專利名稱：抗腹瀉的口服疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腹瀉口服疫苗。更淮確地說，是涉及一種抑制引起人腹瀉的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的口服疫苗組合物。
背景細菌和病毒通常在其膜上或膜內(nèi)表達，特定環(huán)境中的蛋白質(zhì)起到載體的作用，使生物體以特定方式聯(lián)系或依附表面。這種表面可以是人或動物體的胃腸道的內(nèi)壁、食道、或任何其它生物表面或者膜，生物體在這些地方可找到最適宜的生長環(huán)境。通常稱這種微生物膜蛋白為移生因子抗原(CFA)或菌毛。文獻中，這種物質(zhì)也用其它詞例如傘毛蛋白、血凝素蛋白、絲狀蛋白或纖維蛋白表示。為方便起見，本文中用的“CFA”包括所有這類也可具有抗原特性的膜蛋白。對于大多數(shù)生物體，其CFA的產(chǎn)生受到環(huán)境中的各種因素控制，而它們也可以激活質(zhì)粒DNA中的調(diào)節(jié)基因。
許多與醫(yī)學有關(guān)的細菌已被證實可產(chǎn)生與其膜相關(guān)的CFA。在這些細菌中，對于人來說最重要的是定居在人的胃腸道和呼吸道的生物體。定居在胃腸道的生物體例如有腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、霍亂弧菌、彎曲菌屬、幽門螺旋菌、志賀菌屬、沙門菌屬和耶爾森菌屬。
其中醫(yī)學上特別有用的是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)，因為它是旅行者腹瀉和發(fā)展中國家兒童腹瀉的一個主要誘因，每年多于十億人出現(xiàn)腹瀉且至少有一百萬人死亡，主要是兒童。
腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的特性是可產(chǎn)生熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)和/或熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)。
在WO 92/14487中，公開了口服ETEC疫苗的制備方法和用途。帶有CFA的ETEC細菌及其亞成分(CS-抗原)在特定條件下生長。然后可將隨后被福爾馬林殺死的細菌作為一種抑制ETEC細菌的口服疫苗。因此CFA和CS抗原在腸道發(fā)生的免疫過程中起到抗原的作用。
要有規(guī)模地生產(chǎn)帶有CFA的ETEC細菌目前還存在困難，此問題在國際專利申請WO 95/33825中公開了一種解決方案。
ETEC疫苗的制劑包含B亞基霍亂毒素，它在抗原上與ETEC的熱不穩(wěn)定性腸毒素相似，還包含ETEC的移生因子抗原，已經(jīng)證實這種疫苗制劑可刺激瑞典志愿者的相關(guān)粘膜的免疫應答(Jerborn M.，等，《疫苗》1997；16255-260)。
為了產(chǎn)品安全且有效，疫苗組合物必須是非感染性的、且含有確定量的每批都相同的活性成分。
發(fā)明的說明本發(fā)明提供了一種新的疫苗組合物，它基于陰性LT致死腸產(chǎn)毒性大腸桿菌，含有確定量的至少三種不同類型的移生因子抗原，和在抗原上與ETEC的熱不穩(wěn)定性腸毒素相似的B亞基霍亂毒素(CTB)。而且，該疫苗組合物是從可能存在的熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)中純化的。
LT陰性的ETEC細菌可以在實驗室從天然基因修飾菌株中選擇或通過重組技術(shù)制備。
可能存在的熱穩(wěn)定性腸毒素是19個氨基酸殘基的一種較小的蛋白質(zhì)，在疫苗組合物的下游處理過程中被中洗掉了。
消除細菌產(chǎn)生熱不穩(wěn)定性腸毒素的可能性和去除可能存在的熱穩(wěn)定性腸毒素可使產(chǎn)品安全。
殺死細菌應該以基本上保留移生因子抗原的方法進行，例如用溫和的福爾馬林失活的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種抗引起人腹瀉的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的口服疫苗組合物，它含有確定量的至少三種不同類型的移生因子抗原(CFAs)，該抗原選自CFA I、CFA II(CS1、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)，與確定量的B亞基霍亂毒素(CTB)一起存在于缺乏編碼熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT-)基因的死大腸桿菌中，還含有一種載體，該疫苗組合物是從可能存在的熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)中純化的。
在本發(fā)明口服疫苗的一個實施方式中，確定量的不同類型的CFA是指每一類型至少100μg，確定量的CTB是至少0.5mg，載體為生理學上可接受的緩沖溶液。
在一個優(yōu)選實施方式中，確定量的不同類型CFA是指每一類型CFA為100-300μg，CTB的確定量為0.5-2.0mg。
在本發(fā)明的最優(yōu)選的實施方式中，確定量的不同類型CFA是指200μg CFA/I、200μg CS1、150μg CS2、200μg CS4和CS5 150μg CS5，以及CTB為1.0mg，生理學上可接受的緩中溶液是磷酸緩中鹽水溶液。
本發(fā)明疫苗組合物的劑量包含約1011細菌。
該疫苗組合物以溶解在一杯水中的口服形式對人給藥，水中含有碳酸鹽緩沖劑，例如碳酸氫鈉。實驗不同移生因子抗原用量的確定通過抑制ELISA檢測大腸桿菌菌毛抗原，該方法基本上如Lopez-Vidal Y.，等的《臨床微生物學雜志》vol 26，1967-1972(1988)所述。簡言之，將所要分析的細菌樣品與固定量的直接抗CFA的單克隆抗體一起培養(yǎng)。培養(yǎng)后，將混合物轉(zhuǎn)移至預先鋪有CFA的平板上，其中剩余的單克隆抗體可與CFA結(jié)合。通過加入辣根過氧化物酶綴合抗鼠免疫球蛋白使結(jié)合的抗體顯色。作為底物使用的是檸檬酸鹽緩沖劑中的鄰苯二胺二鹽酸。在與裝有數(shù)據(jù)壓縮軟件的計算機相連的分光光度計中于450nm測定光密度。所觀察到的光密度與樣品中抗體的濃度成反比。疫苗組合物的配制配制的許多口服ETEC疫苗分別是從福爾馬林致死的CFA/I SBL菌株101、CS1 SBL菌株106、CS2 SBL菌株107、CS4 SBL菌株104、CS5SBL菌株105的幾種單價體疫苗、以及純化的rCTB的一種單價體疫苗衍生的。組合物
菌株SBL-104和SBL-105也產(chǎn)生CS6，但其數(shù)量還不確定。菌株SBL-107也產(chǎn)生CS3，但其數(shù)量還不確定。評價本發(fā)明抗旅行者腹瀉的口服ETEC B亞基致死全細胞疫苗的效能和反應原性的試驗研究在雙盲、隨機、安慰劑的對比試驗研究中，對三組澳大利亞旅行者進行了調(diào)查研究。除了ETEC疫苗，還包括口服B亞基全細胞霍亂疫苗，因為以前已證實在孟加拉國(Clemens J.，等，《感染性疾病雜志》1988，158372-377)和去摩洛哥的法國的旅行者(Peltola H.，等Lancet，1991，3381285-89)中對大腸桿菌LT-腹瀉具有明顯的抑制。
總共包括250名志愿者，成人和兒童，它們簽約參加了為期7-23天的熱帶或亞熱帶之旅(非洲、亞洲和拉丁美洲的44個不同國家)。其中12人由于違反協(xié)議而被撤出了，這樣，要治療的人群為238人，每種方案完全滿足要求的人群為187人。在出發(fā)前7-21天期間，不少于7天且不多于30天，給兩種連續(xù)劑量的疫苗或安慰劑。給兩種劑量后，記錄接種疫苗后的癥狀和副作用。對所有在該研究中已注冊的志愿者均備有每天記錄日記、以監(jiān)測旅游者在國外期間所出現(xiàn)的腹瀉，且備有收集腹瀉時的大便樣品的運載介質(zhì)(Portagerm和Cary Blair管)。返回后讓旅游者立即移交他們的旅行日記和運載介質(zhì)管。從第一次和第二次給疫苗或安慰劑前后的73名志愿者中取出用于測試免疫原性的血樣。第一次給藥后，在使用第二次劑量之前，立即收集樣品，返回后抽取第二次給藥后的血樣。
給三組隨機旅行者所用的制劑為ETEC疫苗，包含1mg重組B亞基霍亂毒素和1011福爾馬林致死的、表達最普通的移生因子抗原(CFA)的5種ETEC菌株的ETEC細菌，例如CFA I、CFA II(CSl、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)；B亞基霍亂全細胞疫苗(自1992年在瑞典注冊)，它包含1mg重組B亞基霍亂毒素和1011致死全細胞(Inaba、Ogawa、classical和E1 Tor)；安慰劑含1011致死大腸桿菌K12。將這些制劑懸浮在4ml緩沖液中，疫苗或安慰劑的每一劑量以溶解在150cc碳酸氫鈉溶液中的口服形式給藥。根據(jù)Jerborn M.，等(同上)所述對ETEC細菌和抗CTB IgA ELIST進行分離和表征。
250名志愿者接受了一次疫苗或安慰劑劑量，其中246名還接受了第二次劑量。開始研究前由當?shù)氐膫惱韺W委員會同意該研究方案。隨機分組前得到了志愿者的非正式書面許可。
免疫原性結(jié)果如下共43名志愿者(17％)在給第一次劑量后出現(xiàn)輕度至中度胃腸道或全身癥狀；使用安慰劑13名(16％)，霍亂疫苗組13名(16％)，ETEC疫苗組17名(20％)。給第二次后，20(8％)出現(xiàn)癥狀；使用安慰劑6名(7％)，霍亂疫苗組7名(9％)，ETEC疫苗組7名(8％)。統(tǒng)計學上，這些研究組之間志愿者所出現(xiàn)癥狀的比例沒有差異。
從對疫苗效果的評價中已證實1例ETEC腹瀉出現(xiàn)三次或三次以上液體大便，在預處理的大便中檢測到ETEC，但沒有其它病原體。在每種方案的人群中，安慰劑組中ETEC的發(fā)生率為8％(5例)，霍亂疫苗組10％(6例)，ETEC組2％(1例)。ETEC疫苗的效果對照安慰劑是79％(p＝0.119)，對霍亂疫苗是84％(p＝0.0496)。用一邊Fisher精確(exact)試驗比較幾種ETEC腹瀉率。
每種方案的人群中所有ETEC分離物表達了包含在疫苗中的移生因子。
與安慰劑組相比，未檢測到霍亂疫苗對ETEC具有保護作用，但值得注意的是霍亂疫苗組僅有兩例ETEC病例是由僅產(chǎn)生熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)的細菌引起的，理論上霍亂疫苗(通過其B亞基)對該細菌可產(chǎn)生作用。
因此，由于在這一組中幾乎僅存在陰性LT菌株這一事實，霍亂疫苗被認為不具有任何作用。
盡管出現(xiàn)這些結(jié)果，但必須記住上述大便樣品處理可能是誤差的根源。當使用運載介質(zhì)時，會出現(xiàn)丟失敏感性病原體的危險，而諸如大腸桿菌之類的敏感性較低的細菌一旦存在，則會導致假陽性ETEC腹瀉病例(參見ETEC腹瀉的定義)。因此，可能將ETEC腹瀉的比例估計過高。但是，各研究組中的可能的假陽性病例分布不均是不大可能的。
有關(guān)免疫原性，通過抗CTB IgA ELIST方法在接受ETEC疫苗組(疫苗接種前對疫苗接種后的幾何均數(shù)效價第一次接種后7.8對58.7，第二次接種后7.8對62.6；第二次接種后血清轉(zhuǎn)變率91％)和接受霍亂疫苗組(第一次接種后7.6對54.6，第二次接種后7.6對60.1；血清轉(zhuǎn)變率100％)可見抗B亞基霍亂毒素(CTB)的抗體顯著增加。安慰劑組的抗CTB應答沒有出現(xiàn)任何顯著增加(第一次接種后7.9對8.3，第二次接種后7.9對11.8；血清轉(zhuǎn)變率29％)。
因此，雖然CTB霍亂WC疫苗誘導了抗B亞基的非常好的應答，但沒有觀察到這種疫苗對ETEC腹瀉有明顯影響。這可能主要是由于從這些志愿者分離的大多數(shù)ETEC菌株僅產(chǎn)生ST(12人中有9人)，因此不能被霍亂疫苗抑制。顯然，抗CFT抗體對于抑制特別由僅產(chǎn)生ST的ETEC所引起的腹瀉極為重要。
本發(fā)明的結(jié)果第一次支持了在人體中所作的假設(shè)，即口服ETEC疫苗誘導的抗CFA/CS免疫可抑制由僅產(chǎn)生ST的ETEC所引起的腹瀉。
權(quán)利要求
1.抗引起人腹瀉的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的口服疫苗組合物，它含有確定量的至少三種不同類型的移生因子抗原(CFAs)，該抗原選自CFA I、CFAII(CS1、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)，與確定量的B亞基霍亂毒素(CTB)一起存在于缺乏編碼熱不穩(wěn)定腸毒素(LT-)基因的死大腸桿菌中，還含有一種載體，該疫苗組合物是從可能存在的熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)中純化的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服疫苗，其中該確定量的不同類型的CFA是指每一類型CFA至少100μg，該確定量的CTB為至少0.5mg，載體為生理學上可接受的緩沖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的口服疫苗，其中該確定量的不同類型的CFA是指每一類型CFA為100-300μg，該確定量的CTB為0.5-2.0mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的口服疫苗，其中該確定量的不同類型的CFA是指200μg CFA/I、200μg CS1、150μg CS2、200μg CS4和150μg CS5，以及CTB1.0mg，生理學上可接受的緩沖溶液是磷酸緩沖鹽水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腸產(chǎn)毒性大腸桿菌引起的人腹瀉的口服疫苗組合物。它含有確定量的至少三種不同類型的移生因子抗原(CFAs),例如每一類型100－300μg,該抗原選自CFAⅠ、CFAⅡ(CS1、CS2和CS3)和CFAⅣ(CS4、CS5和CS6),與確定量的B亞基霍亂毒素(CTB),例如0.5－2.0mg,一起存在于缺乏編碼熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT
文檔編號A61K39/108GK1330552SQ9981455
公開日2002年1月9日 申請日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月18日
發(fā)明者尼爾斯·卡林, 珀·阿斯克洛夫, 烏爾夫·比埃爾 申請人:Sbl瓦辛公司