專利名稱：脂肪細胞,脂肪細胞系及其應用的制作方法
描述本發(fā)明涉及含脂肪或脂并產生皮脂的皮膚和粘膜細胞，亦稱脂肪細胞。本發(fā)明特別涉及皮脂腺細胞和一個能通過大規(guī)模的傳代培養(yǎng)而連續(xù)培養(yǎng)的皮脂腺細胞系。脂肪細胞尤其適合有價值的應用，如人和動物的皮脂腺的生理和病理研究，研究痤瘡、皮脂溢或其他疾病的發(fā)生，測定不同的物質和藥物的有效性，開發(fā)基于二維或三維的細胞裝配和器官樣結構構建的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，及來自于這些細胞的產物的生產。
依靠Xia等培養(yǎng)技術的改進，最近幾年脂肪細胞的體外培養(yǎng)的可重復性已經有提高。因此，Ziyboulis等(《皮膚藥理學》1991；474-83)在培養(yǎng)基中省略了皮質醇，加入了人血清。Lee(上皮細胞生理學和細胞培養(yǎng)進展；C.J.Jones，編輯Kluwer，Dordrecht，1990；333-350)在有豐富添加物的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)皮脂腺之前利用膠原酶處理它們。還有，原代脂肪細胞培養(yǎng)物通過去掉作為粘附基質層的3T3成纖維細胞層而獲得(Akamatsu等。《皮膚病學調查雜志》1992；99509-511)。傳代培養(yǎng)物維持在添加無脂血清的培養(yǎng)基中(Zouboulis等，《皮膚病學調查雜志》。1993；101628-633)，及在無血清的含角質形成細胞但沒有添加物的基本培養(yǎng)基中(Akamazu等?！镀つw病學調查雜志》1992；99509-511)。并且，研究表明角質形成細胞生長因子明顯增加人脂肪細胞的產量和增殖(Chen等?！镀つw病學調查雜志》1998；11084-89)。
盡管有這些技術的進步，未來的進展非常受限于一個狀況來自于分離的人皮脂腺的脂肪細胞的大量培養(yǎng)非常困難。尤其是在培養(yǎng)時長期保存細胞材料非常困難?；谝陨系脑?，可以設想脂肪細胞通過細胞膜破裂趨于分化并且死亡，隨后釋放內容物。最好的結果是Fujie等獲得的(《皮膚病研究檔案》1996；288703-708)，他以Xia等(1989)的技術為基礎分離了皮脂腺，利用分散細胞培養(yǎng)的方法，在無血清無細胞粘附層的角質形成細胞生長因子培養(yǎng)基中通過六次傳代培養(yǎng)培養(yǎng)了脂肪細胞。
發(fā)明摘要本發(fā)明的目的是提供可通過較高代次的傳代培養(yǎng)而穩(wěn)定培養(yǎng)的脂肪細胞。也就是說，從形態(tài)學、表型和功能特征的表象上來說，提供的脂肪細胞應接近活的正常的人脂肪細胞，至少是在這種程度上即它們適合作為用于生理、病理生理和制藥評價和研究的細胞材料或含脂、產皮脂的細胞，尤其脂肪細胞的細胞培養(yǎng)模型。
本發(fā)明目的通過提供永生化的脂肪細胞而實現。合適地，本發(fā)明的細胞來自于人，因為這是實際應用最感興趣的。這種脂肪細胞存在于人皮脂腺細胞系SZ95中，其在德意志微生物保藏中心保藏，保藏號為DSM ACC2383。
優(yōu)選的實施方案描述本發(fā)明以下參考附圖進行詳細描述。

圖1和圖2表明本發(fā)明提供的永生化的SZ95脂肪細胞保持了正常的原代脂肪細胞(本例中來自于人)的表皮的、多態(tài)的表觀。而且，提供的永生化的脂肪細胞和其克隆(一個克隆意味著來自于單個細胞)表達典型的94kD大小的SV-40大T抗原，其用編碼DNA序列進行了轉染，在傳代培養(yǎng)物中也是如此。圖1表明(a)正常，第二次傳代培養(yǎng)的脂肪細胞，本發(fā)明提供的永生化的脂肪細胞來源于此，(b)由初次傳代培養(yǎng)來源的永生化的脂肪細胞提供的粘附脂肪細胞培養(yǎng)物，(c)提供的永生化的脂肪細胞(克隆的第50代傳代培養(yǎng)物)。所有的細胞表現了相似的表皮的多態(tài)結構。圖2顯示了下述細胞的細胞離心樣品，(a)提供的永生化的脂肪細胞，(b)作為陽性對照細胞的內皮細胞培養(yǎng)物細胞HMEC-1，兩者均用SV-40大T抗原的單克隆抗體標記。兩種樣品均被陽性標記，且顯示人SV-40大T抗原尤為集中在細胞核內表達，部分在細胞漿中表達。在(c)中，Western印跡分析說明了人SV-40大T抗原在提供的永生化的脂肪細胞中的表達。盡管人SV-40大T抗原在未轉染的、正常的人脂肪細胞(第1道)和正常的人表皮角質形成細胞(第2道)中位檢測到，但是特征性94kD大的蛋白質在第34代傳代培養(yǎng)的永生化的脂肪細胞的蛋白提取物中檢測到(第3道)，在三個分離的克隆中也檢測到(第4、5、6道)。
本發(fā)明的永生化的脂肪細胞是人來源的，術語“脂肪細胞”的含義具有很廣泛的意義，即，涉及所有的或多或少含有脂肪或脂質以及產生皮脂的細胞。皮脂純粹由不同的脂肪或脂質物質組成。由此，細胞的脂肪或脂質含量可在脂質物質成分和脂質物質成分的含量方面有所變化。通常但非必需地，細胞的脂肪或脂質物質含量包括游離的脂肪酸、甘油三酯、蠟、鯊烯、游離膽固醇、膽固醇酯、二羥基膽固醇和其他的類固醇及烴。那些來源于人皮脂腺細胞的永生化的脂肪細胞是特別優(yōu)選的。假如脂肪細胞來自于人面部皮脂腺，就非常的適合醫(yī)學用途。
本發(fā)明的脂肪細胞的基本特征是它們的永生化。本發(fā)明的永生化基本上意味著在多次傳代培養(yǎng)中保持了細胞的重要特征。本發(fā)明的永生化脂肪細胞SZ95可保持培養(yǎng)4.5年、超過50次傳代，而正常的人脂肪細胞僅生長3-6代便死亡。
本發(fā)明的永生化的脂肪細胞可利用與增殖抑制基因形成穩(wěn)定的非活性復合物的DNA，轉染人源的尤其是人皮脂腺的正常脂肪細胞而獲得。本發(fā)明的一個非常成功的永生化是通過用包含編碼SV-40大T抗原的DNA序列的DNA轉染正常人脂肪細胞、特別是衍生自面部皮脂腺的脂肪細胞而實現。SV-40大T抗原(蛋白)的永生化效果和DNA編碼序列轉染人細胞的相應應用是已知的。這樣，通過用編碼大T抗原的DNA轉染例如表皮來源的其它細胞(見Tohyama等，《實驗醫(yī)學雜志》1997；18275-82；Bae等，《前列腺》1998；34275-282)，及內皮來源的細胞(見Ades等，《皮膚病學調查雜志》)從而獲得永生化的細胞系。
利用陽離子脂(Lipofectin試劑，其是含陽離子脂DOTMA(1.2-二油酰氧基丙基-3-三甲基氯化銨)和DOPE[二油基磷脂酰乙醇胺]于膜過濾的水中[1mg/ml]的1∶1(w/w)脂質體配制品)，通過細胞的胞吞作用經陽離子/DNA復合物攝入外源DNA(見Wang等，《體外細胞發(fā)育生物學》1991；27A63-74；Staedel等，《皮膚病學調查雜志》，1994；102768-772)的基因轉移方法轉染脂肪細胞后發(fā)現，永生化得到了很好的結果，而轉染混合物中優(yōu)選含另外0.25到2.0％(體積)、尤其是2.0％(體積)的Lipofectin試劑及0.05-0.5％(重量)、特別是0.5％(重量)的于合適的轉染緩沖液中的外源DNA。外源DNA，如編碼SV-40大T抗原蛋白的DNA，典型地插入一個合適的表達載體中，由此優(yōu)選通過啟動子和增強子序列而使蛋白質的表達水平增強。如果在優(yōu)選的實施方案中，正常的人脂肪細胞用編碼SV-40的大T抗原的DNA轉染，則可以設預期脂肪細胞在成功的轉染和永生化后會表達SV-40的大T抗原。利用針對SV-40大T抗原的單克隆抗體進行的免疫細胞化學和Western印跡分析確證了本發(fā)明提供的永生化脂肪細胞中大T抗原的表達。
這樣得到的永生化的脂肪細胞優(yōu)選地以細胞系的狀態(tài)存在，這樣可達到理想的應用目的。
本發(fā)明的永生化的脂肪細胞在適應無血清培養(yǎng)基后，其生長比未轉染的、正常人脂肪細胞狀態(tài)好，它們保持合成皮脂腺細胞特征性脂質的能力，這與在無血清培養(yǎng)中的未轉染的正常的人脂肪細胞相反。根據本發(fā)明的永生化的脂肪細胞可作為持續(xù)更新和繁殖的細胞系并可在一定的培養(yǎng)基中生長。
根據本發(fā)明的永生化的脂肪細胞的特殊價值是它們具有未轉染的、正常的和分化的脂肪細胞的形態(tài)、表型和功能方面的特征。這樣，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞可作為生理學、病理生理學和藥理學研究的優(yōu)秀模型。同時，人源的常規(guī)培養(yǎng)的脂肪細胞的有限的生存能力的不利因素也消除。因此，本發(fā)明提供的永生化的脂肪細胞能基本保持正常脂肪細胞的表型，在功能方面與未轉染的正常人面部脂肪細胞相似。
根據本發(fā)明的永生化的脂肪細胞或脂肪細胞系表現出多態(tài)、表皮表觀，與未轉染的正常人脂肪細胞相似。細胞培養(yǎng)時，細胞大小與細胞內結構多樣，后者表明了細胞成熟的不同階段。因此，觀察到不同大小的細胞，是融合生長的平均5-6倍，這與未轉染的正常人脂肪細胞在體外的程序性分化(平均4-5.5倍大小差異)相符合。而且，根據本發(fā)明，永生化的脂肪細胞在細胞漿中富含脂肪物質或脂質顆粒，與未轉染的正常人脂肪細胞相似。特征性皮脂腺的脂質鯊烯和蠟酯(正常的人脂肪細胞產生)的合成在本發(fā)明的實驗中被證實。而且，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞合成游離脂肪酸，同樣與未轉染的正常人脂肪細胞的體外發(fā)現相符合，即使多次傳代培養(yǎng)也是如此。
而且，確證脂肪細胞來源，提示能存活的分化的表達標記也被證實是本發(fā)明的永生化的脂肪細胞及細胞系的脂肪細胞的典型標記。因此，永生化的脂肪細胞或脂肪細胞系表達人多形態(tài)表皮粘液蛋白團，如皮脂腺抗原、人奶脂球蛋白1和2、人表皮唾液粘蛋白、Thomsen-Friedenreich抗原、粘蛋白樣致癌物相關抗原和表皮膜抗原。以上在本發(fā)明過程中利用免疫細胞化學和Western印跡的方法得到了確證。另外，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞或脂肪細胞系表達角蛋白抗原，它在未轉染的正常人脂肪細胞如亞類7、13和19很典型。該抗原表型說明了脂肪細胞來源和脂肪細胞的分化。
在功能方面，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞或脂肪細胞系與未轉染的正常人脂肪細胞相似。這樣，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞對雄激素如5α-雙氫睪丸酮產生應答，體外增殖加強。而且，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞或脂肪細胞系能通過類維生素A尤其是非芳香族類型的類維生素A(如13-順式視黃酸、全反式視黃酸)改變它們的增殖。
本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案是永生化的優(yōu)選地為人的脂肪細胞得到克隆。這是一個優(yōu)勢，因為永生化的脂肪細胞或由此產生的脂肪細胞系通過其獨特的基因組基礎很好地定義并特異地表征?？寺〉挠郎酥炯毎悼赏ㄟ^在足夠長的培養(yǎng)管中逐漸稀釋永生化的脂肪細胞直到每個培養(yǎng)管中僅從一個細胞重新開始細胞分裂而得到?？赏ㄟ^顯微鏡來觀察和控制這一過程。
相應地，本發(fā)明中發(fā)現，與未轉染的正常人脂肪細胞相比，本發(fā)明得到的永生化的人脂肪細胞或因此產生的脂肪細胞系基本保留了脂肪細胞的特征。這一點從特征鑒定和功能測定中證實。
具有本發(fā)明以上闡述的優(yōu)點的一個脂肪細胞系，命名為SZ95，是皮脂腺細胞系，其保藏于DSMZ，保藏號為ACC2383。
因此，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞或脂肪細胞系提供了有價值應用的非常好的可能性。一般地，本發(fā)明的脂肪細胞或脂肪細胞系可用于診斷、治療和化妝品應用。特別是，上述的脂肪細胞或脂肪細胞系可以用于開發(fā)和研究含脂質的產生皮脂的細胞，尤其是人或動物皮脂腺細胞的生理學或病理生理學，和它們在皮膚的病理生理過程和皮膚病如痤瘡疾病中的作用。在本發(fā)明的幫助下，可以研究痤瘡和/或皮脂溢和/或其他疾病，尤其是在皮脂腺功能起作用或可能起作用的皮膚疾病的產生。本發(fā)明的產品將來可作為檢測和評價抗痤瘡化合物和/或抗皮脂溢化合物或治療劑的優(yōu)異模型，還可作為抗病、特別是皮脂腺功能相關的皮膚病的治療劑。尤其是臨床研究，如體外研究藥物的藥理特性研究中發(fā)揮作用。
本發(fā)明的脂肪細胞或脂肪細胞系的優(yōu)點還包括可建立進一步的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。這包括開發(fā)簡單或復雜的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。簡單的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是二維單層或多層粘附培養(yǎng)物或非粘附培養(yǎng)物，其例如通過將前述的脂肪細胞加入到其他細胞中，或通過半透膜或非透膜培養(yǎng)而形成(Schartz等，《外科研究雜志》1998；7679-85；Nackman等，《外科》1998；124353-361)。復雜的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是三維的單層或多層培養(yǎng)物，其例如通過培養(yǎng)細胞形成球狀體，在球狀體上，在膠原或其他的膠狀物材料或人工皮膚樣結構上培養(yǎng)細胞(Korff和Augustin，《細胞生物學雜志》1998；1431341-1352；Hamamoto等；《生物化學雜志》(東京)1998；24972-979；Desoize等，《抗癌研究》1998；184147-4158；Hamilton《癌癥通訊》1998；13129-34；Niemann等，《細胞生物學雜志》1998；143533-545；Awata等，《胃腸病學肝病學雜志》1998；13增刊S55-61)；Voura等，《顯微研究技術》1998；43265-275；Pipili-Synetos等，《不列顛藥理雜志》1998；1251252-1257；Vasile等，《組化和細胞化學雜志》1999；47159-168；Michalopoulos等?！陡闻K病學》1999；2990-100；Trent和Kirsner，《國際臨床醫(yī)師雜志》1998；52408-413；Fransson等《不列顛皮膚病學雜志》1998；139598-604；Konstantinova等，《皮膚病學研究檔案》1998；290610-614；Black等，FASEB雜志，1998；121331-1340；Zhao等，《生物化學與生物物理研究通訊》1999；25449-53)。
一個特別有利的應用涉及三維細胞集群的產生或者基于本發(fā)明脂肪細胞或脂肪細胞系的器官樣結構的建立或重建。為此，單獨使用脂肪細胞，但優(yōu)選地也加入其它產生皮膚的細胞，尤其是角質形成細胞、成纖維細胞、黑素細胞、內皮細胞、朗罕氏細胞和/或來自毛囊的細胞。為產生三維細胞集群或器官樣結構的建立或重建，首先提供一個含有膠原或其它膠狀材料和/或部分非活性組織的支架，然后前面提到的細胞填充或敷于支架上。這個方法對于本領域熟練技術人員是基本知識(Trent和Kirsner，《國際臨床醫(yī)師雜志》1998；52408-413；Fransson等《不列顛皮膚病學雜志》1998；139598-604；Konstantinova等，《皮膚病學研究檔案》1998；290610-614；Black等，FASEB雜志，1998；121331-1340；Zhao等，《生物化學與生物物理研究通訊》1999；25449-53)。由此產生一種“人工皮膚”或皮膚替代物，其為移植醫(yī)學、對于受損傷皮膚如燒傷的重建或皮膚病損的治療提供了很好的可能。借助于本發(fā)明，當本發(fā)明的脂肪細胞摻入其中時，這樣的“人工皮膚”可合成足量的脂質/皮脂。
更進一步的應用領域涉及生產來自于本發(fā)明的脂肪細胞或脂肪細胞系的產品。這包括細胞物質如脂質、蛋白質、DNA和/或RNA的分離和純化。由于細胞是永生化的，它們可以不斷提供這些細胞物質?？蓮倪@些細胞中獲得的特別合適的例子包括，局部藥用的皮膚脂質、下面實施例3提到的與脂肪細胞表型特征關聯(lián)的抗原蛋白、更進一步的質粒DNA或載體DNA的產生。質粒DNA或載體DNA是通過遺傳工程產生的，這對于本領域熟練的技術人員是知道的。因此，可以得到誘導脂質產生的基因。尤其是用這樣合適的質粒和載體，也包括病毒載體，其他的細胞或生物體可被改變或轉染。
本發(fā)明參考如下非限制的實施例更詳盡地解釋。
實施例如下描述的實施例，可應用如下具體的材料和方法。實施例不應當被理解為是限制性的。
細胞培養(yǎng)如不另外說明，所有的細胞均于由改良的DMEM/HAM F12培養(yǎng)基(1∶1)(Biochrom公司，柏林，德國)組成的培養(yǎng)基中粘附培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含2mM的N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酸，并加入10％熱滅活的胎牛血清(FCS；Biochrom)和50μm/ml慶大霉素(Gibco公司，卡爾斯魯厄，德國)。在含5％CO2的濕度氣氛下于37℃培養(yǎng)。每2-3天換液。
正常人脂肪細胞的分離和培養(yǎng)正常的脂肪細胞是從一個87歲的外科手術女性病人面部皮膚上分離的，Xia曾報道(皮膚病學觀察雜志1989；93315-321)。分離的皮脂腺在無滋養(yǎng)層的補加9ng/ml的表皮生長因子，9ng/ml的角質形成細胞生長因子(均得自Boehringer Mannheim，德國)，0.4μg/ml氫化可的松(得自Sigma，Deisenhofen，德國)，10-9M霍亂毒素(得自Calbiochem，Bad Soden，德國)的標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)。原代正常脂肪細胞培養(yǎng)物作為皮脂腺小葉周圍的生長暈而獲得。
免疫細胞化學測定次融合的正常脂肪細胞培養(yǎng)物的分散細胞經細胞離心吸附到玻璃片上。樣品在空氣中晾干后冰丙酮固定10分鐘。樣品隨后在室溫與相應的單克隆抗體或對照抗體孵育30分鐘。加入1∶100稀釋的兔抗鼠IgG(重鏈+輕鏈)和堿性磷酸酶/抗堿性磷酸酶復合物(Dianova，漢堡，德國)室溫30分鐘，檢測結合的抗體。一抗和二抗在含10％RPMI-1640和10％胎牛血清(pH7.4)的溶液中稀釋。用不含鈣離子和鎂離子的PBS緩沖液(得自Biochrom)洗滌三次。樣品用Neufuchsin作為粘附試劑，萘酚鹽作為偶聯(lián)試劑，在緩沖液中染色30分鐘，用Mayer’s Haemalum(Merck，達姆施塔特，德國)復染，覆蓋并用光顯微鏡觀察。
分離和定量蛋白細胞培養(yǎng)物用PBS洗兩次，在培養(yǎng)瓶中用冰冷的溶液(50mMHEPES，1％Nonidet P-40(ICN，Aurora，美國)，150mM NaCl，蛋白酶抑制劑(CompleteTMMini，寶靈曼公司))裂解，隨后刮下并收集細胞轉移至離心管分離細胞蛋白。得到的材料利用超聲破碎攪均，離心后收集上清置于冰上。加入雙辛可寧酸(BCA-蛋白分析，Pierce，Rochford，伊利諾伊斯州，美國)可見總蛋白，蛋白濃度通過測定550nm的吸收值來定量。
Western印跡分析分離的蛋白等份(20μg)加熱至95℃15分鐘。一維SDS-PAGE電泳，使用7.4％濃度的膠。然后，利用標準的轉印系統(tǒng)(伯樂公司，Munchen，德國)將蛋白轉印到膜(PVDF Immobilon-P，Millipore公司，Eschborn，德國)上。印跡與第一抗體在室溫孵育60分鐘，然后分別和0.2μg/ml稀釋的辣根過氧化酶綴合的羊抗鼠單抗和羊抗兔單抗(Oncogene Science)在室溫孵育60分鐘。徹底洗滌后，信號通過化學發(fā)光法用標準分析(ECL，Amersham公司，Braunschweig)顯影在X光片(XAR5，柯達公司，Rochester，紐約州，美國)上，其中不同的發(fā)光間隔可調。
油紅和尼羅紅染色細胞生長在鉗片中與0.6％的油紅或60％的異丙醇孵育15-120分鐘，或用1μg/ml的尼羅紅(柯達公司)在室溫染色15分鐘，如Xia報道(1989)。培養(yǎng)物隨后在光學顯微鏡下觀察(油紅染色后)或利用450-500nm波段發(fā)光＞580nm的激發(fā)濾光片在熒光顯微鏡下觀察。
流式細胞方法分散的未標記的細胞利用常規(guī)的分選儀依據細胞大小判斷，而標記尼羅紅染料(柯達公司)的細胞利用流式細胞儀根據熒光來判斷脂質含量。每個樣品約測定10.000個細胞。
標記和脂質提取細胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后通過[2-14C]醋酸鈉(45-60 mCi/mmol；杜邦公司，波士頓，美國)進行放射性脈沖，其在PRMI-1640中的濃度是0.5μCi/ml，培養(yǎng)基中含2mM的L-谷氨酸，10％熱滅活的胎牛血清和100IU/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。孵育進一步持續(xù)24小時，脂質從培養(yǎng)的細胞和培養(yǎng)上清中分離，并分為中性脂質、脂肪酸和磷脂(見Seifert等，《皮膚病學調查雜志》1997；108375)。
中性脂質和脂肪酸的大小分離組分可通過在20×10cm2硅膠覆蓋的玻璃板(Merck公司，達姆施塔特，德國)上進行的高效薄層層析法(HPTLC)觀察。玻璃板用正己烷預處理，晾干24小時。樣品利用自動的脂質加樣器(Linomat IV；Camag，柏林，德國)加樣。中性脂質層析譜在正己烷-二乙醚溶液(9∶1)中顯色在9厘米，晾干，在氯仿/二乙醚，乙酸乙酯(80∶4∶16)的溶液中顯色后在4.5厘米。利用發(fā)光片(TR 2040S，富士公司，東京，日本)發(fā)光，用圖象分析儀(BAS 1000生物成像分析儀，富士)掃描。脂質標準作為對照樣品。
生長行為測定細胞接種到96孔板，濃度為0.5-4×103/孔。細胞增殖利用4-甲基umbelliferyl庚酸酯熒光分析自動測定(Zouboulis等，《黑素瘤研究》1991；191-95)。
至此，在測定時，倒掉培養(yǎng)基，細胞用PBS洗兩次，每孔加入100μl的稀釋于PBS的100μg/ml 4-甲基umbelliferyl庚酸酯溶液(Sigma，Deisenhofen，德國)。培養(yǎng)板在37℃放置30分鐘，利用合適的熒光測量儀器(Titertec-Fluoroscan II；Flow，Meckenheim，德國)測定發(fā)射的熒光。在355nm激發(fā)和460nm發(fā)射濾片獲得熒光單位。
用5α-二氫睪丸酮和類維生素A處理將5α-二氫睪丸酮(Sigma)溶于二甲基亞砜，然后溶于無血清無酚的含2mM的N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酸的改良的DMED/Ham’s F12培養(yǎng)基(1∶1)(Gibco-BRL)中，該培養(yǎng)基補加5ng/ml的EGF，50μg/ml的牛垂體提取物，1mg/ml無脂肪酸的牛血清白蛋白(寶靈曼)和50μg/ml慶大霉素，從而5α-二氫睪丸酮終濃度為10-6M和二甲基亞砜為0.1％。用0.1％二甲基亞砜作為對照組。細胞(0.5-2.0×103/孔)用5α-二氫睪丸酮處理18天。
對于類維生素A處理，將全反式視黃酸、13-順式視黃酸和acitretin溶于DMSO，隨后置于無血清的含2nM N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酸的改良DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基(1∶1)中，該培養(yǎng)基補加5ng/ml的EGF，50μg/ml的牛垂體提取物，1mg/ml無脂肪酸的牛血清白蛋白(寶靈曼)和50μg/ml慶大霉素，從而類維生素A終濃度為10-7M和二甲基亞砜為0.1％。用0.1％二甲基亞砜作為對照組。類維生素A在暗琥珀色光下操作。細胞(0.5-1×103/孔)用類維生素A處理9天。
統(tǒng)計學分析生長研究在96孔板上做6次重復。所有的其他實驗做3次。
實施例1正常人脂肪細胞轉染轉染正常人脂肪細胞所用載體為pSVT，其是以pBR322為基礎構建的，其包含編碼SV-40大T抗原的序列，蛋白表達由勞斯肉瘤病毒長末端重復序列所控制(見Dutt，《癌基因》，1990；5195-200；Wang等，《體外細胞發(fā)育生物學》，1991；27A63-74)。第二次傳代培養(yǎng)的人脂肪細胞培養(yǎng)物在35mm的培養(yǎng)皿(Becton Dickinson，Plymouth，UK)中長到50％融合時用于轉染。轉染以陽離子脂質體基因轉染法為基礎。為此，使用LIPOFECTIN試劑，其含有陽離子脂質DOTMA(1，2-二油酰氧基丙基-3-三甲基氯化銨)和DOPE[二油基磷脂酰乙醇胺]于膜過濾的水中[1mg/ml]中的1∶1(w/w)脂質體配制品)。至此，棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)的細胞用無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM，來自Gibco-BRL)洗2次，在此培養(yǎng)基中孵育4小時。然后培養(yǎng)基以轉染混合物代替，所述混合物由不含抗生素量的Opti-MEM培養(yǎng)基(1.5ml)和適量的LIPOFECTIN試劑(Gibco-BRL；5-30μl，最優(yōu)選1.5％(體積))及適量的溶于0.5ml PBS的pSVT DNA(1-10μg，DNA終濃度最優(yōu)選為0.5％(wt))組成。培養(yǎng)物在含5％CO2的濕度環(huán)境于37℃孵育24小時。培養(yǎng)物用培養(yǎng)基洗2次，然后在上述的脂肪細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
轉染處理后，在4周過程中觀察到pSVT處理的脂肪細胞的存活性急劇降低。但是用最佳量的LIPOFECTIN試劑和pSVT DNA，增殖的脂肪細胞集落出現。這些細胞(SZ95)能夠傳代至今超過50次。它們在4.5年的觀察期間始終存活。
實施例2永生化的人脂肪細胞克隆將如此的永生化的人脂肪細胞SZ95系列稀釋接種到96孔板中，細胞數由1×102為第一組，直到最后一組為0個細胞(Zouboulis等，“皮膚惡性黑素瘤”，CE Orfanos和C.Garbe編輯，Muckschwerdt，Munchen，德國，1990；158-168)。細胞在加入5mg/ml EGF和3ng/mlKGF的標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，每孔由單個細胞長成的細胞認為是克隆。這樣，得到了SZ95克隆細胞。
實施例3永生化的脂肪細胞的鑒定檢測SV-40大T抗原永生化的脂肪細胞中，利用免疫細胞化學和Western印跡法，采用鼠血清來源的抗大T抗原的單克隆抗體(Oncogene Science，劍橋，美國)檢測了SV-40大T抗原的表達，所述單克隆抗體1∶1000稀釋用于免疫細胞化學分析，1∶100稀釋用于Western印跡分析。人正常表皮角質形成細胞，皮膚成纖維細胞和作為陽性對照的內皮細胞HMEC-1(被SV-40大T抗原永生化，見WO-A-992/175 69)作為參比。
根據實施例1，利用大T抗原的單抗進行的永生化的脂肪細胞的免疫細胞化學實驗的結果發(fā)現大多在細胞核，部分在細胞漿有明顯的染色(見圖2a)。正常的角質形成細胞和成纖維細胞一致為大T抗原陰性，HMEC-1細胞作為陽性對照則在細胞核，部分細胞漿中有SV-40大T抗原的染色(圖2b)。
圖2c顯示了在未轉染的正常人SV-40大T抗原的Western印跡的分析結果(第1道)，及正常人表皮角質形成細胞(第2道)和本發(fā)明的永生化的脂肪細胞(第34代傳代培養(yǎng)，第3道)，及本發(fā)明的不同克隆脂肪細胞(4、5、6道)。94kD帶被確認是永生化的脂肪細胞和它的克隆中表達的SV-40大T抗原(見Harlow等，《病毒學雜志》，1981；39861-869)。
本發(fā)明的永生化的脂肪細胞的表型鑒定根據實施例1，永生化的脂肪細胞SZ95形態(tài)學是表皮的，表現出多形態(tài)性，細胞大小不同，在細胞漿中有很多小滴(見圖1b和1c)。
用相關的抗體進行的本發(fā)明永生化脂肪細胞的免疫細胞化學實驗結果顯示，與正常表皮角質形成細胞沒有染色相比，檢測到皮脂腺抗原的染色和表達(見圖3)。圖3顯示免疫細胞化學結果，(a)本發(fā)明的永生化的脂肪細胞，(b)正常人表皮角質形成細胞。制備物用抗皮脂腺抗原的單克隆抗體染色。本發(fā)明的永生化的脂肪細胞顯示胞漿染色呈陽性，正常人表皮角質形成細胞沒有染色。
另外，利用Western印跡檢測到永生化的脂肪細胞中，角蛋白7、13和19和人多態(tài)表皮粘蛋白組的各種蛋白的表達，而人角質形成細胞只表達角蛋白13(見圖4)。根據圖4，在Western印跡分析中，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞(第34代培養(yǎng)物，第1道)，本發(fā)明的各種克隆的永生化的脂肪細胞(第2、3、4道)和正常人表皮角質形成細胞(第5道)的總蛋白提取物用來檢測人表皮唾液粘蛋白(＞300kD)，人乳脂球蛋白(HMFG-1)(400kD)，人乳脂球蛋白(HMFG-2)(80-400kD)，粘蛋白型癌關聯(lián)蛋白抗原(MCA)(350kD)，表皮膜蛋白(EMA)(250-400kD)，Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原)(155kD)，角蛋白7(54kD)，角蛋白13(54kD)，角蛋白19(40kD)，5α-還原酶I型(21-27kD)。本發(fā)明的永生化的細胞系和它的克隆均表達所測的蛋白，而角質形成細胞只表達角蛋白13和5α-還原酶I型。
脂質合成用尼羅紅染色和熒光顯微鏡觀察表明細胞漿內有脂質存在。本發(fā)明的永生化的脂肪細胞SZ95(圖5)用尼羅紅熒光染色，中性脂質著色，結果單個或成團脂質小團隨機分散在脂肪細胞的胞漿中，尼羅紅染色熒光細胞計數實驗結果表明，本發(fā)明的永生化的脂肪細胞的內容物由有血清培養(yǎng)基中每細胞510熒光單位(中間值)下降至無血清培養(yǎng)中的每個細胞429個熒光單位。本發(fā)明的永生化的脂肪細胞(實施例1)合成多種中性脂質部分，包括典型的皮脂腺脂質鯊烯、蠟酯、甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯、甘油二酯、羊毛甾醇和游離脂肪酸。25-40傳代培養(yǎng)物均觀察到這一點。圖6示出了結果，其利用放射性測量成像評價永生的和克隆的脂肪細胞培養(yǎng)物(見第3、4道和5道)；放射性標記醋酸鈉后脈沖記錄測定了HPLC分離的脂質。第3、4、5道顯示，細胞合成多種中性脂質部分，包括鯊烯、蠟酯、甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯、甘油二酯、羊毛甾醇和游離脂肪酸。在細胞外上清中所有的中性脂質被發(fā)現，但含量較少(見6道)。為進行比較，采用1道脂質標準，2道人皮脂、4道游離脂肪酸。作為進一步比較，7道和8道表明角質形成細胞的結果。7道表明細胞中膽固醇和甘油三酯為主，而上清(8道)主要是膽甾醇。
增殖研究本發(fā)明的永生化的脂肪細胞對數生長曲線在正常培養(yǎng)狀態(tài)下觀察到，細胞群倍增時間是52.4±1.6，而與最初的細胞培養(yǎng)物密度無關。圖7顯示一個永生化的克隆脂肪細胞系SZ95在18天內在脂肪細胞培養(yǎng)基中的增殖情況。
永生化的脂肪細胞在加入無血清培養(yǎng)基后增殖下降，但加入5α-DHT后，增殖恢復正常。圖8顯示了這樣一個脂肪細胞克隆的例子，在無血清培養(yǎng)基(對照)以及加入10-6M的5α-DHT無血清培養(yǎng)基中觀察細胞增殖(接種2000/孔)18天。在第8天后，5α-DHT明顯增加細胞增殖，所測定的細胞群倍增時間是136小時(對照)和53.7小時(5α-DHT處理的細胞，*，p＜0.05；**，p＜0.01)。
類維生素A對永生化細胞的影響顯示出增殖行為的分化應答。盡管一些克隆表現為類維生素A的增殖抑制(典型的順序是13-順式視黃酸＞全反式視黃酸＞＞acitretin)，但其他的克隆增殖被促進(如被全反式視黃酸和13-順式視黃酸促進)，與正常人表皮角質形成細胞增殖應答相應。圖9展示了這一點(*，＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
權利要求
1.永生化的脂肪細胞。
2.根據權利要求1的脂肪細胞，其特征在于它們來自于人。
3.根據權利要求2的脂肪細胞，其特征在于它們來自于人皮脂腺。
4.根據權利要求3的脂肪細胞，其特征在于皮脂腺細胞是面部的皮脂腺細胞。
5.根據前述的任一項權利要求的脂肪細胞，其特征在于它們以細胞系形式存在。
6.根據前述的任一項權利要求的脂肪細胞，其特征在于它們是經轉染DNA而永生化的。
7.根據前述的任一項權利要求的脂肪細胞，其特征在于它們表達SV-40大T抗原。
8.根據前述的任一項權利要求的脂肪細胞，其特征在于它們表現出正常的、未轉染的、分化中的脂肪細胞的特征。
9.根據前述的任一項權利要求的脂肪細胞，其特征在于它們的增殖可被雄激素和/或類維生素A改變。
10.根據前述的任一項權利要求的脂肪細胞，其特征在于它們是克隆化的。
11.人脂肪細胞系DSM ACC2383。
12.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在診斷、治療或化妝品制劑中的應用。
13.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在檢查人或動物皮脂腺的生理或病理生理學中的應用。
14.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在檢查痤瘡和/或皮脂溢性皮炎和/或其他疾病的起因中的應用。
15.根據權利要求14的脂肪細胞的應用，其中其它要檢查的疾病是涉及或可能涉及皮脂腺功能的皮膚病。
16.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在檢測抗痤瘡和/或抗皮脂溢的化合物或藥劑中的應用。
17.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在檢測抗疾病的化合物或藥劑中的應用。
18.根據權利要求17的脂肪細胞的應用，其中所述疾病是涉及或可能涉及皮脂腺功能的皮膚病。
19.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在開發(fā)簡單的或復雜的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的應用。
20.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在形成或用于三維細胞集群或器官型結構的構建中的應用。
21.根據權利要求1-10任一項的脂肪細胞或權利要求11的人脂肪細胞系在制備來自所述細胞的產品中的應用。
22.根據權利要求21的應用，所述細胞產品為脂質、質粒、載體、所述細胞表達的蛋白質和/或所述蛋白質的DNA或RNA序列。
23.根據權利要求21或22得到的產品在修飾其它的細胞或修飾其他生物體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明描述了脂肪細胞。本發(fā)明尤其涉及具有可連續(xù)傳代培養(yǎng)許多代這一性質的皮脂腺細胞和皮脂腺細胞系。所述脂肪細胞很適合各種應用。
文檔編號A61K35/12GK1344314SQ99816538
公開日2002年4月10日 申請日期1999年12月15日 優(yōu)先權日1999年2月1日
發(fā)明者赫里斯托斯·祖布利斯 申請人:赫里斯托斯·祖布利斯