro Leu Trp Ala Xaa Xaa Val Ala Xaa Phe Ser Tyr Asn Trp Thr290 295 300Phe Tyr Thr Xaa Leu Xaa Leu Leu Pro Thr Xaa Mer Lys Xaa Xaa Leu305 310 315 320Arg Phe Asn Xaa Gln Glu Asn Gly Phe Leu Sar Xaa Xaa Pro Tyr Leu
325 330 335Xaa Xaa Trp Leu Cys Met Ile Leu Xaa Gly Gln Ala Ala Asp Asn Leu340 345 350Arg Ala Xaa Trp Asn Phe Ser Thr Xaa Xaa Val Xaa Arg Xaa Phe Ser355 360 365Leu Ile Xaa Met Ile Gly Pro Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa370 375 380Xaa Gly Cys Asp Tyr Xaa Leu Xaa Val Xaa Phe Leu Xaa Ile Ser Thr385 390 395 400Xaa Leu Gly Gly Phe Cys Ser Ser Gly Phe Ser Ile Asn His Leu Xaa405 410 415Ile Ala Pro Ser Tyr Ala Gly Xaa Leu Leu Gly Ile Thr Asn Xaa Phe420 425 430Ala Thr Tle Xaa Gly Met Xaa Gly Pro Xaa Ile Xaa Xaa Ser Xaa Thr435 440 445Pro Xaa Asn Thr Xaa Gly Glu Trp Gln Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ala Ala450 455 460Ala Xaa Asn Xaa Phe Gly Ala Ile Phe Xaa Thr Leu Phe Ala Lys Gly465 470 475 480Qlu Xaa Gln Asn Trp Xaa Xaa Xaa Asp His Xaa Gly His Arg Xaa485 490 49權(quán)利要求
1．長度至少10個堿基的分離的多核苷酸，其包括編碼B組β溶血性鏈球菌毒素之哺乳動物受體(GBS毒素受體)或其多肽片段的核酸序列或與這樣的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。
2．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中核酸序列包括SEQ ID NO:9。
3．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中核酸序列與選自下列一組中的核酸序列有100％相同性SEQ ID NO:1的殘基61-1542,SEQ ID NO:7的殘基266-1870,SEQ ID NO:3的殘基87-1568。
4．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸在高度嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO:7的核酸序列雜交。
5．含有權(quán)利要求1的多核苷酸的載體。
6．用權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7．生產(chǎn)哺乳動物GBS毒素受體或其片段的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞。
8．包括哺乳動物GBS毒素受體或其片段的分離的多肽。
9．權(quán)利要求8的多肽，其中受體與SEQ ID NO:2的相應(yīng)氨基酸序列至少有大約86％相同性。
10．權(quán)利要求8的多肽，其中所述受體或片段與SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8之氨基酸序列的相應(yīng)區(qū)域有100％相同性。
11．權(quán)利要求8的多肽，其中多肽是由可在高度嚴(yán)格條件下與選自下列一組中的核酸序列雜交的核酸序列所編碼的(a)SEQ ID NO:1的核苷酸61-1542，和(b)SEQ ID NO:3的核苷酸87-1568。
12．包括大約不超過20％的氨基酸殘基不同于選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8組中之氨基酸序列的氨基酸序列的分離多肽。
13．權(quán)利要求12的分離的多肽，其中所說分離的多肽的氨基酸序列有一個氨基酸殘基不同于選自所說的組中的氨基酸序列。
14．權(quán)利要求12的分離的多肽，其中所述不同的氨基酸殘基是選自所說的組中之氨基酸序列的相應(yīng)殘基的保守取代。
15．包括下式之氨基酸序列的分離的多肽AAl-AAn-AAm其中AAl不存在或者是M；AAn是0至100個氨基酸，較好是0至41個氨基酸，最好是SEQ IDNO:8的殘基2-42的連續(xù)鏈；AAm是包括AA43至AA536的494個氨基酸的連續(xù)鏈，其中(1)AA43,AA47,AA51,AA52,AA57,AA58,AA65,AA66,AA72,AA85,AA87,AA93,AA94,AA96,AA115,AA116,AA122,AA123,AA125,AA134,AA143,AA173,AA174,AA178,AA185,AA186,AA189,AA190,AA196,AA200,AA204,AA206,AA207,AA220,AA253,AA260,AA276,AA277,AA280,AA283,AA287,AA294,AA295,AA298,AA300,AA301,AA312,AA324,AA326,AA360,AA365,AA373,AA374,AA379,AA396,AA403,AA407,AA418,AA480,AA483,AA486,AA491,AA494,AA502,AA528,AA529,AA532和AA536是分別相當(dāng)于下列(a)-(c)所示的氨基酸殘基(a)SEQ ID NO:8的殘基43,47,51,52,57,58,65,66,72,85,87,93,94,96,115,116,122,123,125,134,143,173,174,178,185,186,189,190,196,200,204,206,207,220,253,260,276,277,280,283,287,294,295,298,300,301,312,324,326,360,365,373,374,379,396,403,407,418,480,483,486,491,494,502,528,529,532和536,(b)SEQ ID NO:4的殘基2,6,10,11,16,17,24,25,31,44,46,52,53,55,74,75,81,82,84,93,102,132,133,137,144,145,148,149,155,159,163,165,166,179,212,219,235,236,239,242,246,253,254,257,259,260,271,283,285,319,324,332,333,338,355,362,366,377,439,442,445,450,453,461,487,488,491和495,或者(c)其保守取代；(2)AA44-AA46,AA48-AA50,AA53-6,AA59-AA64,AA67-AA71,AA73-AA84,AA86,AA88-AA92,AA95,AA97-AA114,AA117-AA121,AA124,AA126-AA133,AA135-AA142,AA144-AA172,AA175-AA177,AA179-AA184,AA187-AA188,AA191-AA195,AA197-AA199,AA201-AA203,AA205,AA208-AA219AA221-AA252,AA254-AA259,AA261-AA275,AA278-AA279,AA281-AA282,AA284-AA286,AA288-AA293,AA296-AA297,AA299,AA302-AA311,AA313-AA323,AA325,AA327-AA359,AA361-AA364,AA366-AA372,AA375-78,AA380-AA395,AA397-AA402,AA404-AA406,AA408-AA417,AA419-AA478,AA481-AA482,AA484-AA485,AA487-AA490,AA492-AA493,AA495-AA501,AA503-AA527,AA530-AA531和AA533-35分別是(a)SEQ ID NO:8的殘基44-46,48-50,53-56,59-64,67-71,73-84,86,88-92,95,97-114,117-121,124,126-133,135-142,144-172,175-177,179-184,187-188,191-195,197-199,201-203,205,208-219,221-252,254-259,261-275,278-279,281-282,284-286,288-293,296-297,299,302-311,313-323,325,327-359,361-364,366-372,375-378,380-395,397-402,404-406,408-417,419-478,481-482,484-485,487-490,492-493,495-501,503-527,530-531和533-535，或者(b)其保守取代；并且(3)AA315-AA367中的一個或多個任選不存在。
16．識別哺乳動物GBS毒素受體或其片段的抗體。
17．包括與哺乳動物GBS毒素受體或其片段結(jié)合之GBS毒素的分離的復(fù)合體。
18．形成復(fù)合體的方法，包括在允許GBS毒素與多肽特異性結(jié)合的條件下，使GBS毒素與包括哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素之片段的多肽接觸，及使復(fù)合體形成。
19．純化可與GBS毒素受體結(jié)合的化合物的方法，該方法包括提供包括哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素之片段的多肽；在允許化合物與多肽特異性結(jié)合的條件下，使所說的多肽與含該化合物的樣品接觸，并將結(jié)合的化合物與樣品的其余物質(zhì)分開。
20．檢測樣品中是否存在GBS毒素的方法，該方法包括在允許GBS毒素與多肽特異性結(jié)合的條件下，使樣品與含有哺乳動物GBS毒素受體或其可與GBS毒素結(jié)合之片段的多肽接觸，并檢測是否已發(fā)生了特異性結(jié)合。
21．診斷新生兒中早期發(fā)作性疾病的方法，其包括完成權(quán)利要求20的方法，其中樣品得自新生兒，并且其中GBS毒素的存在即為早期發(fā)作性疾病的指征。
22．檢測哺乳動物組織中的病理性脈管系統(tǒng)的方法，該方法包括檢測GBS毒素受體的存在。
23．鑒定可抑制GBS毒素與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合的化合物的方法，其包括在含有GBS毒素的反應(yīng)混合物中并在允許GBS毒素與受體或片段特異性結(jié)合的條件下，使試驗化合物與包括哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素之片段的多肽合并，并且檢測化合物對GBS毒素與多肽結(jié)合的抑制量。
24．GBS毒素與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合的抑制劑。
25．鑒定可特異性結(jié)合哺乳動物GBS毒素受體的化合物的方法，其包括在允許發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，使試驗化合物與包括哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素之片段的多肽接觸，并且檢測所說的試驗化合物與多肽間形成的復(fù)合體。
26．檢測試驗嵌合化合物的細(xì)胞毒性的方法，該方法包括使在細(xì)胞表面上表達(dá)哺乳動物GBS毒素受體或其可結(jié)合GBS毒素之片段的細(xì)胞，與包括偶聯(lián)到所說的GBS毒素上之細(xì)胞毒性劑的試驗嵌合化合物接觸，并且檢測細(xì)胞毒性信號。
27．包括共價連接到可特異性結(jié)合哺乳動物GBS毒素受體之分子上的細(xì)胞毒性劑的嵌合化合物。
28．鑒定GBS毒素受體抑制劑的方法，該方法包括在有或沒有試驗化合物存在下，及沒有試驗化合物存在時被保溫的細(xì)胞即能夠增殖或遷移的條件下保溫試驗細(xì)胞，其中試驗細(xì)胞表達(dá)GBS毒素受體或其具有GBS毒素受體活性的片段；并且將有試驗化合物存在時保溫之試驗細(xì)胞的增殖或遷移與沒有試驗化合物存在時保溫之試驗細(xì)胞的增殖或遷移相比較，其中有試驗化合物存在時增殖或遷移較少即為試驗化合物是GBS毒素受體的抑制劑的指征。
29．鑒定內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移抑制劑的方法，該方法包括在有或沒有試驗化合物存在下，及沒有試驗化合物存在時被保溫的細(xì)胞即能夠增殖或遷移的條件下保溫試驗內(nèi)皮細(xì)胞，其中試驗細(xì)胞表達(dá)GBS毒素受體或其具有GBS毒素受體活性的片段；并且將有試驗化合物存在時保溫之試驗細(xì)胞的增殖或遷移與沒有試驗化合物存在時保溫之試驗細(xì)胞的增殖或遷移相比較，其中有試驗化合物存在時增殖或遷移較少即為試驗化合物是內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移抑制劑的指征。
30．鑒定用于治療或預(yù)防以病理性血管生成或新血管形成為特征的醫(yī)學(xué)狀況的治療化合物的方法，該方法包括在有或沒有試驗化合物存在下保溫試驗細(xì)胞，其中試驗細(xì)胞表達(dá)GBS毒素受體或其具有GBS毒素受體活性的片段；將有試驗化合物存在時保溫之試驗細(xì)胞的增殖或遷移與沒有試驗化合物存在時保溫之試驗細(xì)胞的增殖或遷移相比較，其中有試驗化合物存在時增殖或遷移較少即為試驗化合物是治療或預(yù)防所述醫(yī)學(xué)狀況的候選治療化合物的指征。
31．權(quán)利要求30的方法，其中醫(yī)學(xué)狀況是癌性腫瘤。
32．權(quán)利要求30的方法，其中醫(yī)學(xué)狀況是再灌注損傷。
33．權(quán)利要求30的方法，其中醫(yī)學(xué)狀況是傷口愈合期間的瘢痕形成。
34．權(quán)利要求30的方法，其中醫(yī)學(xué)狀況是瘢痕疙瘩。
35．權(quán)利要求30的方法，其中醫(yī)學(xué)狀況是慢性炎性疾病。
36．權(quán)利要求30的方法，其中醫(yī)學(xué)狀況是神經(jīng)損傷。
37．鑒定可抑制GBS毒素與哺乳動物GBS毒素受體結(jié)合的化合物的方法，其包括(a)模擬并選擇哺乳動物GBS毒素受體的最可能的構(gòu)象；(b)設(shè)計實質(zhì)上模擬該多肽能量上最可能的三維結(jié)構(gòu)的化學(xué)改性類似物；(c)化學(xué)合成該類似物，以及(d)估測類似物的生物活性。
38．鑒定可結(jié)合哺乳動物GBS毒素受體之化合物的方法，其包括(a)模擬并選擇哺乳動物GBS毒素受體的最可能的構(gòu)象，(b)推測多肽的最可能的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，(c)設(shè)計將與該多肽形成能量上最可能的復(fù)合體的化合物，(d)化學(xué)合成該化合物，并且(e)估測該化合物的生物活性。
39．預(yù)防或治療人新生兒的新生兒發(fā)作性疾病的方法，包括投用GBS毒素與人GBS毒素受體結(jié)合的抑制劑。
40．抑制哺乳動物組織中病理性或缺氧驅(qū)使的內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移的方法，該方法包括使分子與存在于該組織中至少一個細(xì)胞的表面上的GBS毒素受體特異性地結(jié)合，其中所說的分子選自于當(dāng)結(jié)合于哺乳動物的GBS毒素受體上時能夠引發(fā)炎性反應(yīng)的化合物；包括偶聯(lián)于可特異性結(jié)合GBS毒素受體之化合物上的細(xì)胞毒性化合物的嵌合化合物；GBS毒素受體磷酸化的抑制劑；以及GBS毒素受體活性的抑制劑。
41．包括藥學(xué)有效量的選自下列一組中之分子和藥物載體的藥物組合物GBS毒素受體或其片段；GBS毒素受體抑制劑；以及包括偶聯(lián)到可結(jié)合GBS毒素受體之化合物上的細(xì)胞毒性劑的嵌合化合物。
42．包括選自下列一組中之成分的試劑盒GBS毒素受體或片段；用于檢測GBS毒素受體或片段之存在的試劑；以及用于檢測編碼GBS毒素受體或片段之多核苷酸存在的試劑。
43．可用于治療人或動物體的方法中的分子，所說的分子選自于用于治療人或動物體的方法中的GBS毒素受體或其片段，該分子選自于GBS毒素受體或其片段；GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的抑制劑；GBS毒素受體抑制劑；以及包括偶聯(lián)于可結(jié)合GBS毒素受體之化合物上的細(xì)胞毒性劑的嵌合化合物。
44．GBS毒素受體抑制劑，或GBS毒素與GBS毒素受體結(jié)合的抑制劑，在制造用于治療以病理性或缺氧驅(qū)使之血管生成或新血管形成為特征的醫(yī)學(xué)狀況的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的GBS毒素受體，其制備和使用方法。還提供了GBS毒素受體多核苷酸和多肽，以及涉及這些多核苷酸和多肽的檢測、篩選和治療方法及藥物組合物。
文檔編號A61P25/00GK1317047SQ99810706
公開日2001年10月10日 申請日期1999年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月22日
發(fā)明者C·G·赫勒奎斯特, 傅長林 申請人:范德比爾特大學(xué)