專(zhuān)利名稱(chēng)：蛇毒止痛劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛇毒作為止痛劑的用途。
背景技術(shù)：
盡管疼痛是至關(guān)重要的生理反應(yīng)，不過(guò)它也會(huì)導(dǎo)致不必要的難受和痛苦。疼痛的控制和緩解是醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要分支。疼痛既可以作為疾病的結(jié)果而發(fā)生，也可以作為醫(yī)療的結(jié)果而發(fā)生，例如化療。無(wú)論怎樣，盡可能多地減輕疼痛都是重要的，以便患者能夠正常活動(dòng)。
與疼痛有關(guān)的兩種神經(jīng)途徑在體內(nèi)同時(shí)發(fā)揮作用(1)感覺(jué)途徑，它感覺(jué)組織損害，隨后產(chǎn)生疼痛的感覺(jué)；(2)止痛途徑，它減少疼痛的感覺(jué)，防止關(guān)于疼痛的信息流向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，因而允許生物體維持其正?；顒?dòng)，不受損傷影響。使用抑制充當(dāng)疼痛感受器的外周神經(jīng)的藥物或者增強(qiáng)天然止痛系統(tǒng)都可以實(shí)現(xiàn)麻醉。由于這些是不同的途徑，因此它們受不同物質(zhì)的影響。例如，阿斯匹林和利多卡因?qū)ν庵芨杏X(jué)途徑有活性，而嗎啡和相關(guān)物質(zhì)對(duì)止痛系統(tǒng)有活性。
目前使用的最有效的止痛劑是阿片來(lái)源的嗎啡類(lèi)物質(zhì)。眾所周知，大腦產(chǎn)生各種內(nèi)源性阿片制劑，這一點(diǎn)解釋了這些物質(zhì)的強(qiáng)大效果。它們對(duì)神經(jīng)元的作用受特異性受體的介導(dǎo)。受這些受體調(diào)節(jié)的信號(hào)防止信息從外周疼痛神經(jīng)元流向CNS。這些CNS神經(jīng)元對(duì)其他各種化學(xué)物質(zhì)也是敏感的，包括兒茶酚胺類(lèi)(血清素、去甲腎上腺素等)、神經(jīng)活性肽類(lèi)(神經(jīng)降壓素)和抑制性氨基酸類(lèi)(甘氨酸和GABA)。
現(xiàn)存4000余種蛇中，已知大約有400種是有毒的。有毒的物種分為五個(gè)科，它們是蝰蛇科、眼鏡蛇科、Crotolidae、海蛇科和穴蝰科(Atractaspidae)。蝰蛇科蛇分布在歐洲、亞洲和非洲，包含8個(gè)屬，其中之一是蝰屬。Crotolidae科包括響尾蛇屬。眼鏡蛇科包括眼鏡蛇屬。
蛇毒包含多種不同的物質(zhì)。據(jù)估計(jì)有數(shù)百種化合物，其中據(jù)信僅有4-8種參與蛇毒的毒性作用。盡管在功能上有相似性，不過(guò)蛇毒在它們的化學(xué)組成上還是有顯著區(qū)別的。每種都具有其特有的蛇毒組成。迄今，在這400余種有毒的蛇中僅鑒別出幾百種化合物。它們包括酶、毒素、生長(zhǎng)因子等。大多數(shù)所分離的蛇毒化合物都是功能未知的。
蛇毒在傳統(tǒng)上被視為毒性物質(zhì)的來(lái)源。不過(guò)，它也是止痛劑的來(lái)源。治療被一種南美蛇(彩響尾蛇(Crotalus durissus terrificus))咬傷的患者的醫(yī)生報(bào)道說(shuō)盡管這些患者處于生命垂危狀態(tài)，不過(guò)他們沒(méi)有感覺(jué)到疼痛。有一種從蛇毒中分離的神經(jīng)毒素產(chǎn)物在南斯拉夫第一屆神經(jīng)毒理學(xué)大會(huì)(1977)上被認(rèn)為是新型的止痛劑。這些和其他觀(guān)察結(jié)果引導(dǎo)人們嘗試從蛇毒中分離止痛化合物。
Bevan，P.和Hiestand，P.(1983)《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2585319-5326描述了通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜法從Viperarusselli russelli毒中分離的單鏈多肽。該多肽與單胺和阿片配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合它們各自的受體，大鼠腦室內(nèi)注射該多肽導(dǎo)致顯著的鎮(zhèn)靜效果。作者認(rèn)為，該多肽是一種強(qiáng)烈?guī)щ姷拇蠓肿?，不太可能通過(guò)血-腦屏障。還發(fā)現(xiàn)該多肽是一種毒性大小適度的毒素，類(lèi)似于粗毒。
Dutta，A.S.和Chaudhuri，A.K.N.(1991)《印度實(shí)驗(yàn)生物學(xué)雜志》(Indian J.Exp.Biol.)29937-942描述了用Viperarusselli粗毒對(duì)小鼠和大鼠所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。將蛇毒通過(guò)腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)方式注射，發(fā)現(xiàn)在與CNS有聯(lián)系的一般行為模式上產(chǎn)生變化。蛇毒在一項(xiàng)測(cè)定中顯示顯著的止痛活性，但是在其他兩項(xiàng)測(cè)定中沒(méi)有活性。
1991年2月21日公布的WO91/01740公開(kāi)了凍干大響尾蛇(Crotalus atrox)全毒在外用藥物組合物中的用途。該組合物具有止痛、致充血和解痙活性。
Giorgi，R.，Bernardi，M.M.和Cury，Y.(1993)《Toxicon》311257-1265描述了由通過(guò)超濾法從彩響尾蛇(Crotalus durissusterrificus)毒提取的小分子量物質(zhì)所激發(fā)的止痛效果。將提取物通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)和口服方式對(duì)小鼠給藥。
1993年5月26日公布的CN1,072,344公開(kāi)了含有蛇毒素酶商品(未給出來(lái)源)、白細(xì)胞肽因子和冰片的蛇毒素軟膏，冰片是一種已知的止痛中藥。該軟膏起到抗生素的作用，沒(méi)有毒副作用。
Pu，X.C.，Wong，P.T.H.和Gopalakrishnakone，P.(1995)《Toxicon》331425-1431描述了通過(guò)凝膠過(guò)濾和HPLC法從扁頸眼鏡蛇毒中精制的神經(jīng)毒素。將該毒素通過(guò)腹膜內(nèi)、口服或i.c.v.方式對(duì)小鼠給藥，發(fā)現(xiàn)具有有力的止痛效果。
U.S.S.R.專(zhuān)利No.435,824描述了從Nayaksin干燥眼鏡蛇毒中制備的止痛組合物。這種蛇來(lái)自眼鏡蛇科的眼鏡蛇屬。
過(guò)去20年間，一種名為Viprosalum或Viprosal的軟膏在前蘇聯(lián)和東歐用于緩解疼痛。這種軟膏是蝰蛇毒(歐洲種)的凡士林溶液以及羊毛脂、樟腦和solicilate的混合物。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供從蛇毒中分離的止痛物質(zhì)，它基本上是無(wú)毒的。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了基本上無(wú)毒的、從蛇毒中分離的級(jí)分，具有通過(guò)Mono Q離子交換色譜法從蛇毒中精制的級(jí)分特征，其中該級(jí)分具有止痛效果。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，在Mono Q柱上、在20mMTris-HCl緩沖液pH7.0中進(jìn)行色譜法，該級(jí)分在12-28分鐘時(shí)洗脫。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，上述條件打算限定本發(fā)明的級(jí)分，并不限制可以制備該級(jí)分的方式。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明的級(jí)分可以通過(guò)各種精制方法而從蛇毒制備。不過(guò)，它被限定為具有如上所限定的精制級(jí)分的特征。
進(jìn)而按照本發(fā)明的這個(gè)方面，提供了作為止痛劑使用的藥物組合物，包含基本上無(wú)毒的、從蛇毒中分離的級(jí)分，具有通過(guò)Mono Q離子交換色譜法從蛇毒中精制的級(jí)分特征，其中該級(jí)分具有止痛效果。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，該藥物組合物用于局部使用。
本發(fā)明在進(jìn)一步方面提供了用于從蛇毒中分離基本上無(wú)毒的級(jí)分的方法，該級(jí)分具有止痛效果，是用一種水性緩沖液通過(guò)離子交換色譜法從蛇毒中精制的。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，該離子交換色譜法是用MonoQ FPLC柱進(jìn)行的。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，該水性緩沖液是Tris-HCl緩沖液或乙酸銨緩沖液。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，緩沖液的濃度是20mM，pH在6.8-7.5范圍內(nèi)。
由本發(fā)明所提供的級(jí)分結(jié)合了大量以前未曾報(bào)道共同出現(xiàn)在相同材料中的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括(1)具有止痛活性；(2)基本上沒(méi)有毒性；和(3)基本上是精制的。
本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)無(wú)毒被定義為不發(fā)生作為使用具有止痛效果的藥理水平的本發(fā)明級(jí)分的結(jié)果的病理現(xiàn)象。術(shù)語(yǔ)基本上無(wú)毒被定義為包括低至可接受程度的毒性以及沒(méi)有毒性。
本發(fā)明的級(jí)分可以從蝰蛇科(Viperidae)、眼鏡蛇科(Elapidae)、響尾蛇科(Crotolidae)、海蛇科(Hydrophidae)和穴蝰科(Atractaspidae)各種毒蛇中分離。盡管下述用于闡述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)涉及山蝰(Vipera xanthina)、蝰蛇(Vipera russelli)、菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)和黑唇眼鏡蛇(Naja melanoleuca)，不過(guò)不言而喻的是這些物種僅僅充當(dāng)上述五科毒蛇的實(shí)例。
盡管本發(fā)明的級(jí)分是粗毒的精制級(jí)分，不過(guò)它顯然包含不止一種物質(zhì)。本發(fā)明不僅包括本發(fā)明的級(jí)分，而且包括各種可以從本發(fā)明級(jí)分中精制、并且具有本發(fā)明級(jí)分性質(zhì)的產(chǎn)物。本發(fā)明還包括這些產(chǎn)物的衍生物，它們保留了本發(fā)明級(jí)分的性質(zhì)。在蛋白質(zhì)類(lèi)材料的情況下，這樣的衍生物將包括蛋白質(zhì)或多肽，其中一種或多種氨基酸已被加入、刪去和/或取代。其他化學(xué)修飾也涵蓋其中。
本發(fā)明的級(jí)分可以用于制備作為止痛劑使用的藥物組合物。這樣一種組合物還將包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，例如羊毛脂和凡士林的混合物。該組合物可以制成腸胃外使用的劑型，例如鹽水溶液，或局部使用的軟膏劑、霜?jiǎng)┗蛴透鄤?。為了緩解受治療者的疼痛，藥物組合物將被注射或者局部涂抹在適當(dāng)?shù)奈恢?。其他可能的用藥模式是口服和直腸用藥。除了活性成分以外，任何藥物組合物一般還將包接受的載體或賦形劑。由于本發(fā)明的級(jí)分有時(shí)在一遲滯期后發(fā)揮作用，預(yù)期它將尤其對(duì)慢性疼痛有效，盡管它可以用于治療任何類(lèi)型的疼痛。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明結(jié)合下列優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明和下列附圖，有助于更好地理解本發(fā)明，其中

圖1A和1B闡述在Mono Q柱上精制巴勒斯坦山蝰(Viperapalestinae)毒期間所得結(jié)果。Y軸代表280nm下的吸光度，X軸是洗脫時(shí)間，以分鐘計(jì)。圖B是圖A9-31分鐘和更低吸光度范圍區(qū)域的放大；圖2闡述另一次在Mono Q柱上精制巴勒斯坦山蝰(Viperapalestinae)毒期間所得結(jié)果；圖3闡述在Mono Q柱上精制蝰蛇(Vipera russelli)毒期間所得結(jié)果；圖4闡述在Mono Q柱上精制菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)毒期間所得結(jié)果；圖5闡述用Tris-HCl緩沖液在Mono Q柱上精制黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)毒期間所得結(jié)果；和圖6闡述用乙酸銨緩沖液在Mono Q柱上精制黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)毒期間所得結(jié)果。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明材料和方法蛇毒提取數(shù)百條蛇，得到巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒。將它們的蛇毒冷凍和凍干。其他蝰屬蛇毒購(gòu)自‘Latoxin’，Rosans，F(xiàn)rance。菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)和黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)毒購(gòu)自‘Quality Venoms for Medical Research’，NewYork，U.S.A.。
測(cè)定A、止痛測(cè)定
A、止痛測(cè)定每項(xiàng)試驗(yàn)使用數(shù)十只相似體重和年齡的倉(cāng)鼠。根據(jù)所要試驗(yàn)的樣本數(shù)將倉(cāng)鼠分組。將含有供試物質(zhì)的軟膏劑(50％羊毛脂和50％凡士林)涂抹在動(dòng)物背部毛皮上。不切除毛皮，以確保對(duì)皮膚沒(méi)有損害。對(duì)照組倉(cāng)鼠用不含本發(fā)明級(jí)分的軟膏劑處理。通過(guò)連續(xù)局部涂抹6、14或21天對(duì)倉(cāng)鼠進(jìn)行處理。在最后一次涂抹軟膏劑后第二天進(jìn)行止痛性試驗(yàn)。
在典型的試驗(yàn)中，對(duì)每只動(dòng)物涂抹含有或不含止痛物質(zhì)的恒量軟膏劑達(dá)預(yù)定天數(shù)。這個(gè)階段之后，在股骨區(qū)皮下注射0.8ml 1NHCl/0.1kg體重誘發(fā)疼痛。倉(cāng)鼠對(duì)HCl注射的反應(yīng)是用舌頭觸及注射區(qū)域，這稱(chēng)為“舔”。從注射后20分鐘開(kāi)始觀(guān)察倉(cāng)鼠達(dá)40分鐘，計(jì)數(shù)“舔”的次數(shù)。“舔”的次數(shù)充當(dāng)HCl誘發(fā)疼痛的定量指征。
比較對(duì)照動(dòng)物與治療動(dòng)物“舔”的平均次數(shù)，測(cè)定止痛效果。利用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)測(cè)定差異的顯著性。
B、致死劑量測(cè)定將四種不同濃度的供試物質(zhì)注射至體重20-25克的小鼠的腹膜內(nèi)。每種濃度注射八只小鼠。計(jì)算供試物質(zhì)引起50％死亡的劑量(LD50)的方法描述在Reed，L.J.和Muench，H.(1938)《美國(guó)衛(wèi)生學(xué)雜志》(Am.J.Hygiene)27493中。LD50單位被定義為每20g體重導(dǎo)致注射小鼠50％死亡所必需的供試物質(zhì)量(mg/20g)。
C、毒性測(cè)定使用倉(cāng)鼠進(jìn)行短期測(cè)定(最多10天)，其中將供試物質(zhì)注射至腹膜內(nèi)達(dá)10天。使用大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期測(cè)定，此間局部涂抹軟膏劑，每天一次，每周6天，歷時(shí)4個(gè)月(共計(jì)涂抹100次)。
在即期毒性測(cè)定中，用0.1或0.2ml各種未稀釋的Mono Q級(jí)分皮下注射小鼠(20-25克)。
D、蛋白質(zhì)測(cè)定使用已知濃度的卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)，在280nm下通過(guò)光譜法測(cè)定本發(fā)明級(jí)分中的蛋白質(zhì)類(lèi)材料的量及其在每份分離物中的濃度。
實(shí)施例I、從巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒精制本發(fā)明的級(jí)分在典型的精制中，將50-80mg巴勒斯坦山蝰毒溶于20mM Tris緩沖液pH7.5，最終濃度為0.1g/ml。離心并除去沉淀后，將上清液通過(guò)微孔濾器(40微米)過(guò)濾，取0.1-0.2ml上1×10cm FPLC Mono Q柱(Pharmacia)。A溶劑由20mM Tris緩沖液pH7.5組成，B緩沖液由20mM Tris和0.5M NaCl組成。在洗脫的前20分鐘期間單用緩沖液A。在后45分鐘期間使用緩沖液A與B的混合物(50％∶50％)，最后5分鐘使用100％緩沖液B。本發(fā)明的級(jí)分在20-25分鐘區(qū)域洗脫出來(lái)(見(jiàn)圖2B)，這是根據(jù)各種測(cè)定所確定的(見(jiàn)下)。洗脫也可以單用緩沖液A進(jìn)行，可以用20mM乙酸銨pH6.9代替。歷時(shí)3年用Mono Q柱進(jìn)行了一百次精制，均得到相似的結(jié)果。
II、來(lái)自巴勒斯坦山蝰(Vipera palestinae)毒的本發(fā)明級(jí)分的鑒別A、本發(fā)明級(jí)分的性質(zhì)為了測(cè)定本發(fā)明級(jí)分的性質(zhì)，將在Mono Q柱上制得的0.1mg本發(fā)明級(jí)分溶于緩沖溶液。同時(shí)，將2.4mg鏈霉蛋白酶E溶于洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5)，制得鏈霉蛋白酶E。準(zhǔn)備三支試管，一支僅含有鏈霉蛋白酶，第二支僅含有本發(fā)明級(jí)分，第三支中將本發(fā)明級(jí)分用5μl鏈霉蛋白酶E(0.17微克)培養(yǎng)。將試管在室溫下培養(yǎng)24小時(shí)，然后試驗(yàn)止痛活性。
結(jié)果是僅有試管2具有止痛活性。該試驗(yàn)重復(fù)3次，均得到同一結(jié)果。因此可以得出結(jié)論，本發(fā)明級(jí)分具有蛋白質(zhì)樣性質(zhì)或者它的止痛活性需要蛋白質(zhì)的參與。
B、本發(fā)明級(jí)分的純度在10次分離操作的基礎(chǔ)上，來(lái)自Mono Q柱的20-25分鐘級(jí)分(見(jiàn)上I)含有0.02±0.05S.D.mg/ml蛋白質(zhì)。每次操作得到0.1mg本發(fā)明級(jí)分。該數(shù)量相當(dāng)于總上柱蛇毒蛋白的0.6％。這說(shuō)明本發(fā)明級(jí)分的純度高。
III、止痛活性使用歷時(shí)兩年制得的制劑試驗(yàn)本發(fā)明級(jí)分的止痛活性。將含有0.01mg蛋白質(zhì)的0.2ml本發(fā)明級(jí)分溶于50g軟膏，得到濃度為0.0002mg本發(fā)明級(jí)分/g軟膏。如“方法”一節(jié)所述將倉(cāng)鼠用該軟膏局部處理21天。結(jié)果總結(jié)在表1中。
表1
*7次實(shí)驗(yàn)“舔”的平均數(shù)±S.D.
這些實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照相比，用本發(fā)明級(jí)分處理的倉(cāng)鼠減少了對(duì)HCl誘發(fā)疼痛的感覺(jué)。用Mono Q柱制備的本發(fā)明級(jí)分完全與蛇毒的毒性組分分離開(kāi)來(lái)，見(jiàn)如下討論。
IV、毒理學(xué)研究A、本發(fā)明級(jí)分的注射A1、向小鼠(每只20-25g)s.c.注射0.05mg用Mono Q柱制備的本發(fā)明級(jí)分。該劑量是在倉(cāng)鼠中產(chǎn)生止痛效果所需量的250倍。在該劑量下，本發(fā)明級(jí)分對(duì)小鼠沒(méi)有毒性，觀(guān)察到?jīng)]有可見(jiàn)的癥狀。相形之下，注射從柱子洗脫的0.02mg前幾次級(jí)分(試管2-7)導(dǎo)致被注射的全部5只小鼠立即死亡。該發(fā)現(xiàn)證明止痛級(jí)分基本上沒(méi)有毒性。
A2、在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，用本發(fā)明級(jí)分注射3組倉(cāng)鼠，每組8只(100-120克)。將凍干級(jí)分溶于生理鹽水溶液，濃度為0.002mg/ml，分別取0.1ml或0.2ml每日注射到第一組和第二組動(dòng)物腹膜內(nèi)達(dá)10天。第三(對(duì)照)組僅注射0.2ml鹽水。注射的10天內(nèi)，采集血樣用于生化參數(shù)的測(cè)定和組織病理學(xué)試驗(yàn)。
在所測(cè)定的生化因子中，在前兩組中觀(guān)察到膽固醇和淀粉酶增加(結(jié)果沒(méi)有顯示)。不過(guò)觀(guān)察到肝酶(LDH，SGOT，SGPT)功能沒(méi)有顯著變化。
A3、研究了A2節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織病理學(xué)。在本發(fā)明級(jí)分注射組與對(duì)照組之間檢測(cè)到?jīng)]有顯著的組織病理學(xué)差異。
B、局部處理如“方法”一節(jié)(止痛測(cè)定)所述將本發(fā)明級(jí)分制成軟膏劑。使用三組大鼠，每組10只(雄性和雌性)，體重120-140g。如“方法”一節(jié)所述局部涂抹軟膏劑。涂于第1組和第2組的軟膏劑包含濃度分別為0.0002和0.001mg/g的本發(fā)明級(jí)分。第3組中，軟膏劑僅包含溶劑作為對(duì)照。每日向每只大鼠涂抹0.2g軟膏。在實(shí)驗(yàn)的四個(gè)月期間，第1組的每只大鼠總計(jì)接受0.03mg/kg體重的本發(fā)明級(jí)分，第2組的每只大鼠總計(jì)接受0.15mg/kg體重的本發(fā)明級(jí)分。在實(shí)驗(yàn)期間，觀(guān)察到大鼠的行為或體重沒(méi)有變化。
在實(shí)驗(yàn)室中收集血液和尿液。關(guān)于收集尿液，將動(dòng)物置于塑料表面上，收集尿液，立即用Multistick試驗(yàn)。關(guān)于采集血液，將大鼠麻醉，采集動(dòng)脈血。離心除去血漿，貯存在4℃下，測(cè)定生化參數(shù)。
B1、檢測(cè)到SGPT或SGOT沒(méi)有增加。檢測(cè)到下列血液分析物水平與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異Cre；Ca2+；P(i)；Glu；Ur；Chl；TP；Alb；Bili；Al.Phos；AMY(結(jié)果沒(méi)有顯示)。
B2、尿液中各種生化參數(shù)的測(cè)量結(jié)果總結(jié)在表2中。
表2
*僅使用雄性大鼠。
表中分析物水平說(shuō)明如下(-)陰性；(0)痕量；(+)低；(++)中等。括號(hào)后的數(shù)字表示所試驗(yàn)的大鼠數(shù)。
檢測(cè)到?jīng)]有顯著差異。
B3、研究了用溶于軟膏的本發(fā)明級(jí)分局部處理的成年大鼠的組織病理學(xué)。最后一次涂抹軟膏后第二天，處死動(dòng)物，取它們的皮膚和組織，固定在福爾馬林中。將組織包埋在石蠟中，切成6微米切片。用蘇木精和Oozin染色。試驗(yàn)了下列組織(1)受處理區(qū)域的皮膚；(2)未處理區(qū)域的皮膚；(3)心臟；(4)腎臟；和(5)腦。
組織來(lái)自(1)用0.0002mg/g止痛級(jí)分處理的十只大鼠中的八只；(2)用0.001mg/g止痛級(jí)分處理的十只大鼠中的六只；和(3)八只對(duì)照大鼠。所有被試驗(yàn)的大鼠都是隨機(jī)選擇的。
結(jié)果總結(jié)在表3中。
表3
結(jié)論是在處理組與對(duì)照組之間觀(guān)察到?jīng)]有顯著的組織病理學(xué)變化。
總而言之，發(fā)現(xiàn)從Vipera palestinae毒中分離的本發(fā)明級(jí)分沒(méi)有顯著毒性。
V、Vipera palestinae的額外精制使用不含NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上進(jìn)行Vipera palestinae毒的額外精制，本發(fā)明級(jí)分在13-17分鐘時(shí)洗脫，峰值為14.5分鐘(圖2)。
VI、從蝰蛇(Vipera russelli)制備本發(fā)明級(jí)分和鑒別A、精制使用20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上精制Viperarusselli毒。本發(fā)明級(jí)分在12-17分鐘時(shí)洗脫，峰值為13.5分鐘(圖3)。
B、止痛活性如“方法”一節(jié)所述試驗(yàn)如上VI-A精制的級(jí)分對(duì)倉(cāng)鼠的止痛活性。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組舔的次數(shù)(平均±S.D.)為83.8±11.8，而受處理倉(cāng)鼠舔的次數(shù)為47.6±7.7(p＜0.02)。這說(shuō)明該級(jí)分具有顯著的止痛活性。
C、毒理學(xué)研究對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，測(cè)量Mono Q級(jí)分的即期(immediate-term)毒性。發(fā)現(xiàn)在0.3-4.3分鐘洗脫的0.1ml級(jí)分導(dǎo)致被注射小鼠立即死亡。5分鐘后洗脫的0.2ml級(jí)分(包括止痛級(jí)分)沒(méi)有毒性。
VII、從菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)制備本發(fā)明級(jí)分和鑒別A、精制使用20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上精制菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)毒。本發(fā)明級(jí)分在10-20分鐘時(shí)洗脫，峰值為15.3分鐘(圖4)。在使用20mM乙酸銨緩沖液pH 7.0所進(jìn)行的另一次精制中，該級(jí)分在12.5-17分鐘洗脫(結(jié)果沒(méi)有顯示)。
B、止痛活性如“方法”一節(jié)所述試驗(yàn)如上VII-A精制的級(jí)分對(duì)倉(cāng)鼠的止痛活性。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組舔的次數(shù)(平均±S.D.)為83.8±11.8，而受處理倉(cāng)鼠舔的次數(shù)為25.3±5.3(p＝0.00)。這說(shuō)明該級(jí)分具有顯著的止痛活性。
C、毒理學(xué)研究如上VI(c)測(cè)量Mono Q級(jí)分的毒性。發(fā)現(xiàn)毒性級(jí)分在0.5-5.0分鐘洗脫。5分鐘后洗脫的全部級(jí)分(包括止痛級(jí)分)都沒(méi)有毒性。
VIII、從黑唇眼鏡蛇(Naja melanoleuca)制備本發(fā)明級(jí)分和鑒別A、精制使用20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0在Mono Q柱上精制Najamelanoleuca毒。本發(fā)明級(jí)分在12-18分鐘時(shí)洗脫，峰值為14.3分鐘(圖5)。在使用20mM乙酸銨緩沖液pH6.9所進(jìn)行的另一次精制中，該級(jí)分在峰值17分鐘洗脫(圖6)。
B、毒理學(xué)研究如上VI(c)測(cè)量Mono Q級(jí)分的毒性。發(fā)現(xiàn)毒性級(jí)分在0.1-4.0分鐘洗脫。5分鐘后洗脫的全部級(jí)分(包括止痛級(jí)分)都沒(méi)有毒性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明并不限于已經(jīng)描述的內(nèi)容，相反，本發(fā)明的范圍僅受下列權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.基本上無(wú)毒的、從蛇毒中分離的級(jí)分，具有通過(guò)Mono Q離子交換色譜法從蛇毒中精制的級(jí)分特征，其中所述級(jí)分具有止痛效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的級(jí)分，其中所述色譜法是在Mono Q柱上、在20mM Tris-HCl緩沖液pH7.0中進(jìn)行的，該級(jí)分在12-28分鐘時(shí)洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的級(jí)分，其中所述蛇選自由蝰蛇科(Viperidae)、眼鏡蛇科(Elapidae)、響尾蛇科(Crotolidae)、海蛇科(Hydrophidae)和穴蝰科(Atractaspidae)組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的級(jí)分，其中所述蝰蛇科是山蝰(Viperaxanthina)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的級(jí)分，其中所述山蝰是巴靳斯坦山蝰(Viperaxanthina palestinae)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的級(jí)分，其中所述響尾蛇科是菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的級(jí)分，其中所述眼鏡蛇科是黑唇眼鏡蛇(Najamelanoleuca)。
8.從權(quán)利要求1級(jí)分得到的產(chǎn)物，它保留該級(jí)分的所述性質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的產(chǎn)物的衍生物，它保留權(quán)利要求1級(jí)分的所述性質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的級(jí)分在作為止痛劑使用的藥物組合物制備中的用途。
11.作為止痛劑使用的藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1的基本上無(wú)毒的級(jí)分和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
12.用于局部給藥的根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物。
13.用于腸胃外給藥的根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物。
14.用于治療疼痛的根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物。
15.緩解受治療者疼痛的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1的基本上無(wú)毒的級(jí)分對(duì)所述受治療者給藥。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述級(jí)分是局部給藥的。
17.用于從蛇毒中分離基本上無(wú)毒的級(jí)分的方法，其中所述級(jí)分具有止痛效果，該方法包括將全毒上離子交換柱，用一種水性緩沖液洗脫該級(jí)分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述柱子是Mono Q離子交換柱。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述柱子是用Tris-HCl緩沖液或乙酸銨緩沖液洗脫的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述緩沖液的濃度是20mM，pH在6.8-7.5范圍內(nèi)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述級(jí)分在12-28分鐘時(shí)洗脫。
全文摘要
公開(kāi)了從蛇毒中分離的基本上無(wú)毒的級(jí)分,該級(jí)分具有止痛效果。該級(jí)分具有在Mono Q離子交換柱上從蛇毒中精制的級(jí)分特征。還描述了包含該無(wú)毒級(jí)分的作為止痛劑使用的藥物組合物和用于緩解疼痛的方法,包括將該無(wú)毒級(jí)分給藥。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1361695SQ99816844
公開(kāi)日2002年7月31日 申請(qǐng)日期1999年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月14日
發(fā)明者A·舒洛弗, N·普利莫爾 申請(qǐng)人:S.I.S.舒洛弗科學(xué)研究有限公司