專利名稱：能快速生長并產(chǎn)生增殖抑制性物質(zhì)的受限細(xì)胞的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及限制具有快速對數(shù)期生長的細(xì)胞增殖，當(dāng)這些細(xì)胞的增殖被物理限制在一種生物相容的、半透材料中時，細(xì)胞能產(chǎn)生正常情況下不表達(dá)的因子或者正常情況下表達(dá)的因子的量增加，所述因子能抑制相同或不同類型和/或來源的其他快速增殖細(xì)胞的生長。這些受限細(xì)胞在下文中稱為增生細(xì)胞。屬于這類增生細(xì)胞的非限制性例子包括瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞和非癌性細(xì)胞包括，但不限于，胚性細(xì)胞、干細(xì)胞和處于組織損傷再生期后的細(xì)胞，包括肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。反映本發(fā)明一個特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)可以作為，或者用于產(chǎn)生諸如大約分子量一定的濃縮物等物質(zhì)，它還具有對相關(guān)于癌癥等疾病或癥狀的快速增殖細(xì)胞的抗增殖作用，或者控制細(xì)胞生長從而預(yù)防某些失控細(xì)胞生長(比如手術(shù)后疤痕的形成)可能引起的醫(yī)學(xué)問題。
背景和現(xiàn)有技術(shù)將各種生物學(xué)物質(zhì)包裹到生物相容性材料中，文獻(xiàn)已有很好的記載，這項技術(shù)已使用了一段時間，雖然成功的不多。能代表現(xiàn)有技術(shù)的包括美國專利5227298(Weber，等)；5053332(Cook，等)；4997443(Walthall，等)；4971833(Larsson，等)；4902295(Walthall，等)；4798786(Tice，等)；4673566(Goosen，等)；4647536(Mosbach，等)；4409331(Lim)；4392909(Lim)；4352883(Lim)和4663286(Tsang，等)。同樣有名的是授予Jain等的美國專利5643569，引入此處作為參考文獻(xiàn)。Jain等較詳細(xì)地討論了將胰島包裹在各種生物相容性材料中。胰島產(chǎn)生胰島素，該文中Jain等公開了利用該材料治療糖尿病。授予Jain等的美國專利5888497描述了可移植的涂敷了瓊脂糖的瓊脂糖珠，含有被限制在其中的癌細(xì)胞，所述細(xì)胞產(chǎn)生的一種能抑制非受限癌細(xì)胞生長的物質(zhì)比等同數(shù)量的相同未受限癌細(xì)胞產(chǎn)生的更多。
Jain等的專利較詳細(xì)地討論了在移植療法領(lǐng)域所采用的現(xiàn)有方法。本文也做了總結(jié)。
已知有5種主要的保護(hù)移植組織免于宿主免疫反應(yīng)攻擊的方法。這些方法均包括將移植組織與宿主免疫系統(tǒng)隔離開的企圖。目前使用的免疫隔離技術(shù)包括血管外擴(kuò)散室、血管內(nèi)擴(kuò)散室、血管內(nèi)超濾室、微膠囊化和巨膠囊化?，F(xiàn)有技術(shù)的方法存在許多問題，包括宿主對移植材料的纖維變性反應(yīng)，移植材料不穩(wěn)定性，通過半透膜的營養(yǎng)擴(kuò)散有限，促分泌素和產(chǎn)品通透性以及通過半透膜屏障的擴(kuò)散延遲。
例如，Lim在1978年建立了一種將細(xì)胞、組織和其他易發(fā)生變化的膜包裹在半透膜中微囊化方法(Lim,Damon公司的研究報告(1978))。Lim用褐藻酸鹽和聚L-賴氨酸的微囊來包裹朗格漢斯島(以下稱為胰島)。1980年，報道了首次成功地將該項新技術(shù)體內(nèi)應(yīng)用于糖尿病研究(Lim等，科學(xué)210:908(1980))。移植這些微囊化的胰島導(dǎo)致糖尿病動物維持血糖正常的狀態(tài)。但是其他研究人員，重復(fù)這些實驗時發(fā)現(xiàn)褐藻酸鹽引起組織反應(yīng)，不能再現(xiàn)Lim等的結(jié)果(Lamberti等，應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)10:101(1984)；Dupuy等，生物醫(yī)學(xué)材料與研究雜志22:1061(1988)；Weber等，移植49:396(1990)；以及Doon-shiong等，移植進(jìn)展22:754(1990))。現(xiàn)在認(rèn)為是這些聚合物的水溶性導(dǎo)致了微膠囊在體內(nèi)穩(wěn)定性和生物相容性有限(Dupuy等，同前，Weber等，同前，Doon-shiong等，同前，以及Smidsrod Faraday，化學(xué)學(xué)會研討57:263(1974))。
Iwata等(Iwata等，生物化學(xué)材料與研究雜志26:967(1992))利用瓊脂糖來使異源胰島微囊化，發(fā)現(xiàn)它可以作為制備微珠的介質(zhì)。在他們的研究中，將1500-2000個胰島單獨(dú)微囊化在5％瓊脂糖中，并移植給鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠。移植物存活了很長時間，受體(不確定)維持正常血糖。
但是他們的方法，有許多缺點(diǎn)。麻煩并且不準(zhǔn)確。例如，許多珠子保持部分被包裹，有數(shù)百個珠子是空的瓊脂糖。因此需要另外的時間來將膠囊化的胰島與空珠子分離開。此外，多數(shù)移植微珠聚集在骨盆腔中，需要大量完全包裹的單個珠子來達(dá)到正常血糖。而且，移植的珠子很難回收，易碎，輕微破壞就容易釋放出胰島。
還檢驗了一種巨膠囊化的步驟。已制備了各種不同材料(比如聚-2-羥乙基-異丁烯酸、聚氯乙烯-c-丙烯酸和醋酸纖維素)的巨膠囊用于胰島的免疫分離(參見，Altman等，糖尿病35:625(1986)；Altman等，移植美國人工體內(nèi)器官學(xué)會30:382(1984)；Ronel等，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志17:855(1983)；Klomp等，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志17:865-87l(1983))。在所有這些研究中，只達(dá)到短時間的血糖正常。
Archer等(外科研究雜志28:77(1980))利用丙烯酸共聚物中空纖維來臨時防止胰島異種移植物的排斥。他們報道了移植到糖尿病倉鼠中的中空纖維中的分散新生鼠胰島移植物能長期存活。最近，Lacy等(科學(xué)254:1782-1784(1991))證實了他們的結(jié)果，但是發(fā)現(xiàn)血糖正常的狀態(tài)限于短期。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)胰島注射到纖維中時，它們聚集在中空管中導(dǎo)致胰島實體中央部分壞死。中央壞死預(yù)防了移植體的延伸。為了解決這個問題，他們利用褐藻酸鹽將胰島分散在纖維中。但是，這個實驗沒有廣泛重復(fù)。因此，該膜作為人體的胰島移植介質(zhì)的功能還有問題。
Jain等的專利討論了以上報道，即將分泌細(xì)胞包裹在通透性親水膠物質(zhì)中得到功能性非免疫源性材料，可以移植到動物中，可以保存很長時間，并且可用于體內(nèi)治療。分泌細(xì)胞的巨膠囊化提供了一種更有效和易于操作的分泌細(xì)胞移植技術(shù)。
該專利完全沒有討論引入能快速增殖的細(xì)胞。
對細(xì)胞被囊化的文獻(xiàn)的調(diào)查顯示，被囊化之后，細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)幾乎總是比未被囊化時少。參見Lloyd-George等，生物材料人工細(xì)胞&免疫生物技術(shù)21(3):323-333(1993)；Schinstine等，細(xì)胞移植4(1):93-102(1995)；Chicheportiche等，糖尿病31:54-57(1988)；Jaeger等，腦研究進(jìn)展82:41-46(1990)；Zekom等，糖尿病29:99-106(1992)；Zhou等，美國生理學(xué)雜志274:C1356-1362(1998)；Darquy等，糖尿病28:776-780(1985)；Tse等，生物技術(shù)&生物工程51:271-280(1996)；Jaeger等，神經(jīng)學(xué)雜志21:469-480(1992)；Hortelano等，血液87(12):5095-5103(1996)；Gardiner等，移植進(jìn)展29:2019-2020(1997)。這些文獻(xiàn)都沒有涉及將能夠快速增殖的細(xì)胞整合到一種結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)能捕獲這些細(xì)胞，限制它們的生長，但不允許物質(zhì)擴(kuò)散到該結(jié)構(gòu)中或結(jié)構(gòu)外。
有一種關(guān)于癌性實體生長的理論把這類實體，例如腫瘤比作正常器官。健康器官，例如肝，生長到一定大小，然后就不再生長，但是，如果肝的一部分被去除，它會在一定程度上再生。在腫瘤中也觀察到這種現(xiàn)象。簡而言之，已經(jīng)注意到，如果部分腫瘤被去除，腫瘤剩余部分中的細(xì)胞就開始非常迅速地增殖直到最后腫瘤達(dá)到一定體積，之后增殖減慢或者停止。這表明有某種癌細(xì)胞的內(nèi)部調(diào)控。
發(fā)明概述由以下內(nèi)容可見，本發(fā)明顯示了當(dāng)能夠快速增殖的細(xì)胞被物理限制時，比如被捕獲，它們的增殖速率顯著下降，它們產(chǎn)生出乎意料高量的某種物質(zhì)，當(dāng)該物質(zhì)施加給未受限的快速增殖細(xì)胞時，能夠抑制這些未受限細(xì)胞的增殖。延遲癌細(xì)胞增殖的能力從開始就是腫瘤學(xué)的目標(biāo)。因此，本發(fā)明在治療癌癥及其他由快速細(xì)胞增殖所致疾病狀態(tài)和癥狀方面的治療用途是顯而易見的，并將在文中詳細(xì)描述。產(chǎn)生的物質(zhì)似乎并不受到快速增殖細(xì)胞的類型的限制，也不被快速增殖細(xì)胞所來源的動物種類限制。此外，所述效應(yīng)沒有呈現(xiàn)出物種特異性，因為來自第一個物種的受限細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制來自第二物種的非受限細(xì)胞的增殖。同樣，就癌癥來說，所述效應(yīng)也未表現(xiàn)為癌癥類型特異性的，因為來自第一種癌癥類型的受限細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制來自另一種癌癥類型的非受限細(xì)胞的增殖。
這種效應(yīng)似乎也不需要免疫應(yīng)答?？乖鲋承?yīng)見于未使用免疫細(xì)胞的體外系統(tǒng)。因此這種抗增殖效應(yīng)不是由于常規(guī)的免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案涉及具有生物相容性、增殖限制性、選擇性通透結(jié)構(gòu)的物質(zhì)組合物。該結(jié)構(gòu)限制快速增殖細(xì)胞，后者從而比相同數(shù)量的同樣的快速增殖細(xì)胞在沒有被限制時產(chǎn)生更多的抑制快速細(xì)胞增殖的物質(zhì)。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案涉及制備生物相容性、增殖限制性、選擇性通透結(jié)構(gòu)的方法，該方法通過使快速增殖細(xì)胞與生物相容性、增殖限制性物質(zhì)進(jìn)行接觸來制備所述結(jié)構(gòu)，并將這些結(jié)構(gòu)培養(yǎng)足夠時間以便限制快速增殖的細(xì)胞，從而使它們比相同數(shù)量的同類未受限快速增殖細(xì)胞產(chǎn)生更多的抑制快速增殖細(xì)胞增殖的物質(zhì)。
還有一個優(yōu)選實施方案涉及提高快速增殖細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞生長抑制物產(chǎn)量的方法，方法包括將快速增殖細(xì)胞限制在生物相容性、選擇性通透、增殖限制性結(jié)構(gòu)中，以及培養(yǎng)所述快速增殖細(xì)胞以便其產(chǎn)生該物質(zhì)。當(dāng)所述結(jié)構(gòu)被置于培養(yǎng)基中時，所述物質(zhì)離開該結(jié)構(gòu)并進(jìn)入培養(yǎng)基。這樣得到的培養(yǎng)基也是本發(fā)明的一個特點(diǎn)。
還發(fā)現(xiàn)將在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)得到的條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾可以取得有力的抗增殖效應(yīng)。這樣得到的濃縮物具有極強(qiáng)的抗增殖效應(yīng)。
所述物質(zhì)、條件培養(yǎng)基和/或由此得到的濃縮物還可以用于誘導(dǎo)其他非受限快速增殖細(xì)胞產(chǎn)生抗增殖物質(zhì)。
在優(yōu)選實施方案中，所述受限細(xì)胞是癌細(xì)胞，但是利用非癌性細(xì)胞來治療癌癥和其他癥狀具有另外的優(yōu)勢，是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。
從以下公開內(nèi)容可以看到本發(fā)明的這些和其他特點(diǎn)。
優(yōu)選實施方案詳述實施例1本實施例，以及下面的幾個，使用了RENCA細(xì)胞。它們是BALB/C小鼠的自發(fā)腎腺癌細(xì)胞，易于獲得，已在體外培養(yǎng)物中和體內(nèi)維持。參見Franco等，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的腫瘤免疫原性，181-193(1994)。
冷凍的RENCA細(xì)胞樣品于37融化，然后移入含有Dulbecco氏改良培養(yǎng)基(D-MEM)的組織培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充了10％小牛血清、青霉素(100u/ml)和鏈霉素(50μg/ml)從而形成以下稱為完全培養(yǎng)基的物質(zhì)。
細(xì)胞生長至鋪滿，然后胰酶消化，之后用Hank氏平衡鹽溶液洗，然后用前面提及的完全培養(yǎng)基洗。
為了確定RENCA細(xì)胞是否能有效形成腫瘤，給兩個BALB/C小鼠腹膜內(nèi)注射106這種細(xì)胞。對小鼠觀察3-4周。臨床上，前兩個周它們看上去很健康，顯示正常的活動。此后，癌癥的臨床表現(xiàn)明顯起來。一只小鼠在23天后死亡，第二只25天后死亡。死亡后，對小鼠進(jìn)行檢查，觀察到各種大小的大量腫瘤。某些腫瘤還出現(xiàn)出血。
將取自一只小鼠的腫瘤樣品固定在10％福爾馬林中用于以后的組織學(xué)檢查。
實施例2證明RENCA細(xì)胞的確能在體內(nèi)生長之后，進(jìn)行研究以便確定當(dāng)這些細(xì)胞被限制在本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)中時能否生長。
如前所述，RENCA細(xì)胞生長至鋪滿，胰酶消化，并清洗，同樣如前所述。然后制備60000到90000個細(xì)胞的樣品。然后將樣品于750RPM離心，移去液體。隨后將細(xì)胞懸浮在溶于磷酸緩沖鹽溶液(pH6.5)的1％atelocollagen溶液中。
在基本培養(yǎng)基(MEM)中制備1％低粘度瓊脂糖，維持在60℃，然后取其中100μl加入前面描述的RENCA細(xì)胞和atelocollagen的懸液中。然后立即將這些物質(zhì)以一個大液滴轉(zhuǎn)移到無菌、室溫的礦物油中?；旌衔镄纬梢粋€光滑半固體珠子。重復(fù)該步驟以便制備許多珠子。
1分鐘后，將這些珠子轉(zhuǎn)移到前面描述過的37℃完全培養(yǎng)基中。然后在前面列出的含有抗生素的基本培養(yǎng)基(MEM)中將珠子洗三次。然后將珠子于37℃在空氣和5％CO2的潮濕環(huán)境中保溫過夜。保溫后，將固態(tài)珠子轉(zhuǎn)移到含有1ml5％瓊脂糖/MEM的無菌勺子中。將珠子在溶液中滾動2-3次以便均勻地裹上瓊脂糖。然后在瓊脂糖固化前將珠子轉(zhuǎn)移到礦物油中以便形成光滑的外表面。60秒后，用完全培養(yǎng)基于37℃將珠子洗5次來除去礦物油。隨后培養(yǎng)過夜(37℃，空氣和5％CO2的潮濕環(huán)境)。
含有珠子的這些RENCA用于以下實驗。
實施例3進(jìn)行體內(nèi)觀察之前，有必要確定RENCA細(xì)胞在以如上所述方式制備的珠子中能否生長。
為此，將按照實施例2制備的珠子在實施例2描述的培養(yǎng)基中，在所述條件下培養(yǎng)3周。然后將其中的三個珠子切成小塊，培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)瓶中，以使它們與瓶子和培養(yǎng)基直接接觸。
對這些培養(yǎng)物的觀察表明細(xì)胞生長并形成常規(guī)RENCA菌落。這表明細(xì)胞在珠子中保持活性。
實施例4然后進(jìn)行體內(nèi)實驗。在這些實驗中，將珠子于37℃保溫7天。目標(biāo)小鼠接受珠子移植。為此，四只小鼠分另經(jīng)腹膜內(nèi)方式實施中線切割。移植三個各含有60000個RENCA細(xì)胞的珠子。然后將切口用可吸收的縫合線縫合(雙層縫合)。這四只小鼠(RALB/C)是正常的雄性小鼠，體重在24-26克，看上去很健康。做兩組對照。在第一組中，兩只小鼠接受三個不含RENCA細(xì)胞的珠子，第二組中，兩只小鼠不進(jìn)行任何處理。
移植三周后，所有小鼠腹膜內(nèi)注射106個RENCA細(xì)胞。8天后，一只對照小鼠死亡。這時將其余全部小鼠處死，并評價是否有腫瘤。
對照小鼠顯示有許多腫瘤，而接受了珠子包裹的細(xì)胞移植物的小鼠只在腹腔內(nèi)有分離的小結(jié)節(jié)。
這些令人振奮的結(jié)果使我們想到了以下實施例中提出的實驗設(shè)計。
實施例5在這些實驗中，通過在6只BALB/C小鼠各自的一個腎囊下注射RENCA細(xì)胞來模擬現(xiàn)有癌。15天以后，小鼠分成兩組。第一組中的三只小鼠按照前面實施例4的描述分別接受三個珠子。第二組(對照組)接受不含有RENCA細(xì)胞的珠子。
開始的4-5天，接受含有RENCA細(xì)胞的移植物的小鼠看上去昏沉沉的，它們的毛聳立。之后，它們恢復(fù)正常。對照組仍然很有活力，毛的狀態(tài)沒有變化。
但是移植后10天(注射RENCA細(xì)胞后25天)，對照小鼠變得行動遲緩，顯示出脹大的腹部。三只對照鼠中的一個在移植珠子14天后死亡。隨后將小鼠處死。
對照鼠的體腔顯示出大量出血，消化道、肝、胃和肺中到處是腫瘤。腹腔中的所有器官都由于腫瘤蔓延生長而難以辨認(rèn)。而接受了包裹著RENCA細(xì)胞的珠子的小鼠沒有出血現(xiàn)象，僅在消化道有少數(shù)結(jié)節(jié)。此外，實驗組和對照組的比較顯示，在實驗組中，結(jié)節(jié)沒有超出它們一開始在腎囊下，移植大珠子之前的生長。
實施例6在體外，自由接種的RENCA細(xì)胞當(dāng)與大珠子限制的RENCA細(xì)胞一起培養(yǎng)時，其生長被抑制。進(jìn)行進(jìn)一步的實驗以便確定在其他細(xì)胞中能觀察到這一效應(yīng)。
腺癌細(xì)胞系，即MMT(小鼠乳腺瘤)得自美國典型培養(yǎng)物收藏中心。用MMT細(xì)胞按照前面的描述制備受限MMT細(xì)胞從而產(chǎn)生每珠含有120000或240000個細(xì)胞的珠子。制備好珠子后，確定它們是否能抑制RENCA的體外增殖。具體來說，經(jīng)在每孔接種1×104個RENCA細(xì)胞/4ml培養(yǎng)基來制備兩個6孔培養(yǎng)板。在每個板中，三個孔作為對照，三個作為實驗組。每板的三個對照孔之一接受一個空珠。其他孔各接受兩或三個空珠。第二組孔做類似處理，各孔接受1、2或3個含有120000或240000個MMT細(xì)胞的珠子。將孔于37培養(yǎng)1周，之后將RENCA細(xì)胞用胰酶消化、清洗并用血球計數(shù)器計數(shù)。結(jié)果如表1所示表1
實施例7根據(jù)實施例6的結(jié)果，用1×104個MMT細(xì)胞而非RENCA細(xì)胞作為接種物(即自由細(xì)胞)進(jìn)行相同的實驗。實驗完全按照實施例6進(jìn)行。結(jié)果如下表2所示表2
這些結(jié)果激勵我們進(jìn)行了體內(nèi)實驗。這在實施例8中給出。
實施例8使用前面描述的小鼠乳腺瘤細(xì)胞系(MMT)。利用前面提出的方案，制備每珠含有120000個細(xì)胞和每珠含有240000個細(xì)胞的移植物。
使用的實驗?zāi)Ｐ褪乔懊娴男∈竽Ｐ汀?2只小鼠分為4只(對照)、9只和9只的三組。第一組，即對照組進(jìn)一步分為三組兩只接受一個空珠子的移植物，一只接受兩個空珠子，一只接受三個空珠子。
在實驗組A(9只動物)中，珠子含有120000個細(xì)胞，而實驗組B中，珠子含有240000個細(xì)胞。在A和B組中，各有三個小組，每個含有三只小鼠。小組接受1、2或3個含有MMT細(xì)胞的珠子。
開始的幾天內(nèi)，A和B組中的小鼠昏睡，毛聳立。這一現(xiàn)象持續(xù)了約5天，之后觀察到正常的行為。移植21天后，所有的動物接受注射40000個RENCA細(xì)胞。
再過20天后，對照小鼠顯示出膨脹的腹部，以及直立的毛發(fā)。一只對照小鼠在注射后25天死亡，而其余對照小鼠接近死亡。將全部小鼠處死，觀察腫瘤發(fā)展情況。這些觀察結(jié)果記錄在表3中表3
這些結(jié)果表明，18只處理小鼠中，13只未顯示疾病。在A組小鼠中，一只小鼠有少數(shù)小結(jié)節(jié)(+)，另一只小鼠顯示出少數(shù)腫瘤(++)。
在B組中，接受一個珠子的一只小鼠和接受兩個珠子的一只小鼠有少量腫瘤，腸紊亂。接受三個珠子的小鼠之一發(fā)展出大的實體瘤，并且明顯病得很嚴(yán)重(+++)。所有的對照小鼠都有大量腫瘤(++++)。這些結(jié)果表明受限小鼠乳腺瘤細(xì)胞能抑制腫瘤形成。
實施例9正如前面提示的，實施本發(fā)明導(dǎo)致產(chǎn)生能抑制和/或預(yù)防腫瘤細(xì)胞增殖的物質(zhì)。這在下面的實驗中作了進(jìn)一步探討。
按照實施例2中的描述再制備珠子，只是不包含atelocollagen。因此，這些珠子是瓊脂糖/瓊脂糖珠子。將前面描述過的RENCA細(xì)胞如前所述引入這些珠子中。
然后以兩組各三個6孔板作為對照和實驗組。在對照組中，孔中注入4ml RPMI完全培養(yǎng)基(10％胎牛血清和11ml/l青霉素)。然后在每個對照組孔中接種10000個RENCA細(xì)胞。
在實驗組中，通過加入受保護(hù)的物質(zhì)(其通過在含有50ml RPMI完全培養(yǎng)基的35×100mm培養(yǎng)皿中溫育10個含有RENCA的珠子(每珠120000個細(xì)胞)而受保護(hù))來調(diào)整RPMI完全培養(yǎng)基。溫育5天后，從這些培養(yǎng)皿中收集培養(yǎng)基，其中的4ml移入各個實驗孔。然后將這些孔每孔接種10000個RENCA細(xì)胞。
將全部培養(yǎng)皿(對照和實驗組)于37培養(yǎng)5天。培養(yǎng)期之后，將細(xì)胞胰酶消化、清洗、匯集并用血球計數(shù)器計數(shù)。結(jié)果如表4所示。
表4
這些結(jié)果顯示當(dāng)細(xì)胞被局限在實施例所述的珠子中時，產(chǎn)生某些導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖被抑制的物質(zhì)。
實施例10前面給出的實驗顯示條件培養(yǎng)基中RENCA細(xì)胞的生長約是對照培養(yǎng)基中細(xì)胞生長的一半。此處給出的實驗檢驗了條件培養(yǎng)基被冷凍后，是否仍保持對增殖的抑制。
通過將10個含有RENCA的珠子培養(yǎng)5天來制備RENCA條件培養(yǎng)基。培養(yǎng)在35×100mm petri培養(yǎng)皿，以50ml RPMI完全培養(yǎng)基于37℃進(jìn)行。培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)基并保存于-20℃。通過培養(yǎng)含有MMT(小鼠乳腺瘤)細(xì)胞的珠子來制備條件培養(yǎng)基。這些珠子每個含有240000個細(xì)胞；其他所有條件相同。
用30kd和50kd濾膜來制備條件培養(yǎng)基的濃縮物，所述培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)含有活性物質(zhì)，并且應(yīng)除去可能成為實驗的失敗因素的毒性代謝物和/或廢物。這些眾所周知的污染物因太小而不能截留在30kd濾膜上。也要檢測濾過液，但是對這類物質(zhì)的結(jié)果進(jìn)行解釋由于存在細(xì)胞廢產(chǎn)物而復(fù)雜化。在某些實驗中還使用了無血清培養(yǎng)基(AIMV)以便確保血清本身的效應(yīng)受到控制。
基本來說，向條件培養(yǎng)基加入大珠子3到5天后，或者給未受限細(xì)胞加入新培養(yǎng)基24小時后收集條件培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基移入一個帶有合適的濾膜(30kd或50kd濾膜)的試管中，離心90分鐘。存留在濾膜上的物質(zhì)作為“濃縮物”，而通過濾膜，收集到試管底部的是濾過液。
結(jié)果總結(jié)于以下表6、7和8中，它們顯示當(dāng)使用由局限于大珠子中的RENCA細(xì)胞得到的條件培養(yǎng)基時，在兩個獨(dú)立實驗中這使RENCA細(xì)胞的增殖抑制了約52％。50kd濃縮物在兩種情況下均使增殖抑制了約99％，而30kd濃縮物抑制了約97％。

該實驗的要點(diǎn)是MMT細(xì)胞和RENCA細(xì)胞，在被捕獲和限制在大珠子中時都能抑制RENCA細(xì)胞增殖，這表明增殖限制效應(yīng)不是腫瘤類型特異性的。這些實驗證實了實施例8的內(nèi)容，在所述實施例中含有MMT的大珠子抑制了RENCA細(xì)胞的體內(nèi)增殖。此外，它們擴(kuò)展了我們的發(fā)現(xiàn)，表明從大珠子釋放到培養(yǎng)基中的物質(zhì)含有一些分子，它們的分子量至少30kd，是增殖限制效應(yīng)的原因之一。最后，這些實驗證明大珠子限制的RENCA和MMT細(xì)胞產(chǎn)生的增殖抑制物質(zhì)比在單層培養(yǎng)物中生長至鋪滿的相同細(xì)胞多得多。
實施例12以上給出的實驗證明MMT和RENCA大珠子條件培養(yǎng)基均含有從大珠子中的增殖限制細(xì)胞釋放出來的物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制RENCA細(xì)胞的體內(nèi)和體外增殖。重要的是，這些實驗證明該增殖抑制效應(yīng)不是某種腫瘤類型特異性的。此處給出的實驗用于檢驗該效應(yīng)是否也與腫瘤原始發(fā)生的物種無關(guān)。在這里，檢驗了來源于人乳腺癌的細(xì)胞系在體外對RENCA細(xì)胞(利用大珠子和大珠子條件培養(yǎng)基)和MMT細(xì)胞(只利用大珠子條件培養(yǎng)基)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)。
用于這些體外研究的方法與以上實施例中描述過的類似。將100000個MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)包裹在大珠子中，形成的MCF-7大珠子與RENCA細(xì)胞(每孔10000個)一起培養(yǎng)5天以便評價大珠子的增殖抑制效應(yīng)。另外，在5天培養(yǎng)期內(nèi)制備MCF-7大珠子條件培養(yǎng)基，在RENCA和MMT細(xì)胞上進(jìn)行驗證。測量5天內(nèi)的細(xì)胞增殖。
結(jié)果如下表9MCF-7大珠子對PENCA靶細(xì)胞的結(jié)果
表10MCF-7條件培養(yǎng)基對RENCA靶細(xì)胞的結(jié)果
表11MCF-7條件培養(yǎng)基對MMT靶細(xì)胞的結(jié)果
結(jié)果顯示MCF-7，這種人乳腺腺癌細(xì)胞系的增殖被限制在大珠子中時，產(chǎn)生一種顯著抑制(30％-70％)小鼠腎腺癌細(xì)胞和小鼠乳腺癌腫瘤細(xì)胞之增殖的物質(zhì)，如大珠子本身和其制備的條件培養(yǎng)基所證實。這表明生長受限的癌細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)與腫瘤類型和腫瘤來源的物種，即小鼠和人均無關(guān)。
實施例13以上給出的實驗證實人源乳腺腺癌細(xì)胞系(MCF-7)在大珠子中生長受限時，對小鼠腎和小鼠乳腺腺癌細(xì)胞體外增殖的抑制。此處給出的實驗檢驗含有MCF-7的大珠子對體內(nèi)RENCA細(xì)胞的腫瘤生長是否存在平行效應(yīng)。
給18只Balb/c小鼠腹膜內(nèi)注射20000個RENCA細(xì)胞。三天后將小鼠分成兩組。第1組有6只小鼠，第2組包括剩下的12只小鼠。第1組的對照小鼠各移植三個空的大珠子。第2組的小鼠各接受3個含有MCF-7的大珠子(每珠100000個細(xì)胞)。25天后，將第1組的兩只小鼠和第2組的三只小鼠處死。第26天處死相同數(shù)量的小鼠，其余的小鼠在第27天處死。
尸檢時，觀察到對照小鼠的腹腔內(nèi)完全被腫瘤充滿，正常器官難以辨認(rèn)。我們把這種情況分類為+++++(100％)腫瘤強(qiáng)度。在處理小鼠中，腫瘤強(qiáng)度評定為+(10-20％)。
這些結(jié)果顯示含有人乳腺腺癌細(xì)胞的大珠予能抑制腎細(xì)胞腺癌在小鼠中的腫瘤生長，再次證實了所述癌細(xì)胞增殖/腫瘤生長抑制效應(yīng)不是類型特異性的，也不是物種特異性的。
實施例14以上給出的實驗證實大珠子生長受限腫瘤的細(xì)胞增殖/腫瘤生長移植效應(yīng)不是腫瘤類型或物種特異性的。此處給出的實驗檢驗增殖受限的小鼠乳腺腺癌細(xì)胞(大珠子)是否能抑制自發(fā)乳腺腫瘤和注射MMT細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤的生長。
C3H小鼠在其生命過程中乳腺腫瘤發(fā)生率很高。七只易發(fā)展這類腫瘤的小鼠在16月齡時顯示出腫瘤。這時，給這七只小鼠中的五只移植4個各含有100000個MMT細(xì)胞的大珠子。其余兩只對照小鼠各接受4個空的大珠子。兩只對照小鼠發(fā)展出大的腫瘤，在移植珠子后的三個月內(nèi)死亡。移植MMT大珠子11個月后處死處理小鼠。對取出的大珠子、器官和腫瘤進(jìn)行粗檢和組織學(xué)檢驗。對MMT大珠子作蘇木精-伊紅(Hemotoxylin&Eosin)染色顯示出活性細(xì)胞。已有腫瘤的體積沒有增加，并且沒有跡象表明發(fā)生新的腫瘤。
還進(jìn)行了在胸部皮下注射MMT腫瘤細(xì)胞的實驗。14只C3H小鼠分成兩組。五只對照組小鼠各移植3個空的大珠子。九只處理小鼠各接受3個含有MMT的大珠子(240000個細(xì)胞)。移植三周后，全部14只小鼠在乳腺區(qū)域皮下分另注射20000個MMT細(xì)胞。
在25到30天內(nèi)，五只對照組小鼠發(fā)病，有明顯的腫瘤形成，注射后35天全部死亡。九只處理小鼠，每周觀察，一直沒有腫瘤形成或患病的跡象。腫瘤注射10到12個月后，九只處理小鼠中的四只發(fā)生腫塊，并成片地脫毛。其余五只小鼠在初次腫瘤注射后13個月再移植3個MMT大珠子。手術(shù)后3天有一只小鼠死亡，但尸檢時完全沒有腫瘤?；钕聛淼乃闹恍∈笤诘诙未笾樽右浦埠?個月處死。尸檢顯示很少或者沒有腫瘤增殖。
觀察這些實驗的另一結(jié)果是，從第一次移植收回的珠子含有活性腫瘤細(xì)胞，根據(jù)是組織學(xué)檢查以及把它們從珠子中取出后能在組織培養(yǎng)基中恢復(fù)侵襲性腫瘤生長模式。
這些實驗的結(jié)果證明，被限制在大珠子中的癌細(xì)胞(本例中小鼠乳腺腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞增殖/腫瘤生長抑制效應(yīng)能影響自發(fā)腫瘤和通過向乳腺區(qū)域注射腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的實驗誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展和生長。
實施例15上面給出的實驗證實了增殖被大珠子限制的癌細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞增殖/腫瘤生長抑制效應(yīng)，其特征在于它的效應(yīng)在自發(fā)和人工誘導(dǎo)腫瘤中均是超越腫瘤類型和物種的。此處描述的實驗將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到檢驗被大珠子捕獲、增殖受到限制的人前列腺腺癌衍生細(xì)胞(ARCaP10)、小鼠(Balb/c)腎腺癌細(xì)胞(RENCA細(xì)胞)和小鼠(C3H)乳腺腺癌細(xì)胞(MMT)對ARCaP10腫瘤細(xì)胞的增殖和ARCaP10腫瘤在裸鼠(Nu/Nu)中生長的影響。
在第一組實驗中，給15只裸鼠(Nu/Nu)在側(cè)腹經(jīng)皮下注射2.5×106個ARCaP10細(xì)胞。在注射后第12天，此時平均最大腫瘤直徑是0.5cm，將小鼠分成兩組。其中九只各移植4個ARCaP10大珠子(每珠1.0×105個細(xì)胞)，六只對照小鼠各接受4個空的大珠子。
移植后10周，對照小鼠有五只已有非常大的血管瘤(直徑平均2.5cm)，一只顯示略小的腫瘤(小于0.5cm)。在處理組中，五只小鼠顯示原來的腫瘤完全退化，其余的直至第8個月處死時都沒有腫瘤。兩只小鼠未顯示腫瘤生長，即它們的腫瘤的最大直徑與移植大珠子時的相同，兩只小鼠顯示從移植大珠子后腫瘤變大。
在一個實驗中4只Nu/Nu小鼠分別于側(cè)腹皮下注射3.0×106個ARCaP10腫瘤細(xì)胞，18天后，移植含有RENCA(1.2×105)的大珠子，該實驗結(jié)果(腫瘤體積和大小(1×w×h))如下表12在處理小鼠中觀察到的腫瘤大小(mm)
表13在處理小鼠中觀察到的腫瘤體積
在另一個實驗中，給10只Nu/Nu小鼠注射2.5×106個ARCaP10細(xì)胞，其中六只在注射后64天顯示腫瘤發(fā)生。其中三只小鼠分別給予4個MMT大珠子(2.4×105個細(xì)胞)，三只接受空的大珠子。結(jié)果如下表14在處理小鼠中觀察到腫瘤大小(mm)
表15在對照小鼠中觀察到的腫瘤大小(mm)
這些實驗的結(jié)果進(jìn)一步證實了各種類型腫瘤的增殖被限制時具有的腫瘤生長抑制效應(yīng)有超越物種和腫瘤的特點(diǎn)。此外，這些實驗還證實增殖被限制的癌細(xì)胞不僅能抑制腫瘤生長，預(yù)防腫瘤形成，還能導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤的實際退化。
實施例16以上給出的實驗顯示多種腫瘤和物種的增殖受限型癌細(xì)胞能抑制相同和不同類型癌細(xì)胞的體外增殖并防止自發(fā)型和誘導(dǎo)型腫瘤的形成，阻止腫瘤的生長，導(dǎo)致腫瘤在體內(nèi)退化，該效應(yīng)與物種和癌癥類型無關(guān)。此處給出的實驗描述了將這些發(fā)現(xiàn)推廣到另一個物種(兔子)和一種已知由病毒誘發(fā)的兔子腫瘤(VX2)。
在本實驗中，給一只新西蘭白兔(2.51bs)在一條大腿上(兩個位點(diǎn))每個位點(diǎn)肌內(nèi)注射0.5ml VX2腫瘤漿(特點(diǎn)是能通過26號注射針)。3.5周時，在大腿背側(cè)出現(xiàn)一個5cm×2.5cm(1×w)的腫瘤，大腿腹側(cè)有兩個直徑3cm的腫瘤。這時，腹膜內(nèi)移植211個大珠子(108個RENCA細(xì)胞珠子，63個MMT細(xì)胞珠子，40個含有MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的珠子)。兩天內(nèi)，大腿背側(cè)的腫瘤收縮了接近50％；但是兩個腹側(cè)腫瘤沒有變化。移植大珠子10天后將動物處死。尸檢時，背側(cè)和腹側(cè)腫瘤有明顯的差異，表現(xiàn)在前者比它在移植大珠子時小得多；而兩個腹側(cè)腫瘤均有出血和壞死。
這個實驗將有效抑制各類癌細(xì)胞增殖(涉及到腫瘤生長的預(yù)防、限制甚至衰退)的發(fā)現(xiàn)推廣到另一個物種，兔子，使癌癥類型的名單增加了一種病毒來源的已知腫瘤，并且由于使用了含有小鼠腎、小鼠乳腺和人乳腺癌細(xì)胞的大珠子，因而進(jìn)一步支持了所述生長抑制效應(yīng)跨腫瘤和物種的特點(diǎn)。此外，該實驗給體內(nèi)檢驗癌細(xì)胞在治療癌癥中的增殖限制效應(yīng)增加了一種更大的動物模型。
實施例17以上給出的實驗顯示多類腫瘤細(xì)胞增殖受限導(dǎo)致它們具有抑制同類或不同類細(xì)胞體內(nèi)生長的能力，和防止各類腫瘤在體內(nèi)的形成、抑制其生長或者導(dǎo)致其退化的能力，并且所見效應(yīng)是不依賴于腫瘤類型和物種的。此處給出的實驗利用組織學(xué)、培養(yǎng)和體內(nèi)技術(shù)來評價瓊脂糖-瓊脂糖大珠子在培養(yǎng)基中保持1個月、六個月、兩年和三年時，其中的增殖受限RENCA癌細(xì)胞的長期生存能力。含有MMT的大珠子在培養(yǎng)基中保持最多6個月。此外，還通過組織學(xué)和培養(yǎng)技術(shù)檢測了含有分別來源于Balb/c和C3H小鼠的RENCA和MMT的大珠子在移植2到8個月后，其中的活性癌細(xì)胞。
為了進(jìn)行這些實驗，用1.2×10 5 個RENCA細(xì)胞或2.4×10 5 個MMT細(xì)胞制備了瓊脂糖-瓊脂糖大珠子。通過組織學(xué)(蘇木精-伊紅染色)和培養(yǎng)技術(shù)按前面描述的間隔時間來檢驗它們的細(xì)胞活性和腫瘤特點(diǎn)。對于RENCA大珠子，在第一個月內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增加了將近3-5倍，然后在六個月內(nèi)又增倍。一年后，細(xì)胞質(zhì)量繼續(xù)增加，但細(xì)胞增殖的速率下降。兩年后，珠子中央開始出現(xiàn)無定形物質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)量/數(shù)量似乎不增加，雖然有絲分裂情況還很明顯。三年后，珠子中央有更多的無定形物質(zhì)，但細(xì)胞質(zhì)量/數(shù)目穩(wěn)定。對MMT大珠子只跟蹤了六個月，但細(xì)胞增殖的早期模式和珠子外觀與RENCA的類似。
為了在前面描述的間隔期評價RENCA和MMT細(xì)胞的活性和生物行為，將10個珠子碾碎，鋪在兩個或多個25cm2的組織培養(yǎng)瓶中的完全RPMI培養(yǎng)基上。然后觀察瓶中的細(xì)胞生長。在一個月和六個月的間隔期，從珠子中收回的活細(xì)胞的數(shù)量增加。一年時，從碾碎的珠子生長出來的RENCA細(xì)胞的數(shù)量與第六個月時類似。在第二和第三年，活細(xì)胞的比例似乎少了，培養(yǎng)三年后降到它們在珠子中達(dá)到過的最大數(shù)目的將近20％(即在它們的受限狀態(tài))。
為了評價體內(nèi)移植后(對于RENCA大珠子是1-4年，對MMT大珠子是8個月)收回的RENCA和MMT大珠子，一直使用組織學(xué)技術(shù)。細(xì)胞增殖的模式和細(xì)胞質(zhì)量與持續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間的珠子的類似，即對RENCA來說，細(xì)胞數(shù)目至少增加4個月，MMT細(xì)胞數(shù)目增加8個月。
對于使用的其他癌細(xì)胞系，比如MCF-7和ARCaP10，大珠子中的存活模式與在RENCA和MMT中觀察到的類似。
這些實驗顯示，在增殖被限制的環(huán)境中，癌細(xì)胞可以在體外保持最多3年和體內(nèi)保持至少8個月，此間還維持其活性，細(xì)胞數(shù)量在至少一年內(nèi)都增加可以清楚地說明這一點(diǎn)。這不僅對制備和保存癌癥治療材料的能力很重要，對增殖受限的細(xì)胞在溫血動物體內(nèi)，在成功治療實驗型或天然型癌癥所需要連續(xù)時間段內(nèi)產(chǎn)生腫瘤生長抑制物質(zhì)的能力也很重要。
實施例18以上給出的實驗顯示多類癌細(xì)胞能在增殖受限的條件下維持很長一段時間(最多3年)，仍保持其增殖能力、腫瘤形成能力和釋放具有細(xì)胞增殖抑制性并使腫瘤生長被阻止、抑制甚至是萎縮的物質(zhì)的能力。此處給出的實驗評價含有癌細(xì)胞的瓊脂糖-瓊脂糖大珠子長期(1年)移植物在Balb/c小鼠中的可能毒性。
給七只Balb/c小鼠各移植3個RENCA大珠子(每珠1.2×105個細(xì)胞)。術(shù)后小鼠很快在幾天內(nèi)呈現(xiàn)病態(tài)(毛聳立和昏睡)，但之后恢復(fù)健康。所有的小鼠至少一年內(nèi)健康存活，一只鼠死于年邁，另一只死于無關(guān)因素。將所有小鼠處死。尸檢時，沒有觀察到異常，比如纖維化、腹膜炎或者腫瘤生長。觀察的所有器官表現(xiàn)正常，雖然看到珠子和腸漿膜表面有一些粘結(jié)，特別是腸襻的位置。沒有觀察到對正常的腸功能或結(jié)構(gòu)的影響。
這些結(jié)果證明含有癌細(xì)胞的瓊脂糖-瓊脂糖大珠子在實驗動物中在1年內(nèi)耐受很好。這些發(fā)現(xiàn)證明增殖限制性癌細(xì)胞珠子可以用于體內(nèi)使細(xì)胞增殖(包括多種類型的體內(nèi)腫瘤)被防止、抑制和退化。
下面的實施例描述了本發(fā)明，其包括(除了其他方面)用于產(chǎn)生能抑制或控制快速增殖細(xì)胞之增殖，特另是抑制癌細(xì)胞的物質(zhì)的組合物。這些組合物包含被捕獲在選擇性通透材料中的對數(shù)生長期(快速增殖期)細(xì)胞，從而形成能抑制被捕獲細(xì)胞的增殖的一種結(jié)構(gòu)。所述細(xì)胞被限制的結(jié)果是它們產(chǎn)生出乎意料高量的能抑制快速增殖細(xì)胞(比如癌細(xì)胞)之增殖的物質(zhì)。受限細(xì)胞產(chǎn)生的這類物質(zhì)比相當(dāng)量的未受限細(xì)胞產(chǎn)生的多。
用于制備本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)的物質(zhì)包括任何生物相容性物質(zhì)，它們能限制快速增殖細(xì)胞的生長，從而誘導(dǎo)它們產(chǎn)生更多細(xì)胞增殖/生長抑制性物質(zhì)。該結(jié)構(gòu)有合適的孔眼大小，從而上述抑制性物質(zhì)能擴(kuò)散到外部環(huán)境，并防止宿主免疫系統(tǒng)的產(chǎn)物或細(xì)胞進(jìn)入該結(jié)構(gòu)和引起對癌細(xì)胞的排斥或者損害它們生存和繼續(xù)產(chǎn)生所需物質(zhì)的能力。用于形成所述結(jié)構(gòu)的物質(zhì)還能通過保證合適營養(yǎng)物的進(jìn)入，消除細(xì)胞廢物和相容性結(jié)構(gòu)內(nèi)物化環(huán)境而在體外和體內(nèi)將活細(xì)胞(增殖受限，但存活)保持一段時間(優(yōu)選最多數(shù)年)。用于制備所述結(jié)構(gòu)的物質(zhì)優(yōu)選當(dāng)移植到體內(nèi)時耐受良好，最優(yōu)選在宿主內(nèi)的整個移植期耐受良好。
可以利用的物質(zhì)和物質(zhì)組合的非限制性列表包括藻酸鹽-聚-(L-賴氨酸)；藻酸鹽-聚-(L-賴氨酸)-藻酸鹽；藻酸鹽-聚-(L-賴氨酸)-聚乙烯亞胺；殼聚糖-藻酸鹽；聚羥基乙基-甲基丙烯酸鹽-甲基甲基丙烯酸鹽；羰甲基纖維素；K-角叉膠；殼聚糖；瓊脂糖-多醚砜-六-methirine-澳化物(Polybrene)；乙基-纖維素；硅膠及其組合。
包含所述物質(zhì)組合物的結(jié)構(gòu)可以采取許多形狀，比如珠子、球形、柱形、膠囊、薄片或其他適用于移植到對象內(nèi)，和/或培養(yǎng)在體外環(huán)境的形狀。該結(jié)構(gòu)的大小可以根據(jù)其最終用途變化，對技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)是選擇性通透的，使?fàn)I養(yǎng)物可以進(jìn)入該結(jié)構(gòu)，而增殖抑制物質(zhì)以及細(xì)胞廢物可以離開該結(jié)構(gòu)。對于體內(nèi)應(yīng)用，優(yōu)選該結(jié)構(gòu)能防止宿主免疫系統(tǒng)的產(chǎn)物或細(xì)胞進(jìn)入，它們可能導(dǎo)致對受限細(xì)胞的排斥或者損害細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制性物質(zhì)的能力。
本發(fā)明的另一個方面包括用于抑制癌細(xì)胞增殖的組合物。這些組合物的制備方法是將前述受限細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，然后回收得到的條件培養(yǎng)基。再從條件培養(yǎng)基中形成濃縮物，如分離分子量大于30kd或50kd的組分，它們對癌細(xì)胞有很高的抗增殖效應(yīng)。
本發(fā)明不限于任何特定類型的增殖細(xì)胞。前面界定過的任何快速增殖細(xì)胞都可以根據(jù)本發(fā)明使用，這些細(xì)胞包括，但不限于瘤細(xì)胞、胚性細(xì)胞、干細(xì)胞，處于比如損傷或外傷后的再生階段的細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。癌細(xì)胞是一類優(yōu)選的細(xì)胞，可以使用的癌細(xì)胞的例子包括腎癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、絨膜癌細(xì)胞等。所述癌細(xì)胞可以是上皮、間皮、內(nèi)皮或生殖(germ)細(xì)胞來源的，包括通常不形成實體瘤的癌細(xì)胞，比如血癌細(xì)胞。
由本說明書很顯然，發(fā)明的另一個方面是治療罹患過度增生性疾病(比如癌癥、炎癥、纖維變性和滋養(yǎng)層炎癥(trophoblastosis))的個體的治療方法?？刂萍?xì)胞在增殖期的生長以便它們以受控方式繁殖也是本發(fā)明的一個方面。這在，例如控制瘢疤瘤和疤痕組織的產(chǎn)生、防止腹部手術(shù)后粘連方面尤其有用，還可能用于過度增生性皮膚病，比如牛皮癬。用于醫(yī)療用途時，正如下文將要詳細(xì)描述的，局限在所述結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞的類型不必與引起患者疾病的細(xì)胞類型相同，雖然可以相同。一個這樣的方法包括將至少一個發(fā)明所述結(jié)構(gòu)插入對象體內(nèi)，用量足夠?qū)е聦ο篌w內(nèi)細(xì)胞增殖被抑制。優(yōu)選該方法用于治療癌癥，所述對象是人，但其他動物，比如家畜、牧業(yè)動物，或者任何患有癌癥的動物也是可行的。
本發(fā)明的組合物可以作為治療過度增生的疾病的主要療法，并且可以輔佐其他療法。例如，可以用文中描述的組合物和方法，結(jié)合已知療法比如放射療法、化療，使用其他生物活性物質(zhì)比如細(xì)胞因子、反義分子、類固醇激素的治療、基因療法等來治療患者。發(fā)明所述組合物和方法也可以與手術(shù)結(jié)合來治療癌癥，例如在切除腫瘤后植入大珠子來防止再生和轉(zhuǎn)移。處于不適合手術(shù)的狀態(tài)的癌癥可以通過用發(fā)明所述抗增殖組合物處理來使它可以接受手術(shù)。
發(fā)明所述組合物還可以給那些容易發(fā)生癌癥的個體，例如存在個體風(fēng)險因素、廣泛癌癥的家族史、特定類型癌癥(例如乳腺癌)的家族史，以及接觸職業(yè)性或其他的致癌物質(zhì)或癌癥誘發(fā)劑的個體起預(yù)防作用。為了預(yù)防癌癥，在鑒定到1或多個風(fēng)險因素時，將預(yù)防有效量的發(fā)明所述結(jié)構(gòu)給予該個體。
正如前面的實施例所表明的，所述抗增殖效應(yīng)不受所用增殖細(xì)胞的類型的限制，也不受增殖細(xì)胞所來源的物種的限制。因此，可以將含有例如第一類癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)給予患有第二種不同類型癌癥的對象。此外，所給予的結(jié)構(gòu)中可以使用與處理物種不同的物種的增殖細(xì)胞。例如，可以將小鼠癌細(xì)胞限制在發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)中，然后給予人。當(dāng)然，所述結(jié)構(gòu)可以含有來自與處理物種相同的物種的癌細(xì)胞。再次，所述增殖細(xì)胞可以取自處理個體，捕獲和限制后，給予同一個體。換句話說，患者自己的癌細(xì)胞可以被局限并用來抑制同樣的癌癥。
本發(fā)明再一方面是如文中所述的濃縮物作為治療劑的用途。這些濃縮物可以按照文中的描述來制備，然后給予有過度增生性疾病(比如癌癥)的對象，或者給予需要控制細(xì)胞生長速率的患者，比如術(shù)后患者傷口處有大量疤痕組織有害或者不喜歡。前面描述過的實施方案均可用來制備所述濃縮物。例如，體外培養(yǎng)含有小鼠癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)之后，制備濃縮物，然后給予人。類似地，所述結(jié)構(gòu)可以含有人細(xì)胞，甚至是來自同一個體的細(xì)胞。還有，正如前面討論過的，用來制備濃縮物的癌細(xì)胞的類型可以，但不必須，與治療對象患有的癌癥類型相同。因此，可以用小鼠乳腺癌細(xì)胞，例如制備用于治療患黑素瘤的人的濃縮物，或者將患前列腺癌的個體的部分前列腺癌細(xì)胞取出，捕獲在發(fā)明所述結(jié)構(gòu)中，培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，然后將得到的條件培養(yǎng)基過濾來產(chǎn)生濃縮物。應(yīng)當(dāng)記住，體外培養(yǎng)本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)得到的條件培養(yǎng)基也是發(fā)明的一部分。
制備發(fā)明所述結(jié)構(gòu)的方法，以及本發(fā)明的濃縮物也是發(fā)明的一部分。就濃縮物而言，人們可以簡單地將本發(fā)明所述結(jié)構(gòu)培養(yǎng)足夠時間以便產(chǎn)生足夠量的抗增殖物質(zhì)，然后從得到的條件培養(yǎng)基中，例如通過帶有適當(dāng)截留分子量(比如30kd或50kd)的濾膜過濾分離出所需的部分。
本發(fā)明的其他方面對領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員是顯而易見的，不需在此陳述。
文中采用的術(shù)語和措辭是作為描述性而非限制性語言，使用這些術(shù)語和措辭并不意味排除已經(jīng)顯示和描述的特點(diǎn)的任何等同物或其部分，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到在本發(fā)明的范圍內(nèi)可能進(jìn)行多種修飾。
權(quán)利要求
1．一種可有效抑制細(xì)胞增殖的組合物，其產(chǎn)生方法是將快速增殖細(xì)胞的樣品捕獲在生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)中，并于培養(yǎng)基中培養(yǎng)該結(jié)構(gòu)一定時間以使所述被捕獲細(xì)胞的增殖得到限制，其中所述被捕獲細(xì)胞產(chǎn)生一種能抑制細(xì)胞增殖的細(xì)胞增殖抑制物，然后培養(yǎng)基經(jīng)濾膜過濾，將分子量至少約30kd的物質(zhì)與分子量小于30kd的物質(zhì)分離，回收分子量至少約30kd的物質(zhì)。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中所述被捕獲細(xì)胞選自瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、胚性細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
3．權(quán)利要求2的組合物，其中所述被捕獲細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
4．權(quán)利要求2的組合物，其中所述被捕獲細(xì)胞是癌細(xì)胞。
5．權(quán)利要求4的組合物，其中所述被捕獲細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和絨膜癌細(xì)胞。
6．權(quán)利要求1的組合物，其中所述被捕獲細(xì)胞是人的細(xì)胞。
7．權(quán)利要求1的組合物，其中所述被捕獲細(xì)胞是小鼠的細(xì)胞。
8．權(quán)利要求1的組合物，其中所述結(jié)構(gòu)含有約10000-500000個細(xì)胞。
9．權(quán)利要求1的組合物，其中所述結(jié)構(gòu)含有約30000-250000個細(xì)胞。
10．一種刺激具有細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的物質(zhì)產(chǎn)生的方法，包括將已使快速增殖細(xì)胞被捕獲于其中的生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠的時間，以便所述細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制物，將培養(yǎng)基經(jīng)濾膜過濾，將分子量至少約30kd的物質(zhì)與分子量小于30kd的物質(zhì)分離，回收分子量至少約30kd的物質(zhì)。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞選自瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、胚性細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是癌細(xì)胞。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和絨膜癌細(xì)胞。
15．權(quán)利要求10的方法，其中所述培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基。
16．權(quán)利要求10的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是人的細(xì)胞。
17．權(quán)利要求10的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是小鼠的細(xì)胞。
18．權(quán)利要求10的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約10000-500000個細(xì)胞。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約30000-250000個細(xì)胞。
20．權(quán)利要求10的方法，其中所述結(jié)構(gòu)是一個珠子。
21．一種在有相應(yīng)需要的研究對象中抑制細(xì)胞增殖的方法，包括給予所述對象藥用有效量的生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有不同于所述對象之物種的受限制的高度增殖性細(xì)胞，其中所述受限細(xì)胞產(chǎn)生一種抑制細(xì)胞增殖的物質(zhì)，其量足以抑制該研究對象的細(xì)胞增殖。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述受限細(xì)胞的類型不同于所述研究對象所患疾病的相關(guān)細(xì)胞類型。
23．權(quán)利要求21的方法，其中所述受限細(xì)胞的類型與所述研究對象所患疾病的相關(guān)細(xì)胞類型相同。
24．權(quán)利要求21的方法，其中所述結(jié)構(gòu)是一個珠子。
25．權(quán)利要求21的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約10000-500000個細(xì)胞。
26．權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約30000-250000個細(xì)胞。
27．權(quán)利要求21的方法，其中所述受限細(xì)胞選自瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、胚性細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
28．權(quán)利要求27的方法，其中所述受限細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
29．權(quán)利要求27的方法，其中所述受限細(xì)胞是癌細(xì)胞。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述癌細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和絨膜癌細(xì)胞。
31．權(quán)利要求21的方法，其中所述研究對象是人。
32．權(quán)利要求21的方法，其中所述受限細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。
33．一種在有相應(yīng)需要的研究對象中抑制細(xì)胞增殖的方法，包括給予所述對象藥用有效量的生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有相同于所述對象之物種的受限制的高度增殖性細(xì)胞，其中所述受限細(xì)胞產(chǎn)生一種分子量至少30kd的抑制細(xì)胞增殖的物質(zhì)，其量足以抑制該研究對象的細(xì)胞增殖，其中該抑制物質(zhì)經(jīng)所述結(jié)構(gòu)擴(kuò)散。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所述受限細(xì)胞來自不同于該研究對象的另一個體。
35．權(quán)利要求33的方法，其中所述受限細(xì)胞取自被給予所述結(jié)構(gòu)的研究對象。
36．權(quán)利要求33的方法，其中所述研究對象是人。
37．權(quán)利要求33的方法，其中所述結(jié)構(gòu)是一個珠子。
38．權(quán)利要求33的方法，其中所述受限細(xì)胞選自瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、胚性細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
39．權(quán)利要求38的方法，其中所述受限細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
40．權(quán)利要求38的方法，其中所述受限細(xì)胞是癌細(xì)胞。
41．權(quán)利要求40的方法，其中所述受限細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、和前列腺癌細(xì)胞。
42．權(quán)利要求33的方法，其中所述受限細(xì)胞的類型不同于所述研究對象所患疾病的相關(guān)細(xì)胞類型。
43．權(quán)利要求33的方法，其中所述受限細(xì)胞的類型與所述研究對象所患疾病的相關(guān)細(xì)胞類型相同。
44．權(quán)利要求33的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約10000-500000個細(xì)胞。
45．權(quán)利要求44的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約30000-250000個細(xì)胞。
46．一種在有相應(yīng)需要的研究對象中抑制細(xì)胞增殖的方法，包括給予所述對象足量的權(quán)利要求1所述組合物以便抑制該對象的細(xì)胞增殖。
47．權(quán)利要求46的方法，其中所述研究對象是人。
48．權(quán)利要求46的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞選自瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、胚性細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
49．權(quán)利要求48的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
50．權(quán)利要求48的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是癌細(xì)胞。
51．權(quán)利要求50的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞選自腎癌細(xì)胞、絨膜癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞。
52．權(quán)利要求46的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞不是人的細(xì)胞。
53．權(quán)利要求46的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是小鼠的細(xì)胞。
54．權(quán)利要求46的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是人的細(xì)胞。
55．權(quán)利要求46的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞的類型與所述研究對象所患疾病的相關(guān)細(xì)胞類型相同。
56．權(quán)利要求46的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞取自被給予所述結(jié)構(gòu)的研究對象。
57．權(quán)利要求46的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約10000-500000個細(xì)胞。
58．權(quán)利要求46的方法，其中所述結(jié)構(gòu)含有約30000-250000個細(xì)胞。
59．權(quán)利要求58的方法，其中所述被捕獲細(xì)胞是人的細(xì)胞。
60．一種物質(zhì)組合物，它包含生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)限制著細(xì)胞，這些細(xì)胞被限制時比等量同種細(xì)胞不被限制時產(chǎn)生更多的分子量至少30kd的一種物質(zhì)，該物質(zhì)能抑制細(xì)胞增殖，它從所述結(jié)構(gòu)中擴(kuò)散出來。
61．一種制備生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)的方法，其步驟包括使細(xì)胞與生物相容的增殖限制性物質(zhì)接觸以形成所述結(jié)構(gòu)，將該結(jié)構(gòu)培養(yǎng)足夠時間以限制所述細(xì)胞，使這些細(xì)胞與等量同種細(xì)胞不被限制時相比產(chǎn)生更多的分子量至少30kd的一種物質(zhì)，該物質(zhì)能抑制細(xì)胞增殖，它從所述結(jié)構(gòu)中擴(kuò)散出來。
62．一種增加能抑制細(xì)胞生長并且分子量至少30kd之物質(zhì)的生產(chǎn)的方法，包括用結(jié)構(gòu)構(gòu)成材料來限制高度增殖的細(xì)胞，從而形成生物相容性、增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)內(nèi)含增殖細(xì)胞，培養(yǎng)所述細(xì)胞直至它們被限制，并且比等量非限制性細(xì)胞產(chǎn)生更多的所述至少30kd的物質(zhì)，該物質(zhì)從所述結(jié)構(gòu)中擴(kuò)散出來。
63．一種有效抑制細(xì)胞增殖的組合物，其產(chǎn)生方法是將快速增殖的非癌性細(xì)胞樣品捕獲在一個生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)中，將該結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠時間以便限制所述被捕獲的非癌性細(xì)胞的增殖，其中所述被捕獲的非癌性細(xì)胞產(chǎn)生能抑制所述細(xì)胞增殖的細(xì)胞增殖抑制物。
64．一種刺激具有細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的物質(zhì)產(chǎn)生的方法，其包括在培養(yǎng)基中將一種生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)培養(yǎng)一定時間，所述結(jié)構(gòu)中捕獲有快速增殖的非癌性細(xì)胞，所述培養(yǎng)時間足以使所述細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制物質(zhì)。
65．一種抑制有相應(yīng)需要的受試者中細(xì)胞增殖的方法，其包括給該受試者施予治療有效量的生物相容性和增殖限制性的選擇性通透結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中包含來自與該受試者同一物種的限制性高度增殖的非癌性細(xì)胞，其中所述限制性非癌性細(xì)胞產(chǎn)生一種可抑制細(xì)胞增殖的物質(zhì)，該物質(zhì)的量足以抑制該受試者的細(xì)胞增殖，其中所述抑制物質(zhì)通過所述結(jié)構(gòu)擴(kuò)散。
全文摘要
本發(fā)明描述了含有增殖受限的細(xì)胞的組合物。受到這樣限制時,細(xì)胞產(chǎn)生意外高量的抑制細(xì)胞增殖的物質(zhì)。這種現(xiàn)象超越細(xì)胞類型和種系的界限。發(fā)明還描述了制備這些組合物的方法及其用途。
文檔編號A61K45/00GK1325271SQ99813076
公開日2001年12月5日 申請日期1999年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月9日
發(fā)明者希林·阿西納, 坎蒂·杰恩, 艾伯特·L·魯賓, 巴里·史密斯, 庫爾特·斯滕澤爾 申請人:羅戈辛研究院