專利名稱：絲氨酸蛋白酶抑制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有醚鍵合精氨酸置換的絲氨酸蛋白酶抑制劑，含有它們的藥物組合物，以及所述絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備藥物中的應用。
絲氨酸蛋白酶是在凝血級聯中起重要作用的酶。除凝血酶和凝血因子Xa之外，此類蛋白酶的其它實例包括凝血因子VIIa、IXa、XIa、XIIa和蛋白質C。凝血酶在凝血級聯中是最終的絲氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是裂解血纖蛋白原生成血纖蛋白單體，它們交聯形成不溶性凝膠。此外，凝血酶通過在級聯早期激活凝血因子V和VIII來調節(jié)其自身的產生。它在細胞水平也具有重要作用，其中凝血酶在特定受體起作用引起血小板聚集、內皮細胞活化和成纖維細胞增殖。因而凝血酶右淤血栓形成中具有中心調節(jié)作用。由于凝血酶的抑制劑具有廣泛的治療性用途，所以人們一直在嘗試發(fā)現新的絲氨酸蛋白酶抑制劑。上述努力中存在的困難是發(fā)現一種可將治療安全性、選擇性、有效性與合成可行性相結合的化合物。特別是，口服途徑給藥的生物利用度對于選擇性凝血酶抑制劑而言是難題。在WO 97/16444中公開了具有修飾的三肽序列苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸的凝血酶抑制劑，其中羧基存在于氨基末端并且精氨酸被通過醚鍵與脯氨酰類似物相連的堿性(氨基亞氨基甲基)苯基或堿性(氨基亞氨基甲基)吡啶基所置換。
本發(fā)明的目的是提供新的化學上可行的絲氨酸蛋白酶抑制劑，這些絲氨酸蛋白酶抑制劑具有良好的藥理學和毒理學性能和足夠的治療用效能。
迄今已發(fā)現本目的可以通過式(I)的絲氨酸蛋白酶抑制劑，特別是凝血酶抑制劑來實現， 其中J為H、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Pig或D-3-Pig的氨基酸；E是-NR2-CH2-或片段 其選擇性地被(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基或芐氧基取代；R1選自(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(2-12C)炔基、(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，這些基團可以被(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、CF3或鹵素選擇性取代；和選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基、(8-16C)芳烯基和(14-20C)(雙芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或鹵素選擇性取代；R2、R2a和R2b分別獨立地選自H、(1-8C)烷基、(2-8C)鏈烯基、(2-8C)炔基、(3-8C)環(huán)烷基和(3-6C)環(huán)烷基(1-4C)亞烷基，它們可以分別被(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；和選自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；R3如R2定義或Het-(1-6C)烷基；R4是H或(1-3C)烷基；X和Y是CH或N，條件是它們不同時為N；Het是含有一個或多個選自O、N和S的雜原子的4-、5-或6-元雜環(huán)；m是1或2；p是1、2或3；q是1、2或3；t是2、3或4；及其前藥；和它們的藥學上可接受的加成鹽和/或溶劑化物。
特別是，本發(fā)明的化合物在口服給藥后具有改進的生物利用度。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中化合物具有式(I)，其中J為H、R1、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；更優(yōu)選是被(1-6C)烷氧基選擇性取代的(3-12C)環(huán)烷基；或D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-的氨基酸；更優(yōu)選是式-NH-CHR1-C(O)-的氨基酸或式-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-的L-氨基酸；或E是-N(3-6)環(huán)烷基-CH2-或片段 它們被(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基或芐氧基選擇性取代；更優(yōu)選不被取代；或R1選自(1-12C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，這些基團可以被(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基或氧代選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(雙芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或鹵素選擇性取代；更優(yōu)選選自(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，它們可以被(3-12C)環(huán)烷基一(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(雙芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基或鹵素選擇性取代；或R2是H；或R2a和R2b分別獨立地選自H、(1-8C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基和(3-6C)環(huán)烷基(1-4C)亞烷基，它們可以分別被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；或R3選自H、(1-8C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基和(3-6C)環(huán)烷基(1-4C)亞烷基，它們分別可以被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；和選自Het-(1-6C)烷基；更優(yōu)選選自(1-8C)烷基和(3-8C)環(huán)烷基，它們分別可以被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代，和選自Het-(1-6C)烷基；或R4是H或(1-3C)烷基；或X和Y是CH；或Het是含有一個或多個選自O、N和S的雜原子的4-、5-或6-元雜環(huán)；m是2；或p是1；或q是2；或t是3或4；更優(yōu)選是4。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，D是式-NH-CHR1-C(O)-的氨基酸或谷氨?；鵞或它們的(1-6C)烷基酯]；R1選自(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，它們可以被(3-12C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(雙芳基)烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基或鹵素選擇性取代；和R3選自(1-8C)烷基和(3-8C)環(huán)烷基，它們分別可以被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代，和選自Het-(1-6C)烷基。
特別優(yōu)選的化合物是其中J為-CH2COO(1-6C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基、-SO2-10-樟腦、-CH2CONH苯基或-CH2CONH(3-8C)環(huán)烷基。其它非常優(yōu)選的化合物是那些其中D為D-環(huán)己基丙氨酰基、D-苯基丙氨?；?、D-二苯基丙氨?；蚬劝滨；鵞或它們的(1-6C)烷基酯]的化合物。另外特別優(yōu)選的其中E是片段 其中t是3或4的化合物。
本發(fā)明中術語具有下列含義(1-12C)烷基、(1-8C)烷基、(1-6C)烷基、(1-3C)烷基是指分別具有1-12、1-8、1-6和1-3個碳原子的支鏈或非支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、己基、辛基等。(2-12C)烯基和(2-8C)烯基是指分別含有2-12和2-8個碳原子的支鏈或非支鏈烯基，例如乙烯基、2-丁烯基等。(2-12C)炔基和(2-8C)炔基是指分別具有2-12和2-8個碳原子的支鏈或非支鏈炔基，例如乙炔基、丙炔基等。(1-6C)烷氧基是指具有1-6個碳原子的烷氧基，烷基部分具有如上定義的含義。(3-12C)環(huán)烷基、(3-8C)環(huán)烷基、(3-6C)環(huán)烷基是指分別具有3-12、3-8和3-6個碳原子的一-或雙環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等。(1-6C)亞烷基、(1-4C)亞烷基是指分別含有1-6和1-4個碳原子的支鏈或非支鏈亞烷基，例如-(CH2)a-(其中a相當于碳原子的數量)-CH(CH3)-和-CH(CH3)-CH2-等。(2-10C)亞烯基是指具有2-10個碳原子和一個或多個雙鍵的支鏈或非支鏈烯基，例如-CH＝CH-CH2-、-(CH2)2-CH＝CH-CH(CH3)-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-等。(6-14C)芳基、(6-12C)芳基是指分別具有6-14或6-12個碳原子的芳族烴基，例如苯基、萘基、四氫萘基、茚基等。(7-15C)芳烷基是指具有7-15個碳原子的芳烷基，其中“烷基”表示(1-8C)亞烷基而芳基是(6-14C)芳基，兩者如上述定義。(8-16C)芳烯基是指具有8-16個碳原子的芳烷基，其中“烯基”表示(2-10C)亞烯基而芳基是(6-14C)芳基，兩者如上述定義。(14-20C)(雙芳基)烷基是指在同一碳原子上或在不同碳原子上被兩個獨立選定的芳基取代的(1-3C)烷基，所述芳基如(6-12C)芳基所述定義，例如雙苯基甲基。鹵素是指F、Cl、Br或I。Tiq是指1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸。Atc是指2-氨基四氫萘-2-羧酸。Aic是指2-氨基二氫茚-2-羧酸。Pig是指全氫異喹啉基羧酸。術語“前藥”是指在給藥后代謝為一種或多種具有式I的活性化合物的化合物。適用的前藥例如是式I化合物的N-烷氧基羰基保護(優(yōu)選N-乙氧基羰基)的衍生物。
由于氨基異喹啉、氨基喹唑啉或氨基酞嗪中的氨基所具有的堿性小于賴氨酸和精氨酸中的氨基，意外地是新發(fā)明的化合物具有足夠的絲氨酸蛋白酶抑制功效。
如上所述，本發(fā)明的化合物是參與凝血級聯的絲氨酸蛋白酶的抑制劑，特別是凝血酶和/或凝血因子Xa的抑制劑。這些化合物可以應用在臨床和獸醫(yī)治療中，即用來治療和預防凝血酶介導性和凝血酶相關性疾病。這包括許多其中凝血級聯被激活的血栓形成和前血栓形成病癥。此類疾病和病癥是或伴隨有例如深度靜脈血栓形成、肺栓塞、血栓靜脈炎、血栓形成或栓塞引起的動脈閉塞、血管成形術或血栓溶解期間或之后的動脈再閉塞、動脈損傷或侵入性心臟手術繼發(fā)的再狹窄、術后靜脈血栓形成或栓塞急性或慢性動脈粥樣硬化、中風、心肌梗塞、某些類型的癌癥和轉移，以及某些種類的神經變性疾病。本發(fā)明的化合物也可以用作體外抗凝劑或用作體外血液循環(huán)的抗凝劑，例如在透析和外科手術中所必需的那些。
按照另一方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預防動物或人體中凝血酶介導和凝血酶相關性疾病的方法，該方法包括用治療有效量的本發(fā)明化合物治療損傷動物或人體。
本發(fā)明的化合物可以經腸道(例如口服、直腸經鼻或局部)或非腸道(例如經肌肉內、皮下、靜脈內或腹膜內注射)給藥。
這些化合物及其組合物的精確給藥劑量和給藥方案必然取決于本發(fā)明化合物所施用的個體對象的需要、藥物的形式、病情的程度或需求以及醫(yī)藥人員的判斷。通常，非腸道給藥需要的劑量需要比其它給藥方法較低的劑量，這更取決于吸收作用。然而，用于人體的日劑量優(yōu)選是O.001-100mg/kg體重，更優(yōu)選0.01-10mg/kg體重。
一個日劑量可以以一個或多個適合如口服、直腸、舌下或經鼻途徑或經皮(如透皮貼劑，或膏劑形式)的劑量單位施用。
本發(fā)明化合物的另一種給藥途徑是通過其它方式將所述化合物引入(透析)循環(huán)中，例如漸進地或一次性地注射到透析膜的系統(tǒng)上游中，同時將血液引入該回路。而且，本發(fā)明的化合物可以提供給所述體外循環(huán)的線路和/或其它設備，優(yōu)選通過涂層的方式(但不限于此)。另外，設備的部分材料中可以吸收有本發(fā)明的化合物，例如在透析用薄膜中。
本發(fā)明涉及一種在哺乳動物中抑制血小板聚集的喪失、抑制血纖蛋白的形成、抑制血栓形成和抑制栓塞物形成的藥物組合物，該組合物含有本發(fā)明的化合物和適當的輔料。這些組合物可以選擇性地含有抗凝劑、抗血小板劑和溶血栓藥?？梢詫⒃摻M合物加入血液、血液制品或哺乳動物器官中以便產生預期的抑制作用。本發(fā)明還涉及一種預防或治療哺乳動物中的不穩(wěn)定心絞痛、頑固性心絞痛、心肌梗塞、暫時性局部缺血發(fā)作、心房纖維性顫動、血栓形成性中風、栓塞性中風、深度靜脈血栓形成、播散性血管內凝血以及再造管血管的再閉塞和再狹窄的藥物組合物，該組合物含有本發(fā)明的化合物。這些藥物組合物可以選擇性地含有抗凝劑、抗血小板劑和溶血栓藥。本發(fā)明還涉及一種降低哺乳動物中表面的血栓形成性的方法，該方法通過共價或非共價地將本發(fā)明的化合物連接在表面上。
本發(fā)明進一步涉及一種與適合該組合物的包裝材料相結合的藥物組合物，該藥物組合物如上所述，所述包裝材料內帶使用所述藥物組合物的說明書。
為了制備給藥形式，如丸劑、片劑、栓劑、(微)膠囊、散劑、乳劑、霜劑、軟膏、植入物、噴霧劑、溶液或混懸液形式的注射制劑，可以采用適當的輔料如載體、填充劑、粘合劑、潤滑劑、分散劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、抗氧劑、著色劑、防腐劑等，如標準參考文獻Gennaro等人的《Remington氏藥物科學》(第18版，Mack發(fā)行公司，1990，尤其參見第8部分藥物制劑及其制備)中所述的。通常，任何不妨礙活性化合物功能的藥學可接受輔料均適宜并且可采用。
適宜本發(fā)明活性劑給藥的載體和填充劑包括，例如瓊脂、醇、纖維素衍生物、脂肪、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、二氧化硅、滅菌鹽水等。
粘合劑是用來賦予藥物組合物粘結性質的試劑，目的是減小藥物組合物在生產和處理中的損耗。粘合劑例如是纖維素、淀粉類、聚乙烯吡咯烷酮等。
適合本發(fā)明活性劑給藥的潤滑劑例如是硬脂酸鎂。
表面活性劑是化合物在不同物理環(huán)境如親水性和疏水性環(huán)境中易于接觸和遷移的試劑。多種表面活性劑是藥物組合物制備領域中所公知的，例如公開在《Remington氏藥物科學》(第18版，作者A.R.Gennaro，Mack發(fā)行公司，1990，Easton，賓西法尼亞)第19章中。在制備藥物制劑過程中可采用的表面活性劑例如是聚乙二醇(PEG)等。
所述化合物也可用于可植入藥物裝置內，例如US專利4767628中所述的那些，其內容在此引入作為參考。所述裝置應含有足夠量的化合物以緩慢釋放該化合物(例如一個月以上)。
式(I)的化合物可以由式(II)的化合物或其衍生物制得，其中位于芳基上的氨基(芳基氨基)被保護為尿烷如Alloc或酰胺如苯甲?；?，其中D、E、X、Y和m具有上述定義并且Pg是N-保護基(優(yōu)選尿烷如Boc)。 本申請中所用的術語N-保護基是指肽化學中常用來保護α-氨基的基團，例如烯丙氧基羰基(Alloc)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Z)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或鄰苯二甲酰基。可以以不同方式脫除保護基，這取決于那些保護基的性質。有關氨基保護基及其脫除方法的概述公開在上文提及的《肽、分析、合成、生物學》第3卷和T.W.Greene&P.G.M.Wuts的《有機合成中的保護基》第2版，(1991，John Wiley&Sons，Inc.，)中。
利用該領域中的已知方法如肽偶聯、烷基化或還原胺化，脫除N-保護基Pg并且選擇性修飾脫保護氨基可以得到式(I)的化合物。
式(II)的化合物可以由式(III)的化合物或其衍生物制得，其中芳基氨基被保護為尿烷如Alloc或酰胺如苯甲?；渲蠩、X、Y、m和Pg具有上述含義。脫除式(III)化合物中的N-保護基Pg并且使肽與式Pg-D-OH的化合物偶聯可以生成式(II)的化合物，其中D和Pg具有上述含義。 另外，式(I)的化合物可直接由式(III)的化合物制得。脫除式(III)化合物中的N-保護基Pg并且使肽與式J-D-OH的化合物偶聯可以生成式(I)的化合物，其中J和D具有上述含義并且可以選擇性地含有附加保護基。
由式(IV)的那些化合物在標準Mitsunobu條件下(三丁基膦，二烷基偶氮二羧酸)通過與式J-D-E-(CH2)m-OH、Pg-D-E-(CH2)m-OH或Pg-E-(CH2)m-OH反應可得到式(I)、(II)和(III)的化合物或其衍生物，其中X和Y具有上述含義，其中芳基氨基被保護為尿烷如Alloc或酰胺如苯甲酰基，其中D、E、J、m和Pg定義如上并且選擇性地含有保護基(R.L.Elliot，H Kopecka，D.E.Gunn，H.-N.Lin&D.S.Garvey，《生物有機、醫(yī)學和化學通訊》(Bioorg.Med.Chem.Lett.)6.2283(1996)；K.Wisniewski，A.S.Koldziejczyk&B.Falkiewicz，《肽科學雜志》(J.Pept.Sc.)4，1(1998))。 通過相應的胺R3NH2與丙烯酸乙酯共軛加成，用氫化鋰鋁還原酯官能團并且進而引入N-保護基Pg制備得到其中E＝-R3NCH2-和m＝2的式Pg-E-(CH2)m-OH類的醇。
通過與BBr3[J.F.W.McOmie&D.E.West，《有機合成合集》(Org.Synth.Collect.)第V卷，412(1973)]或EtSNa[A.S.Kende&J.P.Rizzi，《四面體通訊》，22，1779(1981)]反應可以實現將式(V)的甲基芳基醚脫甲基化為式(IV)相應的酚類化合物。 適合制備式(V)化合物的起始原料是式(VI)的化合物，其中X和Y具有上式含義。式(VI)化合物的氯基通過與氨在加壓下加熱可以被直接轉變?yōu)榘被Ａ硗?，通過與酚在堿性條件下反應可以使式(VI)化合物的氯基轉化為苯氧基，隨后用醋酸銨處理得到式(V)化合物的氨基。式(V)的化合物也可以通過用疊氮化鈉處理式(VI)的化合物且進而用PPh3還原該疊氮芳烴來獲得。 由式(VII)的化合物通過用磷酰氯處理可以獲得其中X和Y定義如上的式(VI)的化合物。式(VII)的化合物公開在文獻中；7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮Chapman等人《化學會志》890(1947)，6-甲氧基-2H-酞嗪-1-酮，Consonni P.&A.Omodei-Sale，Farmaco，Ed.Sci.，76，691(1976)(化學文摘85-177191)。通過例如用過酸(如間-氯過苯甲酸)使6-甲氧基-異喹啉(Hendrickson，J.B.；Rodriguez，C.；《有機化學雜志》1983，48，3344-3346)轉化為N-氧化物鹽，然后用HCl處理，并且此后令該N-氧化物鹽與氯化試劑(如磷酰氯)反應(J.Robinson，《美國化學學會會志》69，1941(1939))可以制備其中X＝CH和Y＝CH的式(VI)化合物(1-氯-6-甲氧基-異喹啉)。 作為上述制備本發(fā)明化合物的方法中提及的一個過程步驟，肽偶聯可以通過所屬領域常用于偶合-或縮合-肽片段的已知方法來進行，例如通過疊氮法、混合酐法、活化酯法，或優(yōu)選通過碳二亞胺法，尤其是催化和消旋抑制化合物如N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基苯并三唑的加入。適用的方法公開在《肽、分析、合成、生物學》第3卷，E.Gross&J.Meienhofer編輯(Academic Press.New York，1981)，R.Knorr，A.Trzeciak，W.Bannwarth&D.Gillessen，《四面體通訊》，30，1927(1989)和L.A.Carpino，《美國化學學會會志》115，4397(1993)。
本發(fā)明的化合物可以是游離堿的形式，也可以是由反應混合物中分離出的藥學可接受鹽的形式。通過用有機或無機酸處理式I的游離堿也可以制得藥學可接受鹽，有機或無機酸例如是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、馬來酸、丙二酸、甲磺酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸和抗壞血酸。
本發(fā)明的化合物具有一個或多個手性碳原子，由此可能獲得純的對映異構體，或對映異構體的混合物，或含有非對映異構體的混合物。獲得純對映異構體的方法為所屬領域所熟知，例如結晶由旋光酸和外消旋混合物獲得的鹽，或用手性柱層析。對于非對映異構體可以采用正相或反相柱。
本發(fā)明通過下列實施例舉例說明。
時間(分鐘) ％A％B％C0 20 60 2030 20 20 6032 20 0 8037 20 0 8050 20 60 20收集適當餾分后，用0.1N鹽酸將混合物脫鹽，隨后冷凍干燥，生成227mg(54％)的標題化合物，其為白色蓬松固體。ESI-MS693.6(M+H)+，637.6(M-H)-，673.4(M+Cl)-。分析HPLC(SupelcosilLC-18-DB5um，250*2.1mm)流動相A＝0.5M NaH2PO4+H3PO4pH2.1；B＝H2O；C＝CH3CN/H2O(3∶2，v/v)。梯度時間(分鐘)％A％B ％C0 20 602030 20 0 8040 0 0 10050 0 0 100保留時間39.27分鐘(純度96.0％)。
通過分光光度分析法測量在凝血酶作用下顯色底物s-2238的水解率可以評估本發(fā)明的抗凝血酶活性。這種在緩沖體系中的抗凝血酶活性實驗用來評估試驗化合物的IC50值。試驗介質氨丁三醇-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)緩沖液參比化合物12581(Kabi)載體TNP緩沖液可以用二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇促進溶解，它們在最終的反應混合物中濃度高達2.5％時也不產生不利影響。技術試劑*1.氨丁三醇-NaCl(TN)緩沖液緩沖液的組成氨丁三醇(Tris)6.057g(50mmol)NaCl 5.844g(100mol)水至 1L37℃下溶液的pH用HCl(10mmol.1-1)調至7.42.TNP緩沖液將聚乙二醇6000溶解在TN緩沖液中得到濃度3g.l-13.S-2238溶液將一瓶S-2238(25mg；Kabi Diagnositica，瑞典)溶解在20mlTN緩沖液中得到濃度1.25mg.ml-1(2mmol.l-1)4.凝血酶溶液將人凝血酶(16000nKat/瓶；Centraal Laboratorium voorBloedtransfusie，Amsterdam，The Netherlands)溶解在TNP緩沖液中得到儲備液835nKat.ml-1。
使用前即時用TNP緩沖液稀釋該溶液至濃度為3.34nKat.ml-1。
*-所用全部組分為分析級-采用超純水水溶液(Milli-Q質量)。試驗和參比化合物溶液的制備將試驗和參比化合物溶解在Milli-Q水中得到10-2mol.l-1的儲備濃度。用載體分步稀釋至各種濃度得到10-3、10-4和10-5mol.l-1。試驗使用稀釋液(包括儲備溶液)(反應混合物中的終濃度分別為3·10-3、10-3、3·10-4、10、3·10-5、10-5、3·10-6和10-6mol.l-1)方法室溫下，將0.075ml和0.025ml試驗化合物或參比化合物溶液或載體分別吸量至微量滴定平板的孔中并且分別用0.115ml和0.0165mlTNP緩沖液稀釋這些溶液。將0.030ml S-2238溶液的等份試樣加入各孔中，37℃下將平板在恒溫箱(Amersham)中預熱和預培養(yǎng)10分鐘。預培養(yǎng)后，通過向各孔加入0.030ml的凝血酶引發(fā)S-2238的水解。37℃下培養(yǎng)平板。培養(yǎng)1分鐘后，利用動力學微量滴定平板讀數器(Twinreader plus，Flow Laboratories)在405nm下每2分鐘測量各個樣本的吸光度，共持續(xù)90分鐘。
所有數據利用LOTUS-MEASURE采集在IBM個人計算機中。對于各種化合物濃度(表示為mol.l-1反應混合物)和空白對照，繪制吸光度與反應時間(分鐘)的曲線。反應的評估對于各個最終濃度，由實驗曲線計算出最大吸光度。按照Hafner等人所述方法(Arzneim，-Forsch，/藥物研究(Drug Res.)1977；27(II)1871-3)利用對數變換分析計算出IC50值(終濃度，表示為μmol.l-1，抑制50％的空白最大吸光度時)?？鼓富钚?br> 權利要求
1.具有式(I)的絲氨酸蛋白酶抑制劑， 其中J為H、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Pig或D-3-Pig的氨基酸；E是-NR2-CH2-或片段 其選擇性地被(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基或芐氧基取代；R1選自(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(2-12C)炔基、(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，這些基團可以被(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、CF3或鹵素選擇性取代；和選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基、(8-16C)芳烯基和(14-20C)(雙芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或鹵素選擇性取代；R2、R2a和R2b分別獨立地選自H、(1-8C)烷基、(3-8C)鏈烯基、(3-8C)炔基、(3-8C)環(huán)烷基和(3-6C)環(huán)烷基(1-4C)亞烷基，它們可以分別被(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；和選自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；R3如R2定義或Het-(1-6C)烷基；R4是H或(1-3C)烷基；X和Y是CH或N，條件是它們不同時為N；Het是含有一個或多個選自O、N和S的雜原子的4-、5-或6-元雜環(huán)；m是1或2；p是1、2或3；q是1、2或3；t是2、3或4；及其前藥；和它們的藥學上可接受的加成鹽和/或溶劑化物。
2.按照權利要求1的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中m為2；X是CH和Y是CH。
3.按照權利要求2的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中J為H、R1、R1-SO2-、R3OOC-(CHR2)p-、(R2a，R2b)N-CO-(CHR2)p-或Het-CO-(CHR2)p-；D是式-NH-CHR1-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)OR1]-C(O)-、-NR4-CH[(CH2)qC(O)N(R2a，R2b)]-C(O)--NR4-CH[(CH2)qC(O)Het]-C(O)-的氨基酸；E是-N(3-6)環(huán)烷基-CH2-或片段 它們被(1-6C)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代；R1選自(1-12C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，這些基團可以被(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基或氧代選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(雙芳基)烷基，其中所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、OH、CF3或鹵素選擇性取代；R2是H；R2a和R2b分別獨立地選自H、(1-8C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基和(3-6C)環(huán)烷基(1-4C)亞烷基，它們可以分別被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基和(7-15C)芳烷基，其中的芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代；或R3選自H、(1-8C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基和(3-6C)環(huán)烷基(1-4C)亞烷基，它們分別可以被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代，和選自Het-(1-6C)烷基；p是1；q是2；t是3或4。
4.按照權利要求3的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中D是式-NH-CHR1-C(O)-的氨基酸或谷氨酰基[或它們的(1-6C)烷基酯]；R1選自(3-12C)環(huán)烷基和(3-12C)環(huán)烷基(1-6C)亞烷基，它們可以被(3-12C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(14-20C)(雙芳基)烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-12C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基或鹵素選擇性取代；R3選自(1-8C)烷基和(3-8C)環(huán)烷基，它們分別可以被(3-6C)環(huán)烷基或(1-6C)烷氧基選擇性取代，并且選自(7-15C)芳烷基，所述芳基可以被(1-6C)烷基、(3-6C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、CF3或鹵素選擇性取代，和選自Het-(1-6C)烷基。
5.按照權利要求4的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中J為-CH2COO(1-6C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基、-SO2-10-樟腦、-CH2CONH苯基或-CH2CONH(3-8C)環(huán)烷基；D為D-環(huán)己基丙氨?；?、D-苯基丙氨酰基、D-二苯基丙氨?；蚬劝滨；鵞或它們的(1-6C)烷基酯]；和E是片段 其中t是3或4。
6.一種藥物組合物，含有權利要求1-5任一項的絲氨酸蛋白酶抑制劑和適合藥用的輔料。
7.權利要求1-5任一項的絲氨酸蛋白酶抑制劑用于治療。
8.權利要求1-5任一項的絲氨酸蛋白酶在制備治療或預防凝血酶介導和凝血酶相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(I)的絲氨酸蛋白酶抑制劑,其中J為H、R
文檔編號A61P9/10GK1348444SQ99812496
公開日2002年5月8日 申請日期1999年10月19日 優(yōu)先權日1998年10月23日
發(fā)明者C·M·蒂默斯, J·B·M·里溫克爾 申請人:阿克佐諾貝爾公司