專利名稱：組織的固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般性地涉及組織的固定，具體涉及一種環(huán)氧化物及用于組織固定的方法。
2.先有技術(shù)描述自體固有的心包和同源性的主動(dòng)脈瓣膜等生物學(xué)組織，由于其具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，已經(jīng)被用于各種外科手術(shù)。生物學(xué)組織衍生的、以化學(xué)方法修飾的異源性組織已被用作外周或冠狀血管的再造導(dǎo)管、修補(bǔ)物、韌帶代替物和修復(fù)的心臟瓣膜。為人熟知的是以膠原纖維構(gòu)造生物學(xué)組織的基本結(jié)構(gòu)骨架。
膠原基質(zhì)的生理化學(xué)性能和生物力學(xué)性能與膠原原纖維的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，膠原分子通過(guò)共價(jià)的分子間交叉聯(lián)接，穩(wěn)定在原纖維中，這種交叉聯(lián)接形成了具有足夠強(qiáng)度的張力和生物穩(wěn)定性的原纖維。
在異源性組織被植入生存主體環(huán)境的修復(fù)手術(shù)后，生物學(xué)組織會(huì)受到主體應(yīng)答，包括細(xì)胞的和酶的攻擊。先前的研究表明，植入的異源性膠原組織會(huì)刺激細(xì)胞的應(yīng)答，導(dǎo)致植入假體受到晶狀體細(xì)胞(phacocytes)(多形核白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的物理侵害，已知巨噬細(xì)胞能夠分泌膠原酶和其他的蛋白酶和氧自由基。異源性生物學(xué)組織很容易被這些蛋白水解酶，和/或通過(guò)氧化作用而降解，明顯減少膠原原纖維的強(qiáng)度和壽命。為了達(dá)到長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，異源性組織衍生的生物假體(bioprostheses)在植入人體進(jìn)行長(zhǎng)期使用之前，必須經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，以增強(qiáng)它們對(duì)酶降解作用的抵抗力。這些化學(xué)修飾包括(1)通過(guò)交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定膠原基質(zhì)，例如增強(qiáng)膠原原纖維、彈性硬蛋白和其它蛋白質(zhì)之間的分子交互作用，提高應(yīng)激狀態(tài)下的組織耐疲勞極限，和維護(hù)組織的整體性和防止炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；(2)將膠原組織改性，使其免疫原性減至最小異源性組織需要進(jìn)行改性，以減小免疫原性，這樣全身性的和局部的負(fù)面效應(yīng)(如慢性炎癥或排斥作用)會(huì)減至最小；(3)使酶攻擊作用最小化的改性處理以化學(xué)方法修飾的組織可以減少被蛋白水解酶識(shí)別的可能性；并且優(yōu)選交聯(lián)和修飾是穩(wěn)定性的，以期達(dá)到長(zhǎng)期的最佳效果。
纖維性膠原的酶催化裂解程度受兩個(gè)因素的影響可識(shí)別裂解部位對(duì)酶的可利用性，和膠原的螺旋狀完整性程度。先期的研究工作提出，受到固定的具有較大交聯(lián)度的組織，其抗降解性越大。
固定意味著通過(guò)與化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，膠原的氨基酸失活，使得異源性生物材料的抗原性以及被膠原酶和其它酶降解的可能性減至最小。
固定處理可以分為兩種類型，第一個(gè)類型是交聯(lián)，其中，具有多功能基的固定劑分子與兩個(gè)或多個(gè)膠原基團(tuán)反應(yīng)，交聯(lián)后，組織的機(jī)械性能發(fā)生變化。第二類型的固定處理可稱為支化，其中，固定劑僅僅與一個(gè)基團(tuán)反應(yīng)，得到一個(gè)由起反應(yīng)的氨基酸生成的分支。通過(guò)支化作用，組織的機(jī)械性能(如柔韌性)通常幾乎不會(huì)發(fā)生改變。
如果被修飾的氨基酸足夠多，以及如果接枝結(jié)構(gòu)(即，支化)足夠大以至改變局部的分子構(gòu)象(即，序列和構(gòu)象抗原決定部位/表位)，那么交聯(lián)和支化都會(huì)改變膠原組織的抗原性。一般情況下，生物固定材料(組織)的固定程度越高，所導(dǎo)致的抗原性越低。
由于宿主細(xì)胞的活性和酶的活性是與炎癥高度相關(guān)的，并且殘留固定劑的毒性會(huì)引起局部的慢性炎癥，因此人們希望假體的殘留毒性最小。
接觸血液的應(yīng)用性膠原組織，例如用作心臟瓣膜和導(dǎo)管的膠原組織，還應(yīng)當(dāng)具有良好的血液相容性。當(dāng)被用于這方面的用途時(shí)，親水性、電荷性、表面紋理以及與血液接觸表面的其它特性也能夠顯著影響組織的性能和耐用性。根據(jù)表面張力和血液相容性/生物粘合性的關(guān)系，可以觀察到某些傾向。R.R.Baier和V.A.Depalma，在＂移植物表面與血栓形成的關(guān)系(The Relation ofthe Internal Surface of Grafts toThrombosis)＂，動(dòng)脈咬合疾病的治療Management of Arterial OcclusiveDisease)，Year Book Medical Publisher，Chicago，IL，147-163(1971)一文中，基于多年的觀察，以材料的生物反應(yīng)性趨勢(shì)作為它們的相對(duì)臨界表面張力的函數(shù)，積累了大量的數(shù)據(jù)。根據(jù)他們的工作得到的經(jīng)驗(yàn)性圖形被分為三個(gè)區(qū)(1)第一區(qū)，所對(duì)應(yīng)的生物相互作用最小，為“生物相容性理想?yún)^(qū)”，其表面張力范圍是20-30達(dá)因/cm(疏水表面)。該區(qū)是正常動(dòng)脈所最常有的表面張力范圍并且描述的是相對(duì)非凝血酶原的表面。(2)第二區(qū)，其范圍是33-38達(dá)因/cm，并且包括了最常用聚合物的表面張力，出人意料的是，該區(qū)將血管移植最常用的聚合物(即，ePTFE和Dacron)排除在外。(3)第三區(qū)，其范圍是40-72達(dá)因/cm，并且被稱為“良好生物粘合區(qū)”，這一“良好生物粘合區(qū)”適于那些需要良好向內(nèi)生長(zhǎng)的修復(fù)手術(shù)，如整形術(shù)和牙齒植入。
在20-30達(dá)因/cm范圍內(nèi)的臨界表面張力，它對(duì)應(yīng)于甲基(CH3)基團(tuán)占優(yōu)勢(shì)的表面，表示植入樣品固有的血栓形成阻力。生物組織可以用甲醛(FA)或戊二醛(GA)進(jìn)行化學(xué)修飾或固定。在過(guò)去的30年中，異源性和同源性的組織被作為假體進(jìn)行固定和植入。臨床上，GA是最常用的固定劑，GA修飾最多的是賴氨酰ε-氨基，在鄰近結(jié)構(gòu)間形成交叉聯(lián)結(jié)，并且它通過(guò)Schiff堿作用聚合而獲得穩(wěn)定化作用。GA產(chǎn)生的修飾作用足以使假體的抗原性最小化，并且使假體表面具有疏水性和負(fù)電荷性能，有利于良好的血液交互作用。但是，GA顯著改變組織僵硬程度和促進(jìn)組織鈣化的傾向是這種固定劑眾所周知的缺點(diǎn)?；谶@些原因，GA已造成不少修復(fù)術(shù)的失敗。
為了降低GA固定的假體的鈣化趨勢(shì)，業(yè)已作了嘗試。例如Imamura等人的美國(guó)專利US 5,080,670公開(kāi)了許多聚縮水甘油醚(商標(biāo)名為DENACOL，生產(chǎn)商N(yùn)agasi Chemicals，Osaka，Japan)用于心臟瓣膜交聯(lián)組織。Imamura等人認(rèn)為，固定劑骨架中醚鍵(C-O)的存在，會(huì)使氧臂(oxygen arm)在交聯(lián)橋接處成為柔韌的接合點(diǎn)，這樣交聯(lián)組織會(huì)具有柔韌性和疏水性。和GA用于固定心臟瓣膜交聯(lián)組織相比較，用聚縮水甘油醚交聯(lián)的生物組織顯示出大的柔韌性(易彎性)和抗鈣化性能。此外，環(huán)氧化合物比GA溶液的細(xì)胞毒性更小。
不幸的是，親水材料對(duì)水具有附著傾向。另外，在這類親水性表面已經(jīng)觀察到較大的蛋白和細(xì)胞的活化作用。這些作用會(huì)影響或降低生物組織的血液相容性。
Imamura等人所提出的策略的另一個(gè)可能的缺點(diǎn)是，醚鍵非常容易受到氧化作用的影響，并因此在植入體內(nèi)后會(huì)一天天失去交聯(lián)，特別是在應(yīng)激反應(yīng)下。參見(jiàn)M.A.Schubert、M.J.Wiggins、M.P.Schaefer、A.Hiltner和J.M.Anderson，＂雙軸向應(yīng)變聚(醚尿烷脲)彈性體的氧化性生物降機(jī)制(Oxidative Biodegradation Mechanisms of BiaxiallyStrained Poly(etherurethane urea.)Elastomers)＂，J.Biomed.Mater.Res.，Vol.29，337-347(1995)(“Schubert等人”)。
外來(lái)生物組織植入人宿主之后，巨噬細(xì)胞附著在植入物或外來(lái)物表面，變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，并能形成異種巨細(xì)胞。這些噬細(xì)胞釋放過(guò)氧化物陰離子、過(guò)氧化氫、次氯酸鹽和水解酶，這些副產(chǎn)物的局部濃度可能非常高。此外，界面環(huán)境(即，植入物周圍)變?yōu)樗嵝?即低pH)范圍。還會(huì)觀察到，α2-巨球蛋白的吸收作用在生物降解中的重要作用，致使發(fā)生氧化和交聯(lián)的破壞。
可以清楚地觀察到醚鍵的裂解。對(duì)這種裂解可能的解釋，現(xiàn)在可以假設(shè)為這種觀察到的降解作用(即裂解)。對(duì)所移植的疏水性聚醚組織樣品的紅外光譜中出現(xiàn)的新譜帶，可以用類似于Wu等人所提出的一種機(jī)制(含有聚(THF)不穩(wěn)固片斷(soft segment)的聚(醚脲烷)在體內(nèi)的降解機(jī)制)和/或聚醚的自氧化機(jī)制進(jìn)行解釋。Y.Wu、C.Sellitti、J.M.Anderson、A.Hilmer、G.A.Lodoen和C.R.Payet，“聚(醚脲烷)在體內(nèi)降解的FTIR-ATR研究”(An FTIR-ATRInvestigation of In VivoPoly(ether urethane)Degradation)J.Appl.Polym.Sci.，Vol.46，201-211(1992)。Wu報(bào)道了過(guò)氧化物陰離子基團(tuán)與質(zhì)子快速結(jié)合，形成過(guò)氧化氫基HOO°，后者攻擊聚合物骨架，形成氫過(guò)氧化物基團(tuán)POOH。氫過(guò)氧化物隨后脫水形成酯，該酯然后因酯酶而水解，導(dǎo)致鏈的分裂，結(jié)果生成羧酸和醇基團(tuán)。這一點(diǎn)在附

圖1中鏈的左側(cè)得到了闡明。
Schubert等人提出，自由基P°可能是含硫游離基(thiyl radica1)從聚醚的不穩(wěn)固片斷(soft segment)上的奪氫反應(yīng)而形成的，所述含硫游離基是在羥基與(被吸收的)α2-巨球蛋白的游離巰基反應(yīng)后形成的，這一點(diǎn)在附圖1中鏈的右側(cè)得到了闡明。
另一種形式的降解(自氧化)可以通過(guò)各種不同的反應(yīng)途徑發(fā)生，它們均涉及自由基機(jī)制。簡(jiǎn)而言之，這種自氧化鏈反應(yīng)包括聚合物骨架上的氫過(guò)氧化物基團(tuán)的形成和分解。氫過(guò)氧化物的均裂導(dǎo)致形成了羥基和烴氧基自由基(PO°)，后者可以通過(guò)氫裂解而形成酯，或者導(dǎo)致鏈的分裂，結(jié)果形成醛和酯基團(tuán)。這些反應(yīng)的發(fā)生并沒(méi)有損失自由基的活性，剩余的自由基繼續(xù)脫水作用。酯鍵的水解會(huì)導(dǎo)致醇和酸基團(tuán)的形成。
由聚縮水甘油醚形成的交聯(lián)一旦發(fā)生醚鍵的裂解，無(wú)論是單環(huán)氧化物或多環(huán)氧化物，也不管是哪個(gè)類型的聚縮水甘油醚，對(duì)組織的改變都將是相同的。改變部位的結(jié)構(gòu)總是 或 根據(jù)先期的研究觀察，單官能的縮水甘油醚不能夠阻斷酶的識(shí)別和潛在的抗原性。正如從新鮮組織所觀察到的那樣，縮水甘油甲醚(DENACOL EX-131)固定的組織在試管中振蕩，被細(xì)菌膠原酶分解為碎片。參見(jiàn)R.Tu、S.H.Shen、D.Lin、C.Hata、K.Thyagarajan、Y.Noishiki和R.J.Quijano，“用單官能的和多官能的聚環(huán)氧化合物固定生物假體組織(Fixation of Bioprosthetie Tissues With Monofunctional andMultifunctional Polyepoxy Compounds)”，J.Biomed.Mater.Res.，Vol.28，677-684(1994)。此外，由于肽鍵的裂解而導(dǎo)致的游離氨基量的增加，與從新鮮組織中所看到的相當(dāng)。換言之，縮水甘油醚的交聯(lián)作用不是有效的。
上述內(nèi)容有力地表明，縮水甘油醚的醚鍵非常容易受到氧化作用的影響。分裂的鍵無(wú)法阻止膠原酶的識(shí)別，因而?？s水甘油醚不能獲得所期望的效果。因此，仍然需求更好的組織固定方法和處理方法，使得鈣化作用減到最少，同時(shí)避免上述已知方法和處理方法所存在的問(wèn)題。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種具有碳?xì)涔羌艿沫h(huán)氧化合物，它是水溶性的且其骨架中不含有醚鍵和酯鍵。適當(dāng)?shù)沫h(huán)氧化物試劑的例子包括具有下面基本結(jié)構(gòu)式的單或雙環(huán)氧化合物單環(huán)氧化合物 雙環(huán)氧化合物 其中n＝1-10。
附圖2是闡明按照本發(fā)明生產(chǎn)生物假體的方法的程序框圖。
發(fā)明詳述以下的詳細(xì)描述是目前本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些描述不具有限定的意義，而僅僅是用于對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的一般原則性的闡明。附加的權(quán)利要求很好地定義了本發(fā)明的范圍。在某些情況下，對(duì)已知的設(shè)備、組成、組分、機(jī)理和方法省略了不必要的詳述，但并不使本出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“膠原組織”是指來(lái)自于動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物的材料，具體例子包括，但不限于豬心臟瓣膜，牛心包，結(jié)締組織衍生的材料如硬腦膜、腱鞘、韌帶、皮膚、動(dòng)脈、靜脈等等。
本發(fā)明提供了用于膠原材料組織固定的交聯(lián)劑。該交聯(lián)劑為一種具有碳?xì)涔羌艿沫h(huán)氧化合物，它是水溶性的且其骨架上不含有醚鍵和酯鍵。適當(dāng)?shù)沫h(huán)氧化物試劑的例子包括具有下面基本結(jié)構(gòu)式的單或雙環(huán)氧化物單環(huán)氧化合物 雙環(huán)氧化合物 其中n＝1-10。例如，n等于3的單環(huán)氧化合物如下所示 本發(fā)明的單環(huán)氧化物一般用于對(duì)那些柔韌性更為重要的組織進(jìn)行的改性，這些組織的例子包括靜脈瓣膜、食管和輸尿管。本發(fā)明的多環(huán)氧化物(即雙環(huán)氧化合物和具有兩個(gè)或更多個(gè)活性環(huán)氧基團(tuán)的環(huán)氧化物)，一般適于對(duì)那些植入后經(jīng)受明顯應(yīng)力和負(fù)荷的組織進(jìn)行改性，這些組織的例子包括動(dòng)脈系統(tǒng)的心臟瓣膜、韌帶和腱鞘。本發(fā)明的交聯(lián)劑可廣泛用于固定和改性各種不同的生物假體組織，包括牛心包和豬動(dòng)脈瓣膜。制備和處理生物假體組織的方法如附圖2的程序框圖所示，并簡(jiǎn)述如下。
在步驟10，獲取膠原組織并進(jìn)行加工。從哺乳動(dòng)物割取適宜的膠原組織，如動(dòng)脈或靜脈，按照已知方法修剪多余的肌肉、脂肪和結(jié)締組織，按照已知方法對(duì)膠原組織進(jìn)行清洗和制備，血管的內(nèi)外用冷的生理鹽水洗滌，除去所有的余血。
在步驟20，用70％的乙醇浸泡各個(gè)組織約1小時(shí)，以降低生物負(fù)荷水平(bioburden levels)，然后將組織存儲(chǔ)在30％的乙醇中，直到需要時(shí)。
在步驟30，將細(xì)胞成分膨脹，要做到這一點(diǎn)，可以將新鮮的過(guò)濾水注射到各組織脈管的腔內(nèi)，然后將其轉(zhuǎn)移到盛有新鮮過(guò)濾水的容器中，然后，在進(jìn)行超聲處理之前，將過(guò)濾水中的組織保持冷凍至少一個(gè)小時(shí)。
在步驟40，將過(guò)濾水中的組織進(jìn)行超聲處理足夠的時(shí)間，以除去細(xì)胞成分，之所以希望除去細(xì)胞成分，是因?yàn)樗哂休^強(qiáng)的抗原性，然后將組織用水充分洗滌。
在步驟50，實(shí)施固定。在pH 8.5-10.5，將先期準(zhǔn)備好的膠原組織浸入本發(fā)明的水溶性環(huán)氧化物交聯(lián)劑的水溶液中，浸泡一段時(shí)間(例如1-30天)，使之發(fā)生不可逆的交聯(lián)。環(huán)氧化物交聯(lián)劑的濃度優(yōu)選范圍是0.01M-1.0M，更優(yōu)選在0.05M-0.5M之間。固定液每2-3天更換一次。
在步驟60，將膠原組織移出固定液，用適當(dāng)?shù)钠匆哼M(jìn)行漂洗，例如使用含有或不含有氨基酸的磷酸鹽緩沖生理鹽水。該漂洗除去了殘余的固定劑反應(yīng)活性。
在步驟70，進(jìn)行最后的修剪和分支結(jié)扎。在不破壞脈管分支的情況下，將多余的結(jié)締組織小心地修剪掉；有漏洞的組織脈管、撕脫的分支、血污或其它看得到的結(jié)構(gòu)缺損均不采用。所有分支用4-0或5-0 Prolene縫合線進(jìn)行縫合結(jié)扎。
在步驟80，進(jìn)行最后的消毒。將膠原組織用非醛類消毒劑進(jìn)行消毒，如0.1％碘溶液，然后儲(chǔ)存在30％的乙醇溶液中，直到將組織移植。
第一個(gè)實(shí)施例用雙環(huán)氧化物交聯(lián)動(dòng)脈移植物將新鮮的生物假體組織，如牛動(dòng)脈，在水溶性多環(huán)氧化物交聯(lián)劑的水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，更具體講，將0.2M的1，2，7，8-雙環(huán)氧辛烷用含5％乙醇的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖劑緩沖至pH 9.5，在室溫下(例如，25℃)將動(dòng)脈置于該溶液中14天，使之發(fā)生不可逆交聯(lián)，每2-3天更換固定液一次。第二個(gè)實(shí)施例帶有瓣膜的靜脈導(dǎo)管的改性將帶有靜脈瓣膜的靜脈導(dǎo)管，在水溶性多環(huán)氧化物交聯(lián)劑的水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，更具體講，將0.2M的1，2-環(huán)氧辛烷用含10％乙醇的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖劑緩沖至pH9.5，在25℃將靜脈置于該溶液中14天，使之完全改性。
權(quán)利要求
1.一種用于生物假體組織交聯(lián)的試劑，所述試劑含有具碳?xì)涔羌艿沫h(huán)氧基團(tuán)，所述環(huán)氧化合物是水溶性的，且其骨架不含有醚鍵或酯鍵。
2.權(quán)利要求1的試劑，其中的環(huán)氧基團(tuán)是具有下面基本結(jié)構(gòu)式的單環(huán)氧化物 其中n＝1-10。
3.權(quán)利要求1的試劑，其中的環(huán)氧基團(tuán)是具有下面基本結(jié)構(gòu)式的多環(huán)氧化物 其中n＝1-10。
4.權(quán)利要求1的試劑，其中的環(huán)氧基團(tuán)是1，2，7，8-雙環(huán)氧辛烷。
5.權(quán)利要求1的試劑，其中的環(huán)氧基團(tuán)是1，2-環(huán)氧辛烷。
6.一種用于生物假體組織交聯(lián)的試劑，所述試劑含有具有下面基本結(jié)構(gòu)式的水溶性的環(huán)氧化合物 其中n＝1-10。
7.權(quán)利要求6的試劑，其中的環(huán)氧化合物是1，2，7，8-雙環(huán)氧辛烷。
8.權(quán)利要求6的試劑，其中的環(huán)氧化合物是1，2-環(huán)氧辛烷。
9.含有交聯(lián)的具碳?xì)涔羌艿沫h(huán)氧化合物的生物假體組織，所述環(huán)氧化合物是水溶性的，且其骨架不含有醚鍵或酯鍵。
10.權(quán)利要求9的生物假體組織，其中的環(huán)氧化合物是具有下面基本結(jié)構(gòu)式的單環(huán)氧化物 其中n＝1-10。
11.權(quán)利要求9的生物假體組織，其中的環(huán)氧化合物是具有下面基本結(jié)構(gòu)式的多環(huán)氧化物 其中n＝1-10。
12.權(quán)利要求9的生物假體組織，其中的環(huán)氧化合物是1，2，7，8-雙環(huán)氧辛烷。
13.權(quán)利要求9的生物假體組織，其中的環(huán)氧化合物是1，2-環(huán)氧辛烷。
14.權(quán)利要求9的生物假體組織，其中的生物假體組織選自豬主動(dòng)脈瓣膜、牛心包、硬腦膜、腱鞘、韌帶、皮膚、動(dòng)脈和靜脈。
15.一種交聯(lián)生物假體組織的方法，包括a.制備具有碳?xì)涔羌艿沫h(huán)氧化合物的溶液，所述環(huán)氧化合物是水溶性的，且其骨架不含有醚鍵或酯鍵；和b.將生物假體組織浸入所述溶液。
16.權(quán)利要求15的方法，其中將生物假體組織在所述溶液中浸泡1-30天。
17.權(quán)利要求16的方法，其中溶液中環(huán)氧化合物的濃度范圍是0.01M-1.0M。
18.權(quán)利要求17的方法，其中溶液中環(huán)氧化合物的濃度范圍是0.05M-0.5M。
19.權(quán)利要求15的方法，其中將生物假體組織在25℃浸泡于所述溶液中。
全文摘要
本發(fā)明提供了環(huán)氧化物,它具有碳?xì)涔羌?溶于水且其骨架中不含有醚或酯鍵。環(huán)氧化合物適當(dāng)?shù)睦影▎苇h(huán)氧化合物或雙環(huán)氧化合物,具有各自的基本結(jié)構(gòu)式:單環(huán)氧化合物:(a);雙環(huán)氧化合物:(b);其中n=1至10。
文檔編號(hào)A61L27/36GK1330528SQ99814433
公開(kāi)日2002年1月9日 申請(qǐng)日期1999年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月15日
發(fā)明者楊軍 申請(qǐng)人:Av康復(fù)股份有限公司