專(zhuān)利名稱(chēng)：鈀取代的細(xì)菌葉綠素衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈀取代的細(xì)菌葉綠素衍生物、其制備方法和中間體、和包含所述鈀取代的細(xì)菌葉綠素衍生物的藥用組合物、及其在體內(nèi)光動(dòng)力療法和診斷領(lǐng)域以及在體外光動(dòng)力殺傷病毒和微生物領(lǐng)域的應(yīng)用。定義和縮寫(xiě)B(tài)Chl＝細(xì)菌葉綠素a(含Mg的7，8，17，18-四氫卟啉，具有一個(gè)植基或香葉基香葉基位于位置173、一個(gè)COOCH3基團(tuán)位于位置132、一個(gè)H原子位于位置132、一個(gè)乙?；挥谖恢?和一個(gè)乙基位于位置8)。
BChlide＝細(xì)菌脫植基葉綠素a(衍生自BChla的C-172游離羧酸)。
BPhe＝細(xì)菌脫鎂葉綠素a(其中中心Mg原子被2個(gè)H原子取代的BChl)。
BPheid＝細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸a(衍生自Bphe的C-172游離羧酸)。
Pd-BPheid＝Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸a(衍生自Bphe的C-172游離羧酸，具有一個(gè)中心Pd原子、一個(gè)COOCH3基團(tuán)位于位置132、一個(gè)H原子位于位置132、一個(gè)乙?；挥谖恢?和一個(gè)乙基位于位置8)。
在本說(shuō)明書(shū)中，全文用所述細(xì)菌葉綠素衍生物的IUPAC編號(hào)。采用該命名法，雖然所述天然細(xì)菌葉綠素在位置132和172攜帶二個(gè)羧酸酯，但是它們?cè)谖恢?33和173被酯化。
背景技術(shù)：
人們對(duì)利用光敏劑治療癌癥興趣目益增加。根據(jù)被稱(chēng)為光動(dòng)力療法(PDT)的該技術(shù)，將光敏劑例如用于腫瘤，并且在原位光敏化產(chǎn)生使惡性腫瘤細(xì)胞中毒的化合物。
迄今為止，采用卟啉和相關(guān)化合物的光動(dòng)力療法已具有悠久的歷史。二十世紀(jì)四十年代(1940s)的早期研究，證明可以引起卟啉在被照射的腫瘤組織中發(fā)熒光。所述卟啉看來(lái)在這些組織中累積，并能夠在原位吸收光，提供根據(jù)熒光的部位探測(cè)腫瘤的一種方法。在光動(dòng)力療法的早期階段，一種既用于檢測(cè)又用于治療、廣泛應(yīng)用的制劑是一種血卟啉的粗制衍生物，也稱(chēng)為血卟啉衍生物HpD，或是按照Lipson和合作者在J Natl Cancer Inst(1961)261-8中描述的方法制備的Lipson衍生物。已經(jīng)用該制劑進(jìn)行大量的研究工作，并且Dougherty和合作者報(bào)道了該衍生物在治療惡性腫瘤方面的用途(Cancer Res(1978)382628-2635；J Natl CancerInst(1979)62231-237)。
Dougherty和合作者制備了一種更有效形式的血卟啉衍生物，所述衍生物包含聚集體重量(aggregate weight)＞10kd的HpD的一部分。可用于光動(dòng)力療法的該種形式的藥物是美國(guó)專(zhuān)利4,649,151的主題，是市場(chǎng)上可得到的，并正處于臨床試驗(yàn)中。
已經(jīng)完全確立了應(yīng)用吸收光的化合物，尤其是與卟啉相關(guān)的那些化合物的一般原則，作為系統(tǒng)給藥時(shí)用于腫瘤的一種療法。這些制劑破壞腫瘤組織但不破壞正常組織的鑒別能力(differential ability)，是由于這些制劑對(duì)有害細(xì)胞的尋靶效應(yīng)(homing effect)產(chǎn)生的。(參見(jiàn)，例如，Dougherty，T.J.等，“CancerPrinciples and Practice of Oncology”(1982)，V.T.de Vita，Jr.等編著，第1836-1844頁(yè))。人們一直努力通過(guò)將血卟啉衍生物綴合到抗體來(lái)提高尋靶能力(homing ablity)。(參見(jiàn)，例如，Mew，D.等，J Immunol.(1983)1301473-1477)。這些藥物在殺傷細(xì)胞中的機(jī)制看來(lái)涉及照射后單線(xiàn)態(tài)氧的生成(Weishaupt，K.R.等，Cancer Research(1976)第2326-2329頁(yè))。
美國(guó)專(zhuān)利4,753,958中也已經(jīng)描述了，采用局部給藥，應(yīng)用血卟啉衍生物或其有效成分治療皮膚病。另外，已經(jīng)用所述藥物消毒含可感染生物如細(xì)菌和病毒的生物樣品(Matthews，J.L.等，Transfusion(1988)81-83)。也已經(jīng)將各種其它光敏化合物用于該目的，如例如美國(guó)專(zhuān)利第4,727,027號(hào)中所陳述的。
一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)用各種各樣結(jié)構(gòu)的輻照致敏劑來(lái)選擇性地削弱生物底物在體內(nèi)和體外的作用的方法是本領(lǐng)域已知的?？捎糜谶@些方法的化合物必須對(duì)待削弱或破壞的靶生物底物具有差別親和力，還必須能夠吸收光，使得照射藥物以某種方式被活化，以便對(duì)相鄰的組合物和物質(zhì)具有有害作用。
因?yàn)槿藗兛偸窍Ｍ怪委煂W(xué)和診斷學(xué)性能的最佳化，所以一直在探索傳統(tǒng)用于治療和診斷的卟啉藥物的變化。已經(jīng)提出了許多普通類(lèi)型的光敏劑，總的來(lái)講包括酞菁、補(bǔ)骨脂素相關(guān)化合物和具有共振體系的多環(huán)化合物。最類(lèi)似于本文公開(kāi)的化合物是各種脫鎂葉綠甲酯一酸衍生物，其在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用已經(jīng)描述于Nihon MetaphysicsCompany的EPO申請(qǐng)220686中；用于該目的的脫鎂葉綠甲酯一酸的乙二胺衍生物，描述于Tama Seikayaku，KK.的日本申請(qǐng)J85/000981中；以及日本申請(qǐng)J88/004805涉及的10-羥基脫鎂葉綠甲酯一酸-a。另外，Beems，E.M.等，在Photochemistry and Photobiology(1987)46639-643中公開(kāi)了用作光敏劑的細(xì)菌葉綠素-a的二種衍生物-細(xì)菌葉綠酸-a(也稱(chēng)為細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸-a，其在細(xì)菌葉綠素-a中缺乏衍生的植醇(phythl alcahol))和細(xì)菌二氫卟酚-a(其既缺乏植基又缺乏所述Mg離子)。這些作者注意這些衍生物，因?yàn)榛谂c細(xì)菌葉綠素-a相比這些衍生物的水溶性增強(qiáng)，它們是有利的。
EP 584552和WO97/19081，兩個(gè)專(zhuān)利均屬于Yeda Research andDevelopment Co.Ltd.，分別描述了葉綠素和細(xì)菌葉綠素衍生物及其作為PDT藥物的用途，以及金屬化的細(xì)菌葉綠素及其通過(guò)對(duì)應(yīng)的Cd-BChl衍生物的金屬轉(zhuǎn)移作用的制備方法。
問(wèn)題仍是發(fā)現(xiàn)合適的可用于光動(dòng)力療法和診斷的光敏劑，所述光敏劑最適于特定靶和特定范圍。因此，本發(fā)明提供了另一類(lèi)的光敏化合物，為了用于具體治療和診斷情況，所述光敏化合物成為候選化合物所有組成部分的一部分。
本發(fā)明因此涉及式I、I’或I”化合物
其中A代表OH，OR1，-O-(CH2)n-Y，-S-(CH2)n-Y，-NH-(CH2)n-Y，-O-(CH2)2-NH2，-O-(CH2)2-OH，-NH-(CH2)n-+No，X-，-NH-(CH2)2-NH＝BOC或-N-(CH2-CH＝CH2)2其中R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、NH4++NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH，+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或+N(Cn′H2n′+1)4；R2代表H、OH或COOR4，其中R4為C1-C12烷基或C3-C12環(huán)烷基；R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；n為1、2、3、4、5或6，Y為-NR′1R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互獨(dú)立地代表-CH3或-C2H5；X為F、Cl、Br或I，n′為1、2、3或4，并且其中*表示不對(duì)稱(chēng)碳，而-代表飽和單鍵或不飽和雙鍵。
此外，本發(fā)明涉及以上新化合物的制備方法。
因此，一方面，本文描述了實(shí)現(xiàn)削弱或破壞靶生物底物的方法，所述方法包括用一定量的式I、I’或I”化合物處理靶底物，以有效光致敏所述底物，然后用被式I、I’或I”化合物吸收的波長(zhǎng)譜帶中的輻照所述靶底物一段時(shí)間，以有效削弱或破壞所述底物。
另一方面，本發(fā)明因此涉及包括至少一種作為活性劑的式I、I’或I”化合物以及藥學(xué)上可按受的載體的藥用組合物。根據(jù)眾所周知的光動(dòng)力技術(shù)，所述組合物可用于腫瘤的體內(nèi)光動(dòng)力療法和診斷并可用于殺傷樣品中以及活組織中的細(xì)胞、病毒和細(xì)菌、寄生物和真菌。
此外，本發(fā)明涉及應(yīng)用式I、I’或I”化合物制備可用于光動(dòng)力療法的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用本發(fā)明化合物制備可用于診斷和活體外殺傷細(xì)菌、寄生物、病毒和真菌的組合物。
本發(fā)明還涉及下文作為中間體的相應(yīng)的式II或式III的酰基氯和酸酐。
圖2和圖3分別描述了由快速原子轟擊進(jìn)行的Pd-BPheid的低分辨率質(zhì)譜和高分辨率質(zhì)譜(FAB-MS)。
圖4顯示在用Pd-BPheid或BChl-SerOMe的PDT后A431細(xì)胞的時(shí)間依賴(lài)性形態(tài)變異[在所述圖中，Bchl-Ser代表BChl-SerOMe，即BChl的絲氨酰甲酯]。
圖5顯示被測(cè)Pd-BPheid和BChl-SerOMe對(duì)ECV-304細(xì)胞的光毒性。
圖6顯示Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯對(duì)培養(yǎng)的M2R小鼠黑素瘤細(xì)胞的光毒性。(A)將色素溶于95％乙醇中，然后在培養(yǎng)基+10％血清中進(jìn)一步稀釋至所示濃度至1％乙醇。(B)將色素直接溶于培養(yǎng)基+10％血清中。
圖7顯示Pd-Bpheid對(duì)培養(yǎng)的M2R小鼠黑素瘤細(xì)胞和人H29結(jié)腸癌細(xì)胞的光毒性。
圖8顯示M2R小鼠黑素瘤用溶于Cremophor和稀釋于鹽溶液的Pd-BPheid(2.5mg/Kg)進(jìn)行的PDT。
圖9顯示M2R小鼠黑素瘤用溶于鹽溶液和用Cremophor稀釋的Pd-BPheid(2.5mg/Kg)進(jìn)行的PDT。


圖10圖示說(shuō)明用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe[在所述圖中為Pd-Bchl-Ser]進(jìn)行PDT后，治愈原發(fā)性C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
圖11顯示外科手術(shù)(切斷術(shù))后或用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe[在所述圖中為Pd-Bchl-Ser]進(jìn)行PDT后，CD1裸鼠中的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的表象(appearance)。
發(fā)明詳述在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有以下光學(xué)構(gòu)型的以下結(jié)構(gòu)式 其中A為如上所述。
如果在上述結(jié)構(gòu)中代表C7和C8以及C17和C18之間鍵的虛線(xiàn)為一個(gè)飽和單鍵時(shí)，則編號(hào)7、8、17和18的碳原子為不對(duì)稱(chēng)碳原子。如果R2或R3為H時(shí)，則C132為一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子。
在氧存在下或于環(huán)境空氣下及在光作用下，上述C7-C8和C17-C18鍵的氧化作用可以發(fā)生，產(chǎn)生在所述位置C7-C8和C17-C18具有雙鍵的化合物。
本發(fā)明的式I’和式I”化合物為式I化合物的氧化形式，并可以通過(guò)描述于Chlorophyll(由Scheer H.(編著)，CRC Press，1991，第147-209頁(yè))中的方法獲得。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化合物是其中A為OR1的那些化合物。
在一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物為Pd-PBheid(本文有時(shí)也命名為Pd-BChl-COOH)，這是其中A為OH、具有以下結(jié)構(gòu)的式I化合物 其中A為OH的式I化合物的制備方法之一，至少包括以下步驟a)將M-BPheid-173-Z化合物聯(lián)合脫金屬和水解，其中Z為植基、香葉基香葉基(gg)或SerOMe(絲氨酰O-甲酯)，而M為選自Mg、Cd或Zn的金屬；b)用Pd試劑將Pd摻入(a)中獲得的化合物中，由此獲得Pd-BPheid，并且，如有需要，c)隨后，將獲得的Pd-BPheid與對(duì)應(yīng)的式R1-H或A-H化合物反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)的R1鹽或其中A不為OH的化合物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法涉及Pd-BPheid的制備，而細(xì)菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中脫金屬并水解，然后將獲得的細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)在步驟(b)中與Pd試劑反應(yīng)，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
式I化合物的另一種制備方法至少包括以下步驟
a)對(duì)BChlide-173-Z進(jìn)行金屬轉(zhuǎn)移，獲得對(duì)應(yīng)的其中Z為植基、gg或SerOme的Pd-BPheid-173-Z，b)水解所獲得的化合物，和c)隨后，任選地將獲得的Pd-BPheid與對(duì)應(yīng)的式R1-H或A-H化合物反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)的R1鹽或其中A不為OH的化合物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法涉及Pd-BPheid的制備，而細(xì)菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)進(jìn)行金屬轉(zhuǎn)移以由Pd取代天然中心Mg原子，然后將獲得的其中Z為植基的Pd-BPheid-173-Z在步驟(b)中進(jìn)行水解，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
式I化合物的另一種制備方法至少包括以下步驟a)酶促水解其中Z為植基或香葉基香葉基的BChlide-173-Z，獲得Bchlide；b)將(a)的所述BChlide進(jìn)行酸性脫金屬；c)用Pd試劑將Pd摻入到(b)的所述脫金屬的BPheid中；和d)隨后，任選地將獲得的Pd-BPheid與對(duì)應(yīng)的式R1-H或A-H化合物反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)的R1鹽或其中A不為OH的化合物。
在式I化合物的上述制備方法中，所述Pd試劑可以是在這類(lèi)結(jié)構(gòu)中提供Pd的任何方便的反應(yīng)性化合物，例如乙酸鈀和氯化鈀。
經(jīng)采用抗壞血酸鈉或抗壞血酸的兩步法，或者經(jīng)采用6-O-棕櫚酰-L-抗壞血酸的一步法，可以實(shí)現(xiàn)上述方法中的Pd的摻入。
通過(guò)將Pd-BPheid(Pd-BChl-COOH)與對(duì)應(yīng)的A-H化合物反應(yīng)，可以獲得其中A不同于OH和OR1的本發(fā)明化合物。
以上式II和式III化合物是本發(fā)明式I化合物的中間體。經(jīng)采用適合于生成酰氯的任何試劑例如SOCl2，可以獲得式II的?；龋碢d-BPheid-COCl。
通過(guò)用乙酸酐使式I、I’、I”化合物脫水，可以獲得式III的酸酐。
通過(guò)使這些中間體II和III與對(duì)應(yīng)的化合物AH反應(yīng)，可以獲得式I、I’或I”化合物。
本發(fā)明還包括式I、I’和I”化合物游離酸的藥學(xué)上可接受的鹽。用本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如通過(guò)使游離酸或其鹽與無(wú)機(jī)或有機(jī)試劑反應(yīng)，可以制備所述鹽，所述無(wú)機(jī)或有機(jī)試劑例如但不限于NaOH、KOH、鈣或鎂合適的鹽、LiOH、NH4OH、氫氧化四烴基銨例如氫氧化四乙銨或N-甲基葡糖胺、葡糖胺和三乙醇胺。
本發(fā)明化合物可用于靶生物底物的光動(dòng)力療法和診斷。所謂“靶生物底物”是指在采用療法或其它矯正作用例如滅菌的環(huán)境中、或在應(yīng)用診斷的環(huán)境中需要知道的位置中不希望有的任何細(xì)胞、病毒或組織行。
按照本發(fā)明，將所述藥物注射到受治療者體內(nèi)，并容許在靶底物中達(dá)到最佳濃度。然后將所述靶底物暴露于適于所給予化合物吸收光譜的波長(zhǎng)下的輻照。通過(guò)伴隨的所述靶底物溫度的升高，可以提高所述化合物的作用。
采用適于計(jì)劃用途的常規(guī)賦形劑，配制本發(fā)明化合物供本發(fā)明的方法之用。對(duì)于系統(tǒng)給藥，一般來(lái)說(shuō)，使用緩沖水性組合物，其含有足夠的無(wú)毒去垢劑以溶解所述活性化合物。因?yàn)楸景l(fā)明化合物一般不大溶于水，因此可以使用增溶量的這種去垢劑。合適的無(wú)毒去垢劑包括但不限于吐溫80、多種膽汁鹽例如甘氨膽酸鈉(sodium glycholate)、各種膽汁鹽類(lèi)似物例如梭鏈孢酸鹽。替代組合物應(yīng)用脂質(zhì)體載體。采用常規(guī)緩沖液例如Hank溶液、Ringer溶液或磷酸鹽緩沖液，于所需的pH下緩沖所述溶液。也可以包括不干擾所述藥物活性的其它成分，諸如穩(wěn)定量的蛋白例如血清白蛋白、或低密度脂蛋白或高密度脂蛋白(分別為L(zhǎng)DL和HDL)。
系統(tǒng)性制劑可以經(jīng)注射給予，例如靜脈內(nèi)(i.v.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、肌內(nèi)、或皮下(s.c.)注射，或者可以通過(guò)經(jīng)膜或經(jīng)皮技術(shù)給予系統(tǒng)性制劑。適于經(jīng)皮或經(jīng)膜給藥的制劑包括含有滲透劑的噴霧劑和栓劑，所述滲透劑通常可以是上述去垢劑。
對(duì)于局部給藥，所述制劑也可以含有滲透劑，為軟膏、油膏、搽劑、乳膏或油的形式。合適的既可用于系統(tǒng)給藥又可用于局部給藥的制劑在Remington′s Pharmaceutical Sciences，最新版，Mack PublishingCo.，Easton，PA中找到。
對(duì)于活體外治療應(yīng)用，例如用于輸血的血液或血漿或者血液制品的制劑，不需要特殊的配制，但將本發(fā)明化合物溶于合適的相容性溶劑中并在輻照前以合適的濃度、通常約為1-100μg/ml，混合到所述生物流體中。
對(duì)于光動(dòng)力治療應(yīng)用和診斷應(yīng)用，合適的劑量范圍將隨應(yīng)用的模式和化合物的選擇以及待治療或診斷的病癥的性質(zhì)而變化。然而，一般來(lái)說(shuō)，合適的劑量約為0.01-50mg/kg體重，最好是0.1-10mg/kg。對(duì)于局部給藥，通常使用的總劑量約為5-100mg。
用于光動(dòng)力活體外療法的通用方法類(lèi)似于由Mattews，J.L.等，Transfusion(參見(jiàn)上文)描述的那些方法。
簡(jiǎn)而言之，對(duì)于系統(tǒng)給藥，給藥后經(jīng)過(guò)一段合適的時(shí)間，通常為數(shù)分鐘至2天，以便在靶生物底物中使本發(fā)明化合物的濃度達(dá)到最佳。一般來(lái)說(shuō)，這種底物將是腫瘤血管系統(tǒng)、腫瘤細(xì)胞或任何其它腫瘤組分，并通過(guò)測(cè)量與背景相比靶組織的光吸收，可以監(jiān)測(cè)所述化合物的定位。已經(jīng)達(dá)到最優(yōu)化后，用范圍為740-800nm或500-600nm或700-900nm的合適譜帶的輻照；以5-750mW/cm2的輻射率和100-1000J/cm2的總能量，，照射所述靶生物底物。
對(duì)于局部療法，定位是快速的，因此此后可以提供相應(yīng)的輻照。對(duì)于生物液體活體外的療法，在達(dá)到靶組織最佳結(jié)合/攝取后應(yīng)用輻照。輻照通量(radiationfluence)約為1-10J/cm2。因?yàn)椴恍枰┩附M織，所以可以使用較低的總能量。
本發(fā)明組合物包括至少一種如上定義的式I、I’或I”化合物以及生理上可接受的載體。這些組合物可以為溶液、脂乳濁液或凝膠的形式或?yàn)橹|(zhì)體或納級(jí)粒子(nanoparticles)的形式。選擇合適的載體以使本發(fā)明化合物在靶底物的濃度最大。這類(lèi)載體的實(shí)例包括但不限于“吐溫80”、聚乙二醇例如PEG400、“Cremophor EL”、丙二醇、乙醇、羅勒油、膽汁鹽和膽汁鹽類(lèi)似物及它們的混合物。脂質(zhì)體制劑可以基于例如二豆蔻?；字Ｄ憠A或磷脂酰甘油。所述載體也可以包括棕櫚?；字Ｄ憠A。
當(dāng)使用納粒子時(shí)，它們可以為PEG包衣的聚乳酸納級(jí)粒子的形式。在脂乳濁液的形式中，通常使用低密度脂蛋白和甘油三酯。
在本發(fā)明組合物中，本發(fā)明化合物的量為組合物總重量的0.01-20％，最好是0.05％-5％(重量)。
現(xiàn)在通過(guò)以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1.Pd-BPheid的制備用以下3-步法從BChla制備Pd-BPheid。(a)細(xì)菌葉綠素a(BChla)的分離如下從凍干細(xì)菌嗜硫小紅卵菌(Rhodovolum sulfidophilum)中提取BChla將凍干細(xì)胞(100gr)研磨成粉，用總共1250ml丙酮洗滌5次，以部分洗去類(lèi)胡蘿卜素，過(guò)濾該混合物，用無(wú)水甲醇從所述固體物中提取(約1200ml，4-5次過(guò)濾)BChla。過(guò)濾后，將深藍(lán)綠色溶液真空下部分蒸發(fā)，用石油醚(b.p.80-100℃，約1300ml)萃取所述濃縮溶液(約500ml)2-3次，進(jìn)一步除去類(lèi)胡蘿卜素，用甲醇(約550ml)萃取石油醚相2次。然后除去該相，將混合的甲醇相真空蒸發(fā)，并將藍(lán)綠色殘留物再溶于甲醇-丙酮(1∶3，v/v)，上樣于用甲醇-丙酮(1∶3，v/v)平衡的DEAE-瓊脂糖凝膠柱(3×10cm)。用甲醇-丙酮(1∶3，v/v)洗脫BChla，蒸發(fā)甲醇-丙酮混合物，將干燥的Bchla再溶于精確體積(用于吸收光譜)的乙醚中，通過(guò)棉絨(coton wool)過(guò)濾，去除溶解的柱材料。在最后一次蒸發(fā)后，將所述固體色素于氬氣下避光貯藏于-20℃。提取得率約700mgBChla/100g凍干細(xì)胞。
如先前所述制備DEAE-瓊脂糖凝膠柱(Omata和Murata，1983，“通過(guò)用DEAE-瓊脂糖凝膠C1-6B和瓊脂糖凝膠C1-6B的柱層析，制備葉綠素a、葉綠素b和細(xì)菌葉綠素a”，Plant Cell Physiol.，第24卷，第1093-1100頁(yè))。簡(jiǎn)而言之，用蒸餾水洗滌DEAE-瓊脂糖凝膠柱，然后通過(guò)將其懸浮于1M乙酸鈉緩沖液(pH＝7)，使其轉(zhuǎn)化成乙酸鹽形式。將所述漿液用丙酮洗滌3次，最后懸浮于甲醇-丙酮(1∶3，v/v)，貯藏于5℃。(b)細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)的制各將如(a)中得到的粗制Bchla提取物(含一些殘留類(lèi)胡蘿卜素的約100mg Bchla)溶于80％三氟乙酸水溶液(約15ml)中，所述三氟乙酸水溶液已經(jīng)用氮通氣10分鐘。于環(huán)境溫度下攪拌所述溶液2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物傾入水(約250ml)中，并用氯仿萃取。將提取物用水洗滌2次，經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥。蒸發(fā)所述溶劑后，殘留物在二氧化硅上層析(3cm×15cm柱，Kieselgel 60，Merck)，用甲醇的氯仿溶液的分段梯度2％、5％、10％、15％洗脫。首先，洗出類(lèi)胡蘿卜素和少量的細(xì)菌脫鎂葉綠素，然后洗出異細(xì)菌脫鎂葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素。于10％甲醇的氯仿溶液，開(kāi)始收集產(chǎn)物并通過(guò)TLC(Kieselgel，氯仿-甲醇，9∶1)監(jiān)測(cè)。蒸發(fā)所述產(chǎn)物(60mg)，然后將溶解于CHCl3的殘留物經(jīng)UltraPore膜過(guò)濾，除去可能在其它情況下引起氧化作用的二氧化硅。(c)將鈀摻入細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸(Bpheid)中將如(b)中得到的BPheid(100mg)和乙酸鈀(80mg)溶于二氯甲烷(約10ml)，然后加入到200mg抗壞血酸鈉在50ml甲醇中的懸浮液中。于室溫下在密閉的燒瓶中攪拌所述反應(yīng)混合物，然后每15-20分鐘從所述反應(yīng)混合物中收集樣品，并記錄其光吸收。約4小時(shí)后，大多數(shù)于357nm的BPheid吸收被于330nm和390nm的Pd-BPheid吸收取代。
將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到氯仿/水溶液(200ml；50∶50v/v)中，并在分液漏斗中振蕩。收集有機(jī)相，用水洗滌，經(jīng)無(wú)水氯化鈉干燥，然后蒸發(fā)。將干燥的物質(zhì)加入到80mg乙酸鈀中，重復(fù)以上步驟直到于357nm的所述殘留的吸收完全消失，并且于765nm的吸收(紅峰-最大躍遷)和于330nm的最大吸收之間的比率達(dá)到數(shù)值≈2.4(在氯仿中)為止。
將所述干燥反應(yīng)混合物溶解于最小體積的2∶1氯仿∶丙酮中，然后上樣于已經(jīng)用丙酮預(yù)平衡的CM-瓊脂糖凝膠柱(150mm×25mm)。首先用丙酮洗滌所述柱，并棄去洗脫的第一流分。然后用9∶1丙酮∶甲醇洗滌所述柱。二條帶占優(yōu)勢(shì)，并被洗出一第一條為主要產(chǎn)物，而第二條為加氧(allomerized)副產(chǎn)物(被棄去)。將所述產(chǎn)物濃縮幾乎至干，然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中的50∶50氯仿∶水體系中。充分振搖所述混合物，分離有機(jī)相，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉(或氯化鈉)干燥，然后蒸發(fā)至干。實(shí)施例2.Pd-BPheid的制備(a)Bchla的分離如以上實(shí)施例1(a)進(jìn)行所述方法的該步驟。(b)Pd-Bpheid的制備將6-O-棕櫚酰-L-抗壞血酸(246mg，593μmol)溶于MeOH(84ml)，并用N2通過(guò)所述溶液。將Bpheid(92mg，151μmol)和Pd(CH3COO)2(83mg，370μmol)溶于CHCl3(34ml，用N2脫氣)，然后加入到所述甲醇溶液中。于惰性氛圍下經(jīng)連續(xù)攪拌保持所述混合物，并通過(guò)每幾分鐘記錄小部份反應(yīng)物的吸收光譜，監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。約30分鐘后，完成所述反應(yīng)，并蒸發(fā)所述溶劑。(c)Pd-Bpheid的純化將粗制Pd-BPheid溶于CHCl3，然后上樣于用15g 0.4％-二氧化硅-Asc裝填的柱。將少量體積的CHCl3(約30ml)通過(guò)該柱，然后用MeOH∶CHCl3(1∶99，約250ml)洗脫所述色素。經(jīng)TLC和光學(xué)吸光譜法測(cè)定所述流分的純度。對(duì)代表性樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析和NMR檢測(cè)。產(chǎn)量82.5mg純的Pd-BPheid(76％)。
對(duì)于制備0.4％-二氧化硅-Asc，將抗壞血酸(240mg)溶于240ccEtOH∶CHCl3∶MeOH(60∶60∶120)混合物中。加入硅膠60(60g，Merck，Cat.No.107734，70-230目)，將所述漿液混合物攪拌10分鐘，然后在泵下過(guò)濾。最后將所述淡黃色二氧化硅-Asc于約50C干燥約1小時(shí)。該0.4％-二氧化硅-Asc隨時(shí)可以用作標(biāo)準(zhǔn)硅膠；其性質(zhì)為極性較少并且它具有某些抗氧化特性。實(shí)施例3.Pd-BPheid的制備(a)Bchla的分離如以上實(shí)施例1(a)進(jìn)行本步驟。(b)葉綠素酶(Chlase)的制備從Melia azedarach L.，Chine樹(shù)葉的葉綠體制備葉綠素酶(Chlase)。將新鮮葉片(50g)在含有350ml冷卻至-20℃的丙酮溶液的搗碎機(jī)中研磨2分鐘。將所述勻漿通過(guò)4層紗布過(guò)濾，收集濾液，于4℃放置過(guò)夜以進(jìn)一步進(jìn)行沉淀。經(jīng)過(guò)濾除去丙酮，用冷丙酮將余下的粉末洗滌幾次以去除痕量Chlase和類(lèi)胡蘿卜素，直到所述濾液無(wú)色為止。最后將Chlase丙酮粉在凍干機(jī)中干燥，并再貯藏于-20℃。在這些條件下，所述酶制備物可穩(wěn)定1年以上，而不顯著損失活性。得率每1kg葉片獲得20g Chlase。(c)細(xì)菌脫植基葉綠素(BChlide)的合成和純化將抗壞血酸(70mg；Merck)溶于水(9ml)中，用10M KOH水溶液將所述溶液的pH調(diào)節(jié)至7.7，加入1ml 0.5M磷酸鈉緩沖液(pH7.7)以在反應(yīng)期間保持所述pH。加入Triton X-100(約80μl)以達(dá)到去垢劑終濃度為0.8％(v/v)。用Polytron勻漿器，將Chlase丙酮粉末(200mg)在6ml該溶液中勻漿。用剩余溶液洗滌該裝置，然后與所述勻漿混合。所述酶溶液與20mg用氬氣(Argon)飽和的固體BChla一起超聲處理，然后于37℃避光攪拌溫育6小時(shí)。
對(duì)于純化，反應(yīng)6小時(shí)后，將所述反應(yīng)物質(zhì)直接冰凍(-20℃)，并隨后凍干。將所述干殘留物溶于丙酮，超聲處理，然后將所述溶液上樣于平衡于丙酮的CM-瓊脂糖凝膠柱。用丙酮洗滌該柱以洗出未反應(yīng)的物質(zhì)，然后用5％和7％甲醇(v/v)的丙酮溶液洗滌，以洗脫細(xì)菌脫植基葉綠素(Bchlide)和細(xì)菌脫鎂甲酯一酸(Bpheid)。用25％甲醇的丙酮溶液洗脫所述產(chǎn)物。蒸發(fā)溶劑，然后將所述固體色素在氬氣下避光貯藏于-20℃。反應(yīng)得率30-55％。
在填充柱和平衡于丙酮之前，首先用水洗滌CM-瓊脂糖凝膠，然后用丙酮洗滌3次，制備用于色譜法的CM-瓊脂糖凝膠。在用2MNaCl水溶液徹底漂洗至無(wú)色后，可以重復(fù)使用所述色譜材料，用水洗滌并重新懸浮于丙酮。(d)將鈀摻入到細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)本方法與以上實(shí)施例1(c)中的方法相同。干燥的物質(zhì)的HPLC顯示出2個(gè)差向異構(gòu)體形式的主要產(chǎn)物和殘余異分同晶體，所述2個(gè)差向異構(gòu)體在化學(xué)上是相同的(全部混合物的88％)。也有微量(0.5％)污染的原材料BPheid。實(shí)施例4.化合物Pd-BPheid的表征(a)吸收光譜采用標(biāo)準(zhǔn)化到基線(xiàn)的PM檢測(cè)器，用UVICON分光光度計(jì)(1cm光程長(zhǎng)度)，測(cè)定Pd-BPheid的吸收光譜。靈敏度為0.05。
Pd-BPheid在丙酮中的吸收光譜以及甲醇/磷酸鉀緩沖液混合物中的吸收光譜報(bào)告于表1和圖1中。
Pd-BPheid在血漿中的吸收光譜紅移至763nm。
表1
照片檢測(cè)顯示按照?qǐng)D1的以下峰值為758nm1.2502；537nm0.3239；384nm0.5351；和329nm0.7766。(b)Pd-BPheid的HPLC檢測(cè)開(kāi)發(fā)出反相HPLC方法以表征雜質(zhì)圖形(impurity profile)并定量鈀-BPheid。固相C8Inertsil 5μm，250×4.6mm液相甲醇∶磷酸鉀緩沖液20mMpH＝6.59(70％∶30％)流速1ml/分鐘注射體積100μl檢測(cè)1-Spectroflow 783，氘燈385nm2-Spectroflow 757，鎢燈753nm正如表2中所示，實(shí)施例3中獲得的產(chǎn)物Pd-Bpheid的HPLC分析顯示出7個(gè)峰。主峰代表了總產(chǎn)物的64-70％。
于-20℃儲(chǔ)存于丙酮中的Pd-BPheid溶液至少穩(wěn)定2個(gè)月。將所述儲(chǔ)備液于室溫保持18小時(shí)時(shí)，則在HPLC圖形中沒(méi)有觀(guān)察到變化，表明Pd-Bpheid是一種穩(wěn)定的化合物。
表2.Pd-BPheid的HPLC檢測(cè)
(c)用NMR表征Pd-BPheid在按照實(shí)施例3制備的Pd-BPheid的純化步驟后，主峰的百分比為90％以上。經(jīng)制備HPLC C8進(jìn)行該純化。用這種純化的化合物經(jīng)NMR和質(zhì)譜法表征所述產(chǎn)物。
用NMR進(jìn)行Pd-BPheid的分析，化學(xué)位移列于表3中-1H NMR和13C NMR-2D1H NMR(COSY和NOESY)-2D1H-13C NMR(HMQC和HMBC逆檢測(cè))
表3.1H、13C化學(xué)位移(ppm)甲基 質(zhì)子碳
內(nèi)消旋
C-H
其它
無(wú)質(zhì)子的碳
(d)用質(zhì)譜法表征Pd-BPheidPd-BPheid的質(zhì)譜法分析產(chǎn)生示于圖2和圖3中波譜。于低分辨率和高分辨率下經(jīng)快速原子轟擊(FAB)進(jìn)行該分析。分光計(jì)為“ZabSpecTOF Micromass”分光計(jì)；電離方式利用Cs+的LSIMS，正性，加速8kV；源溫度40℃；所用的溶劑mNBA(間硝基二苯乙醇(meta-nitrobenzilic alcohol))；輸入側(cè)部。
結(jié)果離子型M+；分子式C35H36N4O6106Pd；理論值714.1670Z1m/z理論值714.1670m/z實(shí)測(cè)值714.1689。
這些結(jié)果證實(shí)所述NMR研究m/e＝714，并證實(shí)鈀金屬的嵌入。
經(jīng)NMR和質(zhì)譜法分析的化學(xué)結(jié)構(gòu)是BChl游離酸形式的鈀衍生物-Pd-BPheid。實(shí)施例5.Pd-Bpheid對(duì)鼠L1210和人HT29細(xì)胞的生物活性(i)細(xì)胞系。用補(bǔ)充10％馬血清、1mM谷胺酰胺、1mM巰基乙醇和慶大霉素的Fischer培養(yǎng)基，在懸浮培養(yǎng)物中保持鼠白血病細(xì)胞系(L1210)。按照Twentyman等的說(shuō)明(1980，“用于比較終點(diǎn)研究的新型小鼠腫瘤模型系統(tǒng)(RIF-1)(A new mousetumor model system(RIF-1)forcomparison of end-point studies)”，J.Natl.Cancer Inst.，64，595-604)保持RIF(輻照誘發(fā)的纖維肉瘤)腫瘤。在含10％胎牛血清和慶大霉素的Weymouth培養(yǎng)基中培育培養(yǎng)物。
在無(wú)酚紅而含有10％FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)HT29人結(jié)腸腺癌細(xì)胞。通過(guò)用0.25％胰蛋白酶使細(xì)胞分散在0.02％EDTA，傳代培養(yǎng)細(xì)胞，然后將1瓶分成5瓶(at a 1∶5 split)再接種。(ii)體外光毒性。對(duì)于涉及L1210和RIF細(xì)胞的光毒性研究，由600瓦具有10cm水濾光器和850nm截止濾光片濾波以去除IR的石英-鹵素光源，提供光源。通過(guò)干涉濾光片(Oriel)，將所述帶寬進(jìn)一步限定于660±5nm。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(為加入緩沖能力，用20mM HEPES pH7取代NaHCO3)中，在規(guī)定濃度的致敏劑存在下，將懸浮液中的細(xì)胞(L1210)或貼壁至24mm直經(jīng)蓋玻片的細(xì)胞溫育15分鐘。然后將所述細(xì)胞洗滌直至不含致敏劑，將其轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中。于10℃進(jìn)行照射。對(duì)于某些研究，然后將所述細(xì)胞用熒光探針標(biāo)記，確定光損傷部位。在其它研究中，然后將所述細(xì)胞于37℃在新鮮培養(yǎng)基中溫育60分鐘，讓編程性細(xì)胞死亡開(kāi)始發(fā)生。用96孔板和72小時(shí)MTT測(cè)定，以四個(gè)復(fù)份進(jìn)行生存力研究。
對(duì)于HT29模型，將細(xì)胞與不同濃度的Pd-Bpheid一起溫育1小時(shí)，然后用鹵素?zé)艋蜮佀{(lán)寶石激光于10J/cm2和25J/cm2，以300mW/cm2進(jìn)行照射。(iii)細(xì)胞生存力。通過(guò)在96孔板中接種1,000-50,000細(xì)胞后3天進(jìn)行的MTT反應(yīng)，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。與含可變數(shù)對(duì)照細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較顏色強(qiáng)度。用BioRad平板讀出器于xnm測(cè)定吸光度。對(duì)于L1210，在下一個(gè)3天內(nèi)讓其在新鮮培養(yǎng)基中發(fā)生生長(zhǎng)，采用MTT測(cè)定方法，類(lèi)似估計(jì)細(xì)胞數(shù)目。(iv)脂蛋白結(jié)合測(cè)定Pd-BPheid與對(duì)照人血漿的蛋白和脂蛋白化合物的結(jié)合。將250μl血漿樣品與3μM所述化合物一起于37℃溫育30分鐘。然后用密度梯度離心機(jī)分離脂蛋白和蛋白組分。分級(jí)分離所述梯度，分級(jí)分離部分在3ml 10mM Triton X-100去垢劑中稀釋或在400nm激發(fā)下測(cè)定分級(jí)分離部分的750-800nm熒光。結(jié)果(v)Pd-Bpheid對(duì)L1210細(xì)胞的光毒性效應(yīng)將L1210鼠白血病細(xì)胞與1μM Pd-BPheid一起于37℃溫育30分鐘，于760±5nm下采用75mJ/cm2的光劑量，導(dǎo)致50％細(xì)胞致死。在RIF系中相似程度的細(xì)胞致死需要215mJ/cm2的光劑量。(vi)Pd-Bpheid對(duì)HT29細(xì)胞的光毒性效應(yīng)當(dāng)HT29細(xì)胞在無(wú)光照下與Pd-BPheid一起溫育時(shí)，存活率在100％和79％之間變化。當(dāng)Pd-BPheid濃度較高，并且所傳遞能量的劑量增加時(shí)，所述細(xì)胞的存活率降低。引起50％死亡率的Pd-BPheid光敏劑劑量(也稱(chēng)為L(zhǎng)D50)在25J/cm2的照射下為48μM。引發(fā)最嚴(yán)重光毒性的激發(fā)波長(zhǎng)為773nm。(vii)光損傷部位。采用小鼠白血病L1210細(xì)胞，Pd BPheid是高度特異性線(xiàn)粒體光敏劑，而對(duì)質(zhì)膜或?qū)θ苊阁w沒(méi)有可檢測(cè)的光損傷。這種結(jié)果與快速引發(fā)編程性細(xì)胞死亡相關(guān)。(viii)血漿脂蛋白結(jié)合。進(jìn)行的研究指出，Pd-BPheid結(jié)合于HDL＞LDL＞＞＞人血清白蛋白部分，認(rèn)為是一種PDP選擇性的決定子。實(shí)施例6.Pd-Bpheid的制劑Pd-Bpheid在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用溶劑中的溶解和穩(wěn)定性以不同的配方構(gòu)成Pd-BPheid的溶液，以獲得0.05-2％的濃度。
(a)如下制備Cremophor制劑將40mgPd-BPheid溶于2ml干管中的Cremophor EL中，或者通過(guò)緩慢旋轉(zhuǎn)所述管形瓶直至所述溶液已經(jīng)完全無(wú)微粒，或者采用超聲振蕩探頭的短脈沖處理進(jìn)行溶解。將所述管冷卻，以便使溫度不上升至30℃以上。所述藥物溶解后，加入0.6ml丙二醇，再次或者通過(guò)緩慢旋轉(zhuǎn)法或者用超聲探頭混合。然后以0.1ml部份加入等滲NaCl至總體積為4ml。每次加入后，所述混合物應(yīng)是澄清的，無(wú)沉淀跡象。所述組合物在每次加入NaCl 0.9％后，簡(jiǎn)單地用所述超聲探頭處理，并小心地保持溫度在25-30℃以下。稀釋到乙醇中后，通過(guò)于757nm測(cè)量吸光度，評(píng)估所述藥物的濃度。
當(dāng)將20mg/kg Pd-BPheid用于實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，這變成每20克小鼠為0.4mg Pd-BPheid。由于可以將不超過(guò)0.1ml的cremophor注射到尾靜脈，于是所述藥物的濃度為4mg/ml。
(b)如下制備改進(jìn)的Cremophor制劑將5mg Pd-BPheid與0.4mlCremophor EL混合。溶解后，加入0.12ml丙二醇。然后以小份兒加入等滲鹽水(1.48ml)，并且每次加入后混合所溶液。最終溶液應(yīng)是完全澄清的并且不含微粒。用超聲探頭幫助溶解所述藥物，按照需要通過(guò)在冰浴中冷卻，保持所述溶液的溫度在25℃以下。
通過(guò)在甲醇中稀釋?zhuān)M(jìn)行Pd-BPheid在Cremophor溶液中濃度的測(cè)定。在740-780nm范圍內(nèi)測(cè)量吸收光譜。將所述峰值與來(lái)自已知濃度的Pd-BPheid的結(jié)果進(jìn)行比較。
(c)用吐溫80和乙醇溶解Pd-BPheid(1mgPd-BPheid/ml溶液)，制備其它的制劑。實(shí)施例7.體內(nèi)毒性研究-Pd-BPheid對(duì)鼠腫瘤模型的作用用涉及鼠腫瘤模型的兩組實(shí)驗(yàn)評(píng)估Pd-BPheid的光毒性。
(a)首先，在兩種鼠腫瘤模型BA-乳腺癌和輻照誘發(fā)性纖維肉瘤(RIF-1)中，評(píng)價(jià)Pd-BPheid的光動(dòng)力反應(yīng)性。
光動(dòng)力療法參數(shù)用患有腫瘤(測(cè)量直經(jīng)為5-7mm)的小鼠進(jìn)行PDT實(shí)驗(yàn)。評(píng)價(jià)3種Pd-BPheid藥物劑量(1、5和10mg/kg)和2種光劑量(100和300焦耳/cm2)。通過(guò)尾靜脈注射給予溶于Cremophor的Pd-BPheid制劑。注射后15分鐘、1小時(shí)或4小時(shí)，開(kāi)始PDT光照射。在每種治療條件下處理3只小鼠，除非最初結(jié)果已證實(shí)致死毒性或無(wú)反應(yīng)性。將調(diào)至757nm的鈦藍(lán)寶石激光用作PDT的光源。將激光產(chǎn)生的光耦合到石英纖維中，用于將光傳遞至腫瘤。使用75mW/cm2的光功率密度。PDT治療后，3天/周測(cè)量腫瘤大小，然后確定腫瘤治愈(定義為治療后40天無(wú)腫瘤復(fù)發(fā))的百分比。
體內(nèi)PDT反應(yīng)下文表4和5提供或者移植BA乳腺瘤或者移植RIF-1纖維肉瘤的C3H小鼠的PDT治療結(jié)果的小結(jié)。每個(gè)表指出以下參數(shù)1)靜脈內(nèi)藥物劑量，以mg/kg表示；2)激光療法參數(shù)，包括總光劑量(J/cm2)、波長(zhǎng)(757nm)、光劑量率(mW/cm2)和時(shí)間間隔(每組治療之間)；4)毒性(治療后不久4只小鼠死亡)；5)腫瘤再生長(zhǎng)(包括PDT治療和腫瘤復(fù)發(fā)之間的天數(shù))；和6)用Pd-BPheid PDT誘發(fā)的腫瘤治愈的小鼠數(shù)目(和百分比)。
如本文所述，發(fā)現(xiàn)Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT在兩種小鼠腫瘤模型中誘發(fā)標(biāo)準(zhǔn)而有效的殺腫瘤反應(yīng)。PDT介導(dǎo)的腫瘤反應(yīng)性直接與藥物劑量、光劑量和藥物給予和光治療之間的時(shí)間間隔相關(guān)。具體來(lái)講，較高的藥物劑量和/或較高的光劑量產(chǎn)生增強(qiáng)的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)BA乳腺癌對(duì)Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT的反應(yīng)性比RIF-1纖維肉瘤的相當(dāng)PDT療法的反應(yīng)性更強(qiáng)。如果在給予藥物的1小時(shí)內(nèi)開(kāi)始光療法，則Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT有效；而如果在藥物給予和光療法之間采用4小時(shí)間隔，則Pd-BPheid介導(dǎo)的PDT無(wú)效。
(b)在第二組實(shí)驗(yàn)中，在移植HT29人結(jié)腸腺癌的小鼠腫瘤模型中評(píng)估Pd-BPheid的光毒性。
動(dòng)物和腫瘤模型從剛死的供體小鼠中立即取出的實(shí)體瘤組織(直經(jīng)2cm)，在1ml 0.9％鹽水溶液中機(jī)械地壓碎，然后將所述溶液(0.1ml)皮下注射到每只小鼠的一條后腿中。當(dāng)腫瘤直經(jīng)為8-10mm時(shí)，將小鼠用于實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)之前10天，在8周齡瑞士裸鼠中進(jìn)行腫瘤皮下移植。
光毒性研究以15mg/kg靜脈內(nèi)注射0.15ml Pd-BPheid。恰好在照射之前，用40mg/kg硫噴妥麻醉小鼠。注射后30分鐘、1小時(shí)、4小時(shí)或24小時(shí)，于300mW/cm2用鈦藍(lán)寶石激光照射小鼠，測(cè)量平均直經(jīng)以調(diào)節(jié)照射時(shí)間，以達(dá)到200或300J/cm2。不用Pd-BPheid注射的對(duì)照小鼠也以相同條件進(jìn)行照射。用在實(shí)驗(yàn)性放療已完成的試驗(yàn)，同等地分析PDT誘發(fā)的腫瘤生長(zhǎng)延遲。對(duì)于體內(nèi)研究和對(duì)于每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，所有結(jié)果都是2個(gè)或3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，并且對(duì)于每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每種實(shí)驗(yàn)條件均使用2只小鼠。
對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)研究，結(jié)果以腫瘤指數(shù)變化表示，參比(＝1)相當(dāng)于來(lái)自未處理細(xì)胞的腫瘤指數(shù)。如下計(jì)算所述腫瘤指數(shù)腫瘤指數(shù)＝(最大腫瘤直經(jīng)+垂直相對(duì)的直經(jīng)(perpendicularlyopposite diameter))/2溫度變化研究為保證熱效應(yīng)不是太大，采用不吸收性氧化鋁包埋的精密熱電偶，測(cè)量鹵素?zé)艉外佀{(lán)寶石激光照射的溫度變化。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(i)于200J/cm2763nm照射對(duì)于注射后30分鐘和4小時(shí)的所述條件，觀(guān)察到腫瘤生長(zhǎng)減少(與對(duì)照比較)。對(duì)于注射后1小時(shí)和24小時(shí)的所述條件，觀(guān)察到腫瘤指數(shù)減少多達(dá)7天。
(ii)于300J/cm2763nm照射對(duì)于注射后30分鐘和24小時(shí)的所述條件，觀(guān)察到腫瘤生長(zhǎng)減少(與對(duì)照比較)。對(duì)于注射后1小時(shí)和4小時(shí)的所述條件，觀(guān)察到腫瘤指數(shù)減少多達(dá)7天。
(iii)注射后1小時(shí)300J/cm2照射對(duì)于773nm下的所述條件，觀(guān)察到腫瘤生長(zhǎng)減少(與對(duì)照比較)多達(dá)5天，而對(duì)于753nm和763nm下的所述條件，則腫瘤生長(zhǎng)減少多達(dá)12天。對(duì)于763nm觀(guān)察到最大腫瘤生長(zhǎng)減少。
(iv)注射后24小時(shí)300J/cm2照射對(duì)于753nm下的所述條件，觀(guān)察到腫瘤生長(zhǎng)減少(與對(duì)照比較)多達(dá)4天，而對(duì)于763nm和773nm下的所述條件，腫瘤生長(zhǎng)減少則多達(dá)12天。對(duì)于773nm觀(guān)察到最大腫瘤生長(zhǎng)減少。
在鹵素?zé)艋蜮佀{(lán)寶石照射小鼠期間，沒(méi)有觀(guān)察到太大的溫度變化。
該研究總起來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)照射的最適波長(zhǎng)為773nm。在注射和照射之間的延遲對(duì)腫瘤反應(yīng)有影響。于764nm，1小時(shí)延遲顯示最有效。當(dāng)使用773nm波長(zhǎng)時(shí)，最有效延遲為24小時(shí)。
表4C3H/BA乳腺癌對(duì)Pd-BPheid的反應(yīng)藥物 光 所治療 毒性(療 有原發(fā)性腫瘤 小結(jié)劑量 參數(shù) 的動(dòng)物 法相關(guān)再生長(zhǎng)的動(dòng)物(治愈)(mg/Kg) 數(shù)目 的死亡) 數(shù)(至復(fù)發(fā)的天 ％數(shù))1i.v300J/cm21 0 1(1天)-757nm 無(wú)反應(yīng)75mW/cm215分鐘間隔5i.v300J/cm23 0+757nm 2(41天)75mW/cm22(40天)15分鐘間隔 100％5i.v300J/cm23 0 1(11天) +757nm 1(41天)75mW/cm266.66％1小時(shí)間隔10i.v 300J/cm23 0+757nm 2(41天)75mW/cm21(41天)1小時(shí)間隔 100％10i.v 300J/cm22 0 2(1天)-757nm 無(wú)反應(yīng)75mW/cm24小時(shí)間隔10i.v 100J/cm23 0+757nm 2(42天)75mW/cm21(41天)15分鐘間隔 100％10i.v 100J/cm23 0 1(5天)+757nm 2(40天)75mW/cm266.66％1小時(shí)間隔表5RIF-1對(duì)Pd-BPheid的反應(yīng)藥物光所治療毒性(療 有原發(fā)性腫瘤 小結(jié)劑量 參數(shù) 的動(dòng)物法相關(guān) 再生長(zhǎng)的動(dòng)物(治愈)(mg/Kg) 數(shù)目 的死亡) 數(shù)(至復(fù)發(fā)的天 ％數(shù))1i.v. 300J/cm22 0 2(1天) -757nm無(wú)反應(yīng)75mW/cm215分鐘間隔5i.v 300J/cm23 01(5天) +757nm1(12天) 1(40天)75mW/cm233.33％15分鐘間隔5i.v 300J/cm23 01(4天) +757nm1(2天)75mW/cm21(7天)1小時(shí)間隔10i.v 300J/cm23 2+757nm 2(1天) 1(41天)75mW/cm233.33％15分鐘間隔10i.v 300J/cm24 21(20天) +757nm 2(1天) 1(40天)75mW/cm225.00％1小時(shí)間隔10i.v 300J/cm21 0-757nm無(wú)反應(yīng)75mW/cm24小時(shí)間隔10i.v 100J/cm23 02(12天) +757nm1(7天)75mW/cm215分鐘間隔10i.v100J/cm23 0 2(3天)+757nm1(6天)75mW/cm21小時(shí)間隔實(shí)施例8.基于Pd-BPheid和BChl-Ser的PDT后A431人上皮類(lèi)癌瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)評(píng)估為了檢查在用Pd-BPheid或BChl-SerOMe對(duì)A431人上皮類(lèi)癌瘤細(xì)胞進(jìn)行PDT后發(fā)生的時(shí)間依賴(lài)性形態(tài)變異，進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。(i)材料如以上實(shí)施例1制備Pd-BPheid，而按照EP 584552制備絲氨酸甲酯BChl-SerOMe。(ii)光源鹵素?zé)?Osram，德國(guó)，100W)，具有4.5cm水濾光器和＞650nm的截止濾光片。以15mW/cm2、總能注量為9J/cm2，將所述細(xì)胞照射10分鐘。對(duì)于照射，將培養(yǎng)板置于玻璃臺(tái)上，以從底部提供光源。(iii)光毒性研究以?xún)蓚€(gè)復(fù)份將A431細(xì)胞(5×104細(xì)胞)接種于3cm平皿內(nèi)，然后在Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)＋F12(1∶1)中培養(yǎng)至75％鋪滿(mǎn)，所述培養(yǎng)基用HEPES(25mM，pH7.4)緩沖、含有胎牛血清(FCS)以及青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)。于對(duì)應(yīng)的LD90濃度(分別為0.1μM和1μM)，將Pd-BPheid或BChl-Ser加入所述細(xì)胞中。4小時(shí)后，用培養(yǎng)基洗滌所述細(xì)胞，然后用以上所述光源照射所述細(xì)胞。采用裝備Contax 35mm SLR照相機(jī)的Zeiss Axiovert-35光學(xué)顯微鏡(放大倍數(shù)×320)，于照射后的不同時(shí)間點(diǎn)(PDT后0、0.5、4和24小時(shí))，進(jìn)行相差顯微鏡檢查。在每種重復(fù)的第二個(gè)平皿中，采用中性紅生存力測(cè)定(Zhang SZ.，1990，Cell Biol Toxicol 6(2)219-234)，于PDT后24小時(shí)，評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力。(iv)結(jié)果在所述細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，兩種致敏劑均引起顯著變化。Pd-BPheid引起所述細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的快速改變(30分鐘)，所述細(xì)胞快速萎縮并且形成纖維性連接，將所述細(xì)胞膜與原始粘著斑點(diǎn)(纖維表型)連接。4小時(shí)后，90％所述細(xì)胞喪失其大部份內(nèi)水體積并且其大部分脫離所述平皿，24小時(shí)后沒(méi)有觀(guān)察到進(jìn)一步的變化(圖4，右欄)。BChl-Ser顯示可能僅在4小時(shí)后觀(guān)察到的不同型式的時(shí)間依賴(lài)性形態(tài)變異。觀(guān)察到膜泄漏(blabbing)為從所述細(xì)胞膜芽生的暗色小泡。24小時(shí)內(nèi)沒(méi)有觀(guān)察到顯著的體積減少，而該時(shí)期后，大多數(shù)細(xì)胞附著于所述平皿，但出現(xiàn)中空(泄漏(blabbing)表型，圖4，左欄)。照射后24小時(shí)，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，進(jìn)行中性紅生存力測(cè)定，證明已殺傷90％±7％細(xì)胞。在圖4中，右柱圖代表所述纖維表型，而左柱圖代表所述泄漏表型。實(shí)心白色箭頭顯示纖維或泄漏物(blab)的形成。實(shí)施例9.Pd-BPheid和BChl-SerOMe對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系ECV304的光細(xì)胞毒性為了評(píng)價(jià)光敏劑Pd-BPheid和BChl-SerOMe對(duì)ECV304人膀胱癌細(xì)胞的光細(xì)胞毒性效應(yīng)，進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。(i)材料如實(shí)施例8(i)所述材料。(ii)光源如實(shí)施例8(ii)所述光源。(iii)光毒性研究在96孔中的含有青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)的M-199、10％FCS中，培養(yǎng)ECV304細(xì)胞(2×104細(xì)胞/孔)至鋪滿(mǎn)(約2×105細(xì)胞/孔)。用增加濃度的Pd-BPheid或BChl-SerOMe與所述細(xì)胞一起溫育4小時(shí)，然后用新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，并如以上小節(jié)1所述進(jìn)行照射。照射后24小時(shí)，采用中性紅生存力測(cè)定評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力。使用以下對(duì)照光對(duì)照不用致敏劑處理的照射細(xì)胞；黑暗對(duì)照在黑暗中用致敏劑處理的非照射細(xì)胞；未處理對(duì)照為了計(jì)算100％存活率，使用既不用致敏劑處理也不照射的細(xì)胞(Rosenbach-Belkin V.等，1996，Photochem Photobiol 64(1)174-181)。(iv)結(jié)果Pd-BPheid和BChl-SerOMe兩者均表現(xiàn)出對(duì)ECV304細(xì)胞的依賴(lài)于劑量和光的細(xì)胞毒性(圖5)。相應(yīng)的LD50值為19nM和1000nM。PDT后的形態(tài)變異與用A431細(xì)胞進(jìn)行的觀(guān)察一致(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例10.Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯左M2R小鼠黑素癌細(xì)胞上的PDT本實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)試Pd-BPheid和Pd-BPheid-乙酯對(duì)M2R細(xì)胞的作用。(i)材料如以上實(shí)施例1制備Pd-Bpheid，而按照WO97/19081所描述的方法制備Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸a乙酯(Pd-Bpheid-乙酯)。(ii)光源如以上實(shí)施例8(ii)所述光源，但以12mW/cm2、總能注量為7J/cm2，將細(xì)胞照射10分鐘。(iii)光毒性研究將M2R細(xì)胞在用HEPES(25mM，pH7.4)緩沖的Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)＋F12(1∶1)中培養(yǎng)為單層。包括胎牛血清(FBS)(10％)、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(0.06mg/ml)和鏈霉素(0.1mg/ml)，并于37℃在含8％CO2的濕潤(rùn)氛圍中培育所述細(xì)胞。對(duì)于光毒性分析，將細(xì)胞(1×104細(xì)胞/孔)在96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)至2×104細(xì)胞/孔的合適密度。將色素直接溶于培養(yǎng)基中或95％乙醇中，并在培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋至終濃度為1％乙醇。加入所述稀釋的色素，于37℃在黑暗中將所述細(xì)胞溫育4小時(shí)。照射之前，用新鮮培養(yǎng)基將所述細(xì)胞洗滌一次，并更換新鮮培養(yǎng)基。然后將所述板于室溫下從底部照射10分鐘，并置于37℃避光培養(yǎng)箱中。24小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活率。使用以下對(duì)照系統(tǒng)黑暗對(duì)照-保持在黑暗中的未處理細(xì)胞；光照對(duì)照-未用致敏劑處理的照射細(xì)胞；黑暗毒性-用色素處理但保持在黑暗中的細(xì)胞。通過(guò)如先前(WO97/19081)所述的[3H]-胸苷摻入，測(cè)定細(xì)胞存活率。(iv)結(jié)果正如可以在圖6A中所觀(guān)察的，如果將所述色素溶于95％乙醇中，則Pd-BPheid的LD50為0.03μM，而Pd-BPheid-乙酯的LD50為0.07μM。如果將所述色素直接溶于含10％血清的培養(yǎng)基中，則只有Pd-BPheid是完全有活性，而Pd-BPheid-乙酯在高達(dá)所測(cè)試的最高濃度1μM下都完全沒(méi)有活性(圖6B)。實(shí)施例11.Pd-BPheid在M2R小鼠黑素瘤細(xì)胞和人HT29結(jié)腸癌細(xì)胞上的PDT這些實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟跍y(cè)定Pd-BPheid對(duì)兩種細(xì)胞系M2R小鼠黑素瘤細(xì)胞和人HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的光毒性效應(yīng)。(i)材料如以上實(shí)施例1所述制備Pd-Bpheid。(ii)光源光源為氟氙LS3-PDT燈(Bio-Spec，Russia)，具有10cm水濾光器和720-850nm光帶。以12mW/cm2、總能量為7J/cm2，將細(xì)胞照射10分鐘。(iii)光毒性研究用具有以下變化如上所述(實(shí)施例10)的相同方案進(jìn)行分析將Pd-BPheid直接溶于含10％血清的培養(yǎng)基中，然后將其加入到所述細(xì)胞中。通過(guò)[3H]-胸苷摻入，測(cè)定M2R細(xì)胞的存活率，而用MTT分析測(cè)定人HT29細(xì)胞的存活率(Merlin JL等，1992 Eur.J.Cancer28A1452-1458)。(iv)結(jié)果如可以在圖7中所觀(guān)察的，人結(jié)腸HT-29細(xì)胞顯示對(duì)該色素較低的敏感性(0.5μM的LD50)，而M2R細(xì)胞的敏感性高約10倍(0.03μM的LD50)。實(shí)施例12.用Pd-BPheid的M2R小鼠黑素瘤腫瘤的體內(nèi)PDT本實(shí)驗(yàn)的目的是研究在CD1裸鼠中用2.5mg/kgPd-BPheid的M2R小鼠黑素瘤腫瘤的PDT。(i)材料如以上實(shí)施例1所述制備Pd-Bpheid。(ii)小鼠CD1裸鼠(25-30g)。(iii)麻醉法腹膜內(nèi)注射50μl氯胺酮/Rumpon(體積/體積＝85/15)。(iv)腫瘤植入法.用106M2R細(xì)胞植入小鼠背部，并在2-3周內(nèi)使腫瘤生長(zhǎng)至所述處理的大小(7-8mm)。(v)光源Osram 150W鹵素光學(xué)照相燈64643(D.K.Keller等1999，Int.J.Hyperthermia 15，467-474)，裝備λ＝650-900mn光譜窗，300mW/cm-2。照射30分鐘。(vi)PDT方案將所述已麻醉的小鼠靜脈內(nèi)注射所述色素，然后立即照射所述腫瘤。在療法結(jié)束時(shí)，將所述小鼠放回籠中。于指定的時(shí)間之前或于指定的時(shí)間，對(duì)所述腫瘤進(jìn)行照相。實(shí)驗(yàn)1致敏劑的制備將2mg Pd-BPheid溶于0.2ml cremophor EL中，然后超聲處理20分鐘。加入0.075ml 1，2-丙二醇，再繼續(xù)進(jìn)行超聲處理15分鐘。加入0.9ml 0.15mM NaCl，然后超聲處理5分鐘。將所述樣品于13,000rpm(Eppendorf)離心12分鐘。根據(jù)氯仿中的光譜，計(jì)算出Pd-BPheid的終濃度為0.5mg/ml。腫瘤的PDT將帶有M2R黑素瘤腫瘤的CD1裸鼠靜脈內(nèi)注射Pd-BPheid 2.5mg/kg。于300mW cm-2照射所述腫瘤30分鐘。所述小鼠皮膚腫瘤區(qū)的溫度為37.7-38℃。處理后1和4天繼續(xù)腫瘤的反應(yīng)。結(jié)果示于圖8中。實(shí)驗(yàn)2致敏劑的制備將2mg Pd-BPheid溶于0.1ml甲醇、0.1ml 0.1MKH2PO4、pH＝8.0和0.9mlPBS中，然后超聲處理10分鐘。用氬氣蒸發(fā)甲醇，加入20％cremophor EL1，2-丙二醇(3∶1)，然后超聲處理15分鐘。將所述樣品于13,000rpm離心8分鐘，根據(jù)氯仿中的光譜，計(jì)算出Pd-BPheid的終濃度為0.5mg/ml。腫瘤的PDT將帶有M2R黑素瘤腫瘤的CD1裸鼠靜脈內(nèi)給予Pd-BPheid 2.5mg/kg(120μl)。于300mW cm-2照射所述腫瘤組織30分鐘。所述小鼠皮膚腫瘤區(qū)的溫度為37.7-38℃。處理后1和4天繼續(xù)腫瘤的反應(yīng)。結(jié)果示于圖9中。結(jié)果如圖8和圖9所示，如上所述用2.5mg/Kg Pd-Bpheid的M2R黑素瘤腫瘤的PDT在24小時(shí)內(nèi)誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和腫瘤壞死。實(shí)施例13.基于Pd-BPheid的PDT降低小鼠中C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移形成的比率比外科手術(shù)有利為了比較基于Pd-BPheid和BChl-SerOMe的PDT的治療潛力，以及由基于Pd-BPheid和BChl-SerOMe的PDT引起的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的可能性，進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。(i)材料20％Cremophor EL中的Pd-BPheid(如實(shí)施例1所述制備)或Pd-BPpheid-SerOMe 5mg/kg。(ii)光源光源為氟氙LS3-PDT燈(Bio-Spec，Russia)，具有10cm水濾光器和720-850nm光帶。(iii)小鼠CD1裸鼠。(iv)腫瘤用106C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植至小鼠后腿的爪內(nèi)。當(dāng)達(dá)到長(zhǎng)度為7-8mm時(shí)，治療腫瘤。(v)麻醉50μl Vetalar/Rumpon(體積/體積＝85/15)。(vi)鎮(zhèn)痛在5％蔗糖飲水中加入羥考酮(12mg/升)，從(切斷術(shù)或PDT)時(shí)起持續(xù)1周。(vii)方案用5mg/Kg致敏劑(Pd-BPheid或Pd-BPpheid-SerOMe)靜脈內(nèi)注射3組小鼠(每組10只小鼠)，然后立即于200mw/cm2下照射30分鐘，讓動(dòng)物在其籠中恢復(fù)。組1和組2分別接受PDT Pd-Bpheid和Pd-BPpheid-SerOMe的動(dòng)物。在腹股溝中的腫瘤反應(yīng)和轉(zhuǎn)移形成持續(xù)4周。組3切斷踝關(guān)節(jié)，并且在腹股溝中的腫瘤轉(zhuǎn)移形成持續(xù)4周的動(dòng)物(與組1成對(duì))。對(duì)PDT的反應(yīng)參數(shù)為腫瘤壞死和消失的動(dòng)物占處理動(dòng)物總數(shù)的百分比。轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為腫瘤在腹股溝或其它部位的出現(xiàn)。認(rèn)為的終點(diǎn)是跟蹤4周，自然死亡，腫瘤達(dá)到直經(jīng)2cm，轉(zhuǎn)移，無(wú)論哪種反應(yīng)先出現(xiàn)均是終點(diǎn)。(viii)結(jié)果腫瘤變平(消失)的結(jié)果示于圖10中。而在第11天，對(duì)Pd-BPheid的反應(yīng)比對(duì)Pd-BPheid-SerOMe強(qiáng)(分別為100％和80％腫瘤變平)，過(guò)后，在第28天，反應(yīng)的百分比相似，約60％。從長(zhǎng)遠(yuǎn)觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，在某些處理的動(dòng)物中，腫瘤變平下降是由于某些腫瘤再生長(zhǎng)引起的，或可能是由于光場(chǎng)(light field)與腫瘤區(qū)錯(cuò)配引起的。轉(zhuǎn)移出現(xiàn)的結(jié)果示于圖11中。通過(guò)腿切斷的外科手術(shù)療法與PDT比較產(chǎn)生顯著更高的轉(zhuǎn)移百分比(高達(dá)78％)。此外，切斷后的轉(zhuǎn)移出現(xiàn)得更早。用Pd-Bpheid進(jìn)行PDT后的轉(zhuǎn)移頻率最低(至多23％)。該結(jié)果類(lèi)似于用Pd-BPheid-SerOMe獲得的結(jié)果，并且Pd-BPheid的主要優(yōu)點(diǎn)是延遲轉(zhuǎn)移出現(xiàn)。用Pd-BPheid或Pd-BPheid-SerOMe的PDT治愈C6神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤。PDT后的轉(zhuǎn)移形成如果與外科手術(shù)療法比較則顯著較低。
權(quán)利要求
1.一種式I、I’或I”的化合物 其中A代表OH，OR1，-O-(CH2)n-Y，-S-(CH2)n-Y，-NH-(CH2)n-Y，-O-(CH2)2-NH2，-O-(CH2)2-OH，-NH-(CH2)n-+No，X-，-NH-(CH2)2-NH＝BOC或-N-(CH2-CH＝CH2)2其中R1代表Na+、K+、(Ca2+)0.5、(Mg2+)0.5、Li+、NH4++NH3-C(CH2OH)3、+NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH，+NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH或+N(Cn′H2n′+1)4；R2代表H、OH或COOR4，其中R4為C1-C12烷基或C3-C12環(huán)烷基；R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；n為1、2、3、4、5或6，Y為-NR′1R′2或-+NR′1R′2R′3，X-，其中R′1、R′2和R′3相互獨(dú)立地代表-CH3或-C2H5；X為F、Cl、Br或I，n′為1、2、3或4，并且其中*表示一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳，而一代表一個(gè)飽和單鍵或一個(gè)不飽和雙鍵。
2.具有如下所示結(jié)構(gòu)式和光學(xué)構(gòu)型的權(quán)利要求1的化合物 其中A為OH或OR1，而R1如權(quán)利要求1中所限定。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中A為OH，所述化合物在此鑒定為Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸a(Pd-BPheid)。
4.一種作為藥物的如在權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的式I、I’或I”化合物。
5.一種藥用組合物，其包含至少一種如在權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的式I、I’或I”化合物以及生理上可接受的載體。
6.權(quán)利要求5的藥用組合物，其中所述組合物為溶液、脂質(zhì)乳劑或凝膠的形式，或?yàn)橹|(zhì)體或納級(jí)粒子的形式。
7.權(quán)利要求5或6的藥用組合物，其中所述化合物的存在量為所述組合物的總重量的0.01％-20％(重量)。
8.一種制備權(quán)利要求1中的式I化合物的方法，其中A為OH，所述方法包括以下步驟a)將M-BPheid-173-Z化合物聯(lián)合脫金屬和水解，其中Z為植基、香葉基香葉基或絲氨酰甲酯(SerOMe)，而M為選自Mg、Cd和Zn的金屬；和b)用Pd試劑將Pd摻入(a)中獲得的化合物中。
9.按照權(quán)利要求8用于制備Pd-BPheid的方法，其中細(xì)菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中被脫金屬和水解，并將所獲得的細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯一酸(BPheid)在步驟(b)中與Pd試劑反應(yīng)，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
10.一種制備權(quán)利要求1中的其中A為OH的式I化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)對(duì)BChlide-173-Z進(jìn)行金屬轉(zhuǎn)移，獲得對(duì)應(yīng)的Pd-BPheid-173-Z，其中Z為植基、香葉基香葉基或SerOMe；和b)水解(a)中所獲得的化合物。
11.按照權(quán)利要求10用于制備Pd-BPheid的方法，其中細(xì)菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中被進(jìn)行金屬轉(zhuǎn)移，以由Pd取代所述天然中心Mg原子，并將所獲得的其中Z為植基的Pd-BPheid-173-Z在步驟(b)中水解，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
12.一種制備權(quán)利要求1中的其中A為OH的式I化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)酶促水解其中Z為植基或香葉基香葉基的BChlide-173-Z，獲得BChlide；b)將(a)的所述Bchlide進(jìn)行酸性脫金屬；和c)用Pd試劑將Pd摻入到(b)的所述脫金屬的化合物中。
13.按照權(quán)利要求12用于制備Pd-BPheid的方法，其中細(xì)菌葉綠素a(Bchla)在步驟(a)中進(jìn)行酶促水解、在步驟(b)中脫金屬并在步驟(c)中與Pd試劑反應(yīng)，產(chǎn)生所需的Pd-BPheid。
14.按照權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的方法，還包括使所述獲得的Pd-BPheid化合物與對(duì)應(yīng)的R1-H或A-H化合物反應(yīng)的步驟，以獲得其中A不為OH的式I化合物。
15.按照權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述Pd試劑是乙酸鈀或氯化鈀。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中通過(guò)采用抗壞血酸鈉或抗壞血酸的兩步法，或者通過(guò)采用6-O-棕櫚酰-L-抗壞血酸的一步法，進(jìn)行所述Pd的摻入。
17.如在權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制備可用于腫瘤的光動(dòng)力療法(PDT)的藥用組合物。
18.如在權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的式I、I’或I”化合物的用途，用于制備可用于活體外殺傷細(xì)菌、病毒、寄生物和真菌的組合物。
19.Pd-BPheid的按照權(quán)利要求17或18的用途。
20.一種作為中間體的式II或式III化合物
全文摘要
鈀取代的式(Ⅰ)細(xì)菌葉綠素衍生物可用于光動(dòng)力療法(PDT)領(lǐng)域,其中A代表OH、OR
文檔編號(hào)A61P31/10GK1334728SQ99816058
公開(kāi)日2002年2月6日 申請(qǐng)日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月9日
發(fā)明者A·謝茲, Y·薩洛蒙, A·布蘭迪斯, H·謝爾 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司