專利名稱：可逆含水pH敏感脂化試劑、組合物和應(yīng)用的方法
背景技術(shù)：
雖然蛋白質(zhì)通過注射給藥是其體內(nèi)遞送的最有效方式，但患者對多次注射的耐受性非常低。另外，藥物注射要求經(jīng)過訓練和技巧，這些并不是患者總能夠得到的。在蛋白質(zhì)藥物起挽救生命作用的情況中，注射給藥是患者可以接受的。然而，在蛋白質(zhì)藥物僅僅是若干可行治療中的一種的情況中，蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)的注射是患者所不愿意接受的。因此，需要開發(fā)遞送蛋白質(zhì)和肽類的其它途徑。
所述其它途徑可以包括經(jīng)頰、經(jīng)鼻、口服、經(jīng)肺、直腸和經(jīng)眼途徑。意想不到的是，與腸胃外給藥途徑相比，這些給藥途徑的有效性很低，但是它們?nèi)匀槐饶c胃外途徑更加吸引人，因為它們?yōu)榛颊咛峁┓奖悴⑶铱烧瓶??？诜緩接绕渥⒛?，因為它最方便且患者易順從?br> 將機體內(nèi)部與外部分隔開的粘膜屏障(如胃腸道、眼、肺、直腸和鼻粘膜)包括一層緊密相連細胞單層，該細胞層嚴格調(diào)節(jié)分子的傳輸。屏障中的各個細胞通過緊密接點相連，其調(diào)節(jié)進入細胞間隙。所以，該粘膜處于第一水平的物理屏障，透過該水平屏障的傳輸取決于跨細胞或旁細胞途徑(Lee，V，H.L.，“臨界可逆治療藥物遞送體系”(Critical Rev.Ther.Drug Delivery Sys.)569-97(1988))。
經(jīng)過水填充緊密接點的旁細胞轉(zhuǎn)運局限于小分子(MW＜1kDa)并且主要是由跨粘膜間濃度梯度驅(qū)動的擴散過程(Lee，V，H.L.，“臨界可逆治療藥物遞送體系”569-97(1988)；Artursson，P.& Magnusson，C.，《藥物科學雜志》79595-600(1990))。緊密接點占粘膜總表面積的0.5％以下(Gonzalez-Mariscal，L.M.等人《膜生物學雜志》(J.MembraneBiol.)86113-125(1985)；Vetvicka，V.& Lubor，F(xiàn).，“臨界可逆治療藥物遞送體系”5141-170(1988))；所以，它們在蛋白質(zhì)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運中僅僅起很小的作用。
能夠有效提供藥物的物理化學特性的小分子藥物的跨細胞轉(zhuǎn)運適宜跨疏水性細胞屏障傳輸。然而，蛋白質(zhì)和肽的跨細胞轉(zhuǎn)運局限于胞轉(zhuǎn)作用方式(Shen，W.C.等，Adv.Drug，Deliv，Rev.893-113(1992))。胞轉(zhuǎn)作用是一個復(fù)雜過程，其中蛋白質(zhì)和肽由細胞的一側(cè)被攝入到囊泡內(nèi)，隨后經(jīng)細胞穿梭運送到細胞的另一側(cè)，在該側(cè)由內(nèi)吞泡放出(Mostov，K.E.& Semister，N.E.，《細胞》43389-390(1985))。粘膜屏障的細胞膜是疏水性脂質(zhì)雙層，其對親水性、帶電荷大分子如蛋白質(zhì)和肽沒有親和力。另外，粘膜細胞可以分泌粘蛋白，粘蛋白可以對許多大分子的轉(zhuǎn)運起屏障作用(Edwards，P.，《英國藥物通訊》(British Med.Bull.)3455-56(1978))。因此，除非蛋白質(zhì)或肽存在特異性傳輸機制，那么其固有跨膜屏障轉(zhuǎn)運幾乎可被忽略。
除了對蛋白質(zhì)和肽的轉(zhuǎn)運提供緊密物理屏障以外，粘膜屏障具有多種可以在蛋白質(zhì)和肽穿透粘膜之前、之后和期間降解蛋白質(zhì)和肽的酶。這種屏障稱作酶屏障。酶(促)屏障是由內(nèi)肽酶和外肽酶組成，它們在蛋白質(zhì)和肽的末端或其結(jié)構(gòu)內(nèi)部裂解它們。若干粘膜的酶促活性已經(jīng)得到研究，結(jié)果證實多數(shù)蛋白酶活性存在于白化兔的頰、鼻、直腸和陰道粘膜勻漿中，并且這些活性相當于髂骨中的那些(Lee，V，H.L.，“臨界可逆治療藥物遞送體系”569-97(1988)。因此，不論被考慮的粘膜，酶促屏障的存在將在蛋白質(zhì)和肽分子的降解中起強有力的作用。
肽的N和C末端帶有電荷，并且?guī)щ妭?cè)鏈的存在賦予這些大分子高親水特性。另外，帶電側(cè)鏈的存在意味著蛋白質(zhì)和肽具有強氫鍵能力；已經(jīng)證實這種H鍵能力在抑制小分子肽的跨細胞膜轉(zhuǎn)運中起主要作用(conradi，R.A.等，《藥物研究》(Pharm.res.)81453-1460(1991))。所以，蛋白質(zhì)和肽的大小和親水特性一起嚴重限制了其跨粘膜屏障轉(zhuǎn)運。
一種業(yè)已被用來改變粘膜屏障物理本性的途徑是應(yīng)用滲透促進劑。滲透促進劑的應(yīng)用是基于利用可流化細胞膜的分子量降低試劑來破壞細胞屏障(Kaji，H等人，《生命科學》(Life Sci.)37523-530(1985))，打開緊密接點(Inagaki，M.等人，《鼻科學》23213-221(1985))，并且在細胞膜中造孔(Gordon，S.等人，《美國國家科學院院報》827419-7423(1985)；Lee，V.H.L.等人，《臨界治療藥物載體體系》891-192(1991))。這些試劑的應(yīng)用導(dǎo)致屏障完整性的非特異性喪失，并且可能吸收多種在體內(nèi)可對細胞有毒的大分子。
已經(jīng)將蛋白酶抑制劑與蛋白質(zhì)和肽聯(lián)合給藥，而且在提高這些大分子的體內(nèi)吸收中顯示出一些有限的活性(kidron，M等人《生命科學》312837-2841(1982)；Takaroi，K等人《生物化學和生物物理學研究通訊》137382-687(1986))。這種途徑的安全性和長效作用尚待徹底研究。
前藥途徑是基于對肽以一定方式的修飾，由此保護它們不被酶降解和識別。利用酰胺化和?；瘜㈦纳系囊讚p基團封閉可以達到上述目的。進一步證明前藥途徑僅僅適用于具有易識別活性結(jié)構(gòu)域的小分子肽。
減小大小是另一種提高蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運有效性的可行途徑。然而，在嘗試減小大小之前必需將蛋白質(zhì)的活性位點作圖。通常，這種途徑難以應(yīng)用于多數(shù)蛋白質(zhì)。
基于其特性，載體配體可以改變細胞對蛋白質(zhì)和肽的攝取和轉(zhuǎn)運特征。這種途徑的本質(zhì)在于使細胞不通透性蛋白質(zhì)或肽共價附著在易于轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的載體上。經(jīng)過該機制，載體配體被胞吞，并且胞轉(zhuǎn)作用在決定載體增強蛋白質(zhì)和肽的轉(zhuǎn)運的適合性中至關(guān)重要。大分子載體是親水性的，無法分配在膜內(nèi)。因此，大的聚合性載體向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運是由載體對細胞膜的親和力介導(dǎo)的。一般地，大分子偶聯(lián)物的攝入始于與細胞膜結(jié)合。載體和細胞的結(jié)合可以是特異性(例如，抗體與細胞表面抗原的結(jié)合)、非特異性的(陽離子配體或凝集素與細胞表面糖類的結(jié)合)或受體介導(dǎo)的(轉(zhuǎn)移或胰島素對其受體的結(jié)合)。一旦載體與細胞表面結(jié)合，它就被攝入囊泡中。這些囊泡隨后被逐步加工并且可以按照若干途徑遞送。一條途徑是囊泡循環(huán)回膜。另一條破壞偶聯(lián)物的途徑是與溶酶體融合。再一途徑是使偶聯(lián)物胞轉(zhuǎn)，該途徑是使囊泡和其產(chǎn)生的膜之相反側(cè)的膜融合。
胞吞和胞轉(zhuǎn)過程之間的正確平衡決定了蛋白質(zhì)偶聯(lián)物向其部位的遞送。例如，胞吞可以決定偶聯(lián)物被靶細胞攝取的程度，但胞轉(zhuǎn)決定了偶聯(lián)物是否能夠抵達部位(Shen，W.C.等人Adv.Drug Deliv.Rev.893-113(1992))。為了順利地經(jīng)胃腸粘膜吸收，偶聯(lián)物必須結(jié)合胃腸粘膜的頂端膜，內(nèi)化在粘膜細胞內(nèi)，跨細胞遞送，并且最終由基底外側(cè)膜釋放。
現(xiàn)有文獻包括許多報導(dǎo)證明非特異性載體如聚賴氨酸(Shen.W.C.&Ryser，H.J.P.，《美國國家科學院院報》787589-7593(1981))和凝集素(Broadwell，R.D.等人，《美國國家科學院院報》85632-646(1988))，和特異性載體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白(Wan.J.，等人，《生物學和化學雜志》25713446-13450(1992))，脫唾液酸糖蛋白(Seth，R.，等人，《感染疾病學雜志》(J.Infect.Diseases)168994-999(1993))，和抗體，可以提高蛋白質(zhì)進入細胞的胞吞。但涉及蛋白質(zhì)胞轉(zhuǎn)載體的報導(dǎo)很少，并且非常少的研究對蛋白質(zhì)偶聯(lián)物穿透細胞屏障的轉(zhuǎn)移進行定量。小麥胚凝集素(Broadwell，R.D.等人，《美國國家科學院院報》85632-646(1988))和抗轉(zhuǎn)鐵蛋白/氨甲蝶呤偶聯(lián)物(Friden，P.M.& Walus，L.R.，《高等實驗醫(yī)學和生物學》(Adv.Exp.Med.Biol)331129-136(1993))業(yè)已表現(xiàn)出可以透過體內(nèi)血腦屏障轉(zhuǎn)運。另外，辣根過氧化物酶(HRP)的聚賴氨酸偶聯(lián)物和HRP的轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)物顯示出可以被跨體內(nèi)細胞單層轉(zhuǎn)運(wan，J.& Shen，W.C.《藥學研究》(Pharm.Res.)8S-5(1991)；Taub，M.E.& Shen，W.C.，《細胞生理學雜志》(J.Cell，Physiol.150283-290(1992)；Wan，J.等人，《生物化學》26713446-13450(1992))。
作為磷脂的組分，脂肪酸構(gòu)成細胞膜的主要部分。它們可商購并且相對便宜。因其親脂性，脂肪酸可容易地分配到細胞膜內(nèi)并且以無毒方式與細胞膜相互作用。因此，脂肪酸潛在地成為蛋白質(zhì)和肽轉(zhuǎn)運的最有效載體配體。將脂肪酸應(yīng)用在蛋白質(zhì)和肽類遞送中的策略包括蛋白質(zhì)和肽的共價修飾和脂肪酸乳液的應(yīng)用。
一些研究已報導(dǎo)脂肪酸乳體內(nèi)遞送肽和蛋白質(zhì)的成功應(yīng)用(Yoshikawa，H.，等人，《藥學研究》2249-251(1985)；Fix，J.A.，等人，《美國生理學雜志》(Am.J.Physiol.)25IG332-G340(1986))。脂肪酸乳液影響蛋白質(zhì)和肽吸收的這種機理尚不清楚。脂肪酸乳液可以打開緊密接點，溶解膜，在胃腸道環(huán)境下遮蔽蛋白質(zhì)和肽，并且以其吸收部分攜帶蛋白質(zhì)和肽穿過胃腸道粘膜。后一機理已經(jīng)被提出但與現(xiàn)有關(guān)于脂肪吸收的機理不一致。
一種更合理的遞送蛋白質(zhì)和肽透過胃腸上皮的策略是應(yīng)用脂肪酸作為非特異性膜吸附劑。若干研究顯示，與蛋白質(zhì)相連的非特異性膜結(jié)合劑可以促進蛋白質(zhì)偶聯(lián)物體外跨過細胞的胞轉(zhuǎn)作用(Wan，J.，等人，《細胞生理學雜志》1459-15(1990)；Taub，M.E.& Shen.W.C.《細胞生理學雜志》150283-290(1992))。已經(jīng)證明脂肪酸偶聯(lián)可提高攝取大分子進入和穿過細胞膜(Letsinger，R.，等人，《美國國家科學院院報》866553-6556(1989)；Kabanov，A.等人，《蛋白質(zhì)工程》(Protein Eng.)339-42(1989))。然而，難于將脂肪酸與肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)，包括(1)脂肪酸在偶聯(lián)反應(yīng)的水溶液中缺乏溶解性；(2)肽和蛋白質(zhì)在脂肪酸?；笫ド锘钚裕缓?3)脂肪酸偶聯(lián)的肽在水溶液中缺乏溶解性(參見例如Hashimoto，M.等人，《藥學研究》6171-176(1989)；Martins，m.B.F.，《生物化學》(Biochimie)72671-675(1990)；Muranishi，S.，等人，《藥學研究》6171-176(1989)；Martins，M.B.F.等人，《生物化學》72671-675(1990)；Muranishi，S.等人，《藥學研究》8649-652(1991)；Robert，S.，等人，《生物化學和生物物理學研究通訊》196447-454(1993))。
一旦遞送到細胞內(nèi)，肽和蛋白質(zhì)必須被其載體釋放。公開的PCT申請?zhí)朩O96/22773和WO98/13007公開了跨細胞遞送和含巰基肽和蛋白質(zhì)的釋放。通過經(jīng)二硫鍵與脂肪酸偶聯(lián)可以提高含巰基親水性分子的細胞吸收。不穩(wěn)定二硫鍵易于還原，提供了一旦存在于體內(nèi)的一種由脂肪酸部分釋放親水性化合物的機制。
除了二硫鍵還原以外，自載體體系釋放生物活性親水性化合物的其它機制包括水解和光解鍵裂解(參見如美國專利號5505931和其中引用的參考文獻)。已知基于水解的遞送體系，在該體系中生物活性胺與有機物偶聯(lián)，摻混在單克隆抗體中或其它以特定細胞為靶向的底物中(參見，連日美國專利號4764368、4618492、5505931和5563250)。在與靶細胞特異性結(jié)合后，這些偶聯(lián)物將活性胺(通常為酰胺的形式)遞送到細胞內(nèi)部，在細胞內(nèi)部(酰胺)水解釋放出游離胺。
現(xiàn)有技術(shù)中基于水解的給藥體系的成功激發(fā)了改進能夠?qū)⒑钚园被衔飩鬏數(shù)郊毎麅?nèi)部的藥物-載體偶聯(lián)物的研究。改進的合成策略和治療技術(shù)正在被開發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的藥物-載體偶聯(lián)物及其制備的適當合成策略。所以，本發(fā)明涉及合成方法、中間體和用于攝取和釋放生物活性的含氨基化合物的最終產(chǎn)物。
特別是，本發(fā)明涉及通式I的化合物 其中R2選自氫、鹵素、烷基或芳基，其中所述烷基或芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷氧基烷基、烷?；?、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；R4和R5中的一個是生物活性的含氨基物質(zhì)，選自含胺藥物、天然或非天然氨基酸、肽和蛋白質(zhì)，并且R4和R5中的另外一個是OR6，其中R6是氫、堿金屬或負電荷；X是氧或硫；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
本發(fā)明還涉及通式II的化合物 其中R2是氫、鹵素、烷基或芳基，其中所述烷基或芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷氧基烷基、烷?；⑾趸?、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
本發(fā)明還涉及通式III的化合物或其可藥用鹽， 其中R2是氫、鹵素、烷基或芳基，其中所述烷基或芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷氧基烷基、烷酰基、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
本發(fā)明還涉及由通式II的化合物和生物活性的含氨基物質(zhì)形成通式I的偶聯(lián)物的方法。
本發(fā)明也涉及由馬來酸類衍生物和相應(yīng)硫醇類或醇類化合物形成通式II的化合物的方法。
本發(fā)明還涉及提高生物活性的含氨基物質(zhì)在哺乳動物中的吸收或延長血液或組織保留的方法，其中通式I的偶聯(lián)物是以可藥用形式對哺乳動物給藥。
本發(fā)明還涉及增強含親水性胺的化合物遞送到具有粘膜屏障的細胞內(nèi)部的方法，其中通式I的偶聯(lián)物與該細胞接觸，由此偶聯(lián)物透過該細胞的粘膜屏障并通過酰胺鍵的水解釋放出游離胺。
本發(fā)明還涉及含有通式I的化合物的藥物組合物。
基于本發(fā)明的描述、教導(dǎo)和指引，本發(fā)明的上述和其它特征、優(yōu)越性、實施方式、方面和目的將是相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所熟知的。
附圖簡述

圖1表示由本發(fā)明所述脂化(lipidization)載體試劑(REAL-酪胺)釋放酪胺的pH依賴性。數(shù)據(jù)是3個試驗的平均值和SD。
圖2.表示糖尿病大鼠在皮下注射5μg/kg AVP(精氨酸后葉加壓素)、棕櫚?；鵄VP和本發(fā)明的REAL-AVP之后的累計尿排量。數(shù)據(jù)顯示測量3只大鼠的平均值和SD。
圖3表示糖尿病大鼠在24小時內(nèi)經(jīng)皮下注射5μg/kg AVP、棕櫚酰基AVP和本發(fā)明的REAL-AVP之后的累計尿排量。數(shù)據(jù)顯示3個試驗的平均值和SD。
圖4表示禁食糖尿病大鼠中在皮下注射0.35U/kg胰島素之后與皮下注射0.35U/kg本發(fā)明的REAL-胰島素相比，血(葡)糖水平的變化。數(shù)據(jù)顯示測量2只大鼠的平均值和SD。
圖5表示皮下注射0.5U/kg胰島素與皮下注射0.5U/kg本發(fā)明的REAL-胰島素相比，對禁食糖尿病大鼠血糖水平的長期作用。數(shù)據(jù)顯示2只大鼠測量的平均值和SD。
圖6表示禁食糖尿病大鼠在口服10U/kg REAL-胰島素、胰島素和安慰劑之后血糖水平的短期作用。數(shù)據(jù)顯示4只大鼠測量的平均值和SD。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明所述，生物活性的含胺化合物(例如氨基酸、肽和蛋白質(zhì))經(jīng)可逆性酰胺鍵連接于親脂性衍生物。這種偶聯(lián)物的親脂性基團結(jié)合在細胞膜的頂側(cè)且促進偶聯(lián)物經(jīng)細胞膜轉(zhuǎn)運。一旦位于細胞膜內(nèi)部，酰胺鍵的水解使生物活性的含胺化合物被釋放到間質(zhì)液中。
按照本發(fā)明的一個方面，提供通式I的偶聯(lián)物 其中R2是氫、鹵素、烷基或芳基，其中所述烷基和芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷氧基烷基、烷酰基、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；R4和R5中的一個是生物活性的含氨基物質(zhì)，選自含胺藥物、天然或非天然氨基酸、肽和蛋白質(zhì)，并且R4和R5中的另外一個是OR6，其中R6是氫、堿金屬或負電荷；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供通式II的化合物 其中R2是氫、鹵素、烷基或芳基，其中所述烷基和芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷氧基烷基、烷?；⑾趸?、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
按照本發(fā)明的一個方面，提供通式III的化合物或其無毒的可藥用鹽 其中R2是氫、鹵素、烷基或芳基，其中所述烷基和芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷氧基烷基、烷?；?、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
典型的烷基包括C1-6烷基，它包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基等。
典型的烷氧基包括被上述任何烷基取代的氧。
典型的烷氧基烷基包括被烷氧基取代的任何上述烷基，例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、丁氧基甲基、戊氧基甲基、己氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、甲氧基丁基、甲氧基戊基、甲氧基己基等。
優(yōu)選的芳基是C6-14芳基并且通常包括苯基、萘基、芴基、菲基和蒽基。
典型的烷氧基取代的芳基包括被一個或多個上述烷氧基取代的上述芳基，例如3-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基等。
典型的烷基取代的芳基包括被任何C1-6烷基取代的任一上述芳基，包括Ph(CH2)n，其中n是1-6，例如甲苯基，鄰-、間-和對二甲苯基，乙基苯基，1-丙基苯基，2-丙基苯基，1-丁基苯基，2-丁基苯基，叔丁基苯基，1-戊基苯基，2-戊基苯基，3-戊基苯基。
典型的鏈烯基包括C2-6鏈烯基，如乙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、3-戊烯基、2-戊烯基、5-己烯基、4-己烯基、3-己烯基和2-己烯基。
典型的炔基包括C2-6炔基，例如乙炔基、2-丙炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、4-戊炔基、3-戊炔基、2-戊炔基、5-己炔基、4-己炔基、3-己炔基和2-己炔基。
典型的鏈烯基或炔基取代的芳基包括被任何上述C2-6烯基或C2-6炔基取代的上述C6-14芳基，例如乙烯基苯基、1-丙烯基苯基、2-丙烯基苯基、1-丁烯基苯基、2-丁烯基苯基、1-戊烯基苯基、2-戊烯基苯基、3-戊烯基苯基、1-己烯基苯基、2-己烯基苯基、3-己烯基苯基、乙炔基苯基、1-丙炔基苯基、2-丙炔基苯基、1-丁炔基苯基、2-丁炔基苯基、1-戊炔基苯基、2-戊炔基苯基、3-戊炔基苯基、1-己炔基苯基、2-己炔基苯基、3-己炔基苯基。
典型的鹵素基團包括氟、氯、溴和碘。
典型的鹵素取代的烷基包括被一個或多個氟、氯、溴或碘原子取代的C1-6烷基，例如氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、全氟乙基、1，1-二氟乙基和三氯甲基。
典型的烷?；–1-5C(O)烷?；缫阴；⒈；?、丁?；?、戊?；图乎；?，或芳基烷酰基，例如被任何上述芳基取代的C1-5C(O)烷?；?。
典型的環(huán)烷基包括C3-8環(huán)烷基，包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
按照本發(fā)明的另一方面，提供由通式II的化合物和含氨基物質(zhì)形成通式I的偶聯(lián)物的方法。
按照本發(fā)明的又一個方面，提供由馬來酸類衍生物和硫醇類化合物和醇類化合物形成通式II的化合物的方法。
按照本發(fā)明的再一個方面，提供增強生物活性的含氨基物質(zhì)在哺乳動物中的吸收或延長血液和組織保留的方法，其中通式I的偶聯(lián)物對哺乳動物給藥(例如，以乳液、毫微顆粒(如固體脂質(zhì)毫微顆粒)、脂質(zhì)體、微球、微囊、氣溶膠、經(jīng)吸入和透皮劑型的形式)。
按照本發(fā)明的一個方面，提供提高親水性含胺化合物向具有粘膜屏障的細胞的內(nèi)部遞送的方法，其中通式I的化合物與該細胞接觸，由此偶聯(lián)物滲透過細胞的粘膜屏障并且通過酰胺鍵的水解釋放出游離胺。
在此所用術(shù)語“親脂性基團”是指天然脂質(zhì)本身，疏水性支鏈或非支鏈的含有約4-約26個碳原子、優(yōu)選約5-約19個碳原子的烴，脂肪酸或其酯，或表面活性劑。適用的親脂性基團包括但不限于長鏈烷?；ㄗ貦盎?C15H31)、油基(C15H29)、硬脂基(C17H35)、月桂基(C11H23)、膽酰基(cholyl)、肉豆蔻基(C13H27)。
在此所用術(shù)語“天然或非天然氨基酸”是指任何21種天然氨基酸以及D型氨基酸；被保護L-和D-型氨基酸，如通過酰胺化或?；Ｗo的那些；取代的氨基酸(如被位阻烷基或環(huán)烷基(如環(huán)丙基或環(huán)丁基)取代的那些)，其中取代在氨基酸內(nèi)引起構(gòu)象限制。優(yōu)選在本發(fā)明中作為氨基酸肽或蛋白質(zhì)的組成的天然氨基酸是丙氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、γ-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、炔基脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、γ-羧基谷氨酸或O-磷酸絲氨酸。優(yōu)選在本發(fā)明中用作氨基酸或肽或蛋白質(zhì)的組成的非天然氨基酸是任何的β-氨基酸類化合物，如β-丙氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、γ-(氨基苯基)丁酸、α-氨基異丁酸、ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、氨基苯甲酸、氨基苯基乙酸、氨基苯基丁酸、半胱氨酸(ACM)、甲硫氨酸砜、苯基甘氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸、δ-鳥氨酸、對硝基苯丙氨酸、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸和硫代脯氨酸。也可考慮由下式衍生的氨基酸 其中p是1-10。
在此所用術(shù)語“生物活性的含氨基物質(zhì)”是指任何當引入細胞內(nèi)部時具有生物活性并在其結(jié)構(gòu)中含有能夠通過?；纬甚０锋I的伯胺或仲胺的物質(zhì)。不含有伯或仲胺的物質(zhì)可以被適當衍生由此能夠與通式II或III的化合物偶聯(lián)。例如具有羧基的化合物可以與適當?shù)亩贰⒗鏑2-C10二胺(如乙二胺、丙二胺、1，4-二氨基丁烷、精胺、亞精胺等)在通式II或III的化合物和水溶性碳二亞胺(如EDC)偶聯(lián)劑的存在下反應(yīng)。在這個途徑中，二胺的作用是將不含有伯或仲胺的生物活性化合物通過酰胺鍵形成與通式II或III的化合物偶聯(lián)。
優(yōu)選的含胺化合物包括但不限于酪胺，精氨酸后葉加壓素，胰島素(Czech，M.P.，《生物活性年鑒》(Ann.Rev.Biochem.)46359(1977))，降鈣素(Brown，E.M.& Aurbach，G.D.，《維生素和激素》(Vitam.Horm.)38236(1980))，去氨加壓素(Vavar等人《藥理學和試驗治療學雜志》(J.Pharmacol.Exp.Ther.)188241(1974))，α，β和γ-干擾素(Stiem，E.R.，《國際醫(yī)學年鑒》(Ann.Rev.Inter.Med.)9680-93(1982))，白介素-2、-3、-4、-6和-11(Kluth，D-C.& Rees，A.J.，Semin.Nephrol.16576-582(1996)；Holyoake，T.L.，《血液學評論》(Blood Rev.)10169-200(1996))，G-CSF(Spiekermann，K.，等人，《白血病》11466-478(1997))，GM-CSF(Jonuleit，H.，等人，《皮膚病學研究文獻》(Arch.Dermatol Res.)2891-8(1996))，人生長激素(Strobl，J.S.& Thoms，M.J.，《藥學研究》461-34(1994))，紅細胞生成素(Spivak，J.L.，Semin.Hematol.302-11(1993))，后葉加壓素(Schroder，E &Lubke，K.，《肽》(The Peptide)2336-350(1966))，奧曲肽(Sheppard，M.C.& Stewart，P.M.，“代謝臨床和實驗”4563-64(1996))，抑肽酶(Haderland，G & Mcconn，R.，F(xiàn)ed.Proc.382760-2767(1979))，催產(chǎn)素(Nachtmann，F(xiàn).，等人，Anal Prof.Drug Subst.，10卷，F(xiàn)lorey，K.編輯Academic Press，New York，NY(1981)，563-600)，β-TGF(Moses，H.L.&Serra，R.，遺傳發(fā)育當前詳述(Curr.Opin.Genet.Dev.)6581-586(1996))，BDNF(Apfel，S.C.& Kessler，J.A.，Baillieres.《臨床神經(jīng)病學》(Clin.Neurol)，4593-606(1995))，b-FGF(Bikfalvi，A.等人，《內(nèi)分泌評論》(Endocr.Rev.)1826-45(1997))，PDGF(Hughes，A.D.，等人，《普通藥理學》(Gen Pharmacol.)271079-1089(1996))，TNF(Majno，P.E.等人，《瑞士外科學》(Swiss Surg.)4182-185(1995))，人工促尿鈉排泄肽(Nakao，L，Curr.Opin，Nephrol，Hypertens.245-50(1993))，松弛素(Schwabe，C.，等人，最新激素研究進展(RecentProgr.Horm Res.)34123-211(1978))，香樹精(Rink.T.J.等人，醫(yī)藥科學趨勢(Trends.Pharmacol.Sci.)14113-118(1993))，脫氧核糖核酸酶(Laskowski，《酶學》第2卷Boyer，P.D.編輯，Academic Press，newYork，NY(1971)，289-311)，EGF(Carpenter，G.，細胞生物學當前詳述(Curr.Opin.Cell.Biol.)5261-264(1993))，水蛭素(Markwardt，《酶學方法》19924(1970))，新制癌菌素(Dedon，P.C.& Glodberg，I.H.，《化學毒理學研究》(Chem.Res.Toxicol)311-332(1992))，血液調(diào)節(jié)肽(Paukovits，E.R.等人，《癌癥治療評論》(Cancer Treat.Res.) 173470354(1990))，和促生長素抑制素(Moss，R.L.，《生理學年鑒》(Ann.Rev Physiol)41617(1979))。
鑒于本發(fā)明的目的，術(shù)語“肽”是指天然或非天然的含有2至100個氨基酸的氨基酸鏈，術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指天然或非天然的含有100個以上氨基酸的氨基酸鏈。蛋白質(zhì)和肽可以由天然來源分離或通過所屬領(lǐng)域已知方法制備，例如DNA重組工程和固相合成。應(yīng)理解本發(fā)明中所用的肽和蛋白質(zhì)可以只包括天然L-氨基酸，L-氨基酸和其它氨基酸(D-氨基酸和修飾氨基酸)的形式，或僅僅是除L-氨基酸以外的氨基酸。為了形成通式I的偶聯(lián)物，肽和蛋白質(zhì)必須帶有至少一個反應(yīng)性氨基。該反應(yīng)性氨基可以是氨基酸側(cè)鏈的一部分，或是肽或蛋白質(zhì)主鏈的末端氨基，或通過肽或蛋白質(zhì)分子內(nèi)官能團的化學修飾引入。肽可以是同源肽或異源肽，并且可以包括天然氨基酸、合成氨基酸或它們的任一組合。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括本發(fā)明化合物的無毒可藥用鹽。特別是，構(gòu)思了由已知方法如將堿金屬鹵化物加入相應(yīng)羧酸生成的羧酸堿金屬鹽。所述鹽包括鈉、鉀、鋰和銨鹽。
在此所用術(shù)語“負電荷”是指任何未溶劑化、溶劑化或復(fù)合的能夠為羧基提供陰離子特性的孤電子對。
在此所用術(shù)語“堿金屬”是指第I或II主族的金屬，例如鈉、鉀、鋰、鈣和鎂。
本發(fā)明優(yōu)選的動物對象是哺乳動物。術(shù)語“哺乳動物”是指屬于哺乳類的個體。本發(fā)明特別適用于治療人類患者。
術(shù)語“治療”是指出于包括預(yù)防、環(huán)境或治愈疾病或病癥在內(nèi)的目的給對象施用脂化的偶聯(lián)物。
可考慮將藥物與一種其它藥物以“聯(lián)合形式”提供，如果它們可以同時提供給患者，或各藥物給藥間的時間能夠使生物活性疊加。
在一個優(yōu)選實施方式中，至少一種偶聯(lián)物作為藥物組合物的一部分提供或給藥。
本發(fā)明給予的藥物組合物可以含有至少一種可藥用形式的(任選地與可藥用載體結(jié)合的)本發(fā)明偶聯(lián)物。這些組合物可以以提供任何獲得其預(yù)期目的的方式給藥。譬如，給藥可以通過口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、顱內(nèi)或鼻內(nèi)途徑。給藥的劑量取決于接受者的年齡、健康狀況和體重，(如果存在的話)合并治療的種類，治療的頻率，預(yù)期作用的本質(zhì)。臨床治療領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員很容易判斷本發(fā)明給藥的量和方案。
給藥的形式也可以包括乳液、毫微顆粒(例如固體脂質(zhì)毫微顆粒)、脂質(zhì)體、微球、微囊、氣溶膠、通過吸入和透皮劑型。
適合腸胃外給藥的劑型包括水溶形式的化合物的水溶液。此外，化合物的懸浮液可作為合適地油性注射懸浮液給藥。適用的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸浮液可以含有提高懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素、山梨糖醇和/或葡聚糖。任選地，水性溶液和/或懸浮液也可以含有穩(wěn)定劑和/或緩沖劑，如硼酸鹽緩沖劑等。
本發(fā)明的藥物制劑是以本身已知的方式制備，例如通過常規(guī)混合、造粒、糖衣制造、溶解或冷凍干燥法的方式。所以，口服用的藥物制劑可以通過將活性化合物與固體賦形劑混合制得，任選地研磨所得混合物，并且加工為顆?；旌衔铮撕笕绻枰虮匾杉尤脒m當輔料，獲得片劑或糖衣片芯。
適用的賦形劑例如是填充劑，如糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素制劑和/或磷酸鈣，如磷酸三鈣或磷酸氫鈣；以及粘合劑，如淀粉糊，使用諸如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、土豆淀粉、明膠、tagaranth、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果希望，可以加入崩解劑，如上述淀粉和羧甲基淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，如藻酸鈉鹽。首先，輔料是流動調(diào)節(jié)劑和潤滑劑，如二氧化硅，滑石，硬脂酸或其鹽(如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣)，和/或聚乙二醇。糖衣片芯帶有適當?shù)陌拢绻Ｍ赡褪芪敢?。為了這個目的，可以采用濃縮糖溶液，該溶液可以任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦、紫膠漆溶液和適當?shù)挠袡C溶劑或溶劑混合物。為了制備耐胃液包衣，可采用適當纖維素制劑如鄰苯二甲酸乙酰基纖維素或鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素的溶液。包衣也可以為本發(fā)明的脂化偶聯(lián)物提供保護，使其不過早暴露在足以水解活性藥物、肽或蛋白質(zhì)與載體之間形成的酰胺鍵的酸性環(huán)境下。參見美國專利號4786505和4853230中保護片芯避免胃酸的劑型單位的制備方法。優(yōu)選片劑是中性或堿性。堿性片芯含有一種或多種堿性反應(yīng)化合物，如美國專利號4786505和4853230中公開的那些。染料或顏料可以加入在片劑或糖衣包衣中，例如用于鑒別出活性化合物給藥的特定聯(lián)合。
其它可應(yīng)用的藥物制劑包括但不限于由明膠制成的口服推入配合型膠囊，直腸栓劑，口腔和/或經(jīng)鼻給藥的吸入制劑，任選地與可藥用載體、滲透促進劑、賦形劑和/或填充劑混合的鼻用或直腸用霜劑或軟膏。適用的滲透促進劑包括陽離子、陰離子、兩性和中性滲透促進劑，如苯扎氯銨、氯代丁醇、氮卓酮和所屬領(lǐng)域其它已知促透劑。
在合成路線1和2中舉例說明通式II的化合物例的合成方法。一般地，令溴甲基馬來酸酐衍生物或其馬來酸鹽與帶有親脂性基團的醇或硫醇反應(yīng)，形成通式III的醚或硫醚。帶有親脂性基團的醇或硫醇任選地含有與氧或硫原子橋連的橋連天然或非天然氨基酸部分以及鍵合親脂性基團的羰基。橋連天然或非天然氨基酸部分可以與氧或硫原子或鍵合親脂性基團的羰基在氨基酸的氨基末端、羧基末端或側(cè)鏈處相連。參見合成路線I，Pal-半胱氨酸實際上包括鍵合于氨基末端的羰基并且經(jīng)側(cè)鏈與硫原子鍵合的甘氨酸橋。在合成路線2中十六烷硫醇的應(yīng)用表示無需橋連天然或非天然氨基酸即可形成式III的化合物。通式III的產(chǎn)品隨后處于脫水條件下以重新形成馬來酸酐，目前的該酸酐經(jīng)過醚或硫醚鍵被親脂性基團取代，得到通式II的化合物。那些所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解多種其它合成路線能夠獲得所需化合物。
合成路線1-試劑A的合成
合成路線2-試劑B的合物
合成路線3-5列出本發(fā)明的示例性pH敏感脂化偶聯(lián)物實例的合成。一般地，令含胺、氨基酸、肽或蛋白質(zhì)的藥物與式II的化合物反應(yīng)形成式I的酰胺。酰胺鍵在堿性條件下、優(yōu)選在緩沖水性溶液中形成。在較低pH下(包括體內(nèi)常見pH)，酰胺鍵水解釋放出游離胺和式III的化合物。可逆酰胺鍵的形成為親水性胺與脂化試劑在一定pH下的偶聯(lián)和在較低pH下胺由脂化試劑的釋放提供了一種機制。
合成路線3-酪胺的脂化(REAL-酪胺)
合成路線4-精氨酸后葉加壓素的脂化(REAL-AVP)
合成路線5-胰島素的脂化(REAL-胰島素)
實施例實施例1. 3-S-(N-棕櫚酰基-半胱氨?；?甲基，2-甲基馬來酸酐，試劑A的合成(合成路線1)N-棕櫚酰基-半胱氨酸(Pal-CPD)的吡啶二硫化物衍生物通過已知方法獲得。Pal-CPD是按照Ekrami等人FEBS Letters 371283-286(1995)所述方法合成。Pal-CPD(0.7g，0.0015mol)溶解在10mlNaOH(pH11)中。二硫蘇糖醇(DTT)(0.9g，0.006mol)溶解在5ml水中。在連續(xù)攪拌和室溫條件下將Pal-CPD溶液滴加到DTT溶液中。2小時后，終止該反應(yīng)。用0.01N HCl將混合物的pH調(diào)至3，期間出現(xiàn)白色沉淀(Pal-半胱氨酸)。沉淀用稀鹽酸洗滌5次除去過量的DTT。
通過將一當量的溴化物原子團加入到2，3-二甲基馬來酸酐(DMMA)中獲得起始原料3-溴甲基，2-甲基馬來酸酐(Br-DMMA)。由此，在40ml氯仿中將DMMA(1.5g，0.012mol)、NBS(2.3g，0.013mol)、苯甲酰過氧化物(0.3g，0.0012mol)和氧化鎂(0.02g，0.0005mol)在回流下加熱4小時。過濾該混合物并且在減壓下蒸發(fā)氯仿。向褐色殘余物中加入40ml四氯化碳并且過濾。收集濾液并且減壓下除去溶劑。獲得帶有淺綠色的澄清油，其在4℃下儲藏時固化。
參見合成路線1，Br-DMMA與Pal-半胱氨酸反應(yīng)得到式III的Pal-半胱氨酸硫醚，其中R1是氫，R2是甲基，R3是棕櫚基(C15H31)，X是硫，Y是甘氨酸殘基(-NHCH(CO2H)-)，n＝1和m＝1。該反應(yīng)通過室溫下直接將Br-DMMA(0.3g，0.0014mol)加入到Pal-半胱氨酸在30ml稀HCl中的懸浮液內(nèi)。用1N NaOH逐步地將該混合物的pH調(diào)節(jié)至7、9，最終為1l。該混合物的pH在2小時后穩(wěn)定在pH11。25℃下攪拌16小時后，過濾該混合物并且用1N HCl酸化濾液。出現(xiàn)白色沉淀，用乙醚提取該沉淀。減壓下蒸發(fā)乙醚。殘余的綠色油在高真空下干燥。獲得3-S-(N-棕櫚?；腚装滨；?甲基，2-甲基馬來酸(420mg，0.84mmol)，熔點為60-63℃。摩爾收率為56％。
將3-S-(N-棕櫚酰基半胱氨?；?甲基，2-甲基馬來酸(420mg，0.84mmol)溶解在5ml無水THF中。將N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(692mg，3.36mmol)溶解在1ml無水THF中，在冰浴中加入上述溶液中。在冰浴中將該反應(yīng)攪拌5小時，隨后過濾。收集濾液，減壓下除去THF。將濾液加入30ml的冷卻無水己烷中，在4℃下保存16小時。所得沉淀用冷卻無水己烷洗滌并且施加高真空除去溶劑。獲得淺褐色產(chǎn)物(試劑A)，熔點為46-49℃。摩爾收率為54％。
實施例2 3S-(十六烷基)甲基2-甲基馬來酸酐，試劑B的合成(合成路線2)參見合成路線2，Br-DMMA與十六烷硫醇反應(yīng)得到式III的硫醚，其中R2是甲基，R3是十六烷(C16H33)，n＝0和m＝0。在脫水條件下，得到式II的酸酐試劑B，其中R2、R3、n和m如上所述。
所以，如合成路線2所列，Br-DMMA(0.5g，0.0025mmol)在pH8的10ml水中水解，并且將0.63g十六烷硫醇(0.0025mol)溶解在50mlTHF中。三乙胺(1ml)加入該混合物中并且室溫下攪拌16小時。過濾該反應(yīng)混合物。濾液在減壓下蒸發(fā)。所得殘余物溶解在稀NaOH溶液(pH11)中并且用乙醚洗滌(3×20ml)。用1N HCl將濾液調(diào)至pH2，出現(xiàn)白色沉淀。將沉淀提取到乙醚中并且在減壓下除去乙醚。高真空下干燥終產(chǎn)物3-(十六烷硫基)甲基2-甲基馬來酸。
利用與上述試劑A相同的方法使3-(十六烷硫基)甲基2-甲基馬來酸脫水。將試劑B溶解在熱的DMF中并且4℃下保持16小時。出現(xiàn)白色沉淀，用冷DMF洗滌。高真空下除去溶劑。得到白色粉末(73mg)，摩爾收率16％。實施例3.利用試劑A制備的可逆脂化酪胺(REAL-酪胺)(合成路線3)將試劑A(2mg，0.00426mmol)溶解在60μl無水DMF中并且在冰浴中加入0.2mg(0.00146mmol)存在于200μl硼酸鹽緩沖液USP(pH10，0.1M)中的酪胺。該反應(yīng)在冰浴中進行4小時，并且在4℃下進行16小時。
實施例4.REAL-酪胺的pH敏感性的測定通過監(jiān)測游離酪胺的濃度可測定酰胺鍵形成的pH依賴性。制備pH為6、7和8的1M磷酸鹽緩沖液。用這些緩沖液將REAL-酪胺1∶2稀釋。酪胺的儲備液也稀釋為具有相同的REAL-酪胺濃度并且用作對照。樣本在37℃下溫育。在不同的時間點用熒光胺反應(yīng)測定由REAL-酪胺釋放出的游離酪胺的熒光。
酪胺脂化之后，游離酪胺的濃度最多減小到起始濃度的15％。在低pH下溫育REAL-酪胺導(dǎo)致游離酪胺濃度的增高，表明酰胺鍵斷裂。酰胺鍵水解的速率取決于pH(pH6＞pH7＞pH8)。在pH6下溫育REAL-酪胺1小時后，酰胺鍵幾乎全部水解，然而，在pH7下約為45％，并且在pH8下僅7％的REAL-酪胺的酰胺鍵水解(圖1)。實施例5.利用試劑A制備的可逆脂化AVP(REAL-AVP)(合成路線4)將精氨酸后葉加壓素(AVP)(0.5mg)溶解在1ml硼酸鹽緩沖液(pH10，0.1m)中。一等份的0.5ml(0.25mg，0.207μmol)該溶液在冰浴中與1mg(2.1μmol)溶解在50μl無水二甲基甲酰胺(DMF)中的試劑A反應(yīng)。該混合物在4℃下攪拌16小時。REAL-AVP的終濃度為0.455mg/ml。實施例6.REAL-AVP在后葉加壓素缺乏Brattleboro大鼠中的體內(nèi)作用將REAL-AVP皮下注射給動物(5μg/kg)，并且在不同時間點收集尿。圖2顯示在注射后的前8小時中尿的累計體積。AVP和Pal-AVP具有類似的作用，使尿排泄延遲4小時。REAL-AVP注射后觀察到更長延遲尿排泄，長達6小時。AVP用棕櫚酸直接酯化，Pal-AVP無法如同REAL-AVP般有效。尿排泄量在注射Pal-AVP和AVP后恢復(fù)到起始24小時。然而，REAL-AVP的作用持續(xù)3天(圖3)。
可以推斷，AVP的pH敏感性脂化延長了AVP的生物活性。
實施例7.利用試劑A制備的可逆脂化的胰島素(REAL-胰島素)(合成路線5)
將胰島素(2mg)溶解在2ml硼酸鹽緩沖液(pH10，0.1m)。將試劑A(1mg，2.1μmol)溶解在100μlDMF中并且與1ml(1mg，約0.14μmol)胰島素溶液在冰浴中反應(yīng)。該反應(yīng)混合物在4℃下攪拌24小時，隨后4℃下對500ml硼酸鹽緩沖液(pH10，0.01M)透析24小時。用硼酸鹽緩沖液(pH10，0.1M)調(diào)節(jié)透析的REAL-胰島素的體積至2ml，得到REAL-胰島素的濃度為0.5mg/ml。胰島素母液的體積(1ml)也調(diào)節(jié)至2ml，得到濃度0.5mg/ml。
實施例8.REAL-胰島素在高血糖大鼠中的作用用靜脈內(nèi)注射60mg/kg鏈脲霉素在Sprague Dawley大鼠中引起糖尿病。在硼酸鹽緩沖液(pH10，0.1M)中制備0.5單位/ml胰島素或REAL-胰島素的溶液。試驗之前大鼠禁食16小時并且皮下注射0.5單位/kg的胰島素或REAL-胰島素。在9小時內(nèi)的不同時間點監(jiān)測大鼠的血糖水平。此時給大鼠進食并且在進食15小時后測量血糖水平。再次使大鼠禁食并且在16小時后測定血糖水平。
引發(fā)糖尿病后大鼠在1周內(nèi)的血糖水平由平均100mg/dl升高至420mg/dl(非禁食大鼠)。在胰島素治療大鼠中，在第一個小時內(nèi)觀察到血糖水平明顯降低。然而，在REAL-胰島素治療大鼠中，在第一個小時內(nèi)血糖水平?jīng)]有改變，并且在注射后第2小時觀察到血糖明顯降低(圖4)。這可能歸因于REAL-胰島素水解和釋放游離胰島素需要時間。注射胰島素后，禁食大鼠血糖水平在24小時內(nèi)恢復(fù)至起始水平。然而，在用REAL-胰島素治療大鼠的情況中，藥物對禁食血糖水平的影響持續(xù)3天(圖5)。禁食糖尿病大鼠也通過口服方式給予10U/kg的胰島素、REAL-胰島素和安慰劑?？诜o藥之前大鼠禁食16小時。用水/油微乳液作為藥物載體。圖6顯示在口服給予胰島素或安慰劑后觀察到血糖水平?jīng)]有顯著降低。然而，在用REAL-胰島素處理的大鼠中，觀察到在9小時中血糖水平降低28％。
可以推斷，利用REAL-胰島素，胰島素的生物作用可以得到延長。利用適當制劑，REAL-胰島素可以口服給藥來降低血液葡萄糖水平。
現(xiàn)已全面描述了本發(fā)明，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，利用許多且等效的條件、制劑和其他參數(shù)同樣可以實施而不影響本發(fā)明的范圍或其任何實施方式。在此引用的所有專利和文獻在此全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.通式I的化合物 其中R2選自氫、低級烷基或芳基，其中所述低級烷基或芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷酰基、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、低級烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；R4和R5中的一個是生物活性的含氨基物質(zhì)，選自含胺藥物、天然或非天然氨基酸、肽和蛋白質(zhì)，并且R4和R5中的另外一個是OR6，其中R6是氫、堿金屬或負電荷；X是氧或硫；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
2.按照權(quán)利要求1的化合物，其中R2是甲基，X是硫。
3.按照權(quán)利要求1的化合物，其中n＝0，m＝0，R3是直鏈或支鏈的具有4-26個碳原子的烴。
4.按照權(quán)利要求3的化合物，其中所述直鏈或支鏈烴含有5-19個碳原子。
5.按照權(quán)利要求4的化合物，其中所述直鏈或支鏈烴與羰基一起選自棕櫚?；?、油酰基、硬脂?；⒃鹿瘐；?、肉豆蔻?；?、膽?；兔撗跄戸；?。
6.按照權(quán)利要求1的化合物，其中所述天然或非天然氨基酸是天然氨基酸。
7.按照權(quán)利要求1的化合物，其中所述含胺藥物是酪胺。
8.按照權(quán)利要求1的化合物，其中所述肽選自精氨酸后葉加壓素和胰島素。
9.通式II的化合物 其中R2是氫、低級烷基或芳基，其中所述低級烷基或芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷?；⑾趸?、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、低級烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
10.按照權(quán)利要求9的化合物，其中R2是甲基，X是硫。
11.按照權(quán)利要求9的化合物，其中n＝0，m＝0和R3是直鏈或支鏈的具有4-26個碳原子的烴。
12.按照權(quán)利要求11的化合物，其中所述直鏈或支鏈烴含有5-19個碳原子。
13.按照權(quán)利要求11的化合物，其中所述直鏈或支鏈烴與相鄰羰基一起選自棕櫚?；?、油?；⒂仓；?、月桂?；⒛戸；兔撗跄戸；?。
14.按照權(quán)利要求9的化合物，其中所述天然或非天然氨基酸是天然氨基酸。
15.通式III的化合物或其可藥用鹽 其中R2選自氫、低級烷基或芳基，其中所述低級烷基或芳基任選地被一個或多個烷氧基、烷酰基、硝基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、酰氧基、低級烷基或鹵素原子取代；R3是親脂性基團；X是O或S；Y是橋連天然或非天然氨基酸；n是0或1；和m是0-10的整數(shù)。
16.按照權(quán)利要求15的化合物，其中R2是甲基，X是硫。
17.按照權(quán)利要求15的化合物，其中n＝0，m＝0，R3是直鏈或支鏈的具有4-26個碳原子的烴。
18.按照權(quán)利要求17的化合物，其中所述直鏈或支鏈烴含有5-19個碳原子。
19.按照權(quán)利要求18的化合物，其中所述直鏈或支鏈烴與相鄰羰基一起選自棕櫚?；⒂王；?、硬脂?；⒃鹿瘐；?、膽?；兔撗跄戸；?。
20.按照權(quán)利要求15的化合物，其中所述天然或非天然氨基酸是天然氨基酸。
21.一種提高含胺物質(zhì)的細胞吸收的方法，所述含胺物質(zhì)選自含胺藥物、肽和蛋白質(zhì)，該方法包括給所述細胞施用權(quán)利要求1的化合物。
22.一種延長生物活性的含胺化合物在哺乳動物血液和組織中保留的方法，所述含胺化合物選自含胺藥物、肽和蛋白質(zhì)，該方法包括給所述哺乳動物施用權(quán)利要求1的化合物。
23.一種形成權(quán)利要求1的化合物的方法，包括將選自含胺藥物、肽和蛋白質(zhì)的生物活性的含氨基物質(zhì)與權(quán)利要求9的化合物在一定條件下反應(yīng)，由此得到權(quán)利要求1的化合物。
24.一種使生物活性的含氨基物質(zhì)遞送到細胞內(nèi)部的方法，包括令該細胞暴露在權(quán)利要求1的化合物下，由此所述化合物被該細胞吸收，并且在該細胞中暴露于足夠低的pH下以水解酰胺鍵，并且釋放出該生物活性的含氨基物質(zhì)。
25.一種藥物組合物，該組合物含有(a)有效量的權(quán)利要求1的化合物；和(b)可藥用載體。
26.按照權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述組合物包括腸溶包衣，該包衣保護所述化合物不發(fā)生酰胺鍵水解，由此防止該生物活性的含氨基物質(zhì)釋放直至該包衣被除去或溶解。
全文摘要
本發(fā)明提供脂化偶聯(lián)物,其含有含氨基的生物活性物質(zhì)和能夠透過生物膜的親脂性基團。在中性和溫和酸性條件下(包括那些見于體內(nèi)的),通過酰胺鍵的水解從所述偶聯(lián)物釋放出游離的含氨基生物活性物質(zhì)。本發(fā)明還涉及制備脂化試劑和脂化偶聯(lián)物、含脂化偶聯(lián)物的藥物組合物的方法以及提高含氨基物質(zhì)遞送到細胞內(nèi)的方法。優(yōu)選的含氨基物質(zhì)包括肽、蛋白質(zhì)及其衍生物。
文檔編號A61P9/00GK1350519SQ99814244
公開日2002年5月22日 申請日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月10日
發(fā)明者W－C·沈, H·海蒂 申請人:南加利福尼亞大學