專利名稱：生產(chǎn)無(wú)基質(zhì)血紅蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及系統(tǒng)和方法，使用自動(dòng)血細(xì)胞分離器來(lái)制備高質(zhì)量的血紅蛋白溶液，作為制造基于血紅蛋白的治療性氧載體(“血液替代品”)的原料。
背景技術(shù)：
輸儲(chǔ)藏的人血液是醫(yī)學(xué)實(shí)踐的一種古老備用方法。然而嚴(yán)格的說(shuō)其功效從未顯示，而且該方法具有明顯缺陷。例如，甚至在最好的醫(yī)學(xué)中心內(nèi)，當(dāng)確定需要輸血時(shí)，由于需要確定病人的血型并進(jìn)行交叉配型，然后才將血液送到病人床邊或手術(shù)室或急救室，而延遲了治療。另外，一些證據(jù)提示，輸血可能是免疫抑制的，供血者自身的淋巴細(xì)胞可在受體體內(nèi)建立嵌合體。眾所周知，輸血有傳播病毒性疾病的危險(xiǎn)。
盡管有這些問(wèn)題，隨著醫(yī)學(xué)實(shí)踐變得更復(fù)雜和人口老齡化，對(duì)于輸血存在持續(xù)增長(zhǎng)的全球范圍的需要。如果將美國(guó)的輸血率擴(kuò)大到60億的世界人口，可預(yù)計(jì)總年度需求約為300百萬(wàn)單位血紅細(xì)胞。不可能嚴(yán)格估計(jì)實(shí)際輸血的單位數(shù)，但該數(shù)字可能低至90百萬(wàn)單位。假定該估計(jì)是準(zhǔn)確的，全世界范圍每年有超過(guò)200百萬(wàn)單位的潛在短缺?？磥?lái)，發(fā)展中國(guó)家不可能支持在發(fā)達(dá)世界中所適用的復(fù)雜血庫(kù)程序，而大部分發(fā)展中國(guó)家也不能生產(chǎn)足夠的供血者血液來(lái)滿足需要，因?yàn)楣残l(wèi)生狀況一般很差。
為了嘗試克服血液供給中潛在的短缺，從八十年代中期開(kāi)始，商業(yè)和高等院校的實(shí)驗(yàn)室，甚至更早，在一些研究實(shí)驗(yàn)室中已在緊張開(kāi)發(fā)治療性氧載體，即“血液替代品”。一些重要的問(wèn)題已經(jīng)解決，包括純化血紅蛋白作為原料，確定溶液特征和血紅蛋白修飾化學(xué)。
血液替代品在市場(chǎng)上是否成功基于幾個(gè)關(guān)鍵因素。第一，它必須有效。然而，尚未建立對(duì)效力的明確試驗(yàn)。一個(gè)可能的試驗(yàn)是是否該產(chǎn)品可有效降低病人和同種異體血液的接觸。第二，產(chǎn)品必須是安全的。迄今產(chǎn)生的安全焦點(diǎn)是圍繞著已知的血紅蛋白的血管收縮性能。至少該性能的一部分是一氧化氮(NO)作為血紅素配體和血紅蛋白在巰基位點(diǎn)非常強(qiáng)的結(jié)合。第三，紅細(xì)胞替代品必須成功的和血液競(jìng)爭(zhēng)臨床用途?，F(xiàn)在正在開(kāi)發(fā)的血液替代產(chǎn)物具有范圍為12-58小時(shí)(半衰期)的血漿滯留時(shí)間。因此，它們將僅用于臨時(shí)情況或在可重復(fù)施用劑量的背景下使用。
在發(fā)現(xiàn)HIV可通過(guò)輸血制品傳播后，人血在對(duì)血庫(kù)行業(yè)認(rèn)真詳細(xì)檢查后，變?yōu)闃O端安全。為了成為可用的產(chǎn)品，紅細(xì)胞替代品必須是安全而相對(duì)價(jià)廉的。僅當(dāng)在安全性、效力、使用方便性或病人可接受性上有明顯優(yōu)勢(shì)時(shí)，才會(huì)支持比血液昂貴的費(fèi)用。因此，隨著這些血液替代品臨近臨床使用，原料的來(lái)源、成分和供應(yīng)變得更加重要。對(duì)于臨床試驗(yàn)中的制品，未加工的血紅蛋白從過(guò)期的人庫(kù)存血液、?；蛑亟M(大腸桿菌)源獲得。據(jù)估計(jì)儲(chǔ)藏的血液中約有1％或以下過(guò)期，每年僅對(duì)血液替代品的制造提供約120,000單位的血液。因此，這種過(guò)期血液的競(jìng)爭(zhēng)和成本是高的。牛血的優(yōu)點(diǎn)是，它能大量獲得。然而，飼養(yǎng)用于該目的的牛要求嚴(yán)格的健康標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)動(dòng)物進(jìn)行獸醫(yī)學(xué)看護(hù)，經(jīng)常檢測(cè)和用大量的土地和食物來(lái)飼養(yǎng)它們。另外，必須用為該目的設(shè)計(jì)的特殊儀器來(lái)收集牛血。重組來(lái)源將是理想解決之道，因?yàn)榻档土吮蝗祟惒≡w污染的危險(xiǎn)。然而，重組血紅蛋白需要大規(guī)模純化，來(lái)從發(fā)酵的其它成分中分離出蛋白質(zhì)，要使用大量水，并在處理廢產(chǎn)物中面臨嚴(yán)重的問(wèn)題。這些處理要求導(dǎo)致用重組血紅蛋白制備的血液替代品產(chǎn)物比用常規(guī)庫(kù)存血液制備的成本要貴數(shù)倍。
目前從人血制備血紅蛋白溶液的過(guò)程涉及廣泛用鹽水處理洗滌備用儲(chǔ)存的紅細(xì)胞，沉淀或透析過(guò)濾，用低滲緩沖液溫和裂解，并嚴(yán)格除去紅細(xì)胞膜。這些過(guò)程需要大型無(wú)菌容器和昂貴的濾器，并需要極長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)完成。在該過(guò)程中使用的許多成分和溶液必須保存在冷藏和/或清潔室內(nèi)。有人報(bào)道，每周能生產(chǎn)5升無(wú)基質(zhì)紅血細(xì)胞溶液的試驗(yàn)性加工廠需要4個(gè)獨(dú)立分隔但相互連接的房間，占約1000平方英尺的實(shí)驗(yàn)室空間。產(chǎn)品價(jià)格大約是$1000/升。(見(jiàn)Winslow和Chapman，“血紅蛋白溶液的試驗(yàn)性批量制備”，酶學(xué)方法，2313-16，1994，公開(kāi)內(nèi)容在此引入以供參考)除了產(chǎn)品高成本的顯著缺點(diǎn)外，該試驗(yàn)性機(jī)構(gòu)的大批量和復(fù)雜性需要幾個(gè)支持性人員，并造成了許多污染機(jī)會(huì)。
為了制備大量的血液替代品，以充分克服全球血液供給中突出缺陷，必須改進(jìn)處理制備血液替代品的原料的現(xiàn)有方法。仍需要一種用于制備無(wú)基質(zhì)的血紅蛋白的方法，以使降低該產(chǎn)品的成本、復(fù)雜性和污染危險(xiǎn)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提供了一種在自容式、自動(dòng)化儀器中制備無(wú)基質(zhì)血紅蛋白的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提供了一種制備高質(zhì)量的血紅蛋白溶液，作為制造血液替代品的原料的方法，該方法使用直接來(lái)自供血者的收集點(diǎn)的血液，從而消除了血液定型和儲(chǔ)藏的需要，并減少了污染的危險(xiǎn)。
在一個(gè)示范性實(shí)施例中，本方法使用一臺(tái)可商品購(gòu)得的血細(xì)胞分離器，它包括一計(jì)算機(jī)控制的離心機(jī)，其具有一轉(zhuǎn)頭，在其中放置了含有供血者血液的血液處理袋。一旦收集了血液，處理完全在密封的離心轉(zhuǎn)頭中進(jìn)行，優(yōu)選在供血者收集點(diǎn)原地進(jìn)行。該離心機(jī)轉(zhuǎn)頭包括一個(gè)或多個(gè)處理室，來(lái)接受處理袋。在第一步中，離心血液，從細(xì)胞成分中分離血漿。用液壓力通過(guò)血處理袋中的可彎曲隔膜和螺線管控制的彈簧夾除去上清液，即淋巴細(xì)胞、血小板和血漿，剩下壓積的細(xì)胞。彈簧夾通過(guò)夾緊含有溶液的管道起作用，避免直接接觸，從而保持液體通道無(wú)菌。一旋轉(zhuǎn)密封裝置使液體在離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)能進(jìn)出血處理袋。從其它血液成分中分離出紅細(xì)胞后，用生理鹽水或其它溶液洗滌紅細(xì)胞。通過(guò)液壓力除去洗滌溶液，并通過(guò)管道轉(zhuǎn)移到上清液收集容器中。放置一臺(tái)光電傳感器，來(lái)監(jiān)測(cè)通向上清液收集容器的管道，檢測(cè)紅血細(xì)胞的存在。如果檢測(cè)到紅血細(xì)胞，由系統(tǒng)控制器引發(fā)停止和保持功能。然后用低滲休克裂解紅血細(xì)胞，使用離心力從裂解物中分離紅細(xì)胞膜(基質(zhì))，將其收集入無(wú)菌容器，僅將基質(zhì)留在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭中?？蓪⒆罱K產(chǎn)物用作任何現(xiàn)在開(kāi)發(fā)用作紅細(xì)胞替代品的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體的原料。在細(xì)胞分離器或儲(chǔ)存器的轉(zhuǎn)頭中進(jìn)行所有步驟，來(lái)維持無(wú)菌。
在供血點(diǎn)處理血液的能力提供了更快速和更低廉的紅血細(xì)胞收集，以用于制備血液替代品。特別是，該過(guò)程消除了被收集的血液?jiǎn)挝坏亩ㄐ秃蛢?chǔ)藏的需要，而且用于該用途的被收集的血單位可被合并儲(chǔ)存，以減少測(cè)試傳染性因子，如HIV或丙型肝炎病毒的費(fèi)用成本。
附圖簡(jiǎn)述考慮下文對(duì)本發(fā)明結(jié)合附圖的優(yōu)選例的詳述，將促進(jìn)對(duì)本發(fā)明的理解，其中相應(yīng)數(shù)字指相應(yīng)部件，而且其中

圖1是用于制備無(wú)基質(zhì)血紅蛋白的紅血細(xì)胞處理器的圖解視圖；圖2是從壓積的紅血細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)基質(zhì)的血紅蛋白的流程圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明的加工流程的框圖；和圖4顯示了本發(fā)明生產(chǎn)“血液替代品”的一種可能的離心法的示意圖。
發(fā)明詳述產(chǎn)生無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(“SFH”)的方法使用了一種常規(guī)商品血細(xì)胞處理儀器，它在圖1中概略說(shuō)明。用該系統(tǒng)處理將病人或供血者的全血分離為成分。收集紅血細(xì)胞，然后將剩余成分輸回供血者或丟棄。儀器含有離心機(jī)2，以容盛血袋6，多個(gè)含有處理溶液的儲(chǔ)液器8和10，一個(gè)接受上清液14的儲(chǔ)液器，多個(gè)閥門和無(wú)菌管式導(dǎo)線，將許多儲(chǔ)液器和血袋6連接，以及控制器20，控制離心機(jī)和閥門。在管式導(dǎo)線中含有一次性使用的旋轉(zhuǎn)密封裝置34，使液體在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)進(jìn)出血處理袋。密封裝置防止液體從液體通道中漏出，和空氣進(jìn)入液體。從供血者(顯示了手臂22)通過(guò)導(dǎo)管30和閥門32收集血液，直接進(jìn)入血袋6，優(yōu)選直接處理。在優(yōu)選例中，血袋6和管式導(dǎo)線是預(yù)先滅菌的一次性使用的處理裝置的一部分。閥門通過(guò)夾緊導(dǎo)管，從而不直接接觸導(dǎo)管中的液體來(lái)起作用。
啟動(dòng)離心轉(zhuǎn)頭24，從血漿中分離紅血細(xì)胞。離心力提供了將血漿擠出泵到上清液儲(chǔ)液器14(或如需要，回到病人或供血者)的抽吸作用。具體說(shuō)，在離心轉(zhuǎn)頭24中包括移位室，它包括一個(gè)液壓操作的隔膜4。系統(tǒng)控制器20通過(guò)控制離心機(jī)驅(qū)動(dòng)裝置36的轉(zhuǎn)動(dòng)和指導(dǎo)可逆液壓泵38，控制液壓液流入和流出可彎曲隔膜4下的區(qū)域?？刂破?0導(dǎo)致閥門16打開(kāi)，允許血漿通過(guò)導(dǎo)管18流出血袋，然后在血漿排出后關(guān)閉閥門16。使用光學(xué)探頭28(其檢測(cè)紅血細(xì)胞在透明導(dǎo)管中的存在)可確定血漿的完全除去。打開(kāi)閥門12，使鹽水溶液從儲(chǔ)液器8通過(guò)導(dǎo)管26釋放到血袋6中。另外，可用抗菌劑、去垢劑或其它合適的清潔溶液作為洗滌溶液，或加到鹽水溶液中，來(lái)除去任何可能存在于血液中的細(xì)菌污染。離心轉(zhuǎn)頭在相對(duì)低速轉(zhuǎn)動(dòng)，來(lái)提供攪動(dòng)，洗滌紅血細(xì)胞。洗滌后，提高轉(zhuǎn)速，控制器20打開(kāi)閥門16，使離心力和可彎曲隔膜將洗滌溶液擠到上清液儲(chǔ)液器14中。
一旦從血袋6中除去了洗滌溶液，通過(guò)引入蒸餾水來(lái)誘導(dǎo)低滲休克裂解紅血細(xì)胞，從血紅蛋白中分離基質(zhì)。打開(kāi)閥門13，通過(guò)導(dǎo)管11轉(zhuǎn)移儲(chǔ)藏在儲(chǔ)液器10中的蒸餾水。當(dāng)紅細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入與蒸餾水接觸時(shí)，它們中的一些裂解，將血紅蛋白釋放到溶液中?？稍诖藭r(shí)收集無(wú)細(xì)胞成分，并繼續(xù)灌注蒸餾水，隨著懸浮介質(zhì)的離子強(qiáng)度下降，釋放越來(lái)越多的血紅蛋白。伴隨離心轉(zhuǎn)頭低速轉(zhuǎn)動(dòng)，使對(duì)血紅蛋白的損害最小化，無(wú)基質(zhì)血紅蛋白將分布在轉(zhuǎn)頭中，而紅血細(xì)胞和膜將在轉(zhuǎn)頭外沿被壓積。由于可能需要大量蒸餾水，將需要幾次重復(fù)來(lái)釋放大部分血紅蛋白。通過(guò)血袋6中的無(wú)菌端口40，通過(guò)導(dǎo)管42進(jìn)入無(wú)菌容器44，來(lái)除去血紅蛋白。在轉(zhuǎn)移通道(導(dǎo)管)中包括一個(gè)濾器46，來(lái)除去最后痕量的膜顆粒將是理想的。如果給予足夠的水和時(shí)間，應(yīng)取出所有血紅蛋白，然而隨后可能需要濃縮血紅蛋白溶液，視它的用途而定。可通過(guò)測(cè)量血紅蛋白溶液中的離子濃度確定血紅蛋白抽提物的完全性。通過(guò)將導(dǎo)電表和系統(tǒng)控制器20連接，當(dāng)離子濃度下降到預(yù)定水平時(shí)，可終止該過(guò)程。預(yù)定水平的選擇基于時(shí)間和血紅蛋白抽提物效率的平衡，即成本-效益分析。
其它引入低滲休克來(lái)裂解紅血細(xì)胞的方法是已知的，而且可以代替或聯(lián)合蒸餾水漂洗使用。下文更詳細(xì)的描述了裂解方法。
轉(zhuǎn)移血紅蛋白溶液的無(wú)菌容器可含有預(yù)先定量的試劑，以制備血液替代品，包括例如緩沖鹽、Traut’s試劑和活化的聚乙二醇(PEG)。在專利號(hào)5,814,601和專利號(hào)5,296,465中詳述了制備血液替代品的示范性方法，其公開(kāi)內(nèi)容在此引入以供參考。
該處理方法完全在一次性使用的預(yù)滅菌的處理裝置中進(jìn)行，它優(yōu)選含有所有管線、儲(chǔ)液器、離心轉(zhuǎn)頭和管線內(nèi)的濾器。該密封系統(tǒng)排除了污染的危險(xiǎn)。
提供了下列實(shí)施例，僅供說(shuō)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1構(gòu)建了一臺(tái)從血液產(chǎn)生無(wú)基質(zhì)血紅蛋白的實(shí)驗(yàn)性儀器，它包括過(guò)期血液的排空袋集合；用于洗滌、裂解和純化的交叉過(guò)濾裝置；交聯(lián)血紅蛋白的生物反應(yīng)器；制備級(jí)的高效液相層析(HPLC)儀器；和最后將產(chǎn)品填充入無(wú)菌袋的通風(fēng)櫥。流動(dòng)回路，包括PFW分散回路是密封的。所有接頭是衛(wèi)生三鉗(通)型，在層流環(huán)境中制造。除去辦公室，完整過(guò)程需要大約1000ft2實(shí)驗(yàn)室空間。該實(shí)驗(yàn)性廠的能力是每周約5升，產(chǎn)品成本是約$1000/升。
交叉過(guò)濾系統(tǒng)由三個(gè)泵、四個(gè)罐和4個(gè)不同的濾器部件構(gòu)成。所有構(gòu)建材料用316L不銹鋼制造，用180磨光粉進(jìn)行內(nèi)部磨光。導(dǎo)管是可彎曲的，用硬化聚硅酮制造。中空的纖維濾膜柱空心纖維濾器夾是不溶血、無(wú)致熱原的聚砜膜。
在裝有護(hù)套的不銹鋼500升罐中制備后，冷凍所有溶液。用甘油套起紅細(xì)胞洗滌和裂解罐，用于溫度控制。500和10-kDa超濾回路使用雙管熱交換器。在透析過(guò)濾濃縮的血紅蛋白前，冷凍PFW。旋轉(zhuǎn)葉泵確保低剪切力狀態(tài)。在整個(gè)系統(tǒng)中監(jiān)測(cè)壓力分布，并控制在每平方英寸20磅力以下。將所有溶液的pH維持在生理學(xué)范圍內(nèi)。
在整個(gè)過(guò)程中保持無(wú)菌。將交叉過(guò)濾系統(tǒng)放置在100級(jí)環(huán)境中。用純蒸汽對(duì)所有處理罐、管道和濾器蒸汽滅菌，或用0.1N NaOH化學(xué)消毒。從系統(tǒng)中用PFW漂洗出消毒溶液。在處理前和處理中通過(guò)用鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物(LAL)試驗(yàn)采樣致熱原來(lái)檢測(cè)系統(tǒng)的無(wú)菌性。
在圖2中顯示了生產(chǎn)SFH的典型運(yùn)行的流程圖。在過(guò)期4周后使用過(guò)期的人壓積紅血細(xì)胞(PRBC’s)。所有單位對(duì)于HIV和乙型肝炎抗原測(cè)試為陰性。在一個(gè)典型的批料中，使用血收集裝置，在100升套層不銹鋼罐中用80升生理鹽水合并約20升壓積紅血細(xì)胞。用7體積的冷凍生理鹽水通過(guò)在恒定體積(80升)經(jīng)三個(gè)0.65微米中空纖維膜柱(總表面積69ft2)的透析滲濾，來(lái)洗滌紅血細(xì)胞。為了證實(shí)血漿已被除去，測(cè)試濾液的血清白蛋白，作為血漿蛋白指標(biāo)。在典型的洗滌過(guò)程中，血清白蛋白濃度從2mg/ml以上穩(wěn)定下降到不可檢測(cè)的水平(＜2微克/毫升)。緩慢裂解紅血細(xì)胞，用5體積冷凍10mM NaHPO4，pH7.6，以恒定體積(80升)通過(guò)0.1微米中空纖維膜柱，來(lái)透析過(guò)濾除去基質(zhì)。將0.1微米柱的濾液引入100升不銹鋼罐中。然后以恒定體積(80升)透析濾過(guò)500-kDa膜柱，來(lái)除去任何基質(zhì)顆粒。然后將來(lái)自500-kDa柱的濾液(SFH)通過(guò)三個(gè)10-kDa中空纖維膜柱循環(huán)濃縮到10g/dl。
用6體積Ringer’s乙酸鹽，pH7.4透析過(guò)濾得到最終的SFH溶液，然后從不銹鋼濃縮罐中通過(guò)0.2微米，10英寸濾器轉(zhuǎn)移到40升不銹鋼收集槽中。最后，將SFH產(chǎn)物在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到塑料袋內(nèi)，并冰凍在-80℃?；蛘邔FH轉(zhuǎn)移到70-升生物反應(yīng)器中交聯(lián)。
用上述儀器和程序生產(chǎn)的無(wú)基質(zhì)血紅蛋白溶液用水或磷酸緩沖液配制。高鐵血紅蛋白濃度通常小于1％，而溶液可以無(wú)限期的儲(chǔ)藏在-80℃。兔致熱原測(cè)試是陰性的，而且溶液不被細(xì)菌污染。用HPLC分析評(píng)估純度，并顯示溶液本質(zhì)上無(wú)非血紅蛋白蛋白質(zhì)。其它質(zhì)量控制試驗(yàn)包括氧結(jié)合(P50，Hill’s參數(shù)，n)，pH，內(nèi)毒素(LAL試驗(yàn))和SDS凝膠電泳。在表1中顯示了將一批代表性SFH作為產(chǎn)品在這些試驗(yàn)中的結(jié)果。
表1.SFH溶液的示范性特征
可能在生產(chǎn)無(wú)基質(zhì)血紅蛋白中，除了污染外最大的關(guān)注是嚴(yán)格除去膜磷脂成分。磷脂是在常規(guī)基礎(chǔ)上極端難測(cè)量的，因此使用了較簡(jiǎn)單的總磷酸鹽試驗(yàn)。雖然十分靈敏，它并不識(shí)別磷酸鹽的來(lái)源。胞內(nèi)酶組成了第二組紅細(xì)胞污染，而且不清楚從最終產(chǎn)物中除去所有紅細(xì)胞酶是否理想，考慮它們的抗氧化作用。
用該方法收集的SFH“單位”可無(wú)限期的冰凍儲(chǔ)藏，并運(yùn)到中央處理廠(因?yàn)樵谀承┑胤竭M(jìn)行血漿處理)或部分合并，用于質(zhì)量控制測(cè)試。該被推薦的系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它能大大降低成本?，F(xiàn)在，對(duì)所有收集的血液進(jìn)行昂貴的病毒測(cè)試，是血液收集最大的單項(xiàng)成本。使用該新系統(tǒng)，可在測(cè)試前合并所有血單位，它大大降低了全部成本。血液學(xué)家估計(jì)收集一單位血液的成本是$18，其中$15是用于病毒測(cè)試。例如，對(duì)于10單位合并物進(jìn)行的測(cè)試，該項(xiàng)成本將減少到十分之一。
用該方法收集的血液用于重新制造“血液替代品”可能是可接受的，如專利號(hào)5,814,601中公開(kāi)的。然而，它可能不符合目前美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)對(duì)供血者血液的標(biāo)準(zhǔn)。例如，現(xiàn)在FDA禁止患血色素沉著的病人捐獻(xiàn)輸血用血液。這促使這些病人尋找私人醫(yī)生來(lái)進(jìn)行靜脈放血，對(duì)病人來(lái)說(shuō)費(fèi)用可觀。鐵超負(fù)荷病協(xié)會(huì)估計(jì)僅在美國(guó)有1,500,000人患有嚴(yán)重的鐵超負(fù)荷。該協(xié)會(huì)記錄有約5,000個(gè)在規(guī)律靜脈放血程序中每年除去約6單位的病人，約30,000單位。紅細(xì)胞替代品已建立了劑量等效性，即1g/dl血漿血紅蛋白在出血模型中和7g/dl紅細(xì)胞血紅蛋白一樣有效。因此，單該群病人每年就可提供多達(dá)150,000單位人工血液的原料。
實(shí)施例2在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用了設(shè)計(jì)成在床邊收集供血者/病人血液的獨(dú)立的便攜式裝置。用于該用途的合適系統(tǒng)包括Haemonetics MCS＋8150血液收集系統(tǒng)(Haemonetics Corporation，Braintree，MA)和COBE 2991細(xì)胞處理器(COBELaboratories，Inc.，Lakewood，CO)。血液收集在CP2D/AS-3抗凝劑/添加劑系統(tǒng)，抗凝劑和抗凝血的比例是1∶16。機(jī)器配置成能從一供血者在約25分鐘內(nèi)收集一或二單位的紅血細(xì)胞。收集的每單位得到約180ml壓積的紅血細(xì)胞(“RBC”)和400ml血漿?？捎孟铝嘘P(guān)系確定分離的效率處理后RBC計(jì)數(shù)×處理后重量×100＝％RBC回收處理前RBC計(jì)數(shù)×處理前重量留在壓積紅血細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞數(shù)應(yīng)少于5×108。白血細(xì)胞(“WBC”)絕對(duì)計(jì)數(shù)是轉(zhuǎn)換成毫升數(shù)的白細(xì)胞數(shù)×產(chǎn)品的毫升數(shù)，而百分?jǐn)?shù)是處理后WBC計(jì)數(shù)×處理后重量×100＝％WBC回收處理前WBC計(jì)數(shù)×處理前重量Latham，Jr.，的專利號(hào)4,303,193和Toavs等，專利號(hào)5,921,950提供了基本的商品化血細(xì)胞處理系統(tǒng)的例子。這些專利的公開(kāi)內(nèi)容在此引入以供參考?？偟恼f(shuō)，商品化血細(xì)胞處理系統(tǒng)使用自平衡的離心機(jī)，將供血人的血液分離成兩種成分，一種富含血漿，另一種富含細(xì)胞成分。該儀器要直接在供血者/病人旁立即使用。血液流動(dòng)的通道是完整的一次性使用的處理裝置，包括一靜脈放血針和將靜脈放血針和柔韌可彎曲的血液處理袋(容積為約630ml)連接的血液相容的管式接頭。在該處理裝置中還包括管式導(dǎo)線，旋轉(zhuǎn)密封裝置和上清液收集容器。旋轉(zhuǎn)密封裝置使液體在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭正在旋轉(zhuǎn)時(shí)能流入和流出血處理袋。密封裝置防止液體從液體管道中漏出，空氣進(jìn)入液體。管式導(dǎo)線系列提供了無(wú)菌的液體通道，將洗滌溶液引到紅細(xì)胞。三個(gè)閥門控制血液或洗滌溶液流入血處理袋。每個(gè)閥門是螺線管控制的彈簧夾，在系統(tǒng)計(jì)算機(jī)的控制下，和管道中的液體不直接接觸。處理袋外沿上的無(wú)菌輸出口使處理過(guò)的細(xì)胞可直接從袋中轉(zhuǎn)移到無(wú)菌容器中。
將該血處理袋定形以被支承在離心轉(zhuǎn)頭輪廓樣的處理室內(nèi)，從而第二血液成分可沿袋內(nèi)短軸運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)分離。一具有液壓操作的隔膜的移位室也被安裝在離心轉(zhuǎn)頭的血處理室中。液壓液流入和流出柔韌可彎曲的隔膜下的區(qū)域是由離心驅(qū)動(dòng)裝置的旋轉(zhuǎn)和彈簧夾螺線管控制的。液壓系統(tǒng)包括正壓移位活塞型泵裝置，流速控制和開(kāi)關(guān)，以及管線和儲(chǔ)液器(塑料袋)的液體流動(dòng)網(wǎng)絡(luò)。泵由變速可逆馬達(dá)驅(qū)動(dòng)。泵的容量被調(diào)節(jié)成約600ml。泵馬達(dá)控制以設(shè)定的速率驅(qū)動(dòng)，在血處理袋上施加壓力，擠壓上清液，迫使上清液通過(guò)打開(kāi)的閥門之一從該袋流到上清液收集容器中。這持續(xù)至通過(guò)光電傳感器檢測(cè)出紅細(xì)胞，達(dá)到上清液輸出體積，或引發(fā)了終止或停頓功能。反向驅(qū)動(dòng)泵，從離心機(jī)液壓液室和儲(chǔ)液器中抽取液體。然后可停止離心機(jī)轉(zhuǎn)頭，使第二血液成分回輸?shù)皆摴┭?。因?yàn)樗羞@些功能是計(jì)算機(jī)控制的，操作人的干預(yù)很小，因此操作人為錯(cuò)誤的誤差機(jī)會(huì)很小。
離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的體積是大約250ml，而離心機(jī)的轉(zhuǎn)速是約4,000rpm。用無(wú)菌鹽水稀釋進(jìn)入離心場(chǎng)中的血液，連續(xù)除去非紅細(xì)胞成分和血漿濃縮紅細(xì)胞。目的是將血清白蛋白的量降到盡可能低的水平，最好變得檢測(cè)不到。非血細(xì)胞成分可丟棄或用于其它目的。
RBC洗滌步驟后血清蛋白除去的評(píng)估是用血細(xì)胞處理器制造商規(guī)定的程序進(jìn)行的。例如，在COBE2991細(xì)胞處理器中，洗滌紅血細(xì)胞后，從血袋的無(wú)菌口抽取1毫升樣品，在實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)中離心，收集上清液。可用可商品購(gòu)得的蛋白質(zhì)化學(xué)量尺濕潤(rùn)板測(cè)試上清液，其顏色的改變指示了蛋白質(zhì)水平。蛋白質(zhì)水平應(yīng)是痕量(15-30mg/dl)或更少，代表血漿減少大于或等于96％。
首次洗滌期后，用蒸餾水替換鹽水。根據(jù)圖3，可見(jiàn)當(dāng)紅細(xì)胞首次和蒸餾水接觸時(shí)，它們中的一些裂解，將血紅蛋白釋放到溶液中。下文討論了裂解的條件?？稍诖藭r(shí)收集無(wú)細(xì)胞成分，繼續(xù)灌注蒸餾水，隨著懸浮介質(zhì)的離子強(qiáng)度下降，釋放越來(lái)越多的血紅蛋白。如果給以充足的時(shí)間，可能取出所有血紅蛋白，僅在離心轉(zhuǎn)頭中留下血細(xì)胞影。
血液裂解物的體積視實(shí)現(xiàn)所要的裂解水平所需的蒸餾水量而定。然而，視它將來(lái)的用途而定，血紅蛋白溶液可能需要進(jìn)一步濃縮。因?yàn)镹aCl可能和血紅蛋白溶液共存，可能需要進(jìn)一步純化。通過(guò)電導(dǎo)率測(cè)量可獲得對(duì)最終溶液離子強(qiáng)度的迅速、靈敏的測(cè)量。
人紅血細(xì)胞裂解的條件盡管在循環(huán)紅細(xì)胞內(nèi)生存期很長(zhǎng)，血紅蛋白是一種脆弱的蛋白質(zhì)。它由4個(gè)多肽亞基，2α和2β構(gòu)成。一條α和一條β鏈緊緊連接成αβ亞基，兩個(gè)αβ亞基形成較不穩(wěn)定的四聚體，即完整成形的血紅蛋白分子。每個(gè)4亞基含有鐵-輔基，血紅素。鐵原子維持在還原的Fe++狀態(tài)，以便結(jié)合氧。該還原態(tài)是由紅血細(xì)胞內(nèi)許多酶系統(tǒng)的存在維持的。當(dāng)血紅蛋白被從該細(xì)胞釋放時(shí)，該保護(hù)不再存在，發(fā)生一系列事件，最終導(dǎo)致該分子降解。這些事件是鐵的氧化，血紅素-珠蛋白連接的松開(kāi)，血紅素的釋放，四聚體分離成二聚體，珠蛋白變性和最終沉淀。在紅細(xì)胞替代品的生產(chǎn)中，因此最重要的是非常溫和的處理蛋白，以防止一或多個(gè)這些降解步驟。不這樣做將導(dǎo)致原料損失，并形成必須濾出的沉淀。另外，即使部分變性或降解的血紅蛋白分子也不能與氧可逆結(jié)合，因此不能作為氧載體。
一般有三種方法來(lái)裂解人紅細(xì)胞。第一，可反復(fù)冷凍和融化它們。在細(xì)胞內(nèi)和周圍形成的冰破碎該膜，釋放血紅蛋白。然而，使用該方法裂解是以不完全而著稱的，而且可發(fā)生血紅蛋白變性。在第二種方法中，可用有機(jī)溶劑，如CCl4?；蚣妆揭部墒褂?。該方法更有效，然而溶劑也對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有有害作用。
第三種方法是滲透裂解，如上所述。紅細(xì)胞對(duì)滲透裂解的敏感性是眾所周知的。
估計(jì)的處理效率根據(jù)COBE 2991細(xì)胞處理器的方案，產(chǎn)率報(bào)道為平均RBC回收率是82％，除去達(dá)99％的血漿和93.4％的白血細(xì)胞。使用離心洗滌和裂解紅細(xì)胞的該發(fā)明方法，從起始質(zhì)量50克得到約40克無(wú)基質(zhì)的血紅蛋白(“SFH”)，得到估計(jì)的30％產(chǎn)率。因此，估計(jì)從起始材料到處理好的SFH的最終產(chǎn)率是大約66％質(zhì)量。
血紅蛋白生產(chǎn)中的一個(gè)問(wèn)題是蛋白質(zhì)變性。血紅蛋白對(duì)稀釋、壓力、剪切力、溫度和pH改變的作用是敏感的，這些因素可導(dǎo)致和氧化、沉淀、血紅素喪失和亞基解離有關(guān)的問(wèn)題。因此，重要的是所有處理步驟在同一溫度和低溫下進(jìn)行。例如，可冷藏COBE 2991細(xì)胞處理器，維持在4℃。另外，攪動(dòng)不能太劇烈，pH變化不能太急驟，壓力不能達(dá)到高水平。
特征確定和質(zhì)量控制可用總磷酸鹽試驗(yàn)進(jìn)行基質(zhì)污染的測(cè)量。從血紅蛋白溶液抽提磷脂可能是困難的，因此總磷酸鹽試驗(yàn)是較簡(jiǎn)單而低成本的程序。雖然十分靈敏，該試驗(yàn)不能分辨磷酸鹽的來(lái)源。
胞內(nèi)酶組成了第二組紅血細(xì)胞的潛在的污染，然而該類污染中的某些在血液替代品中可能是可被接受的。可用分析級(jí)快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)，使用280nm濾器從非血紅蛋白的蛋白質(zhì)中分辨SFH來(lái)評(píng)估無(wú)基質(zhì)血紅蛋白產(chǎn)品的均一性。
用動(dòng)態(tài)濁度測(cè)定法，基于鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物(LAL)凝集級(jí)連的引發(fā)進(jìn)行內(nèi)毒素測(cè)量。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。(見(jiàn)例如，Cohen等，鱟(Limulidae)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，1979，Alan R.Liss，Inc.，New York.)可用常規(guī)pH和電導(dǎo)計(jì)測(cè)量無(wú)基質(zhì)血紅蛋白溶液的pH和電導(dǎo)率，例如來(lái)自Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，PA的Accumet Line中的那些。光譜分析可提供對(duì)血紅蛋白濃度和溶液中高鐵血紅蛋白量的分析。這些分析可用快速掃描二極管陣列分光光度計(jì)，如Milton Roy 3000在索雷(Soret)和可見(jiàn)區(qū)內(nèi)進(jìn)行，根據(jù)Vandegriff和Shrager描述的多成分分析技術(shù)進(jìn)行(“用快速掃描分光光度計(jì)和奇值(singular value)分解評(píng)估與血紅蛋白結(jié)合的氧平衡”，酶學(xué)方法，232460-485，1994)，在此引入以供參考。
確定血紅蛋白溶液的功能狀態(tài)的最敏感試驗(yàn)是測(cè)量其氧結(jié)合曲線。一種該方法需要用新穎酶系統(tǒng)在密封比色杯中線性消耗氧。隨著氧被耗盡，拍攝重復(fù)的可見(jiàn)光譜，而同時(shí)用Clark型電極測(cè)量PO2。用0.1M bis-Tris丙烷或磷酸緩沖液將血紅蛋白稀釋到約60μm濃度(在亞鐵血紅素中)。反應(yīng)需要大約15分鐘。該反應(yīng)使用原兒茶酸(PCA，Sigma Chemical Co.，St.Louis)作為底物，并對(duì)于每摩爾PCA被原兒茶酸3，4-脫氧酶(PCD，Sigma Chemical Co.，St.Louis)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物消耗1摩爾O2。實(shí)驗(yàn)后，PO2值和光譜匹配。對(duì)光譜進(jìn)行多成分分析和曲線擬合程序，來(lái)確定氧結(jié)合曲線的參數(shù)(P50，Hill’s參數(shù)，n)。在分析這些光譜的過(guò)程中，計(jì)算脫氧每一步中的高鐵血紅蛋白相對(duì)比例。另外，該方法和分析揭示了任何額外血紅蛋白成分，如變性和降解產(chǎn)物的存在。
還用等電聚焦(IEF)在pH范圍8.5-5.5內(nèi)，在瓊脂糖和聚丙烯酰胺上確定了本發(fā)明產(chǎn)生的血紅蛋白溶液的特征。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳評(píng)估了亞基結(jié)構(gòu)。光譜分析提供了對(duì)血紅蛋白濃度和溶液中高鐵血紅蛋白和碳氧血紅蛋白量的估計(jì)。在快速掃描二極管陣列分光光度計(jì)上，于索雷和可見(jiàn)區(qū)收集光譜。用多成分分析評(píng)估光譜。其它質(zhì)量控制測(cè)量包括測(cè)量血紅蛋白濃度、pH和電導(dǎo)率。如需要，可制定其它質(zhì)量控制測(cè)量。
實(shí)施例3用描述發(fā)明制各修飾的血紅蛋白本發(fā)明還可被用來(lái)在圖4所示的該所述改進(jìn)的細(xì)胞分離器裝置中制備的無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(SFH)溶液制備修飾的血紅蛋白溶液(“產(chǎn)物”)。
可從任何來(lái)源，包括動(dòng)物或人，儲(chǔ)藏或新鮮的，或甚至從血庫(kù)獲得的過(guò)期人(血)單位獲得紅血細(xì)胞。改進(jìn)程序還可用以任何方法(包括本發(fā)明或其它方法)制備的血紅蛋白溶液(包括重組血紅蛋白)。如果使用供血者血液，首先將其和抗凝集劑50混合，在離心轉(zhuǎn)頭52中用生理鹽水54洗滌，并用蒸餾水56裂解。除去血漿、血小板和白血細(xì)胞部分，并儲(chǔ)藏在獨(dú)立分隔的容器58中。將血紅蛋白溶液(SFH)60置于獨(dú)立分隔的儲(chǔ)液器62或離心轉(zhuǎn)頭52中，在其中進(jìn)行化學(xué)修飾。過(guò)濾后，將最終產(chǎn)物收集在無(wú)菌容器64中，儲(chǔ)藏以供進(jìn)一步使用。
就用上述儀器制備的SFH要進(jìn)一步加工成產(chǎn)物的情況而言，將該SFH收集在儲(chǔ)液器中，它含有預(yù)測(cè)量的試劑以用于化學(xué)修飾。在優(yōu)選方法中，試劑是緩沖鹽，亞氨基硫醇(iminothiolane)和活性聚乙二醇。在反應(yīng)期末將修飾的血紅蛋白(PEG-Hb)收集在塑料袋中或其它儲(chǔ)藏容器中，并儲(chǔ)藏。
雖然和PEG的反應(yīng)是優(yōu)選的血紅蛋白修飾，可通過(guò)本發(fā)明所述儀器進(jìn)行所述修飾，而且這些產(chǎn)物在血液替代品制劑領(lǐng)域中是熟知的。這些修飾包括例如內(nèi)部交聯(lián)、聚合反應(yīng)、或用葡聚糖、淀粉或其它合成或天然聚合物對(duì)血紅蛋白進(jìn)行表面修飾。
可將產(chǎn)物通過(guò)圖4中的濾器66和68進(jìn)一步純化。這些濾器和超離心裝置，可以是例如尺寸排阻濾器、離子交換濾器、混床離子交換器、活性碳濾器或其它用于蛋白質(zhì)純化和透析程序的管線內(nèi)濾器?？捎萌魏嘻}溶液或其它材料配制產(chǎn)物。
可用相同的儀器，用任何數(shù)量的程序，包括溶劑-清潔劑處理、γ輻射、超微過(guò)濾、亞甲基藍(lán)或類似衍生物，或任何其它方法滅活或除去細(xì)菌和病毒等生物體，以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行消毒。
本發(fā)明的方法提供了更快速和低成本的收集紅血細(xì)胞(需要它用于生產(chǎn)血液替代品，能解決全球?qū)τ谳斞玫倪m用可得血液的顯著短缺)的方法。本發(fā)明方法可用于處理過(guò)期血液，但最有利的是用于在供血者/病人床邊原地使用。因?yàn)樵撨^(guò)程在計(jì)算機(jī)控制的、完全自容的儀器中進(jìn)行，處理被最小化，消除了污染的危險(xiǎn)。該過(guò)程還消除了對(duì)收集的血液?jiǎn)挝贿M(jìn)行定型和儲(chǔ)藏的需要，為該目的收集的血單位可被合并以減少測(cè)試傳染性因子的成本。
明顯的是，還有其它未具體包括在本詳述中，但在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)的實(shí)施例和用途。本說(shuō)明書不是為了限制，而本發(fā)明的范圍僅受權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.一種在包括離心機(jī)的自動(dòng)化血液分離器中從含有紅血細(xì)胞的溶液生產(chǎn)血紅蛋白溶液的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)分離溶液中的紅血細(xì)胞；(b)取出分離步驟中產(chǎn)生的上清液；用洗滌溶液洗滌紅血細(xì)胞；(c)裂解紅血細(xì)胞，產(chǎn)生溶血產(chǎn)物；和(d)從溶血產(chǎn)物中分離紅血細(xì)胞的基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滌溶液是生理鹽水溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滌溶液是殺菌劑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滌溶液是病毒滅活劑。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)到(d)在放置于離心機(jī)中的一處理容器內(nèi)進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟測(cè)量溶血產(chǎn)物的離子濃度，并重復(fù)步驟(c)到(d)，直到離子濃度下降到預(yù)定水平。
7.一種在細(xì)胞處理儀器中進(jìn)行的方法，用于從含有紅血細(xì)胞和血漿的溶液中產(chǎn)生血紅蛋白，其特征在于，該方法包括步驟在含有處理袋和管式導(dǎo)線系列的無(wú)菌處理裝置中收集所述溶液，將該處理袋置于所述細(xì)胞處理儀器中的離心機(jī)中；通過(guò)在離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)所述處理袋，從血漿中分離紅血細(xì)胞；從所述處理袋中擠出血漿；將洗滌溶液引入處理袋，以洗滌紅血細(xì)胞；洗滌后，擠出上清液；將蒸餾水引入處理袋以裂解紅血細(xì)胞，以將血紅蛋白釋放入溶液；通過(guò)旋轉(zhuǎn)在所述離心機(jī)中的所述處理袋，從所述血紅蛋白溶液中分離紅血細(xì)胞膜；和通過(guò)所述處理袋的無(wú)菌口取出所述血紅蛋白溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，從血紅蛋白分離紅血細(xì)胞膜的步驟包括步驟當(dāng)蒸餾水首次和所述紅血細(xì)胞接觸時(shí)，取出首次產(chǎn)生的血紅蛋白；和連續(xù)取出隨著溶液離子強(qiáng)度下降，額外產(chǎn)生的血紅蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，還包括步驟測(cè)量由從溶液取出血紅蛋白的步驟產(chǎn)生的血紅蛋白溶液的離子強(qiáng)度；加入額外的蒸餾水；和重復(fù)取出額外的血紅蛋白，并加入額外的蒸餾水的步驟，直到離子強(qiáng)度達(dá)到預(yù)定閾值。
10.一種從細(xì)胞處理儀器中處理容器內(nèi)的壓積紅血細(xì)胞分離血紅蛋白的方法，該方法包括在儀器內(nèi)進(jìn)行的步驟在所述處理容器中用鹽水溶液洗滌所述紅血細(xì)胞；在所述處理容器中裂解所述紅血細(xì)胞；在所述處理容器中從血紅蛋白分離紅血細(xì)胞膜和未裂解的紅血細(xì)胞；和從所述處理容器抽提溶液中的所述血紅蛋白。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述分離步驟包括離心所述儀器內(nèi)的所述處理容器，來(lái)壓積紅血細(xì)胞膜和未裂解的紅血細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述洗滌步驟包括在鹽水溶液中加入去垢劑、抗菌劑或抗病毒劑。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該方法進(jìn)一步包括測(cè)量所述血紅蛋白溶液的離子強(qiáng)度的步驟，其中重復(fù)進(jìn)行裂解、分離和抽提的步驟，直到離子強(qiáng)度降到預(yù)定水平。
14.一種制備修飾的血紅蛋白溶液的方法，其特征在于，該方法包括將壓積紅血細(xì)胞混入生理鹽水溶液；用鹽水溶液洗滌所述紅血細(xì)胞；裂解所述紅血細(xì)胞；透析過(guò)濾所述紅血細(xì)胞，以除去基質(zhì)；透析過(guò)濾所述已過(guò)濾的紅血細(xì)胞；將得到的血紅蛋白溶液收集在容器中，所述容器中含有預(yù)定的試劑，所述試劑適用于化學(xué)修飾所述血紅蛋白溶液；使所述血紅蛋白溶液和所述試劑反應(yīng)；和將所述反應(yīng)的溶液儲(chǔ)藏在儲(chǔ)藏容器中。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定的試劑含有緩沖鹽。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述緩沖鹽是亞氨基硫醇和活性聚乙二醇。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，該方法還包括過(guò)濾所述反應(yīng)的溶液。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，該方法還包括對(duì)所述反應(yīng)的溶液進(jìn)行滅菌，以除去或滅活生物體。
全文摘要
本方法使用一臺(tái)可商品購(gòu)得的血細(xì)胞分離器,它包括一計(jì)算機(jī)控制的離心機(jī)(2),其具有一轉(zhuǎn)頭,在其中放置了含有供血者血液的血液處理袋(6)。一旦收集了血液,加工完全在密封的離心轉(zhuǎn)頭中進(jìn)行,優(yōu)選在供血者收集位點(diǎn)原位進(jìn)行。在第一步中,離心血液,從細(xì)胞成分中分離血漿。從其它血液成分中分離出紅血細(xì)胞后,用生理鹽水或其它溶液洗滌紅細(xì)胞。然后通過(guò)低滲休克裂解該紅血細(xì)胞,來(lái)分離該紅細(xì)胞膜(基質(zhì)),并將裂解物收集在無(wú)菌容器(44)中,僅將基質(zhì)留在該離心轉(zhuǎn)頭中?？蓪⒆罱K產(chǎn)物用作任何現(xiàn)在開(kāi)發(fā)用作紅細(xì)胞替代物的以血紅蛋白為基礎(chǔ)的氧載體的原料。在加工容器或離心轉(zhuǎn)頭中血袋(6)中進(jìn)行所有步驟,來(lái)使操作最少化,并保持無(wú)菌。一種制備修飾的血紅蛋白溶液的方法包括將產(chǎn)生無(wú)－基質(zhì)血紅蛋白,然后加入預(yù)先定量的試劑和該溶液反應(yīng)并過(guò)濾該溶液的步驟結(jié)合使用。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1332646SQ99813429
公開(kāi)日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月15日
發(fā)明者R·M·溫斯洛, K·D·范德格里夫 申請(qǐng)人:桑伽特股份有限公司