專利名稱：通過阻斷淋巴毒素β途徑逆轉(zhuǎn)病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
廣義上，本發(fā)明涉及誘導個體抗病毒應(yīng)答的方法。具體地，本發(fā)明提供在個體中治療病毒引起的系統(tǒng)休克(systemic shock)和呼吸窘迫的方法。這些方法包括施用某些“淋巴毒素β阻斷劑?！卑l(fā)明背景幾種病毒包括Sin Nombre病毒(SNV)、埃博拉病毒(Ebola)、馬爾堡病毒(Marburg)、拉沙病毒(Lassa)和登革病毒(Dengue)均引起具有如下癥狀的急性疾病發(fā)病迅速、發(fā)燒、系統(tǒng)休克和肺窘迫(pulmonarydistress)(Lacy等(1997)Adv.Ped.Inf.Dis.12:21)。這些感染的另一個共同點是病毒感染的全身分布，并靶向內(nèi)皮細胞和巨噬細胞(Lacy等(1997)Adv.Ped.Inf.Dis.12:21)。這些新出現(xiàn)的病毒除了SNV之外大多數(shù)是幾十年前初次鑒定的。從它們被發(fā)現(xiàn)之后的這些年中，這些病原體又多次在全世界爆發(fā)。到1998年6月，已證實在美國西南部由于鹿、鼠(deer mouse)數(shù)量增加有183例已證實的SNV病例，SNV是漢坦病毒肺休克綜合癥(Hantavirus Pulmonary ShockSyndrome)的致病因子。這些病例中僅有55％感染后存活(疾病控制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention).MMWR.47,449(1998))。目前，對這些病毒的致病機理和如何有效治療全球每年成千上萬患有病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的感染患者了解極少。
因此，有必要開發(fā)在個體中治療病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的新方法。
本發(fā)明概述本發(fā)明通過提供在個體中治療病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的藥物組合物和方法解決上述問題。
本發(fā)明的方法和組合物部分利用了如下發(fā)現(xiàn)某些試劑，本文稱為淋巴毒素β(LT-B)阻斷劑，可用于在個體中治療病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫。在一個實施方案中，LT-B阻斷劑是淋巴毒素β受體(LT-B-R)阻斷劑。在一個優(yōu)選實施方案中，LT-B-R是抗淋巴毒素B受體或可溶性淋巴毒素B受體的抗體。在一個最優(yōu)選的實施方案中，LT-B-R阻斷劑是重組LT-B-R融合蛋白，該融合蛋白具有與免疫球蛋白恒定重鏈結(jié)構(gòu)域融合的LT-B-R細胞外配體結(jié)合域。
通過下面優(yōu)選實施方案的描述，本發(fā)明前述和其它目標、特征、方面和優(yōu)點，以及本發(fā)明本身，將被更全面地理解。
附圖簡述

圖1顯示，NZB小鼠感染LCMV克隆13導致死亡。感染了LCMV-13的NZB小鼠的死亡曲線(n=14)和感染后第6天LCMV-13感染小鼠各種器官的病毒滴度(n=7)。
圖2顯示NZB小鼠中LCMV-13感染的組織學分布。(A)正常肺(100X,H+E)；(B)肺中有單核細胞浸潤和肺泡壁增厚的間質(zhì)性肺炎，感染后第5天(100X,H+E)；(C)脾中淋巴耗竭、細胞壞死和濾泡結(jié)構(gòu)的堵塞(25x,H+E)；(D)更高的放大倍數(shù)，顯示脾中細胞壞死和核破裂碎片(158X,H+E)；(E)肺中LCMV-13陽性內(nèi)皮細胞(箭號)和巨噬細胞(白色箭號)(100X,H+E)；(F)脾中LCMV-13陽性內(nèi)皮細胞(箭號)、間皮細胞(鍥形符號)和巨噬細胞(白色箭號)(50X,IHC)；(G)心臟中LCMV-13陽性內(nèi)皮細胞(100X,IHC)；(H)肝臟中LCMV-13陽性庫普弗細胞和竇狀隙襯細胞(100X,IHC)。
圖3顯示LTβR信號傳導通路的阻斷顯著改善克隆13感染NZB小鼠的存活率。這里給出了按所述方式處理的克隆13感染NZB小鼠的死亡曲線。靜脈內(nèi)給NZB小鼠施用2.5×106pfu克隆13，然后在感染后第1天和第4天兩次腹膜內(nèi)注射250ug溶于無內(nèi)毒素的PBS中的TN3-19.12抗體(見參考文獻S)。對照小鼠在相同天數(shù)時注射相同體積的無抗體的PBS。小鼠按參考文獻R中所述處理。對于三重處理組，在感染后第0天和第3天腹膜內(nèi)注射200ug量的TNFR55-Ig和LTβR-Ig蛋白。對照小鼠在相同天數(shù)時注射相同量在合成這些融合蛋白中使用的人抗體(AY1943-29)。僅接受LTβR-Ig的小鼠處理相同，只是省略TNFR55-Ig注射。數(shù)據(jù)從如下幾個實驗收集僅注射抗TNF(TN3-19.12)，僅注射LTβR-Ig(n=16)，三重處理組(n=10)(三重處理組(n=10)，僅注射LTβR-Ig(n=22),LTβR-Ig+TNFR55-Ig組(n=10)，抗TNF和TNFR55-Ig處理組(n=5)，僅注射抗TNF(TN3-19.12)組(n=6)和對照(n=25))。
圖4顯示LTβR通路的阻斷導致CD8T細胞功能降低。感染后第6天收集不同處理組的小鼠脾細胞，按前人所述用含有NP118九肽的Ld四聚物染色。所給出的值已對非特異背景染色校正。為監(jiān)測對相同肽響應(yīng)的γ干擾素的產(chǎn)生，在0.1ug/ml終濃度NP118和IL-2存在時將細胞在37℃孵育5小時。所給出的值已對無肽存在的背景水平校正。和兩個LTβR-Ig小鼠的脾細胞(LTβ#2/3)一樣，用對照人Ig處理的3個小鼠的脾細胞也合并起來。所有其它結(jié)果均來自單個小鼠。
圖5顯示CD8+T細胞而不是CD4+T細胞的耗竭逆轉(zhuǎn)NZB小鼠中LCMV-13的致死效果。小鼠按體內(nèi)耗竭細胞群的所述方法處理。每一個處理組均給出了死亡曲線(n=4)。
本發(fā)明詳述定義為了更加清楚而準確地闡明本發(fā)明的主題，給下面的描述和附及的權(quán)利要求中使用的特定術(shù)語提供下列定義。
淋巴毒素β(LT-β)是TNF配體家族的成員，TNF配體家族還包括Fas、CD27、CD30、CD40、OX-40和4-1BB受體的配體(Smith等，細胞(Cell),76，第959-62(1994))。TNF家族的若干成員(包括TNF、LT-α、LT-β和Fas)的信號傳導可誘導腫瘤細胞通過壞死或細胞凋亡(程序化細胞死亡)死亡。在非腫瘤發(fā)生細胞中，TNF和許多TNF家族配體-受體相互作用影響免疫系統(tǒng)發(fā)育和對各種免疫激發(fā)的應(yīng)答。
淋巴毒素-β(也稱p33)已在T淋巴細胞、T細胞系、B細胞系和淋巴因子激活殺傷(LAK)細胞的表面被鑒定。LT-β是本申請人共同未決國際中請PCT/US91/04588(1992年出版，WO92/00329)以及PCT/US93/11669(1994年出版，WO94/13808)的主題，上述申請以參考文獻并入本文。
LT-β受體是TNF受體家族的成員，它特異地結(jié)合表面LT配體。LT-β-R結(jié)合LT異聚體復合物(主要是LT-α1/β2和LT-α2/β1)，但不結(jié)合TNF或LT-α(Crowe等，科學(Science),264，第707-10頁(1994))。LT-β-R的信號傳導可能在外周淋巴器官發(fā)育和體液免疫應(yīng)答中起作用。
LT-β-RmRNA存在于人脾、胸腺和其它主要器官中。LT-β-R的表達模式與報道的p55-TNF-R相似，只是LT-β-R在外周血T細胞和T細胞系中缺乏。
術(shù)語“LT-β阻斷劑”是指能消除配體與LT-β結(jié)合、細胞表面LT-β聚集、或LT-β信號傳導，或能影響LT-β信號如何在細胞內(nèi)解釋的試劑。LT-β阻斷劑的例子包括抗LT-β、可溶性LT-β-R-Fc分子，和抗LT-α、抗LT-α/β和抗LT-β-R抗體。優(yōu)選地，這些抗體不與分泌形式的LT-α交叉反應(yīng)。
術(shù)語“LT-β受體阻斷劑”是指能消除配體與LT-β-R結(jié)合、細胞表面LT-β-R聚集、或LT-β-R信號傳導，或能影響LT-β-R信號傳導如何在細胞內(nèi)解釋的試劑。LT-β-R阻斷劑的例子包括可溶性LT-β-R-Fc分子和抗LT-β-R抗體。優(yōu)選地，這些抗體不與分泌形式的LT-α交叉反應(yīng)。
術(shù)語“抗LT-β受體抗體”是指任何特異結(jié)合該LT-β受體至少一個表位的抗體。
術(shù)語“抗LT抗體”是指任何特異結(jié)合LT-α、LT-β或LT-α/β復合物的至少一個表位的抗體。
術(shù)語“LT配體”是指能特異結(jié)合LT-β受體的LT異聚復合物或其衍生物。
術(shù)語“LT-β-R信號傳導”是指與LT-β-R通路有關(guān)的分子反應(yīng)以及由此產(chǎn)生的隨后分子反應(yīng)。
術(shù)語“LT-β-R配體結(jié)合域”是指LT-β-R參與LT配體特異識別和與LT配體相互作用的一個或多個部分。
術(shù)語“LT-α/β異聚復合物”和“LT異聚復合物”是指至少一個LT-α和一或多個LT-β亞基(包括一或多個這些亞基的可溶性、突變、改變或嵌合形式)之間的穩(wěn)定結(jié)合。這些亞基可通過靜電、范德華力或共價相互作用結(jié)合。優(yōu)選地，LT-α/62異聚復合物具有至少兩個相鄰LT-β亞基并缺少相鄰LT-α亞基。當LT-α/β異聚復合物充當細胞生長分析中的LT-β-R激活劑時，該復合物優(yōu)選是可溶性的，并具有化學計量的LT-α1/β2。
可溶性LT-α/62異聚復合物缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，并可被已改造成表達LT-α和/或LT-β亞基的適當宿主細胞分泌(Crowe等，免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods),168，第79-89頁(1994))。
術(shù)語“表面LT-α/62復合物”和“表面LT復合物”是指展示在細胞表面上的含有LT-α和膜結(jié)合LT-β亞基(包括突變、改變和嵌合形式的一或多個上述亞基)的復合物?！氨砻鍸T配體”是指可特異結(jié)合LT-β受體的表面LT復合物或其衍生物。
“有效量”是指足以實現(xiàn)有益或所期望臨床結(jié)果的量。有效量可在一次或多次給藥中施用。對于本發(fā)明，阻斷淋巴毒素B結(jié)合其受體的試劑的有效量是足以改善、穩(wěn)定或延遲病毒應(yīng)答發(fā)展的試劑量。特別地，是足以改善、穩(wěn)定或延遲病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的發(fā)展的試劑量。這些效力指標的檢測和測量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
“個體”是指脊椎動物，特別是哺乳動物物種的成員，包括但不限于家畜、體育用動物和靈長類，包括人類。
氨基酸殘基的“功能等價物”是(ⅰ)與被功能等價物替代的氨基酸殘基在反應(yīng)特性上相似的氨基酸；(ⅱ)本發(fā)明拮抗劑的氨基酸，該氨基酸與被該功能等價物替代的氨基酸殘基具有相似特性；(ⅲ)與被該功能等價物替代的氨基酸殘基具有相似特性的非氨基酸分子。
如果滿足下列條件中的至少一項，則編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)性拮抗劑的第一多核苷酸與編碼該拮抗劑蛋白質(zhì)的第二多核苷酸相比是“功能等價物”(a)該“功能等價物”是在標準雜交條件下與第二多核苷酸雜交的第一多核苷酸和/或是該第一多核苷酸序列的簡并序列。最優(yōu)選地，它編碼具有整聯(lián)蛋白拮抗劑蛋白活性的突變蛋白質(zhì)；(b)該“功能等價物”是在表達時編碼第二多核苷酸編碼的氨基酸序列的第一多核苷酸。
氨基酸殘基的“功能等價物”是(ⅰ)與被功能等價物替代的氨基酸殘基在反應(yīng)特性上相似的氨基酸；(ⅱ)本發(fā)明拮抗劑的氨基酸，該氨基酸與被該功能等價物替代的氨基酸殘基具有相似特性；(ⅲ)與被該功能等價物替代的氨基酸殘基具有相似特性的非氨基酸分子。
如果滿足下列條件中的至少一項，則編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)性拮抗劑的第一多核苷酸與編碼該拮抗劑蛋白質(zhì)的第二多核苷酸相比是“功能等價物”(a)該“功能等價物”是在標準雜交條件下與第二多核苷酸雜交的第一多核苷酸和/或是該第一多核苷酸序列的簡并序列。最優(yōu)選地，它編碼具有整聯(lián)蛋白拮抗劑蛋白活性的突變蛋白質(zhì)；(b)該“功能等價物”是在表達時編碼第二多核苷酸編碼的氨基酸序列的第一多核苷酸。
本發(fā)明使用的LT-B阻斷劑包括但不限于本文所列試劑及其功能等價物。因此，本文所用術(shù)語“功能等價物”是一種LT-B阻斷劑或編碼該LT-B阻斷劑的多核苷酸，其與判斷功能等價物的基礎(chǔ)LT-B阻斷劑相比對接受者具有相同或改善的有益作用。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能理解的，功能等價物蛋白質(zhì)可通過重組技術(shù)如表達“功能上等價的DNA”來產(chǎn)生。因此，本發(fā)明包括天然存在DNA編碼的LT-B阻斷劑以及編碼天然存在DNA編碼的相同蛋白質(zhì)的非天然存在DNA編碼的LT-B阻斷劑。由于核苷酸編碼序列的簡并性，其它多核苷酸也可用于編碼LT-B阻斷劑。這些多核苷酸包括通過在該序列中進行不同密碼子的替代而改變的上述序列的全部或部分，這些不同密碼子編碼相同的氨基酸殘基，因而產(chǎn)生沉默變換。這種改變的序列被認為是這些序列的等價物。例如Phe(F)由兩個密碼子TTC或TTT編碼，Tye(Y)由TAC或TAT編碼，而His(H)由CAC或CAT編碼。另一方面，Trp(W)由單個密碼子TGG編碼。因此，應(yīng)當理解，對于一個給定的編碼特定整聯(lián)蛋白的DNA序列，會有許多編碼該蛋白的DNA簡并序列。這些簡并DNA序列均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
術(shù)語“融合”或“融合蛋白”是指兩個或多個蛋白質(zhì)或其片段通過各自的肽主鏈共線性共價連接，最優(yōu)選通過編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸分子的基因表達來實現(xiàn)。優(yōu)選這些蛋白質(zhì)或其片段來自不同來源，因而這種類型的融合蛋白質(zhì)稱為“嵌合”分子。因此，優(yōu)選的融合蛋白質(zhì)是包括與非LT-B阻斷劑的第二部分共價連接的LT-B阻斷劑或片段的嵌合蛋白。本發(fā)明優(yōu)選的融合蛋白可包括保留抗原結(jié)合特異性的完整抗體的部分，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、包含一條重鏈和一條輕鏈的二聚體等。
最優(yōu)選的融合蛋白是嵌合蛋白，并包含與免疫球蛋白輕鏈、重鏈或兩者的全部或部分鉸鏈和恒定區(qū)融合或連接的LT-B阻斷劑部分。因此，本發(fā)明的特征是包含如下部分的分子(1)LT-B阻斷劑部分，(2)第二肽，如增加LT-B阻斷劑部分的可溶性或體內(nèi)存留時間的肽，如免疫球蛋白超家族的成員或其片段或部分，如IgG的部分或片段，如人IgG1重鏈恒定區(qū)，如CH2、CH3和鉸鏈區(qū)。具體地，“LT-B或LT-B-R/Ig融合蛋白”是包含與免疫球蛋白鏈N端相連的本發(fā)明生物學活性LT-B阻斷劑(如可溶性LT-B-R)或其生物學活性片段的蛋白質(zhì)，其中免疫球蛋白N端的一部分被LT-B阻斷劑替代。一種LT-B或LT-B-R/Ig融合蛋白是“LT-B-R/Fc融合蛋白”，后者是包含與免疫球蛋白恒定區(qū)至少一部分相連的本發(fā)明LT-B-R的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的Fc融合蛋白包含與其中含有免疫球蛋白重鏈C端結(jié)構(gòu)域的抗體片段相連的本發(fā)明LT-B阻斷劑。
“標準雜交條件”-用于雜交和洗膜的鹽和溫度條件，基本上相當于0.5×SSC至約5×SSC和65℃。因此，本文所用術(shù)語“標準雜交條件”是一個操作性定義，包括一個雜交條件范圍。較高嚴緊性的雜交條件可包括例如用噬菌斑篩選緩沖液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll 400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-HCl(pH7.5)；1M NaCl；0.1％焦磷酸鈉；1％SDS)；10％硫酸葡聚糖和100ug/ml變性的超聲處理鮭精DNA在65℃雜交12-20小時，再用75mM NaCl/7.5mM檸檬酸鈉(0.5×SSC)/1％SDS在65℃洗膜。較低嚴緊性的雜交條件可包括例如用噬菌斑篩選緩沖液、10％硫酸葡聚糖和110ug/ml變性的超聲處理鮭精DNA在55℃雜交12-20小時，再用300mM NaCl/30mM檸檬酸鈉(2.0×SSC)/1％SDS在55℃洗膜。也見《當代分子生物學實驗手冊》(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley&Sons公司，紐約，第6.3.1-6.3.6部分，(1989)。
本文所用“治療組合物”定義為包含本發(fā)明蛋白質(zhì)和其它生物學相容成分。治療組合物可包含賦形劑如水、礦物質(zhì)和載體如蛋白質(zhì)。
Ⅱ.優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明部分依賴于LT-B阻斷劑可在個體中誘導抗病毒應(yīng)答的發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)治療感染了病毒的個體可極大地增加個體的存活率。特別地，我們顯示，用LT-B阻斷劑如LTβR-Ig融合蛋白治療LCMV-13感染的NZB小鼠增加存活率73％。
當前，本文提到的埃博拉病毒、登革病毒、SNV和其它病毒的治療是通過教育預防疾病的轉(zhuǎn)播。對這些高病原性病毒還沒有疫苗。病毒唑-一種胍類似物-已被用作幾種上述感染的通用抗病毒藥物，但文獻僅記載在疾病早期使用時治療拉沙熱中可重復成功(M.D.Lacy和R.A.Smego,Adv.Ped.Inf.Dis.,12,21(1997))。我們的數(shù)據(jù)顯示與這些病毒有關(guān)的一些致病機理可能是免疫介導的。LT系統(tǒng)的阻斷可通過短暫降低病毒特異的CD8 T細胞數(shù)目和它們的功能極大地增加存活機會。采用若干阻斷TNFα通路的方法來治療幾種疾病的臨床實驗已在進行之中(H.I.Pass,D.Mew,H.A.Pass等，Chest Surg.Clin.N.Amer.5,73(1995))。我們認為，要最終用于有關(guān)迅速發(fā)展的急性病毒感染包括休克和/或肺窘迫的患者的人體實驗，LTβR-Ig治療應(yīng)當在動物模型中做進一步測試。
LT-B阻斷劑在本發(fā)明的一個實施方案中，LT-β阻斷劑包括抗LT-β的抑制LT-β信號傳導的抗體(Ab)。優(yōu)選地，抗LT-βAb是單克隆抗體(mAb)。抑制性抗LT-βAb和其它LT-β阻斷劑可采用檢測一或多種試劑結(jié)合LT配體或抑制細胞中LT-β信號傳導效應(yīng)的能力的篩選方法來鑒定。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，LT-β阻斷劑包含LT-β受體(LT-B-R)阻斷劑。在一個優(yōu)選實施方案中，LT-B-R阻斷劑是抑制LT-β-R信號傳導的抗LT-β-R的抗體(Ab)。優(yōu)選地，抗LT-β-R抗體是單克隆抗體(mAb)。一個這種抑制性抗LT-β-R mAb是BDA8 mAb。抑制性抗LT-β-R Ab和其它LT-β-R阻斷劑可采用檢測一或多種試劑結(jié)合LT-β-R或LT配體或抑制細胞中LT-β-R信號傳導效應(yīng)的能力的篩選方法來鑒定。
一種篩選方法利用LT-β-R信號傳導對帶有LT-β-R的腫瘤細胞的細胞毒性效應(yīng)。腫瘤細胞暴露于一或多種LT-β-R激活劑中以誘導LT-β-R信號傳導。LT-β-R激活劑包括IFN-γ存在下的LT-α/62異聚復合物(優(yōu)選可溶性LT-α1/β2)或活化性抗LT-β-R Ab(見下；也描述于申請人的共同未決美國申請08/378,968)。
可阻斷LT-β-R信號傳導的抗體和其它試劑按如下方式根據(jù)其抑制LT-β-R信號傳導對腫瘤細胞的細胞毒作用的能力來選擇1)在有或無系列稀釋的被測試劑存在時將腫瘤細胞如HT29細胞在一系列含有培養(yǎng)基和至少一種LT-β-R激活劑的組織培養(yǎng)孔中培養(yǎng)3-4天；2)向腫瘤細胞混合物加入測量線粒體功能的活體染料如MTT，并反應(yīng)數(shù)小時；3)測定每孔混合物在550nm波長光處的光密度(OD550)。OD550與LT-β-R激活劑和被測LT-β-R阻斷劑存在時每孔中剩余的腫瘤細胞數(shù)成正比?？山档蚅T-β-R激活的腫瘤細胞細胞毒性至少20％的試劑或試劑組合是本發(fā)明范圍內(nèi)的LT-β-R阻斷劑。
任何激活LT-β-R信號傳導的試劑或試劑組合都可用于上述鑒定LT-β-R阻斷劑的分析。導致LT-β-R信號傳導的LT-β-R激活劑(如激活性抗LT-β-R mAb)可使用上述腫瘤細胞分析根據(jù)其單獨或聯(lián)合其它試劑加強腫瘤細胞細胞毒性的能力來選擇。
選擇LT-β-R阻斷劑的另一種方法是檢測該推測試劑直接妨礙LT配體-受體結(jié)合的能力。能阻斷配體-受體結(jié)合至少20％的試劑或試劑組合是本發(fā)明范圍內(nèi)的LT-β-R阻斷劑。
可采用任何測量配體-受體結(jié)合強度的眾多分析進行推測LT-β-R阻斷劑的競爭實驗。受體與配體之間的結(jié)合強度可采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定(RIA)來測量。特異結(jié)合也可用熒光標記抗體-抗原復合物并進行熒光激活細胞分類(FACS)分析或其它這類免疫檢測方法來測量，所有這些方法均是本領(lǐng)域熟知技術(shù)。
配體-受體結(jié)合相互作用還可采用BIAcore TM儀(PharmaciaBiosensor)用胞質(zhì)團共振檢測法(plasmon resonance detection)來測量(Zhou等，生物化學(Biochemistry),32，第8193-98頁(1993)；Faegerstram和O’Shannessy，“親合技術(shù)中的表面胞質(zhì)團共振檢測(Surface plasmon resonance detecton in affinitytechnologies)”，親合層析手冊(Handbook of AffinityChromatography)，第229-52頁，Marcel Dekker公司，紐約(1993))。
BIAcore TM技術(shù)可允許受體與金表面結(jié)合并將配體流過該表面。胞質(zhì)團共振檢測實時直接檢測與該表面結(jié)合的物質(zhì)量。該技術(shù)既產(chǎn)生結(jié)合速度常數(shù)也產(chǎn)生解離速度常數(shù)，因此，配體-受體解離常數(shù)和親合常數(shù)可在有或無推測的LT-β-R阻斷劑存在時直接測定。
利用任何測定受體-配體相互作用的這些技術(shù)或其它技術(shù)，可評價LT-β-R阻斷劑單獨或聯(lián)合其它試劑抑制表面或可溶性LT配體結(jié)合表面或可溶性LT-β-R分子的能力。這些分析也可用于單個地或組合地測試LT-β-R阻斷劑或這些試劑的衍生物(如融合物、嵌合物、突變體和化學變化形式)，以優(yōu)化該變化的試劑阻斷LT-β-R激活的能力。
在本發(fā)明的一個實施方案中，LT-β-R阻斷劑包含可溶性LT-β受體分子。編碼配體結(jié)合域的人LT-β-R細胞外部分的序列顯示于美國專利5,925,351的圖1中，后者以參考文獻并入本文。使用美國專利5,925,351圖1中的序列信息和本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)，可將編碼該LT-β-R配體結(jié)合域的功能片段克隆至載體中，并在適當宿主中表達產(chǎn)生可溶性LT-β-R分子。選擇根據(jù)本文描述的方法能與天然LT-β受體競爭結(jié)合LT配體的可溶性LT-β-R分子作為LT-β-R阻斷劑。
包含選自美國專利5,925,351圖1所示序列之氨基酸序列的可溶性LT-β受體可與一或多個異源蛋白結(jié)構(gòu)域(“融合域”)結(jié)合以增加該受體融合蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)其生物活性或定位。優(yōu)選地，使用穩(wěn)定血漿蛋白質(zhì)(典型地，其在循環(huán)系統(tǒng)中半衰期大于20小時)構(gòu)建受體融合蛋白。這種血漿蛋白包括但不限于免疫球蛋白、血清白蛋白、脂蛋白、載脂蛋白和運鐵蛋白。還可將能使可溶性LT-β-R分子導向特定細胞或組織類型的序列與該LT-β-R配體結(jié)合域結(jié)合，產(chǎn)生特異定位的可溶性LT-β-R融合蛋白。包含LT-β-R配體結(jié)合域的整個LT-β-R細胞外區(qū)域(美國專利5,925,351圖1)或其功能部分可與免疫球蛋白恒定區(qū)如人IgG1重鏈Fc域融合(Browning等，免疫學雜志(J.Imunl.),154，第33-46頁(1995))。可溶性受體-IgG融合蛋白是普通免疫學試劑，它們的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域已知的(見如美國專利5,225,538)。功能性LT-β-R配體結(jié)合域可與IgG1以外的免疫球蛋白類或亞類的免疫球蛋白(Ig)Fc域融合。屬于不同Ig類或亞類的抗體Fc域可激活不同次級效應(yīng)子的功能。在Fc域被同源Fc受體結(jié)合時發(fā)生激活。次級效應(yīng)子功能包括激活補體系統(tǒng)、通過胎盤和結(jié)合各種微生物蛋白質(zhì)的能力。不同類和亞類免疫球蛋白的特性描述于Roitt等，免疫學(Immunology)，第4.8頁(Mosby-Year Book Europe Ltd.，第3版，1993)。補體酶級聯(lián)反應(yīng)可被結(jié)合抗原的IgG1、IgG3和IgM抗體的Fc域激活。IgG2的Fc域似乎不太有效，而IgG4、IgA、IgD和IgE的Fc域?qū)せ钛a體無效。因此，可根據(jù)對于用LT-β-R-Fc融合蛋白治療的特定免疫應(yīng)答或疾病而言是否期望該蛋白具有相關(guān)次級效應(yīng)子功能來選擇Fc域。如果損傷或殺死攜帶LT配體的靶細胞是有利的，則可選擇特別有活性的Fc域(IgG1)構(gòu)建LT-β-R-Fc融合蛋白?；蛘?，如果期望將LT-β-R-Fc融合蛋白導向細胞而不觸發(fā)補體系統(tǒng)，則可選擇無活性的IgG4 Fc域。
前人已描述過降低或消除與Fc受體結(jié)合和補體激活的Fc域突變(S.Morrison，免疫學年評(Annu.Rev.Immunl.),10，第239-65頁(1992))?？蓡蝹€或組合地利用這些突變或其它突變以優(yōu)化用于構(gòu)建LT-β-R-Fc融合蛋白的Fc域活性。
包含與人免疫球蛋白Fc域融合的配體結(jié)合序列的可溶性人LT-β-R融合蛋白(hLT-β-R-Fc)的生產(chǎn)描述于美國專利5,925,351的實施例1，該專利以參考文獻并入本文。根據(jù)實施例1制備的分泌hLT-β-R-Fc的CHO細胞系稱為“hLTβ；R-hG1 CHO#14”。該細胞系樣品已按照布達佩斯條約的規(guī)定于1995年7月21日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Cultrue Collection,ATCC)(Rockville,Md.)，并給予了ATCC保藏號CRL 11965。
可溶性鼠LT-β-R融合分子(mLT-β-R-Fc)的生產(chǎn)描述于美國專利5,925,351的實施例2，該專利以參考文獻并入本文。根據(jù)美國專利5,925,351實施例2制備的分泌mLT-β-R-Fc的CHO細胞系稱為“mLTβ；R-hG1 CHO#1.3.BB”。該細胞系樣品已按照布達佩斯條約的規(guī)定于1995年7月21日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Cultrue Collection,ATCC)(Rockville,Md.)，并給予了ATCC保藏號CRL 11964。
形成受體-Ig融合蛋白連接點的不同氨基酸殘基可改變可溶性LT-β受體融合蛋白的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性并最終改變其生物學活性?？上蛩xLT-β-R片段的C端加入一或多個氨基酸來修飾具有所選融合域的連接點。
LT-β-R融合蛋白N端也可通過改變所選LT-β-R DNA片段為插入重組表達載體在其5’端切割的位置來改變。每個LT-β-R融合蛋白的穩(wěn)定性和活性可采用常規(guī)實驗和本文所述用于篩選LT-β-R阻斷劑的分析來測試和優(yōu)化。
使用圖1顯示的細胞外結(jié)構(gòu)域中的LT-β-R配體結(jié)合域序列，也可構(gòu)建氨基酸序列變體以修飾可溶性LT-β受體或融合蛋白對LT配體的親和性。本發(fā)明的可溶性LT-β-R分子能與內(nèi)源細胞表面LT-β受體競爭結(jié)合表面LT配體。可以設(shè)想，任何包含可與細胞表面LT-β受體競爭結(jié)合LT配體的LT-β-R配體結(jié)合域的可溶性分子均是本發(fā)明范圍內(nèi)的LT-β-R阻斷劑。
在本發(fā)明另一個實施方案中，抗人LT-β受體的抗體(抗LT-β-R Abs)充當LT-β-R阻斷劑，用于治療將個體包括人置于病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫境地或危險之中的疾病。本發(fā)明的抗LT-β-R Abs可是多克隆的或單克隆的，并可被修飾以優(yōu)化其阻斷LT-β-R信號傳導的能力、其體內(nèi)生物利用率、穩(wěn)定性或其它期望特征。
抗人LT-β受體的多克隆抗體血清采用傳統(tǒng)技術(shù)按如下步驟制備用溶于完全弗氏佐劑的人LT-β受體-Fc融合蛋白(美國專利5,925,351的實施例1)皮下注射動物如山羊、兔、大鼠、倉鼠或小鼠，之后用溶于不完全弗氏佐劑的抗原進行腹膜內(nèi)或皮下加強注射。含有抗LT-β受體的期望抗體的多克隆抗血清通過傳統(tǒng)免疫學程序篩選。
抗人LT-β受體-Fc融合蛋白的鼠單克隆抗體(mAbs)按美國專利5,925,351的實施例5所述制備。產(chǎn)生鼠抗人LT-β-R mAb BDA8的雜交瘤細胞系(BD.A8.AB9)已根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于1995年1月12日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209)，并給予ATCC保藏號HB11798。
也可采用標準重組DNA技術(shù)制備各種形式的抗LT-β-R抗體(Winter和Milstein，自然(Nature),349，第293-99頁(1991))。例如，可構(gòu)建一個動物抗體的抗原結(jié)合域與一個人恒定區(qū)相連的“嵌合”抗體(如Cabilly等，美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),81，第6851-55頁(1984))。嵌合抗體可降低動物抗體用于人臨床治療時引起的觀察到的免疫原性應(yīng)答。此外，可以合成識別LT-β-R的重組“人源化抗體”。人源化抗體是主要包含人IgG序列的嵌合物，在此IgG序列中插有負責特異抗原結(jié)合的區(qū)域(如WO94/04679)。用所期望抗原免疫動物，分離相應(yīng)抗體，并除去負責特異性抗原結(jié)合的可變區(qū)序列部分。然后將該動物來源的抗原結(jié)合區(qū)克隆至已缺失抗原結(jié)合區(qū)的人抗體基因的適當位置。人源化抗體使人抗體中最少使用異源(種間)序列，因而在治療對象中引起免疫應(yīng)答的可能性更小。
構(gòu)建不同種類重組抗LT-β-R抗體也可通過制備含有抗LT-β-R可變區(qū)和從不同種類免疫球蛋白分離的人恒定區(qū)(CH1、CH2、CH3)的嵌合或人源化抗體來進行。例如，具有增加的抗原結(jié)合位點效價的抗LT-β-R IgM抗體可通過將該抗原結(jié)合位點克隆至攜帶人μ鏈恒定區(qū)的載體之中來重組產(chǎn)生(Arulanandam等，J.Exp.Med.,177，第1439-50頁(1993)；Lane等，Eur.J.Immunl.,22,2573-78頁(1993)；Traunecker等，自然，339，第68-70(1989))。此外可使用標準重組DNA技術(shù)通過改變抗原結(jié)合位點附近的氨基酸殘基來改變重組抗體與其抗原的親和性。人源化抗體的抗原結(jié)合親和性可根據(jù)分子模擬通過誘變來提高(Queen等，美國國家科學院院刊，86，第10029-33頁(1989)；WO94/04679)。
根據(jù)所靶向組織類型或設(shè)想的特定治療方案可能期望增加或降低低抗LT-β-R Ab對LT-β-R的親和性。例如，對于半預防治療，用通過LT-β通路發(fā)出信號的能力已降低的恒定水平抗LT-β-R Ab治療患者是有利的。同樣，對LT-β-R親和性增加的抑制性抗LT-β-R Ab對于短期治療可能是有利的。
通過測試其它抗人LT-β受體的抗體，可期望能利用常規(guī)實驗和本文所述分析方法鑒定起LT-β-R阻斷劑作用的其它抗LT-β-R抗體，用于治療將個體包括人置于病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫境地或危險之中的疾病。
本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案涉及包含起LT-β-R阻斷劑作用的抗LT配體抗體的組合物和方法。正如上面關(guān)于抗LT-β-R Abs所述，起LT-β-R阻斷劑作用的抗LT配體的抗體可以是多克隆的或單克隆的，并可按照常規(guī)程序修飾以改變其抗原結(jié)合特性和免疫原性。本發(fā)明的抗LT抗體可通過單獨地抗兩種LT亞基的任何一個，包括LT亞基的可溶性、突變、改變或嵌合形式來產(chǎn)生。如果使用LT亞基作為抗原，則優(yōu)選它們是LT-β亞基。如果使用LT-α亞基，則優(yōu)選獲得的抗LT-α抗體結(jié)合表面LT配體，并且不與分泌的LT-α交叉反應(yīng)或調(diào)節(jié)TNF-R活性(根據(jù)美國專利5,925,351實施例3中描述的分析方法)。
此外，可產(chǎn)生抗包含一或多個LT亞基的均聚(LT-β)或雜聚(LT-α/62)復合物的抗體，并根據(jù)其LT-β-R阻斷劑活性來篩選。優(yōu)選地，使用LT-α1/β2復合物作為抗原。如上所述，優(yōu)選獲得的抗LT-α1/β2抗體結(jié)合表面LT配體，并且不結(jié)合分泌的LT-α，也不影響TNF-R活性。
多克隆抗人LT-α抗體的產(chǎn)生描述于申請人共同未決申請(WO94/13808)中。單克隆抗LT-α抗體和抗LT-β抗體也有描述(Browning等，免疫學雜志，54，第33-46頁(1995))。鼠抗人LT-βmAb按美國專利5,925,351的實施例6所述制備。產(chǎn)生鼠抗人LT-β-R mAbB9的雜交瘤細胞系(B9.C9.1)已根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于1995年7月21日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209)，并給予ATCC保藏號11962。
單克隆倉鼠抗小鼠LT-α/62抗體按美國專利5,925,351的實施例7所述制備。產(chǎn)生倉鼠抗小鼠LT-α/62 mAb BB.F6的雜交瘤細胞系(BB.F6.1)已根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于1995年7月21日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209)，并給予ATCC保藏號MB11963。
按美國專利5,925,351的實施例6和7所述，開發(fā)了一種熒光活化細胞分類(FACS)分析方法篩選抗LT亞基和LT復合物并能充當LT-β-R阻斷劑的抗體。在該分析方法中，當存在遞增量的測試抗體時向PMA激活的表達表面LT復合物的Ⅱ-23細胞(Browning等，免疫學雜志，154，第33-46頁(1995))加入可溶性人LT-β-R-Fc融合蛋白。選擇能抑制LT-β受體-配體相互作用至少20％的抗體作為LT-β-R阻斷劑。
使用LT-α/β復合物而不是LT亞基作為免疫動物的抗原可導致更有效的免疫，或者可產(chǎn)生與表面LT配體具有更高親和性的抗體。可以想象，通過用LT-α/62復合物免疫，可分離識別LT-α和LT-β兩亞基上的氨基酸殘基(即形成LT-α/62裂縫的殘基)的抗體。通過測試抗人LT-α/62異聚復合物的抗體，可期望能使用常規(guī)實驗和本文所述分析方法鑒定起LT-β-R阻斷劑功能的更多抗LT抗體。
給藥方式在治療個體中病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的方法中本文所述組合物以有效劑量給藥。對于一個給定應(yīng)用，考慮例如患者的狀況和體重、期望治療的程度和患者對治療的耐受性，確定優(yōu)選藥物制劑形式和治療有效劑量方案的方法是本領(lǐng)域所熟知的。優(yōu)化治療劑量的適合起始點預期是大約1mg/kg可溶性LT-β-R的劑量。
治療有效劑量的確定也可通過進行如下體外實驗來評價，該實驗測定包被靶細胞(根據(jù)阻斷劑不同，為LT-β-R或LT配體陽性細胞)1-14天所需要的LT-β-R阻斷劑的濃度?？墒褂帽疚乃鍪荏w-配體結(jié)合分析監(jiān)測細胞包被反應(yīng)。LT-β-R或LT配體陽性細胞可采用FACS法從激活的淋巴細胞群體中分離。根據(jù)這些體外結(jié)合分析的結(jié)果，可選擇一定范圍的適當LT-β-R阻斷劑濃度根據(jù)本文所述分析在動物中進行測試。
本發(fā)明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R Ab，包括這些抗體或復合物的分離和純化形式、它們的鹽或其藥物學上可接受的衍生物，可采用免疫抑制劑活性試劑的任何傳統(tǒng)上可接受的施用形式來單獨或聯(lián)合給藥。
這些治療方法使用的藥物組合物也可是多種形式。這些形式包括例如固體、半固體和液體劑量形式，如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液或懸液、栓劑、和可注射和可輸入溶液。優(yōu)選的形式取決于期望的給藥方式和治療應(yīng)用。
給藥方式可包括口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、損傷內(nèi)或局部給藥。例如，本發(fā)明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R Ab可置于有或無刺激吸收或穩(wěn)定性的輔因子的無菌等滲制劑之中。該制劑優(yōu)選是液體，或可是冷凍干燥的粉劑。例如，本發(fā)明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R Ab可用含有5.0mg/ml一水合檸檬酸、2.7mg/ml檸檬酸三鈉、41mg/ml甘露醇、1mg/ml甘氨酸、1mg/ml聚山梨醇酯20的制劑緩沖液稀釋?？蓪⒃撊芤簝龈刹⒗鋬霰４?，施用前用無菌注射用水(USP)重新溶解。
所述組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)藥學上可接受的載體(見例如Reminton’s Pharmaceutical Sciences，第16版，1980,MacPublishing Company)。這種藥學上可接受的載體可包括其它醫(yī)藥試劑、載體、遺傳載體、佐劑、賦形劑等，如人血清白蛋白或血漿制品。所述組合物優(yōu)選采用單位劑量的形式，并通常按每天一或多次給藥。
本發(fā)明的藥物組合物也可采用置于感染組織或血流之中、附近或以其它方式與其相聯(lián)系的微球體、脂質(zhì)體、其它微粒遞送系統(tǒng)或持續(xù)釋放制劑來給藥。持續(xù)釋放載體的適當例子包括制成一定形狀的半透性聚合基質(zhì)如栓劑或微囊。可植入的或微囊化持續(xù)釋放基質(zhì)包括聚交酯(美國專利3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22，第547-56頁(1985))；聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸)或乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15，第167-277頁(1981)；Langer,Chem.Tech.,12，第98-105頁(1982))。
含有單個或聯(lián)合的本發(fā)明可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R抗體的脂質(zhì)體可通過熟知方法制備(見如DE 3,218,1211；Epstein等，美國國家科學院院刊，82，第3688-92頁(1985)；Hwang等，美國國家科學院院刊，77，第4030-34頁(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545)。一般地，所述脂質(zhì)體屬于小的(約200-800埃)單層類型，其中脂質(zhì)含量大于約30ml.％膽固醇。選擇膽固醇的比例以控制可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R抗體釋放的最佳速率。
本發(fā)明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R抗體還可與含有其它LT-β-R阻斷劑、免疫抑制劑或細胞因子的脂質(zhì)體連接以調(diào)節(jié)LT-β-R阻斷活性。LT-β-R分子、抗LT配體和抗LT-β-R抗體與脂質(zhì)體的連接可通過任何已知交聯(lián)劑來完成，如廣泛用于將毒素或化學治療劑和抗體偶聯(lián)以便定向遞送的異雙功能交聯(lián)劑。與脂質(zhì)體的連接還可采用針對碳水化合物的交聯(lián)試劑4-(4-馬來酰亞氨基苯基)丁酰肼(MPBH)來進行(Duzgunes,J.Cell.Biochem.Abst.Suppl.16E 77(1992))。
根據(jù)被治療的病癥、失調(diào)或疾病不同，可修飾本發(fā)明的組合物和方法的LT-β-R阻斷劑以獲得期望水平的LT-β-R信號傳導。可以設(shè)想，通過操作這些LT-β-R阻斷劑的濃度和其對各自的分子靶標的親和性可精確調(diào)節(jié)LT-β-R信號傳導的絕對水平。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，給被治療者施用含有可溶性LT-β-R分子的組合物。該可溶性LT-β受體可與細胞表面LT-β受體有效競爭結(jié)合表面LT配體。競爭表面LT配體的能力取決于可溶性LT-β-R分子和細胞表面LT-β-R分子的相對濃度，并取決于它們結(jié)合配體的相對親和力。
含有增加或降低突變可溶性LT-β-R與表面LT配體結(jié)合親和力的突變的可溶性LT-β-R分子，可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標準重組DNA技術(shù)來制備?？墒褂贸Ｒ?guī)實驗方法和本文所述技術(shù)測試具有定點或隨機突變的大量分子充當LT-β-R阻斷劑的能力。同樣，在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗LT-β受體或一或多個LT配體亞基的抗體起LT-β-R阻斷劑作用。這些抗體阻斷LT-β受體信號傳導的能力可通過突變、化學修飾或其它可改變給受治療者遞送的抗體的有效濃度或活性的方法來進行修飾。
用途通常，本發(fā)明的方法可用于在個體中誘導抗病毒應(yīng)答，包括給該個體施用有效量的LT-B阻斷劑和藥物學上可接受載體。待治療的病毒應(yīng)答可以是任何幾種已知病毒引起的，這些病毒包括但不限于SinNombre(SNV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒和登革病毒。
等價物本發(fā)明可以以其它具體形式實現(xiàn)而不脫離本發(fā)明的精神或關(guān)鍵特征。因此，前述實施方案在所有方面均被認為是本文所公開的本發(fā)明的舉例說明，而不是對本發(fā)明的限制。因此，本發(fā)明的范圍由附及的權(quán)利要求書而不是以上描述所指明，而且所有屬于這些權(quán)利要求的意義和等同范圍之內(nèi)的變化均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求之內(nèi)。
實施例腫瘤壞死因子(TNFα)在促使對病毒感染和其它免疫原的急性休克應(yīng)答中起關(guān)鍵作用(K.C.F.Sheehan,N.H.Ruddle，和R.D.Schreiber.，免疫學雜志，142,3884(1989)；G.W.H.Wong和D.V.Goeddel，自然323,819(1986)；B.Beutle,I.W.Milsark,A.Cerami，科學229,869(1985)；F.Mackay,P.R.Bourdon,D.A.Griffiths等，免疫學雜志159,3299(1997)；P.D.Crowe,T.L.VanArsdal,B.N.Walter等，科學264,707(1994))。在涉及休克的登革熱的發(fā)病中，和可溶性TNFR-75水平一樣，患者血清的TNFα水平也升高(D.Hober等，J.Trop Med.Hyg.,48,324(1993)；D.B.Bethell,K.Flobbe,C.X.T.Phuong等，J.Infect.Dis.,177,778(1998))。我們測量了感染淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)變體克隆13(LCMV-13)(HH,Ⅱ)的小鼠血清中TNFα的水平。發(fā)現(xiàn)感染LCMV-13的小鼠血清中TNFα的水平直到感染后第4天才處于該分析的檢測水平之上(血清TNFα水平用ELISA分析(Genzyme公司，目錄號80-2802-00)測量)。在第5和6天，當疾病處于高峰時，血清中可溶性TNFα水平比正常增加3-6倍(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們選擇用已知結(jié)合兩種分泌TNFα的單克隆抗體TN3-19.12阻斷TNFα的功能，從而耗盡小鼠的TNFα，這用ELISA得到證實(K.C.F.Sheehan,N.H.Ruddle，和R.D.Schreiber.，免疫學雜志，142,3884(1989)；G.W.H.Wong和D.V.Goeddel自然323,819(1986)；B.Beutler,I.W.Milsark,A.Cerami，科學229,869(1985)；F.Mackay,P.R.Bourdon,D.A.Griffiths等，免疫學雜志159,3299(1997)；P.D.Crowe,T.L.VanArsdale,B.N.Walter等，科學264,707(1994)；D.Hober等，J.Trop.Med.Hyg.,48,324(1993)；D.B.Bethell,K.Flobbe,C.X.T.Phuong等，J.Infect.Dis.,177,778(1998))。血清TNFα水平用ELISA分析(Genzyme公司，目錄號80-2802-00)測量。NZB小鼠靜脈內(nèi)注射2.5×106pfu克隆13，之后在感染后第1和4天兩次腹膜內(nèi)注射250ug溶于無內(nèi)毒素的PBS(見參考文獻S)的TN3-19.12抗體。對照小鼠在相同日期注射相同體積的無抗體的PBS。該處理(抗TNF)對這些小鼠的存活率影響極小(圖3)。淋巴毒素α(LTα)也稱作TNFβ，盡管其與TNFα的受體和許多生物學效應(yīng)相同，但它并不被該抗體識別(F.Mackay,P.R.Bourdon,D.A.Griffiths等，免疫學雜志159,3299(1997))。可能需要同時靶向TNFα和LTα來增加存活率。為了測試該假說，我們使用了上述TN3-19.12mAb和融合了TNF p55受體細胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1(TNFR55-Ig)CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的受體融合蛋白(W.R.Force,B.N.Walter,C.Hession等，免疫學雜志，155,5280(1995)；G.T.Miller,P.S.Hochman,W.Meier等，JEM.,178,211(1993)；J.L.Browning,I.Dougas,A.Ngam-ek，等，免疫學雜志154:33(1995))。按參考文獻R所述處理小鼠。對于三重處理組，在感染后第0天和第3天腹膜內(nèi)給予200ug量的TNFR55-Ig和LTβR-Ig蛋白。對照小鼠在相同日期給予相同量在這些融合蛋白合成中使用的人抗體(AY1943-29)。僅接受LTβR-Ig的小鼠同樣處理，只是未注射TNFR55-Ig。該處理也沒有顯著改變感染LCMV-13的NZB小鼠的存活率(見抗TNF和TNFR55-Ig組)。淋巴毒素的膜形式，LTα和LTβ的異聚體，不識別TNFR-75或TNFR-55，但結(jié)合第三種受體LTβR(15)。我們選擇使用含有也與人IgG1的CH2和CH3域相連的該LTβR細胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(LTβR-Ig)。用抗TNFαmAb、TNFR55-Ig和LTβR-Ig處理小鼠(三重處理或TNFR55-Ig和LTβR-Ig)導致存活急劇增加，分別達80％和70％。相反，用抗TNFαmAb和TNFR55-Ig處理的小鼠僅20％感染后存活。最近鑒定了LTβR的第二種配體LIGHT(D.N.Mauri,R.Ebner,R.I.Montgomery等，免疫(Immunity)8,21(1998)；R.I.Montgomery,M.S.Warner,B.Lum等，細胞(Cell)87,427(1996))。LIGHT也顯示結(jié)合皰疹病毒進入介體(herpesvirus entry mediator,HVEM)，一種與激活的CD4和CD8 T細胞上表達的TNFR家族成員顯著同源的Ⅰ型跨膜蛋白(D.N.Mauri,R.Ebner,R.I.Montgomery等，免疫8,21(1998)；R.I.Montgomery,M.S.Warner,B.Lum等，細胞87,427(1996))。根據(jù)這里給出的結(jié)果，通過LTβR-Ig結(jié)合LTβ2α1和LIGHT阻斷LTβR信號傳導并潛在地阻斷HVEM信號傳導，可能是三重處理組中觀察到的大多數(shù)效應(yīng)的原因。我們通過只用LTβR-Ig融合蛋白處理LCMV-13感染的NZB小鼠證實了該假說。該組小鼠的存活率(73％)幾乎和三重處理組一樣高(圖3)?？偨Y(jié)起來，這些數(shù)據(jù)首次證實，LTβR和/或HVEM信號傳導通路參與涉及系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的急性致死疾病的發(fā)病。
為確定LTβ阻斷處理背后的存活機制，對來自經(jīng)對照抗體、僅僅LTβR-Ig處理或三重處理的LCMV-13感染NZB小鼠的樣品進行如下實驗共染CD8/四聚體(NZB LD系統(tǒng)中主要的CD8表位)以顯示NP118特異性T細胞，并進行細胞內(nèi)染色顯示NP118肽刺激的脾細胞的γ干擾素產(chǎn)生。圖4說明NP118特異性CD8 T細胞數(shù)目的減少，在三重處理小鼠中觀察到最大效果。在用對照抗體處理的小鼠中，僅10％四聚體陽性細胞活躍地產(chǎn)生INFγ。前人已記載在LCMV-13感染過程中出現(xiàn)無反應(yīng)性T細胞，這可能是由于小鼠中高水平的病毒抗原引起的(圖1)。不僅LTβR-Ig處理的小鼠中NP118特異性T細胞數(shù)日減少，而且產(chǎn)生INFγ的細胞的百分比也降低。這種效應(yīng)在三重處理組中甚至更為顯著。因此，CD8區(qū)室可能是這種對LCMV-13感染的致死NZB應(yīng)答的原因。激活的CD8細胞已知表達LTβ2α1的事實與該假說相符(Y.Abe,A.Horiuchi,Y.Osuka等，Lymph Ctyok.Res.,11,115(1992)；C.F.Ware,P.D.Crowe,M.H.Grayson等，免疫學雜志(J.Immunl.)149,3881(1992)；J.L.Browning,A.Ngam-ek,P.Lawton等，細胞，72,847(1993))。為支持該論斷，我們將感染的NZB小鼠的CD8或CD4陽性T細胞體內(nèi)耗空(靜脈內(nèi)給予雄性NZB小鼠2.5×106pfu LCMV-13，之后兩次腹膜內(nèi)注射500ul抗T細胞抗體。采用mAb Lyt2.43消耗CD8+T細胞，而采用GK1.5(M1)抗體消耗CD4+T細胞。這兩種抗體從雜交瘤上清液通過硫酸銨沉淀，之后用PBS進行透析來制備。使用FACS分析證實若干小鼠中的消耗。)。CD4 T細胞的消耗并不增加存活。相反，與LTβR-Ig處理的小鼠不同，CD8 T細胞的消耗導致100％的存活，并沒有疾病癥狀(圖5)。因為CD8消耗小鼠的若干組織的病毒滴度比未處理的高，所以死亡可能是由于CD8 T細胞介導的毒性免疫應(yīng)答而不是由于病毒感染引起的組織破壞造成的。
我們在此報道了當用高劑量LCMV-13靜脈內(nèi)感染時，NZB小鼠出現(xiàn)與埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒、登革病毒、和Sin Nombre感染具有若干共同特征的急性、迅速發(fā)展的疾病。該疾病的致死率取決于已知激活時表達TNFα、LTα和LTβ的CD8+T細胞的存在。盡管這是一個鼓舞人心的發(fā)現(xiàn)，但通過CD8+T細胞消耗治療病毒感染是不可取的。這種治療可使病人易受到其它機會感染。而且，因為病毒清除在沒有CTL時是不可能的，所以耐受病毒的患者重建CD8+區(qū)室的危險是非常實際的。我們證明通過施用LTβR-Ig阻斷LTβR/HVEM通路是一種有用的治療方法，該方法本質(zhì)上是短暫的，一旦治療停止即可迅速恢復內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(Mackay和Browning，未發(fā)表)。以該方法治療的存活小鼠最終從被測組織中清除了病毒(數(shù)據(jù)未顯示)，并且不再顯示疾病癥狀。
這些數(shù)據(jù)首次證實LTβR信號傳導在抗病毒應(yīng)答和CD8 T細胞功能中起重要作用。該淋巴毒素系統(tǒng)很可能通過控制指導T和B細胞組織的若干趨化因子的表達，與淋巴結(jié)構(gòu)的組織緊密相關(guān)(Chaplin等，Curr.Opin.Immunl.10,289(1998),J.Cyster，出版中)。濾泡樹突細胞的成熟功能狀態(tài)通過恒定的B細胞信號傳導來維持，并且這些細胞在LTβR信號傳導終止后一天內(nèi)消失。這些細胞對于向B和T細胞區(qū)室呈遞抗原是關(guān)鍵的。一個合理的推測是LTβR信號傳導的中斷阻止了抗原向CD8細胞呈遞的某個方面或成熟過程中這些細胞在趨化因子梯度中的適當定位。對LT功能的研究以前主要集中在B細胞的生物學上，并未預見T細胞功能的參與。要么LT具有其它功能，要么這些數(shù)據(jù)反映了新配體LIGHT的作用。HVEM和LIGHT在本文所述疾病的進程中所起的作用目前還不清楚。
權(quán)利要求
1．在個體中誘導抗病毒應(yīng)答的方法，其包括給該個體施用有效量阻斷淋巴毒素β與其受體結(jié)合的試劑和藥物學上可接受的載體。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是LT-β-R阻斷劑。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述試劑是抗淋巴毒素β受體或可溶性淋巴毒素β受體的抗體。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述試劑是淋巴毒素β受體/Ig融合蛋白。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是可溶性淋巴毒素β或抗淋巴毒素β的抗體。
6．在個體中誘導抗病毒應(yīng)答的方法，包括給該個體施用有效量阻斷淋巴毒素β受體和/或HVEM信號傳導通路的試劑。
7．權(quán)利要求1-6的方法，其中所述個體感染了Sin Nombre病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、拉沙病毒或登革病毒
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述試劑是淋巴毒素β-R/Ig融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及在個體中誘導抗病毒應(yīng)答的方法,其包括給該患者施用有效量的LT－B阻斷劑和藥學上可接受的載體。特別地,本發(fā)明提供治療病毒引起的系統(tǒng)休克和呼吸窘迫的方法。
文檔編號A61K38/17GK1323223SQ99811955
公開日2001年11月21日 申請日期1999年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月9日
發(fā)明者J·布朗寧, M·普戈萊利, B·阿邁德 申請人:拜奧根有限公司, 埃默里大學