專利名稱：一種新的血管發(fā)生抑制劑的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種新的血管發(fā)生抑制劑，LK68，其氨基酸序列與人載脂蛋白(a)kringle結構域IV36、IV37和V38相同，更具體地說，本發(fā)明涉及一種LK68的氨基酸序列，編碼LK68的cDNA序列，包含該cDNA的重組表達載體，用該重組表達載體轉化的重組微生物，以及LK68作為抗癌劑的新用途，和治療血管發(fā)生介導的疾病的方法。
據報道血管生成過程的不平衡導致病理性疾病例如糖尿病性視網膜病、類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬(參見Folkman，J.，Nature Med.，127-31，1995a)。尤其是原發(fā)性和轉移性腫瘤都需要血管生成的血管恢復生長(參見Folkman，J.，New Engl.J.Med.，2851182-1186，1971；Folkman，J.，J.Biol.Chem.，26710931-10934，1992)。如果這種血管發(fā)生活性能夠被抑制或消除，那么腫瘤即使存在，也將停止生長。一些報道表明，抑制腫瘤的血管發(fā)生可以提供一種長期控制疾病的可操作方法。阻斷血管發(fā)生的陽性調控劑或應用陰性調控劑抑制血管發(fā)生導致實驗腫瘤的延遲或抑制。如果這種血管發(fā)生活性能夠被抑制或消除，那么腫瘤即使存在，也將停止生長。而且，在疾病狀態(tài)，防止血管發(fā)生能夠有效轉移由于微血管系統的侵害造成的損害。因此，旨在控制血管發(fā)生過程的治療會導致這類疾病的消除或緩解。
因此，需要一種新的血管發(fā)生抑制劑，其能夠抑制血管的不期望的生長，特別是生長成為腫瘤。含有血管發(fā)生抑制劑的抗癌劑應該能夠抑制前轉移性腫瘤中的內源性生長因子的活性，并防止腫瘤中毛細血管的形成，由此抑制腫瘤的生長。這種抗癌劑還應該能夠調節(jié)其它血管發(fā)生過程，例如傷口愈合和生殖過程的毛細血管的形成。最后，這種抗癌劑和抑制血管發(fā)生的方法應該優(yōu)選為非毒性的并產生較少副作用。
迄今為止，本領域已經鑒定了至少10中內源性血管發(fā)生抑制物(參見O′Reilly，M.S.等，Cell，88277-285，1997)。這類分子中的一種是制管張素，其由血纖維蛋白溶酶原kringle I到IV構成(參見O′Reilly，M.S.等，Cell，79315-328，1994)。當系統應用時，制管張素有效抑制原發(fā)性腫瘤的生長和轉移，且無毒性，同時也抑制由bFGF誘導的血管發(fā)生(參見O′Reilly，M.S.等，Nature Med.，2689-692，1996)。這些抗腫瘤作用伴隨腫瘤塊中微血管密度的顯著降低，表明血管發(fā)生的抑制與腫瘤生長的抑制有關。
Kringle是由大約80個氨基酸和三個分子內二硫鍵構成的蛋白質結構域。Kringle結構在一些蛋白質中發(fā)現，例如凝血酶原(參見Walz，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，741969-1973，1977)、血纖維蛋白溶酶原(參見Ponting，C.P.，Blood Coagul.&Fibrinolysis，3605-614，1992)、尿激酶(參見Pennica，D.等，Nature，301579-582 1983)、肝細胞生長因子(參見Lukker，N.A.等，Protein Eng.，7895903，1994)和載脂蛋白(＂apo＂)(a)(參見McLean，J.W.等，Nature，330132-137，1987)。這些結構域看起來是一種獨立折疊單元，但它們的功能作用尚不清楚。以前的報道指出kringle結構能夠作為血管發(fā)生過程中內皮細胞遷移和增殖的抑制劑。特別是凝血素的kringle 2和血纖維蛋白溶酶原的kringle 1-4、和5已經表明抗血管發(fā)生(參見Ji，W.R.等，FASEB J.，151731-1738，1998a；Ji，W.R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，247414-419，1998b；Cao，Y.等，J.Biol.Chem.，27129461-29467，1996；Cao，Y.等，J.Biol.Chem.，27222924-22928，1997；Barendsz-Janson，A.F.，J.Vasc.Res.，35109-114，1998；Lee，T.H.等，J.Biol.Chem.，27328805-28812，1998)。
載脂蛋白(a)，一種具有kringle結構的蛋白質，是一種新的血管發(fā)生抑制劑的候選物。Apo(a)與apoB-100共價結合，是形成脂蛋白(a)的低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白成分(參見Fless，G.M.，J.Biol.Chem.，2618712-8718，1986)。脂蛋白(a)濃度的升高代表動脈粥樣硬化的一種主要獨立風險因素(參見Armstrong，V.W.等，Artherosclerosis，62249-257，1986；Assmann，G.，Am.J.Cardiol.，771179-1184，1996；Bostom，A.G.等，JAMA，276544-548，1996)。雖然已經報道了apo(a)的幾種病原性活性，但其生理作用還未曾確定(參見Lawn，R.M.等，J.Biol.Chem.，27131367-31371，1996；Scanu，A.M.和Fless，G.M.，J.Clin.Invest.，851709-1715，1990；Utermann，G.，Science，2460904-910，1989)。
Apo(a)含有兩種類型的kringle結構域和一種無活性的蛋白酶樣結構域前37個kringle結構域與血纖維蛋白溶酶原kringle IV有～75％等同性，最后kringle結構域與血纖維蛋白溶酶原kringle V有90％的等同性。有趣的是，kringle IV樣結構域在不同的人的apo(a)基因的等位基因中存在15-40拷貝。從這一點上說，應用Apo(a)kringle結構研制一種腫瘤血管發(fā)生和生長的抑制劑是可行的。
因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種新的LK68蛋白，其由人apo(a)kringle結構域IV36，IV37和V38構成，以及編碼LK68蛋白的cDNA。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種新的重組載體，其含有編碼人apo(a)kringle結構域IV36，IV37和V38的cDNA。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種抗癌劑，其含有LK68蛋白或其單一kringle，LK6，LK7和LK8作為活性成分。
本發(fā)明的第四個目的在于提供一種通過應用LK68蛋白治療由血管發(fā)生介導的疾病的方法。
圖2是顯示LK68對雞絨毛尿囊膜(CAM)血管發(fā)生的抑制作用的照片。
圖3(A)是顯示CAM中血管生長的抑制作用隨LK68變化的圖。
圖3(B)是顯示CAM中血管生長的抑制作用隨單一kringles，LK6，LK7，LK8和對照變化的圖。
圖4(A)是顯示重組LK68和制管張素對BCE細胞增殖的抑制作用的圖。
圖4(B)是顯示重組LK6，LK7和LK8對BCE細胞增殖的抑制作用的圖。
圖4(C)是顯示重組LK68和LK8對HUVEC細胞增殖的抑制作用的圖。
圖5(A)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，LLC細胞的BrdU標記指數的圖。
圖5(B)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，Y1細胞的BrdU標記指數的圖。
圖5(C)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，TIB74細胞的BrdU標記指數的圖。
圖5(D)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，CHO細胞的BrdU標記指數的圖。
圖5(E)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，MSF細胞的BrdU標記指數的圖。
圖5(F)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，NIH3T3細胞的BrdU標記指數的圖。
圖6(A)是顯示重組LK68，LK8和PK5對HUVEC細胞遷移的抑制作用的圖。
圖6(B)是顯示重組LK68，LK6，LK7和LK8對HUVEC細胞遷移的抑制作用的圖。
圖7是顯示制管張素，重組LK68，LK6，LK7，和LK8，以及單一kringle的組合對BCE細胞遷移的抑制作用的圖。
圖8以總體積作為時間的函數，顯示施用LK68對已移植Lewis肺癌細胞的小鼠的影響。
圖9(A)到9(C)是顯示通過蘇木精和曙紅(H/E)染色的Lewis肺癌細胞組織學分析照片。


圖10以總體積作為時間的函數，顯示給已移植人肺癌A549細胞的裸鼠施用LK68的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種新的蛋白質LK68，其可以從人載脂蛋白(＂apo＂)(a)kringle作為重組蛋白克隆和表達。LK68蛋白由人載脂蛋白(a)kringle結構域IV36(氨基酸8到80)，IV37(氨基酸122到194)和V38(氨基酸226到300)的氨基酸序列以連續(xù)的方式構成(參見SEQ ID NO2)。LK68的前兩個kringle結構域(即IV36和IV37)與人血纖維蛋白溶酶原kringle IV同源，第三個kringle結構域V38與人血纖維蛋白溶酶原kringle V同源。本發(fā)明還提供了編碼LK68蛋白的cDNA(參見SEQ ID NO1)以及含有所述cDNA和表達載體例如pET載體系列的重組載體。
在描述本發(fā)明的kringle結構域時，人載脂蛋白(a)kringle IV36，IV37和V38分別簡稱為KIV36，KIV37和KV38；應用LK68意味著應用含有所述三種kringle結構域的重組蛋白；應用LK6，LK7和LK8分別意味著應用KIV36，KIV37和KV38重組蛋白。
由于載脂蛋白(a)含有血纖維蛋白溶酶原-IV和V型kringle結構域，設想載脂蛋白(a)可能具有抗血管發(fā)生活性。有一個實驗證據表明載脂蛋白(a)可能具有作為腫瘤血管發(fā)生和生長抑制劑的生物活性(參見Trieu，V.N.和Uckun，F.M.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，257714，1999)。據報道LL/2(Lewis肺癌)腫瘤生長在apo(a)轉基因小鼠中延遲，apo(a)轉基因小鼠的LL/2腫瘤的微血管密度比作為對照的野生型小鼠的低。
在這種情況下，本發(fā)明人設想LK68蛋白，其單一kringle或它們的功能等同物可能具有抗-血管發(fā)生活性。為了證明所述抗-血管發(fā)生活性，研究重組LK68和其單一kringle(即，LK6，LK7和LK8)是否在體外以及在體內是有效的抗血管發(fā)生因子。結果發(fā)現，LK68，LK6，LK7和LK8對培養(yǎng)的內皮細胞的增殖和對內皮細胞遷移表現抑制活性。LK68和其單一kringle還抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中毛細血管的正常發(fā)育。并且顯示LK68的系統給藥抑制原發(fā)性腫瘤生長，其與誘導腫瘤的血管發(fā)生的抑制有關。既然每個單一kringle蛋白，LK6，LK7和LK8均表現抗血管發(fā)生活性，料想也抑制原發(fā)性腫瘤生長或轉移。
因此，LK68蛋白、其單一kringle或它們的功能等同物可以應用于開發(fā)強效抗癌劑，其對于由血管發(fā)生介導的疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、或眼血管發(fā)生性疾病等具有高度有效性。
另外，LK68蛋白，其單一kringle或它們的功能等同物還可以與其它組合物和方法聯合應用于治療疾病。例如，可以常規(guī)地用手術、放療或化療結合LK68、其單一kringle或它們的功能等同物治療腫瘤，接著可以給患者施用LK68、其單一kringle或它們的功能等同物，以延長微轉移的休眠期，同時穩(wěn)定和抑制任何殘存原發(fā)性腫瘤的生長。
下面進一步以實施例說明本發(fā)明，它們不應當用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1重組LK68的克隆和表達為了驗證人apo(a)kringle的抗血管發(fā)生活性，本發(fā)明克隆和表達了含有IV36，IV37和V38的最后三個kringle，作為一種重組蛋白LK68。從人肝cDNAPCR擴增了apo(a)從核苷酸12052到12975的DNA片段(參見McLean J.W.等，Nature，330132，1987)，并將得到的924-bp NdeI-BamHI片段連接到大腸桿菌表達載體pETlla(Novagen，USA)中。對于PCR擴增，應用標準PCR方案，使用寡核苷酸引物A(SEQ ID NO9)和F(SEQID NO14)(參見表1)。該克隆命名為＂pETlla/LK68＂，其編碼包括人apo(a)kringle結構域，IV36，IV37和V38在內的308個氨基酸(參見SEQ NOID2)。該克隆的前兩個kringle結構域，IV36和IV37與人血纖維蛋白溶酶原kringle IV同源，第三個kringle結構域V38與人血纖維蛋白溶酶原kringle V同源。
該克隆的核苷酸序列在兩個方向上都得到驗證。當將該克隆的核苷酸序列與人apo(a)的相同區(qū)域(參見McLean J.W.等，Nature，330132，1987)比較時，它們的核苷酸序列除了核苷酸554位上發(fā)生一個堿基改變外其余都相同。我們的克隆在該位置含有一個胞嘧啶，而McLean等(參見McLean J.W.等，Nature，330132，1987)報道的序列中為胸腺嘧啶(thymidine)，導致從Met到Thr的一個氨基酸改變。其它研究組也曾報道過該取代(參見Van der-Hoek，Y.Y.等，Hum.Mol.Genet.，2361-366，1993；LoGrasso，P.V.等，J.Biol.Chem.，26921820-21827，1994)，并且看起來是apo(a)的主要等位基因。
用一種表達質粒pETlla/LK68轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在下面的條件下表達重組LK68蛋白。用10ml過夜培養(yǎng)的攜帶pETlla/LK68質粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種1升含氨芐青霉素的Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基，在37℃振搖培養(yǎng)。當培養(yǎng)物的OD600達到0.4-0.6時，加入終濃度為1mM的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)。細胞經誘導后再生長4小時。在4℃，8000xg離心30分鐘收獲細胞。將這些細胞沉淀超聲，通過SDS-PAGE分析過表達的蛋白質(參見圖1)。在圖1中，Mr代表分子量標記(Boehringer Mannheim，Germany)，1道，無IPTG誘導的重組LK68蛋白的表達；2道，有IPTG誘導的重組LK68蛋白的表達。分子量為37kDa的重組LK68蛋白在大腸桿菌中很好地表達，通過掃描凝膠的圖象分析表明，該蛋白累積到總蛋白的約20-30％。由此制備的轉化體被命名為′大腸桿菌BL21/LK6-8′，并于1999年6月9日保藏在國際保藏機構，韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韓國，保藏號為No.KCTC0633BP。
各單一kringle結構域，IV36，IV37和V38分別如上述克隆到表達載體pET15b中。用于克隆的寡核苷酸引物在表1中列出即用于克隆KIV36的是A(SEQ ID NO9)和D(SEQ ID NO12)；用于克隆KIV37的是B(SEQID NO10)和E(SEQ ID NO13)；用于克隆KV38的是C(SEQ ID NO11)和F(SEQ ID NO14)。這三對寡核苷酸引物用于以標準PCR方案進行PCR擴增，得到的克隆命名為＂pET15b/LK6＂、＂pET15b/LK7＂和＂pET15b/LK8＂，它們各自分別包括單一人apo(a)kringle結構域IV36，IV37和V38。用各表達質粒pET15b/LK6，pET15b/LK7和pET15b/LK8轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞。如此由質粒pET15b/LK6制備的轉化體命名為′大腸桿菌BL21(DE3)/LK6′，于1999年9月3日保藏在國際保藏機構，韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韓國，保藏號為No.KCTC0655BP。如此用質粒pET15b/LK7制備的轉化體命名為′大腸桿菌BL21(DE3)/LK7′，于1999年9月3日保藏在國際保藏機構，韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，與上述相同地址，保藏號為No.KCTC0656BP。如此用質粒pET15b/LK8制備的轉化體命名為′大腸桿菌BL21/LK8′，于1999年6月9日保藏在國際保藏機構，韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，與上述相同地址，保藏號為No.KCTC0634BP。
重組LK6，LK7和LK8蛋白在與含N-末端His-tag的融合蛋白相同的條件下表達。用pET His-tag系統，在生產商推薦的條件下純化每種過表達的重組LK6，LK7和LK8蛋白。表1.用于PCR克隆的寡核苷酸引物
*限制性位點，為了克隆方便，加入NdeI和BamHI(下化線)。**參見McLean等，Nature，330132，1987，對于核苷酸序列(登記號為X06290)。實施例2重組LK68的純化為了生產重組LK68，在5L Bioflow III生物反應器(New BrunswickScientifics，Edison，USA)中的下列培養(yǎng)基中進行高細胞密度發(fā)酵4％(w/v)酵母提取物，4％(w/v)甘油，1％(w/v)磷酸氫二鈉，0.2％(w/v)磷酸二氫鉀和50μg/ml氨芐青霉素。當細胞在600nm的吸收值達到100，用1mMIPTG誘導蛋白質表達，然后用飼養(yǎng)培養(yǎng)基(29％(w/v)酵母提取物，39％(w/v)甘油和0.5％(w/v)硫酸鎂)進行9小時的DO-stat飼養(yǎng)分批培養(yǎng)(fed-batch)。8000xg離心30分鐘收獲細胞。每個發(fā)酵過程產生約80g細胞/L(濕重)。
為了評價LK68在大腸桿菌細胞的可溶性細胞組分還是不溶性細胞組分中表達，本發(fā)明人分析了這些組分中LK68的表達。該分析表明LK68位于不溶性細胞組分中。因此，必須使LK68變性、重折疊和再氧化二硫鍵。通過使用去氧膽酸鹽和其它變性劑，不溶性LK68蛋白以包涵體形式純化，純度大于95％。然后，用7M脲使包涵體溶解，通過快速稀釋法和平衡透析機制將其折疊成天然構型。在折疊緩沖液中，純化的包涵體可以方便地再折疊，且無可檢測的蛋白凝聚。透析后，通過賴氨酸瓊脂糖凝膠4B親合色譜純化蛋白質。結合到賴氨酸瓊脂糖凝膠上的蛋白質用ε-ACA(ε-氨基-n-己酸)特異性洗脫。這表明定位在重折疊蛋白的KIV37 kringle中的賴氨酸結合位點是完全有功能的。用0.1Mε-ACA對LK68進行的親合洗脫產生約3mg蛋白/g細胞(濕重)。隨后用多粘菌素B小珠(Sigma Chemical Co.，USA)進行層析，消除所有內毒素，用鱟變形蟲狀細胞裂解物分析試劑盒(Biowhittaker Inc.，USA)確定殘存的內毒素活性。通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質，然后將其在-20℃儲藏，直到使用。LK68的計算pI值為6.13。純化的LK68 N-末端氨基酸序列通過氨基酸測序證實。實施例3雞絨毛尿囊膜分析為了確定LK68在體內是否有抗血管發(fā)生活性，本發(fā)明人考察了它抑制絨毛尿囊膜(＂CAM＂)中毛細血管發(fā)育的能力(參見Lee，T.H.等，J.Biol.Chem.，27328805-28812，1998)。將受精三天的雞蛋在37℃孵育，提取卵清蛋白后，開一個小口。孵育兩天后，將一個含有重組LK68蛋白的Thermanox蓋玻片(Nunc Inc.，USA)應用于個體胚的CAM。48小時后，將20％的脂肪乳注射到胚的絨毛尿囊中，考察Thermanox周圍的血管形成(參見圖2)。在圖2中，左照片顯示CAM中毛細血管的正常發(fā)育；右照片顯示LK68對CAM血管發(fā)生的抑制作用。
當給CAM施用劑量范圍為3-5pg的LK68時，受測試的100個雞蛋中超過60％在應用樣品的周圍顯示無血管區(qū)，表明毛細血管的生長受到抑制。對于每種kringle結構域的重組蛋白，例如LK6，LK7或LK8，60-70％受測試蛋在1g/CAM的劑量范圍時，顯示抑制作用(參見圖3(A)和3(B))。該體內研究顯示apo(a)kringle結構域具有抗-血管發(fā)生活性，并且LK68及單一kringle蛋白是血管發(fā)生的強效抑制劑。在所有受測試的雞胚中，沒有任何毒性的證據。實施例4內皮細胞增殖的抑制在下述條件下分析重組LK68，LK6，LK7和LK8蛋白對bFGF刺激的牛毛細血管內皮(BCE)細胞增殖的抑制活性。BCE細胞在含10％小牛血清(BCS)和3ng/ml bFGF(Upstate Biotechnology，USA)的DMEM中生長。將約3000個細胞加入96-孔組織培養(yǎng)平板的各個孔中，在37℃，5％CO2大氣下培養(yǎng)。培養(yǎng)18小時后，用含0.5％BCS的DMEM替換培養(yǎng)基，并將實驗樣品加到各孔中。30分鐘溫育后，加bFGF至終濃度為1ng/ml。通過[3H]胸苷摻入法測定細胞數目。實驗進行三次。
如圖4所示，確定了LK68，LK6，LK7和LK8以劑量依賴方式特異性抑制BCE細胞增殖。當使用制管張素作為陽性對照時，所有受測試的Apo(a)kringle蛋白在該實驗條件下看起來更為有效。測定LK68的半數最大抑制濃度(ED50)約為200-250nM，LK6約為140-170nM，LK7約為10-20nM，LK8約為10-20nM(參見圖4(A)和4(B))。
在下述條件下分析重組LK68和LK8蛋白對bFGF刺激的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖的抑制活性。HUVEC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，USA)在含10％熱滅活的胎牛血清(＂FBS＂)(Hyclone，USA)，30μg/ml內皮細胞生長添加劑(ECGS)(Sigma Chemical Co.，USA)，和100μg/ml肝素(Sigma Chemical Co.，USA)的F12K培養(yǎng)基中生長。將細胞以2000/孔的密度接種96-孔組織培養(yǎng)平板中。細胞在37℃，5％CO2溫育18小時，用無血清的培養(yǎng)基清洗一次，然后加入含有0.5％FBS的F12培養(yǎng)基。用不同濃度的樣品處理細胞，并溫育30分鐘。然后，分別將終濃度為30μg/ml，100μg/ml和5ng/ml的ECGS、肝素和bFGF(Upstate Biotechnology，USA)加入細胞。溫育48小時后，應用5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)(BoehringerMannheim，USA)通過細胞增殖ELISA測定細胞數目。實驗進行三次。
如圖4(C)所示，確定了LK68以及LK8以劑量依賴方式特異性抑制HUVEC細胞增殖。
在存在LK68或單一kringle蛋白例如LK6，LK7和LK8時，BCE或HUVEC細胞的形態(tài)看起來類似未處理細胞的形態(tài)。除此而外，除去LK68后，細胞增殖可以通過bFGF刺激恢復。這些結果表明LK68以及單一kringle蛋白對毛細血管內皮細胞沒有細胞毒性。而且，該抑制活性看起來對內皮細胞，例如BCE和HUVEC細胞是特異性的。另外，LK68和LK8未顯示抑制非內皮細胞型細胞，例如CHO細胞、小鼠皮膚成纖維細胞NIH3T3細胞、小鼠Lewis肺癌細胞、小鼠腎上腺瘤Y1細胞和小鼠胎肝/SV40轉化細胞系TIB74的增殖(參見圖5(A)到5(F))。圖5(A)到5(C)代表各種腫瘤細胞例如LLC、Y1、和TIB74的敏感度，圖5(D)到5(F)分別代表各種正常細胞系例如CHO，MSF，和NIH3T3的敏感度。實施例5內皮細胞遷移的抑制作用在8-mm孔的Transwells(Costar，USA)中進行細胞遷移分析。簡單地說，將各孔涂布纖連蛋白(25μg/ml)(Sigma Chemical Co.，USA)過夜，將HUVEC以2000/孔的密度接種到上層腔中的100μl含有0.4％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改進的Eagle′s培養(yǎng)基中。將500μl含有0.4％FCS的DMEM加到下層腔中，在37℃溫育1小時。將1μM濃度的實驗樣品加入到上層腔中，將25ng/ml的bFGF加入到下層腔中。溫育5小時后，用棉簽擦拭掉上層腔中的細胞后，對穿過纖連蛋白鋪板膜的細胞定量。用Diff-Quik染料(Dade Behring Inc.，USA)按照生產商的說明書設置的方法對穿過膜的細胞染色，然后在100x放大倍數下記數。實驗進行兩次。
用堿性FGF(25ng/ml)刺激HUVEC細胞遷移。在劑量為1μM，LK68和單一kringle蛋白例如LK6，LK7和LK8將bFGF-誘導的HUVEC細胞遷移完全抑制到未誘導的對照水平(參見圖6(A)和6(B))。在圖6中，(-)CON代表未誘導的對照，(+)CON代表bFGF-誘導的陽性對照。
如上述用BCE細胞進行遷移分析。應用兩種不同濃度的LK68或單一kringle蛋白，所有受測試的Apo(a)kringle蛋白顯示對BCE細胞遷移具有抑制作用。另外，LK68和其單一kringle蛋白對BCE細胞遷移的抑制比制管張素(AS)更有效(參見圖7)。實施例6對原發(fā)性腫瘤生長的抑制為了比較處理小鼠和對照小鼠的腫瘤，還從血管密度和出血形成，以及形態(tài)外觀方面進行了組織學分析(參見圖9(A)到9(C))。在圖9(A)到9(C)中，9(A)顯示PBS-處理的對照，9(B)是10mg/kg體重LK68-處理的LLC腫瘤，9(C)是100mg/kg體重LK68-處理的LLC腫瘤。通過蘇木精和曙紅(H/E)染色，在LK68-處理的腫瘤中觀察到明顯的組織學差異即腫瘤細胞不完整，形態(tài)學上非存活；腫瘤周圍檢查到帶狀壞死。而且，LK68-處理的腫瘤中血管密度降低。在所有用重組LK68處理的小鼠中，沒有出現炎癥或出血的證據。
該實驗中使用的四周齡遠系繁殖的雌性nu/nu裸鼠在無菌環(huán)境下養(yǎng)殖?；\子、草墊、食物和水都是高壓滅菌的。小鼠以12-hr光/12-hr暗循環(huán)生長。人肺癌細胞(A549，購自韓國細胞系庫)在添加10％熱滅活的FBS和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中維持生長。將大約2×107個人肺癌細胞皮下注射到裸鼠背部近中線部位。當腫瘤移植7天后，腫瘤可觸知時，用劑量為100mg/kg體重的LK68處理小鼠。對照組僅用PBS處理。治療持續(xù)17天。每隔一天測量腫瘤尺寸。
LK68的處理減弱了腫瘤生長即，LK68-處理的A549腫瘤比對照動物的腫瘤小大約57.5％(參見圖10)。在所有處理小鼠中，沒有顯示任何毒性。只要給藥，連續(xù)治療使腫瘤始終維持在休眠狀態(tài)。這些數據充分表明LK68的抗血管發(fā)生作用可以用于靶向多種原發(fā)性惡性腫瘤。
如前面清楚地舉例說明和證明的，本發(fā)明提供了一種新的血管發(fā)生抑制劑，LK68，其氨基酸序列與人apo(a)kringle結構域IV36，IV37和V38的一致，一種編碼LK68的DNA序列，一種含有所述DNA的重組表達載體，一種用所述重組表達載體轉化的重組微生物，LK68作為抗癌劑的用途，及治療血管發(fā)生介導的疾病的方法。
序列表<110>財團法人牧巖生命工學研究所<120>一種新的血管發(fā)生抑制劑<160>14<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>924<212>DNA<213>人<400>1aaaagccctg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac ggagttatcg aggcatatcc60tccaccactg tcacaggaag gacctgtcaa tcttggtcat ctatgatacc acactggcat120cagaggaccc cagaaaacta cccaaatgct ggcctgaccg agaactactg caggaatcca180gattctggga aacaaccctg gtgttacaca accgatccgt gtgtgaggtg ggagtactgc240aatctgacac aatgctcaga aacagaatca ggtgtcctag agactcccac tgttgttcca300gttccaagca tggaggctca ttctgaagca gcaccaactg agcaaacccc tgtggtccgc360cagtgctacc atggcaatgg ccagagttat cgaggcacat tctccaccac tgtcacagga420aggacatgtc aatcttggtc atccatgaca ccacaccggc atcagaggac cccagaaaac480tacccaaatg atggcctgac aatgaactac tgcaggaatc cagatgccga tacaggccct540tggtgtttta ccacggaccc cagcatcagg tgggagtact gcaacctgac gcgatgctca600gacacagaag ggactgtggt cgctcctccg actgtcatcc aggttccaag cctagggcct660ccttctgaac aagactgtat gtttgggaat gggaaaggat accggggcaa gaaggcaacc720actgttactg ggacgccatg ccaggaatgg gctgcccagg agccccatag acacagcacg780ttcattccag ggacaaataa atgggcaggt ctggaaaaaa attactgccg taaccctgat840ggtgacatca atggtccctg gtgctacaca atgaatccaa gaaaactttt tgactactgt900gatatccctc tctgtgcatc ctct 924<210>2<211>308<21 2> PRT<213>人<400>2Lys Ser Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Arg Ser Tyr1 5 10 15Arg Gly Ile Ser Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp20 25 30Ser Ser Met Ile Pro His Trp His Gln Arg Thr Pro Glu Asn Tyr Pro35 40 45Asn Ala Gly Leu Thr Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ser Gly Lys50 55 60Gln Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Cys Val Arg Trp Glu Tyr Cys65 70 75 80Asn Leu Thr Gln Cys Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Leu Glu Thr Pro85 90 95Thr Val Val Pro Val Pro Ser Met Glu Ala His Ser Glu Ala Ala Pro100 105 110Thr Glu Gln Thr Pro Val Val Arg Gln Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln115 120 125Ser Tyr Arg Gly Thr Phe Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln130 135 140Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Arg Thr Pro Glu Asn145 150 155 160Tyr Pro Asn Asp Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala165 170 175Asp Thr Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Ile Arg Trp Glu180 185 190Tyr Cys Asn Leu Thr Arg Cys Ser Asp Thr Glu Gly Thr Val Val Ala195 200 205Pro Pro Thr Val Ile Gln Val Pro Ser Leu Gly Pro Pro Ser Glu Gln210 215 220Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys Ala Thr225 230 235 240Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu Pro His245 250 255Arg His Ser Thr Phe Ile Pro Gly Thr Asn Lys Trp Ala Gly Leu Glu260 265 270Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ile Asn Gly Pro Trp Cys275 280 285Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Ile Pro Leu290 295 300Cys Ala Ser Ser305<210>3<211>273<212>DNA<213>人<400>3aaaagccctg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac ggagttatcg aggcatatcc60tccaccactg tcacaggaag gacctgtcaa tcttggtcat ctatgatacc acactggcat120cagaggaccc cagaaaacta cccaaatgct ggcctgaccg agaactactg caggaatcca180gattctggga aacaaccctg gtgttacaca accgatccgt gtgtgaggtg ggagtactgc240aatctgacac aatgctcaga aacagaatca ggt 273<210>4<211>91<212>PRT<213>人<400>4Lys Ser Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Arg Ser Tyr1 5 10 15Arg Gly Ile Ser Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp20 25 30Ser Ser Met Ile Pro His Trp His Gln Arg Thr Pro Glu Asn Tyr Pro
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1.LK6蛋白(SEQ ID NO4)，由人載脂蛋白(a)kringle結構域IV36的氨基酸序列組成。
2.LK7蛋白(SEQ ID NO6)，由人載脂蛋白(a)kringle結構域IV37的氨基酸序列組成。
3.LK8蛋白(SEQ ID NO8)，由人載脂蛋白(a)kringle結構域V38的氨基酸序列組成。
4.LK68蛋白(SEQ ID NO2)，由人載脂蛋白(a)kringle結構域IV36，IV37和V38的氨基酸序列以連續(xù)方式組成。
5.一種編碼權利要求1的LK6蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO3)。
6.一種編碼權利要求2的LK7蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO5)。
7.一種編碼權利要求3的LK8蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO7)。
8.一種編碼權利要求4的LK68蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO1)。
9.一種重組表達載體pET15b/LK6，含有權利要求5的cDNA，其表達權利要求1的LK6蛋白。
10.一種重組表達載體pET15b/LK7，含有權利要求6的cDNA，其表達權利要求2的LK7蛋白。
11.一種重組表達載體pET15b/LK8，含有權利要求7的cDNA，其表達權利要求3的LK8蛋白。
12.一種重組表達載體pET11a/LK68，含有權利要求8的cDNA，其表達權利要求4的LK68蛋白。
13.用權利要求9的重組表達載體pET15b/LK6轉化的大腸桿菌BL21(DE3)/LK6(KCTC0655BP)。
14.用權利要求10的重組表達載體pET15b/LK7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)/LK7(KCTC0656BP)。
15.用權利要求11的重組表達載體pET15b/LK8轉化的大腸桿菌BL21/LK8(KCTC0634BP)。
16.用權利要求12的重組表達載體pET11a/LK68轉化的大腸桿菌BL21/LK6-8(KCTC0633BP)。
17.一種抗癌劑，其含有活性成分LK68蛋白，其單一kringles，或它們的功能等同物，和藥物可接受載體。
18.一種治療血管發(fā)生-介導的疾病的方法，其包括給人或動物施用治療有效量的K68蛋白，其單一kringles，或它們的功能等同物。
19.權利要求18的治療血管發(fā)生-介導的疾病的方法，其中血管發(fā)生-介導的疾病是癌癥、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、或眼血管發(fā)生性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的血管發(fā)生抑制劑,LK68,其氨基酸序列與人載脂蛋白(a)kringle結構域IV36,IV37和V38的一致,一種編碼LK68的cDNA序列,一種含有所述cDNA的重組表達載體,一種用所述重組表達載體轉化的重組微生物,以及LK68作為抗癌劑的新用途和治療血管發(fā)生介導的疾病的方法。LK68,LK6,LK7和LK8對培養(yǎng)的內皮細胞增殖和內皮細胞遷移表現抑制活性。LK68和其單一kringle還抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中毛細血管的正常發(fā)育。還顯示LK68的系統給藥抑制原發(fā)性腫瘤生長,其與誘導腫瘤的血管發(fā)生的抑制有關。因此,LK68蛋白,其單一kringle或它們的功能等同物可以用于開發(fā)有效的抗癌劑,該抗癌劑對血管發(fā)生介導的疾病,包括癌癥、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、眼血管形成性疾病等高度有效。
文檔編號A61K38/17GK1367791SQ99816907
公開日2002年9月4日 申請日期1999年9月15日 優(yōu)先權日1999年9月15日
發(fā)明者張志勛, 金章性, 樸恩正, 廉晶善, 鄭守一 申請人:財團法人牧巖生命工學研究所