專利名稱：豬促生長素傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳遞外源多肽至宿主中的表達構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及包括該表達構(gòu)建體的重組細胞和包括該重組細胞的半滲透膠囊。
背景技術(shù)：
在哺乳動物中，促生長素(生長激素)通常由腦垂體分泌。但是，已經(jīng)證實向豬給予外源促生長素會提高攝食效率15-20％，增加日增重10-15％，降低身體脂肪10-20％，增加瘦肉含量5-10％，降低攝食量。令人遺憾的是，促生長素(它是190個氨基酸的小蛋白質(zhì))對胃酸和蛋白降解敏感，因此需要每日注射才會有效果。當前，福利和道德的考慮使得使用氣動pST注射槍不受歡迎，每日用藥的費用也限制了其大規(guī)模的使用。
基因治療的最新進展已經(jīng)發(fā)展出了新的策略，無需依賴自體靶細胞和免疫抑制治療，而使用包封在半滲透藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜中的轉(zhuǎn)染細胞。APA膠囊環(huán)境允許細胞存活和生長，因此轉(zhuǎn)染細胞保持存活并在較長時間內(nèi)分泌生長因子。APA對小蛋白是可通透的，因此基因表達可以通過外源機制控制。APA屏障抑制免疫監(jiān)視和細胞排斥事件，從而可以在膠囊中使用非宿主、高表達細胞。APA屏障也可能阻止宿主受體中轉(zhuǎn)染細胞不受控制的增殖。APA膠囊可以取出，可能還可以再次使用，從而打消對于食用轉(zhuǎn)基因材料的擔(dān)憂。而且，如果膠囊被嚴重的組織創(chuàng)傷損害，正常的宿主-移植物排斥就會摧毀植入的細胞。
發(fā)明概述發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在基因序列導(dǎo)入宿主細胞中之前，胰島素分泌信號與異源基因序列的連接導(dǎo)致外源基因產(chǎn)物分泌水平出乎意料的增長。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致開發(fā)出了改進的基因傳遞系統(tǒng)，包括包封重組細胞植入宿主中。
因而，第一方面，本發(fā)明提供了一種表達盒，包括編碼胰島素分泌信號的序列，其與編碼一種多肽的異源序列有效連接。
“異源序列”是指不是編碼胰島素的序列的序列。
“有效連接”是指胰島素分泌信號序列與異源編碼序列鄰接并位于同一閱讀框。
優(yōu)選的胰島素分泌信號是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的胰島素分泌信號。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可以對分泌信號進行多種修飾而不會對信號的生物活性有不利影響。例如，這可以通過在肽序列中進行各種改變或通過保守或非保守的氨基酸插入、缺失和取代(如D-氨基酸，脫氨基酸)實現(xiàn)，所述改變?nèi)缌蛩峄?、磷酸化、硝化和鹵化，只要這些改變不會對分泌信號的總體生物活性有不利影響。因此，在表達盒中包括已經(jīng)以上述一種或多種方式修飾的胰島素分泌信號被認為包括在本發(fā)明之中。
異源序列可以編碼除胰島素以外的目標多肽。例如，異源序列可以編碼激素、細胞因子、受體激動劑或拮抗劑、信息素或酶。在優(yōu)選實施方案中，異源序列編碼生長激素。優(yōu)選，生長激素是促生長素。
本發(fā)明第二方面提供了包括第一方面的表達盒的載體。該載體可以是將表達盒導(dǎo)入細胞的任何合適的載體。合適載體包括病毒載體和細菌質(zhì)粒。
本發(fā)明第一方面的表達盒或第二方面的載體還可以包括一個或多個調(diào)控基因表達的元件。合適調(diào)控元件的實例包括褪黑素應(yīng)答元件(MRE)(見Schrader et al.,1996，此處全文引入作為參考)，和/或雷帕霉素介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(見Magari et al.,1997，此處全文引入作為參考)。在優(yōu)選實施方案中，調(diào)控元件可以實現(xiàn)目標多肽的脈動表達。
本發(fā)明第三方面提供了一種重組細胞，它包括本發(fā)明第一方面的表達盒。
重組細胞可以是細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物細胞。在優(yōu)選實施方案中，重組細胞是哺乳動物細胞。在進一步優(yōu)選的實施方案中，細胞是大鼠成肌細胞(L6)。
本發(fā)明第四方面提供生產(chǎn)多肽的方法，包括在可以表達和分泌所述多肽的條件下培養(yǎng)第三方面的重組細胞，可選地包括分離該多肽。
本發(fā)明的重組細胞可以包封在半滲透基質(zhì)中以傳遞或植入人體。
因此，本發(fā)明第五方面提供植入宿主的膠囊，該膠囊包括包封本發(fā)明第三方面的一種或多種重組細胞的半滲透膜。
在優(yōu)選實施方案中，半滲透膜是藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜。APA半滲透膜的制備見Basic et al.,1996，該文獻全文引入作為參考。
本發(fā)明第六方面提供向宿主給予多肽的方法，包括向宿主給予本發(fā)明第一方面的表達盒。
本發(fā)明第七方面提供向宿主給予多肽的方法，包括在宿主中植入本發(fā)明第五方面的膠囊。
宿主可以是任何動物或人。在優(yōu)選實施方案中，宿主是家畜。在進一步優(yōu)選的實施方案中，宿主選自放牧牛、圈養(yǎng)牛、奶牛、豬和家禽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，本發(fā)明提供了傳遞遺傳物質(zhì)到宿主中的改進系統(tǒng)。胰島素分泌信號與生物活性多肽的連接導(dǎo)致從重組細胞分泌的多肽增加。分泌后，分泌信號可以切除，留下生物活性多肽。重組細胞包封在半滲透膜中時，可以分泌相當數(shù)量的生物活性多肽，借助半滲透膜可以通過外來方式控制基因表達。植入包封的重組細胞的優(yōu)勢在于植入需要的手術(shù)最輕。此外，半滲透膜減少了免疫監(jiān)視和細胞排斥，這意味著非宿主細胞可以用在膠囊中。
在優(yōu)選實施方案中，半滲透膜是持久耐用的，從而具有限制細胞生長并阻止在宿主受體中的不受控制增殖的優(yōu)勢。膠囊的另一個優(yōu)勢在于它們可以被取出并再次使用。
為了更清楚地理解本發(fā)明的特點，以下參照非限定性實施例和附圖敘述本發(fā)明的優(yōu)選方式。
附圖簡述

圖1胰島素分泌信號-pST基因構(gòu)建體。
圖2胰島素分泌信號-pST肽序列。
圖3對照和pST-L6IXS處理豬的增重率(從0天起)。
圖4對照和pST-L6IXS處理豬的增重百分比。
圖5對照和pST-L6IXS處理動物的血漿pST水平。
圖6Plate 1-pST-L6IXS膠囊給藥部位評估。
Plate 2-pST-L6IXS膠囊置于培養(yǎng)基中進行來自體內(nèi)的評估。
圖7從宿主動物取出后24小時從膠囊分泌pST的來自體內(nèi)的評估。
圖8在給予pST膠囊之前(白柱體)和一周后(黑柱體)平均血漿pST(3小時@30分鐘間隔)(*顯著性)圖9分別植入分泌25ng/ml和500ng/ml的膠囊的兩只豬206和228的每日血漿pST濃度。
圖10實施例4中的豬的增重率(ROG，公斤/日，黑方塊)和P2背脂肪測定。
圖11植入pST分泌或?qū)φ彰庖咧行曰蛑委?IGT)膠囊后公豬增重率(ROG)(±SEM)。
圖12植入pST分泌或?qū)φ彰庖咧行曰蛑委?IGT)膠囊后公豬背脂肪(P2)(+SEM)。
圖13植入pST分泌或?qū)φ彰庖咧行曰蛑委?IGT)膠囊后公豬腰(眼)肌肉面積(+SEM)。
發(fā)明詳述實施例1ISS-pST構(gòu)建體的克隆pST基因獲自Southern Cross Biotechnology Pty Ltd的大腸桿菌。含有pST基因的質(zhì)粒pMG939使用標準質(zhì)粒制備技術(shù)從細菌中分離。設(shè)計用來擴增pST基因的PCR引物，在5’末端加入XhoⅠ位點，3’末端加入XbaⅠ位點，以進行連接。
修飾pST基因序列然后連接至來自前原胰島素cDNA的分泌信號序列(ISS)。NheⅠ(GCTAGC)和XbaⅠ(TCTAGA)限制位點分別構(gòu)建在ISS起始密碼子之前pST 3’末端密碼子之后，以便整合進pCI-neo質(zhì)粒(Promega)。然后分離pST融合構(gòu)建體并測序，以驗證編碼區(qū)(圖1)。
大鼠成肌細胞(L6)用胰蛋白酶處理后2小時，用LipoTAXI(Stratagene)進行轉(zhuǎn)染(pST基因整合細胞)。PST轉(zhuǎn)染L6細胞克隆在培養(yǎng)物中維持，用G418選擇，直至產(chǎn)生＞107細胞。培養(yǎng)物上清的等分試樣(2ml)在-20℃保存，直至用悉尼大學(xué)(Camden)的Dr P.Wynn首創(chuàng)的pST放射免疫試驗(RIA)測定pST濃度。RIA敏感性被認為大于0.4ng/ml,CV為12.4％。多克隆抗血清用pST肽抗原在豚鼠中產(chǎn)生。RIA結(jié)果(表1)表明pST基因構(gòu)建體產(chǎn)生一種蛋白(圖2)，它被由豬腦垂體純化的天然形式pST產(chǎn)生的多克隆抗血清識別。L6克隆pCI/pst-1.5如下所述由修飾轉(zhuǎn)染技術(shù)產(chǎn)生。
修飾轉(zhuǎn)染法一般說來，L6細胞粘附在培養(yǎng)板上，需要用胰蛋白酶解吸附才能傳代；轉(zhuǎn)染一般在24小時后進行。該方法產(chǎn)生分泌6-18ng/ml pST的L6細胞克隆(n=10)。胰蛋白酶處理2小時后，加入LipoTAXI(Promega)和ISS/pST質(zhì)粒至L6細胞增加pST分泌速率10到20倍(＞180ng/ml,n=5克隆)。該較高的pST分泌速率降低了促進生長所需的細胞數(shù)(膠囊數(shù))。
表1用ISS-pST轉(zhuǎn)染的各克隆的濃度(ng/ml)
實施例2豬促生長素-大鼠成肌細胞(L6)免疫中性表達系統(tǒng)(pST-L6IXS)的制備按照Basic et al,1996所述進行包封步驟，包括如下改進。
在室溫下包封細胞，利用氯化鈣(或乳酸鈣)(100mM)使藻酸鹽(1.5％w/v)液滴形成凝膠，然后立即用鹽水(0.9％NaCl)洗滌，再重懸于聚-L-賴氨酸(0.05％)中5分鐘。37℃氯化鈣交聯(lián)10分鐘產(chǎn)生與細胞活力更相容的藻酸鹽基質(zhì)。
聚-L-賴氨酸包被和鹽水洗滌之后，加入另一層藻酸鹽。檸檬酸鈉(55mM)室溫處理4分鐘軟化膠囊至一定堅度，增加進一步操作的難度。檸檬酸鈉處理4分鐘顯著降低細胞活力至＜35％。檸檬酸鈉處理之前將膠囊置于細胞濾過器使得37℃下處理1分鐘提高細胞活力達＞98％。
對包封方法的步驟和設(shè)備改進提高了包封的效率(時間和資源)，細胞活力一般增加64％。
實施例3pST-L6IXS植入豬的初步試驗(1)將pST-L6IXS給予生長中的小鼠獲得的初步結(jié)果表明了較好的生長特性。在用公豬進行的初步試驗(n=9，平均活體重61公斤)中，在不同部位給予不等量的pST-L6IXS(0天，每只動物頸部肌肉，3個膠囊，i.m.；頸部，3個膠囊，s.c.；耳根部，10個膠囊，s.c.；頸部，20個膠囊，i.m.；頸部，29個膠囊，i.m.)。頸靜脈穿刺采集血樣(10ml)，給藥后-14、0、7、14、21、28和36天記錄P2超聲(us)測定結(jié)果。試驗中全程監(jiān)測pST-L6IXS給藥部位的組織反應(yīng)事件。36天將動物無痛處死，對軀體各部分進行分析(背部脂肪厚度，BF(mm)；眼肌面積，EMA(cm)；前臂骨長，BONE(cm)；心臟重量，HEART(gm)；脾臟重量，SPLEEN(gm)；肝臟重量，LIVER(gm))并記錄(見表2)，回收pST-L6IXS。圖3代表對照(con，平均值±SE,n=4)和各只pST-L6IXS處理豬的增重率(從0天起)。對照(con)(平均值±SE)和各只pST-L6IXS處理動物相對于pST-L6IXS處理的增重百分比在圖4中示出。對照(平均值±SE)(con)和各只pST-L6IXS處理動物的血漿pST(ng/ml)通過放射免疫試驗(RIA)確定并在圖5中示出。處死時評價pST-L6IXS給藥部位(圖6,Plate 1，箭頭)，然后取出并置于培養(yǎng)基中進行來自體內(nèi)的24小時pST分泌評估(圖6,Plate 2)(圖6)。在36天i.m.或s.c.給藥均未觀察到明顯的組織損害或免疫反應(yīng)。但是，置于耳部(s.c.)的膠囊似乎高度血管化，而且100％可回收。置于頸部的膠囊可回收的小于10％。
pST-L6IXS在體內(nèi)36日仍有效，并且似乎在膠囊中增殖(Plate2)，膠囊可以取出，從而打消對食用轉(zhuǎn)基因材料的擔(dān)憂。而且，如果膠囊受損(即由于嚴重的組織創(chuàng)傷)，正常的宿主-移植物排斥會摧毀L6細胞，防止轉(zhuǎn)染材料的增殖。小鼠和豬中進行的試驗已經(jīng)證實pST-L6IXS可有效改變血清pST，提高生長特性，還可能提高動物的免疫能力。
表2pST-L6IXS初步試驗公豬由Westmill piggery(Young,NSW)在EMAI的高度安全豬舍進行試驗ACEC號98/20
實施例4pST-L6IXS植入豬的初步試驗(2)為了優(yōu)化通過膠囊的pST-L6IXS傳遞，從而獲得類似于每日注射pST的能量再分配的生長應(yīng)答，進行了第二次初步試驗。
如實施例1所述，制備了多種分泌速率(6-200ng/ml)的pST分泌細胞。對pST分泌細胞外加脅迫(即細菌污染)后，2-25ng/ml的pST分泌速率似乎是最穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未示出)。因此，選擇分泌約5ng/ml(克隆pCI/pst-14)和約10ng/ml(pCI/pst-12)的克隆進行該初步試驗。在公豬(n=10，平均活體重78.1kg)耳根部以s.c.途徑給予不同數(shù)量的膠囊(按照實施例2所述步驟制備)(表3)。
a=克隆pCI/pst-14(5ng/ml)b=克隆pCI/pst-12(10ng/ml)試驗開始和結(jié)束時記錄體重。動物分別圈養(yǎng)于圍欄(2m2)，并在控制的環(huán)境條件下(22℃)穩(wěn)定一周。動物自由飲水，定量給予標準顆粒狀食料(3kg/日@0:900hrs)，記錄每日殘留。插管置于耳靜脈(evc)，24小時后開始取樣。對照豬(即不給予pST膠囊)血漿(10毫升)每30分鐘收集一次，共3小時。系列取樣后，耳后部給予pST膠囊。通過evc收集血樣(10毫升)(每日@11:00hrs)，插管仍留置。處理(給予pST膠囊后7日)血漿(10ml)每30分鐘收集一次，共3小時。處死和軀體分析在21日后活體重為約100kg時進行。然后由耳部回收pST膠囊，置于體外培養(yǎng)(進行pST分析)。評估膠囊植入部位的免疫應(yīng)答(如淋巴細胞浸潤)。
接受pST膠囊(分泌5到1000ng/ml)之前和之后7天，豬平均(3小時、30分鐘間隔)血漿pST濃度測定結(jié)果示于圖8。由圖8可見，免疫中性pST(5-100ng/ml)分泌膠囊處理后1周，豬血漿pST明顯減少。
個體間和個體中血漿pST濃度的變化在對照系列取樣期間似乎更明顯。這種現(xiàn)象反映在平均測定濃度的標準誤中。此外，穩(wěn)定基線和pST脈沖間隔(一般3-4小時)不能被設(shè)計來鑒別激素脈沖的計算機程序識別。但是，穩(wěn)定基線和明顯的pST脈沖在pST膠囊給藥后一周的動物中可以觀察到(圖9)。
動物的增重率(ROG)似乎以劑量依賴方式對pST膠囊分泌有反應(yīng)(圖10)。30ng/ml的分泌率(即3個膠囊各分泌10ng/ml)似乎是觀察到生長速率增加所需的最小劑量。大多數(shù)evc在21天保持有效，此時動物用巴比妥鹽無痛處死以進行軀體分析。軀體背部脂肪分析(不計皮膚的P2)測定值進一步表明30ng/ml是pST膠囊給藥21天內(nèi)觀察到能量再分配所需的最小劑量(圖10)。
包括接受100個膠囊的動物在內(nèi)，所有動物在試驗過程中未觀察到副反應(yīng)，即增重下降或不利免疫應(yīng)答。
實施例5pST-L6IXS植入豬的初步試驗(3)實施例4后，進行試驗以評估在處死前不同時間(即處死前2、4和6周)向豬給予最佳pST分泌速率/膠囊數(shù)對背部脂肪的影響。每個處理使用8只動物，8只動物用作對照(即無pST膠囊)。
增重率測定結(jié)果在圖11中給出。
在全軀體冷凍(24小時@4℃)后進行背部脂肪測定(圖12)。對距脊柱中心65毫米的第12肋骨記錄P2測定值。觀察到給予分泌pST的膠囊2、4和6周的豬背部脂肪較少約46％。給予pST IGT膠囊4周的動物背部脂肪反應(yīng)差異更大，這可能與從多只這樣的動物中不能回收膠囊有關(guān)。
分泌膠囊處理的豬腰部肌肉面積只有在pST IGT膠囊處理6周后才顯著增加(22％)(圖13)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，對本發(fā)明的具體技術(shù)方案可以進行多種改進和/或修飾，而不會偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本文所述的各種實施方案僅是示例性的而非限制性的。
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1．一種表達盒，包括編碼胰島素分泌信號的序列，該序列與編碼一種多肽的異源序列有效連接。
2．權(quán)利要求1的表達盒，其中胰島素分泌信號具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
3．權(quán)利要求1的表達盒，其中胰島素分泌信號是修飾的胰島素分泌信號，具有與氨基酸序列為SEQ ID N0:1的胰島素分泌信號基本相同的總體生物活性。
4．權(quán)利要求1到3任一項的表達盒，其中異源序列編碼選自激素、細胞因子、受體激動劑、受體拮抗劑、信息素和酶的多肽。
5．權(quán)利要求4的表達盒，其中多肽是生長激素。
6．權(quán)利要求5的表達盒，其中多肽是促生長素。
7．權(quán)利要求1到6任一項的表達盒，還包括使異源序列脈沖表達的一種或多種調(diào)控序列。
8．包括權(quán)利要求1到7任一項的表達盒的載體。
9．包括權(quán)利要求1到7任一項的表達盒的重組細胞。
10．權(quán)利要求9的重組細胞，其中細胞是細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。
11．權(quán)利要求10的重組細胞，其中細胞是哺乳動物細胞。
12．權(quán)利要求11的重組細胞，其中細胞是大鼠成肌細胞(L6)。
13．制備多肽的方法，包括在可以表達和分泌該多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9到12任一項的重組細胞，并可選地包括分離該多肽。
14．用于植入宿主的膠囊，膠囊包括包封權(quán)利要求9到12任一項的重組細胞的半滲透膜。
15．權(quán)利要求14的膠囊，其中半滲透膜是藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜。
16．向宿主給予多肽的方法，其中該方法包括向宿主給予權(quán)利要求1到7任一項的表達盒。
17．向宿主給予多肽的方法，其中該方法包括在宿主中植入權(quán)利要求14或15的膠囊。
18．權(quán)利要求16或17的方法，其中宿主是動物或人。
19．權(quán)利要求18的方法，其中宿主是家畜。
20．權(quán)利要求19的方法，其中家畜是豬。
21．向豬給予促生長素的方法，其中該方法包括在豬中植入包括包封重組細胞的半滲透膜的膠囊，所述重組細胞包括和表達一種表達盒，所述表達盒包括編碼胰島素分泌信號的序列，所述胰島素分泌信號與編碼促生長素的異源序列有效連接，其中所述膜對表達的促生長素是可通透的。
22．權(quán)利要求21的方法，其中胰島素分泌信號具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
23．權(quán)利要求21的方法，其中胰島素分泌信號是修飾的胰島素分泌信號，其具有與氨基酸序列為SEQ ID NO:1的胰島素分泌信號基本相同的總體生物活性。
24．權(quán)利要求21到23任一項的方法，其中重組細胞是哺乳動物細胞。
25．權(quán)利要求24的方法，其中哺乳動物細胞是大鼠成肌細胞(L6)。
26．權(quán)利要求21到25任一項的方法，其中半滲透膜是藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜。
27．權(quán)利要求21到26任一項的方法，其中向豬植入一個或多個膠囊，這些膠囊足以分泌至少30ng/ml的促生長素。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于傳遞外源多肽(如促生長素等生長激素)至宿主中的表達構(gòu)建體。在本發(fā)明一個應(yīng)用中,將表達構(gòu)建體導(dǎo)入非宿主重組細胞,該細胞包封于半滲透膜中,用于植入宿主。半滲透膜抑制免疫監(jiān)視和細胞排斥事件,從而可以使用非宿主的高表達重組細胞。
文檔編號A61P5/02GK1323348SQ99812256
公開日2001年11月21日 申請日期1999年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月16日
發(fā)明者M·基根, M·R·瓊斯, G·P·M·莫雷 申請人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織, 西悉尼大學(xué)(尼平), 豬只研究及開發(fā)公司