專利名稱：：佐劑化的基因疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)的基本領(lǐng)域，以及通常涉及用于核酸免疫技術(shù)的試劑。更具體的，本發(fā)明涉及疫苗組合物以及利用這些疫苗組合物來誘導(dǎo)增強的免疫應(yīng)答抵抗所選抗原的方法。因此這些所謂的“基因疫苗”被證明在被治療的動物中引發(fā)免疫應(yīng)答，其與在施用活減毒疫苗后觀察到的免疫應(yīng)答類似，減毒疫苗是目前所用疫苗的最有效的形式?；诤怂岬囊呙绲睦碚撚行詠碓从谝呙缃M合物引發(fā)重新生產(chǎn)正確折疊的蛋白抗原的能力，該蛋白抗原可導(dǎo)致識別復(fù)合的三維表位的抗體應(yīng)答。此外，這些抗原在特定抗原呈遞細胞中的體內(nèi)產(chǎn)生導(dǎo)致加工的肽片段由MHCI類分子呈遞，導(dǎo)致抗原特異性溶細胞性的T淋巴細胞(CTLs)的激活。迄今為止，最有效的核酸免疫技術(shù)包括通過顆粒介導(dǎo)，胞內(nèi)的遞送(delivery)將DNA疫苗組合物遞送到表皮。參見，例如，歐洲專利No.0500799。此技術(shù)避免了胞外遞送的缺陷(例如，通過針或注射器遞送到皮膚或肌肉)，因為人們確信大多數(shù)的此種胞外遞送的DNA是快速降解的，因此需要接種超量DNA僅僅來達到充分水平的抗原表達。顆粒介導(dǎo)的DNA遞送到表皮，在一方面，直接地遞送質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)沉淀到表皮細胞中，包括表皮朗格罕氏細胞(Langerhanscells)。因為此直接的胞內(nèi)遞送，DNA避免了被胞外核酸酶作用且僅非常少量的DNA需要被遞送。事實上，通常單獨施周之后，用納克級量的所給質(zhì)粒DNA進行的顆粒介導(dǎo)的免疫可導(dǎo)致引發(fā)非常強烈的體液和CTL應(yīng)答。瘧疾是一種普遍和重要的人類疾病，尤其在一些熱帶國家。疾病由蚊子攜帶的寄生蟲惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)和間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)引起的。然而瘧疾疫苗研究還需安全，實用，和有效的預(yù)防性疫苗產(chǎn)物的發(fā)展。盡管大量實例的顯著免疫應(yīng)答已經(jīng)在動物模型和人自愿受試者中通過使用許多種的試驗疫苗被引發(fā)，由此種接種賦予的在人臨床試驗中實際上的保護卻令人非常失望的低。增加的對瘧疾寄生蟲生活周期的理解以及來自不同寄生蟲生活階段的重要抗原的鑒定使得制備來引發(fā)保護性抗體以及細胞效應(yīng)細胞，例如CTLs，的各種疫苗策略得到了發(fā)展。瘧疾的疾病周期開始于蚊子的咬傷，其注射傳染性的瘧疾子孢子到血液中。因此子孢子特異性抗體是預(yù)防或顯著限制肝細胞在此階段感染的有效方式看起來是很合理的。在肝細胞被感染后，然而寄生蟲在肝細胞的胞內(nèi)發(fā)育且可能避開循環(huán)抗體(circulatingantibody)。在此階段，在裂體性孢子或血液階段的裂體性孢子釋放之前在感染的肝細胞表面子孢子特異抗原的呈遞提供了瘧疾特異的CTLs的有吸引力的靶。此效應(yīng)器能夠在成熟血液裂體性孢子的第一次釋放之前除去感染的肝細胞或引發(fā)破壞胞內(nèi)寄生蟲。因此，本發(fā)明提供了一種組合物其含有(a)含有編碼目的抗原的序列的核酸分子；以及(b)一種佐劑，當其在接種個體的細胞中表達時其有效地增強至少一種免疫應(yīng)答的成分直接抵抗抗原，其中的佐劑以不同于DNA的形式存在于組合物中。在一個具體的實施方案中，核酸分子被提供在載體構(gòu)建體中，優(yōu)選為質(zhì)粒。組合物也優(yōu)選包被在核心載體顆粒上，例如包被在金或鎢沖擊載體顆粒上。所選抗原可被獲得或來源于任意的被期望引發(fā)免疫應(yīng)答抵抗的因子，且因此可來自感染的或寄生蟲疾病因子，腫瘤特異的或“自體”抗原，變態(tài)反應(yīng)原，等等。在一個具體的實施方案中，抗原是病毒抗原，例如來自肝炎B病毒(HBV)，人體免疫缺陷病毒(HIV)或流感病毒的抗原。在另一個實施方案中，抗原來自寄生蟲，例如瘧疾寄生蟲。所選佐劑可以為任意合適的佐劑組合物。在一個具體的實施方案中，佐劑至少部分溶于乙醇中。優(yōu)選的佐劑包括單磷酰基脂A(MPL)，以及皂草苷例如Quil-A。其它優(yōu)選的佐劑為在本文所描述的所謂免疫改變佐劑(immuneshiftadjuvant)。所有的這些佐劑可被用在藥劑的生產(chǎn)中來用于核酸免疫技術(shù)。本發(fā)明也提供了利用上述的組合物來引發(fā)免疫應(yīng)答抵抗接種的個體中所選的抗原。這些方法需要直接遞送充分量的組合物到個體靶位點的細胞來產(chǎn)生所期望的免疫應(yīng)答。在特定的實施方案中，組合物首先被包被到核心載體顆粒(例如金或鎢沖擊顆粒)上并通過穿越皮膚的接種(transdermal)遞送技術(shù)給藥，例如顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)。優(yōu)選的靶組織因此為表皮組織。本發(fā)明的主要目的也是為了提供新的組合物來用于核酸(遺傳)接種方法其中組合物由含有編碼目的抗原的序列的核酸分子和免疫改變佐劑結(jié)合形成，該免疫遺傳改變佐劑有效地增強引發(fā)抵抗接種個體中的抗原的免疫應(yīng)答的Th1成分。這里免疫改變佐劑也是以不同于DNA的形式存在于組合物中，且組合物用于直接的胞內(nèi)遞送。在特定的實施方案中，抗原來自傳染性或寄生蟲疾病因子和/或免疫改變佐劑是單磷酰基脂A。組合物可被包被在核心載體顆粒上來提供藥理制劑。本發(fā)明的另一個進一步的目的是提供一種方法來引發(fā)免疫應(yīng)答抵抗個體(例如，接種抵抗一種傳染性疾病因子)中的所選抗原，其包括步驟遞送在抗原的個體細胞中在充分的水平引起表達的基因構(gòu)建體到細胞中來產(chǎn)生抗原特應(yīng)性免疫應(yīng)答；以及鄰近在遞送遺傳構(gòu)建體時共同給藥(coadminister)個體有效量的免疫改變佐劑來充分的引起在沒有免疫改變佐劑的應(yīng)答的接種個體中被引發(fā)的Th1和Th2型免疫應(yīng)答平衡的改變。本發(fā)明因此通過利用改變或重新引導(dǎo)個體對基因疫苗的免疫學(xué)應(yīng)答的免疫改變佐劑推動了基因疫苗的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括(a)遞送基因疫苗組合物到受驗者的靶位點的細胞中，其中的疫苗組合物含有編碼抗原的核酸；以及(b)共同給藥一種佐劑，其中佐劑組合物可被給藥于與疫苗組合物相同或不同的位點。佐劑組合物可以在疫苗組合物之前或之后或同時被遞送。佐劑和疫苗組合物可以單一的組合物或分開的組合物被給藥。在一個特定的實施方案中，佐劑組合物以微粒的形式并通過皮膚遞送技術(shù)被遞送，優(yōu)選利用無針注射粉末注射裝置。在一個相關(guān)的實施方案中，佐劑通過顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)被給藥。對于這兩個實施方案來說，優(yōu)選的靶位點為表皮組織。在另一個實施方案中，佐劑被局部給藥于靶位點。本發(fā)明的另一個進一步的目的是提供一種用于瘧疾的有效的基因疫苗。組合物包括一種編碼在一或多個瘧疾抗原，例如，CS抗原，在個體中表達的基因構(gòu)建體；以及充分改變在接種的個體中引發(fā)的免疫應(yīng)答有利于從顯著的Th2應(yīng)答到Th1應(yīng)答的特性的有效量的免疫改變佐劑。本發(fā)明的優(yōu)點為基因疫苗組合物的效力可以被增強。另一個優(yōu)點是所述的方法和組合物可被用于特定適應(yīng)或改變使用基因疫苗組合物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的特性。本發(fā)明的這些或其它的目的，實施方案以及優(yōu)點對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說參考本文的內(nèi)容將很容易地想起。優(yōu)選實施方案詳述在具體描述本發(fā)明之前，可以理解本發(fā)明不限于特定的疫苗制劑或方法參數(shù)因為這些，當然，會改變的。也可以理解本文所用的術(shù)語僅僅是為了描述本發(fā)明的特定的實施方案的目的且并非用于來限制。必須說明，在此說明書和所附的權(quán)利要求書中，單數(shù)形式的“a““an”和“the”包括復(fù)數(shù)含義除非內(nèi)容在其它方面清楚地表明。因此，例如，“一顆?！卑▋苫蚋嗟念w粒，“一種抗原”或“一種佐劑”包括兩或更多因子的混合物或組合?！耙环N賦形劑”包括兩種或更多賦形劑的混合物或組合物。等等。A.定義除非另有定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的普通人員普遍理解的意思相同。盡管大量的與本文所描述的相似或等同的方法可被用于到本發(fā)明的實施中，在此描述優(yōu)選的材料和方法。在本發(fā)明的描述中，應(yīng)用下面的術(shù)語，且被定義如下。本文所用的術(shù)語“穿越皮膚的(transdermal)”遞送意指進入皮膚內(nèi)的(例如，進入真皮或表皮層之內(nèi))，穿越皮膚的(例如，”經(jīng)由皮膚的”)例如，通過因子遞送到或通過至少皮膚的表層。參見，例如TransdermalDrugDeliveryDevelopmentalIssuesandResearchInitiatives，Hadgraft和Guy(eds.)，MarcelDekker，Inc.，(1989)；ControlledDrugDeliveryFundamentalsandApplications，Robinson和Lee(eds.)，MarcelDekkerInc.，(1987)；以及TransdermalDeliveryofDrugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(eds.)，CRC出版社，(1987)?！翱乖笔侵溉我獾拿庖咴栽蛞蜃樱ǔ榇蠓肿?，其可以引發(fā)個體的免疫學(xué)應(yīng)答。此術(shù)語可被用于指單獨的大分子或抗原大分子的同源或異源群體。本文所用的術(shù)語“抗原”包括變態(tài)反應(yīng)原。因此，術(shù)語“抗原”廣泛地包含，包括蛋白質(zhì)，多肽，抗原蛋白片段，寡糖，聚多糖，有機的或無機的化學(xué)制劑或組合物，等等元件。此外，抗原可來源于或獲得自任意的病毒，細菌，寄生蟲，原生動物，或真菌，且可以為完整的生物體。此術(shù)語也包括腫瘤抗原或所謂的涉及自身免疫病的“自體”抗原。類似的，表達抗原的寡核苷酸或多核苷酸，例如在核酸免疫應(yīng)用中的，也包括在此定義中。合成抗原也被包括在內(nèi)，如多聚抗原表位、側(cè)翼抗原表位和其它的重組或合成來源的抗原(Bergmann等(1993)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol).232777-2781；Bergmann等(1996)免疫學(xué)雜志(J.Immunol).1573242-3249；Suhrbier，A.(1997)免疫學(xué)和細胞生物學(xué)(Immunol.andCellBiol)75402-408；Gardner等(1998)第12屆世界AIDS研討會(12thWorldAIDSConference)，日內(nèi)瓦，瑞士，6月28日-7月3日，1998)。術(shù)語“核酸分子”和“多聚核苷酸”可互換使用，是指任何長度核苷酸的多聚體形式，核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它們的類似物。多聚核苷酸的非限制的例子包括基因，基因片段，外顯子，內(nèi)含子，信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)運RNA，核糖體RNA，核酶，cDNA，重組多聚核苷酸，分枝的多聚核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離DNA，任何序列的分離RNA，核酸探針和引物。本發(fā)明上下文中的“基因”是指核酸分子(染色體，質(zhì)粒等)遺傳功能相關(guān)的核苷酸的序列?；蚴且粋€例如生物體的遺傳單位，包括一個多核苷酸序列(例如，一個哺乳動物的DNA序列)，其在生物體的基因組中占有特異性的物理區(qū)域(“基因座位”或“遺傳座位”)。基因可以編碼表達產(chǎn)物，例如多肽或多核苷酸(例如，tRNA)。可選擇的，基因可以限定基因定位來用于特定的事件/功能，例如蛋白和/或核酸的結(jié)合(例如，噬菌體吸附位點)，其中的基因不編碼表達的產(chǎn)物。典型地，基因包括編碼序列，例如多肽編碼序列，和非編碼序列，例如啟動子序列，多腺苷化序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(例如增強子序列)。許多真核基因具有被“內(nèi)含子”(非編碼序列)隔開的“外顯子”(編碼序列)。在某些情況下，基因與另一個基因具有共同的序列(例如，重疊基因)?！熬幋a序列”或“編碼”選擇多肽的序列是一個核酸分子，當其放置在適當?shù)恼{(diào)控序列(或“控制元件”)控制下的時候，在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄(在DNA的情況下)并且翻譯(在RNA的情況下)成多肽。術(shù)語包含基因。編碼序列的界線是由5′(氨基)末端的一個起始密碼子和3′(羧基)末端的一個翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可包括，但不限于，來自病毒的cDNA，原核生物或真核生物的mRNA，來自病毒的基因組DNA序列或原核生物的DNA，甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼序列的3′一端。編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯通常被“控制元件”調(diào)控，包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄啟動子，轉(zhuǎn)錄增強子元件，轉(zhuǎn)錄終止信號，多聚腺苷酸序列(位于翻譯終止密碼子的3′一端)，優(yōu)化翻譯起始的序列(位于編碼序列的5′一端)，和翻譯終止序列?！拜d體”是任意的能夠遞送核酸分子(例如多核苷酸或基因序列)到靶細胞(例如，病毒載體，非病毒載體，顆粒載體，和脂質(zhì)體)的元件。典型的，“載體構(gòu)建體”，“表達載體”，和“基因遞送載體”，指任意的能夠引導(dǎo)目的基因表達的核酸構(gòu)建體且其能夠遞送基因序列到靶細胞。因此，術(shù)語包括克隆和表達載體，以及病毒載體?！翱刹僮鞯剡B接”是指元件的排列，其中所述的元件被裝配以便行使其通常的功能。因此，一個給定的可操作地連接到一個編碼序列(例如，編碼目的抗原)的啟動子，當存在適合的酶的時候，是能夠影響編碼序列的表達的。啟動子或其它的控制元件不需要鄰近編碼序列，只要它們發(fā)揮指導(dǎo)其表達的功能。如，插入性非翻譯但仍然轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于啟動子序列和編碼序列之間并且啟動子序列仍能被認為是“可操作地連接”到編碼序列的。本文使用的描述一個核酸分子的“重組的”意指一個基因組的、cDNA的、半合成的或合成來源的多聚核苷酸，合成來源是根據(jù)其來源或操作而言的(1)不與同它在自然狀態(tài)下一起關(guān)聯(lián)的全部或部分多聚核苷酸關(guān)聯(lián)；和/或(2)連接到不同于它在自然狀態(tài)下連接的多聚核苷酸。術(shù)語“重組的”涉及蛋白質(zhì)或多聚核苷酸時意指通過重組多聚核苷酸的表達而產(chǎn)生的多肽。確定核酸和氨基酸的“序列一致性”的技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。典型地，這樣的技術(shù)包括確定基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定由此編碼的氨基酸序列，以及將這些序列和另一核苷酸或氨基酸序列進行比較。通常，“一致性(identity)”是指兩個多聚核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸的各自的對應(yīng)。兩個或多個序列(多聚核苷酸或氨基酸)能夠藉由確定它們的“百分比一致性”來比較。兩個序列的百分比一致性，無論核酸或氨基酸序列，是一個由兩個比對(aligned)的序列之間的精確匹配個數(shù)除以較短序列的長度，再乘以100后得來的數(shù)字。核酸序列的近似比對是由Smith和Waterman的局部同源算法(localhomologyalgorithm)提供的，AdvancesinAppliedMathematics2482-489(1981)。此算法通過使用由Dayhoff開發(fā)的劃線矩陣，AtlasofProteinSequencesandStructureM.O.Dayhoffed.，5suppl.3353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation，華盛頓，D.C.，USA，且被Gribskov標準化(1986)Nucl.AcidsRes.14(6)6745-6763，可被應(yīng)用于氨基酸序列。這一算法的一個示范性的運行是確定由GeneticsComputerGroup(Madison，WI)在“BestFit”這一應(yīng)用軟件中提供的序列百分比一致性的確定。這個方法的默認參數(shù)在威斯康辛序列分析軟件包(WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual)的程序手冊第8版(1995)(可以從GeneticsComputerGroup，Madison，WI得到)中有描述。本發(fā)明上下文中確定百分比一致性的方法優(yōu)選使用愛丁堡大學(xué)的MPSRCH軟件包，由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok開發(fā)，并由IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)分發(fā)。從這一軟件包套件，可以進行Smith-Waterman算法，使用默認參數(shù)用于得分表(scoringtable)(如，gapopenpenaltyof12，gapextensionpenaltyofone，andagapofsix)。從這一數(shù)據(jù)產(chǎn)生的“匹配”值反映“序列一致性”。用于計算序列之間的百分比一致性或類似性的其它合適的程序通常是本領(lǐng)域熟知的，如另外的一個比對程序是BLAST，按默認的參數(shù)使用。如，BLASTN和BLASTP可使用如下的默認參數(shù)geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swissprotein+Spupdate+PIR。這些程序的細節(jié)能在下列各項英特網(wǎng)地址找到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST?？蛇x擇的，同源性可以由多聚核苷酸雜交來確定，雜交的條件是在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定的雙鏈體形式，隨后用單鏈特異的核酸酶消化并進行被消化片段的大小確定。如同使用上面的方法確定的那樣，兩個DNA或兩個多肽序列，當它們的序列在一個分子整個的定義長度下，呈現(xiàn)至少約80％-85％，優(yōu)選至少約90％，和最優(yōu)選至少約95％-98％序列一致性的時候，就說它們是彼此“大體上同源”。如本文使用的，大體上同源也是指序列與指定的DNA或多肽序列表現(xiàn)完全的一致性。大體上同源的DNA序列能由在如特定的系統(tǒng)所定義的嚴格條件下進行的Southern雜交實驗來確定。例如，嚴格的雜交條件可以包括50％甲酰胺、5xDenhardt氏溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml變性的鮭精DNA，而且洗滌條件可以包括37℃，2×SSC，0.1％SDS，隨后68℃1×SSC，0.1％SDS。定義適當?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)。參見，例如，Sambrook等，supra；DNACloning，supra；NucleicAcidHybridization，supra。術(shù)語“疫苗組合物”是指任意的含有抗原的藥物組合物(特定的，本文所用術(shù)語是指包含含有編碼抗原的序列的核酸分子的組合物)，其中組合物可被用于預(yù)防或治療受試者的疾病或身體不適。疫苗組合物也可含有一或多種佐劑。典型的，疫苗被用于病原菌引起的疾病的預(yù)防，然而，本發(fā)明的疫苗組合物也可被用于治療。抵抗所選因子，抗原或目的組合物的“免疫學(xué)應(yīng)答”或“免疫應(yīng)答”是對存在于藥劑或目的組合物中的分子(例如抗原)，個體中體液和/或細胞免疫應(yīng)答的擴展。對應(yīng)于本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng)答”是指由抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細胞免疫應(yīng)答”是一種T-淋巴細胞和/或其它白血球介導(dǎo)。哺乳動物的免疫應(yīng)答被認為涉及一或兩個顯著應(yīng)答策略后的免疫級聯(lián)，其通過引發(fā)級聯(lián)的T輔助細胞來表征。因此，對特異性抗原的免疫應(yīng)答可被表征為T輔助細胞1(Th1)-型或T輔助細胞2(Th2)-型應(yīng)答，依據(jù)抗原呈遞后，從抗原特異性T淋巴細胞釋放的細胞因子的類型。Th1免疫應(yīng)答通常通過從抗原刺激的T輔助細胞中的釋放炎癥性的細胞因子例如IL-2，γ干擾素(IFN-γ)，以及α腫瘤壞死因子(TNF-α)來表征。Th1應(yīng)答也與強烈的細胞免疫性(例如，CTLs)以及具有受調(diào)理素作用和補體固定活性的IgG抗體亞組例如IgG2a的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，在通常所用的小鼠模型中。在另一方面，Th2免疫應(yīng)答是在抗原特異的T輔助細胞刺激后，通過非炎癥性細胞因子，例如IL-4和IL-10的釋放來表征的。Th2應(yīng)答通常沒有最大的CTL活性，但與強烈的抗體應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，呈遞IgG亞組例如小鼠中的IgGI，缺少受調(diào)理素作用和補體固定活性的抗體。通常，與Th2應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的抗體水平被認為比與Th1應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的抗體水平更強烈。術(shù)語“佐劑”是指任意的能夠特異性或非特異性改變，增強，引導(dǎo)，重新引導(dǎo)，加強或引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)或組合物。因此，佐劑和抗原(例如，疫苗組合物)的共同給藥可在給藥抗原的受試者中獲得期望的免疫應(yīng)答所必需的低劑量的或較低劑量的抗原。在本發(fā)明的特定實施方案中，佐劑與編碼抗原的核酸共同給藥可重新引導(dǎo)免疫應(yīng)答抵抗抗原，例如，其中的免疫應(yīng)答被從Th2-型重引導(dǎo)為Th1-免疫應(yīng)答，反之亦然。佐劑的效力可被檢測通過給藥含有佐劑的疫苗組合物以及疫苗組合物對照于動物并比較抗體的滴度和/或細胞介導(dǎo)的免疫抵抗此二者，通過利用本領(lǐng)域公知的例如放射免疫測定，ELISAs，CTL實驗，等標準的方法。典型的，在疫苗組合物中，佐劑是來自抗原的單獨的元件，盡管可具有佐劑和抗原的特性(例如，霍亂毒素)。為達到本發(fā)明的目的，佐劑被用來增強對特異性抗原的免疫應(yīng)答，例如，當佐劑與疫苗組合物一起給藥時，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強烈于由相同量的疫苗組合物而沒有佐劑給藥引發(fā)的免疫應(yīng)答，或者佐劑被用于重新引導(dǎo)免疫應(yīng)答的特性。此外，為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，“有效量的”佐劑應(yīng)為增強對疫苗組合物中的共同給藥的抗原的免疫應(yīng)答的量，使得較低或較少劑量的抗原被需求來產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，或“有效量的”佐劑應(yīng)為充分的引起對于單獨抗原的免疫應(yīng)答相關(guān)的免疫應(yīng)答的改變或重新引導(dǎo)的量?！白魟┙M合物”指任意的含有佐劑的藥物組合物?！懊庖吒淖冏魟笔且环N有效的改變或引導(dǎo)(重引導(dǎo))抵抗含有(receiving)抗原和免疫改變佐劑的所選抗原的免疫應(yīng)答特性的佐劑。改變或重引導(dǎo)是相關(guān)于直接抵抗沒有免疫改變佐劑的抗原的免疫應(yīng)答的特性。因此，此佐劑在此被用于改變抵抗所選抗原(由存在于疫苗組合物中的核酸序列編碼的抗原)的免疫應(yīng)答的特性來使得利于Th1型應(yīng)答代替Th2型應(yīng)答，或利于Th2型應(yīng)答代替Th1型應(yīng)答。大量已知的可被用作免疫改變佐劑的佐劑包括，但不限于單磷酰脂A(MPL)佐劑。佐劑充當免疫改變佐劑的能力可以被檢測，通過測定疫苗組合物單獨給藥，疫苗組合物和佐劑一起給藥產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的特性。此測定包括在主體中抗原呈遞后，從抗原特應(yīng)性T淋巴細胞釋放的細胞因子的類型的表征或鑒定和/或相對于單獨抗原，抗原/佐劑組合物引發(fā)的主要的IgG亞組的表征和鑒定。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過本說明書指導(dǎo)，能較好地理解所有的這些特性或特征。本文所述的術(shù)語“共同給藥”，例如當一種佐劑被與編碼抗原的核酸(例如，一種疫苗組合物)“共同給藥”時，是指佐劑和抗原的同時或協(xié)作給藥，例如，當二者存在于相同的組合物中或在幾乎相同的時間但在不同的位點分別給藥。以及單獨組合物中的佐劑和抗原的遞送在不同的時間的遞送。例如，佐劑組合物可在相同或不同位點的抗原的遞送之前或其后被遞送。佐劑和抗原遞送之間的時間選擇可為從大約幾分鐘的間隔到幾小時間隔，到幾天的時間間隔的范圍。本文的術(shù)語“治療”包括下面的任意一種感染或再感染的預(yù)防；癥狀的減輕或去除；以及病原體的減少或完全去除。治療可以是預(yù)防性的作用(在感染前)。術(shù)語“個體”(individual)和“受試者”(subject)在此被交互使用，其是指任意cordata亞門(subphylumcordata)的一員，包括但不限于，人和其它的靈長類動物(包括非人類靈長類例如黑猩猩和其它的猿類和以及猴子)；農(nóng)業(yè)動物例如牛，綿羊，豬，山羊和馬；馴養(yǎng)的哺乳動物例如狗和貓；實驗室動物包括嚙齒動物例如小鼠，大鼠和豚鼠；鳥(包括家養(yǎng)的，野生的和野味鳥例如小雞，火雞和其它的鶉雞類鳥，鴨子，鵝)；魚，等等。此術(shù)語不表示特定的年齡。因此，成年的和新出生的個體均被包括。本文所述的方法可被用于上述脊椎動物種類的任意種類，因為所有這些脊椎動物的免疫系統(tǒng)的運作是相似的。B.常規(guī)的方法本發(fā)明的基本前提是發(fā)現(xiàn)非DNA佐劑可被合并到基于核酸的疫苗組合物(例如，DNA或基因疫苗組合物)中并用于改變，增強，引導(dǎo)到或重新引導(dǎo)在治療個體中對抗原的免疫應(yīng)答特性。組合物，其含有包含編碼目的抗原的序列的核酸分子組合物以及以不同于DNA的形式的佐劑，被直接給藥于需治療的個體的靶組織的細胞中。優(yōu)選的，但不是必要的，組合物被包被在核心載體顆粒上其大大地促進了新組合物的直接的胞內(nèi)遞送。組合物的佐劑成分為有效地增強被引發(fā)抵抗相應(yīng)抗原的免疫應(yīng)答的至少一個方面。在本發(fā)明的一個方面，選擇佐劑來改變或重新引導(dǎo)相對于在缺乏共同給藥的佐劑時產(chǎn)生的抗原特異的免疫應(yīng)答的特性。在本發(fā)明的另一個方面，選擇佐劑來增強抗原特異的免疫應(yīng)答的T輔助細胞1(Th1)組分。在本發(fā)明的一個特定的方面，人們已發(fā)現(xiàn)加入合適的免疫應(yīng)答改變佐劑到DNA疫苗中具有刺激和改變由疫苗引發(fā)的抗原特異的免疫應(yīng)答來利于Th1應(yīng)答替換Th2應(yīng)答。一種特定的已被發(fā)現(xiàn)具有這種作用的是單磷酰脂A(MPL)，盡管其它的類似作用的佐劑已被鑒定。此種DNA疫苗中的免疫應(yīng)答的改變增加了DNA疫苗對各種感染性疾病例如瘧疾的效力?？乖糜诒景l(fā)明組合物的基因疫苗的核酸分子不需要復(fù)雜制備技術(shù)。最關(guān)鍵的制備步驟哪么，非常明顯，是編碼目的抗原的合適的序列的選擇?？乖贿x擇使得免疫應(yīng)答，當被引發(fā)時，將提供一些對預(yù)防接種的個體的特定水平的治療效果，例如特定水平的抵抗疾病因子的有效保護。在這些實施方案中，其中來自DNA疫苗的免疫應(yīng)答可被變更(modified)來增強免疫應(yīng)答的Th1特性。疫苗中由DNA編碼的抗原將基于此影響來篩選。因此，通常，抗原將通過特定的遞送方法，靶組織，以及相應(yīng)的佐劑被篩選。例如，小鼠用編碼流感病毒核蛋白抗原(NP)，人癌變胚胎抗原(CEA)，或P.falciparumCS抗原的載體進行的顆粒介導(dǎo)的免疫可預(yù)測地導(dǎo)致Th2應(yīng)答的抗體應(yīng)答。在另一方面，小鼠用編碼HIV蛋白的載體免疫最初產(chǎn)生Th1類的應(yīng)答，伴隨另外的免疫可被轉(zhuǎn)變?yōu)門h2應(yīng)答。此外，用編碼肝炎B病毒(HBV)表面和核心抗原的載體免疫產(chǎn)生一種可被分類為Th0的應(yīng)答，其由于兩種主要IgG亞組在抗原特異性免疫應(yīng)答中的等表示(equalrepresentation)。因此，對于特定的感染性或由寄生蟲引起的疾病來說，可能DNA免疫后的免疫學(xué)結(jié)果將適當?shù)靥峁┳罴训谋Ｗo，而對于其它的疾病，免疫學(xué)結(jié)果的變更或重新引導(dǎo)對于獲得高于未使用佐劑所觀察到的有效水平的保護是必要的。例如，有可能對于特定的感染性或由寄生蟲引起的疾病來說，免疫應(yīng)答，當在強度上顯著，可能不會適當?shù)靥峁┳罴阎委熜Ч?，例如，保護。換句話說，免疫應(yīng)答可能是在量上是充分的，但在質(zhì)上不充分。此種可為瘧疾的情況，其中的較早的疫苗數(shù)據(jù)顯示Th1應(yīng)答可能是重要的，但當使用編碼CS的質(zhì)粒載體時，其中的Th2應(yīng)答通過表皮的DNA接種被引發(fā)。因此，預(yù)想的佐劑的效果可能不增強免疫應(yīng)答的量的水平，但反而僅是重新引導(dǎo)免疫應(yīng)答來增強應(yīng)答的Th1組分。因此，對于本發(fā)明組合物的核酸成分而言，合適的啟動子系統(tǒng)將被可操作的連接于編碼目的抗原的序列。目的抗原將優(yōu)選的與病原體例如病毒，細菌或寄生蟲病原體相結(jié)合，或抗原可為腫瘤特異性抗原，自身抗原或變態(tài)反應(yīng)原。抗原可以為全長蛋白?？蛇x擇的，抗原主要僅含有抗原的B-細胞表位或T-細胞表位。腫瘤特異性抗原包括，但不限于，任意的不同的MAGEs(黑素瘤E相關(guān)抗原E)，包括MAGE1，MAGE2，MAGE3(HLA-A1肽)，MAGE4，等等；任意不同的酪氨酸酶(HLA-A2肽)；突變體ras；突變體p53；以及p97黑素瘤抗原。其它的腫瘤特異性抗原包括與早期癌癥相關(guān)聯(lián)的Ras肽和p53肽，與子宮癌相關(guān)的HPV16/18和E6/E7抗原，與乳房癌相關(guān)的MUC1-KLH抗原，與結(jié)腸癌相關(guān)的CEA(癌初期抗原)，與黑素瘤相關(guān)的gp100和MART1抗原，以及與前列腺癌相關(guān)的PSA抗原。p53基因序列是已知的(參見，例如Harris等(1986)Mol.Cell.Biol.64650-4656)并被保藏且GenBank登錄號No.M14694。合適的病毒抗原包括，但不限于，獲得和來源于肝炎病毒家族的抗原，包括肝炎A病毒(HAV)，肝炎B病毒(HBV)，肝炎C病毒(HCV)，δ肝炎病毒(HDV)，肝炎E病毒(HEV)以及肝炎G病毒(HGV)。通過實施例的方式，HBV的病毒基因組序列是已知的，同樣其編碼抗原的序列的獲得的方法也是已知的。參見，例如，Ganem等(1987)Annu.Rev.Biochem.56651-693；Hollinger，F(xiàn).B.(1990)HeatitisBvirus，vol.II，pp.2171-2235，F(xiàn)ields等(eds)，Virology，2nded，Raven出版社，NewYork，NY；以及Valenzuela等.(1980)肝炎B病毒基因組的核苷酸序列和主要病毒基因的鑒定(ThenucleotideSequenceoftheHepatitisBviralGenomeandtheIdentificationoftheMajorViralGenes)，pp.57-70，F(xiàn)ields等.(eds)，動物病毒遺傳學(xué)，學(xué)院出版社(AcademicPress)，紐約，NY)。HBV基因組編碼一些病毒蛋白，包括大的，中等的，主要的表面抗原多肽，X-基因多肽，以及核心多肽。參見，例如Yokosuka等(1986)N.Engl.j.Med.3151187-1192；Imazeki等(1987)肝臟病學(xué)(Hepatology)7753-757；Kaneko等(1988)J.Virol.623979-3984；以及Ou等(1990)J.Virol.644578-4581。同樣地，HCV的病毒基因組序列以及其獲得的方法是已知的。參見，例如國際公布WO89/04669；WO90/11089；以及WO90/14436。HCV基因組編碼一些病毒蛋白，包括E1和E2。參見，例如，Houghton等(1991)肝臟病學(xué)(Hepatology)14381-388。編碼這些HBV和HCV蛋白的序列，以及其抗原的片段，將被用于本發(fā)明的方法中。類似的，來自HDV的δ抗原的編碼序列是已知的(參見，例如，U.S.專利5,378,814)。同樣的，編碼來自肝炎病毒家族的大量不同蛋白抗原的序列可被用于本發(fā)明中，其包括獲自或來源于1和2型單純皰疹病毒(HSV)，例如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB，gD和gH的抗原；來自痘皰疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)以及巨細胞病毒(CMV)包括CMVgB和gH的抗原；以及來自其它人皰疹病毒例如HHV6和HHV7的抗原。(參見，例如Chee等(1990)巨細胞病毒(Cytomegaloviruses)(J.K.McDougall，ed.，SpringerVerlag，pp.125-169；McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美國專利5,171,568；Baer等(1984)Nature310207-211；以及Davison等(1986)J.Gen.Virol.671759-1816.)。HIV抗原，例如大多數(shù)的HIV-1和HIV-2分離株的gp120序列，包括不同HIV遺傳亞型的成員是已知的并被報道(參見，例如，Myers等，LosAlamosDatabase，LosAlamosNationalLaboratory，LosAlamos，新墨西哥(1992)；以及Modrow等(1987)J.Virol.61570-578)并且獲自任意這些分離株的抗原將被用在本方法中。此外，發(fā)明同樣適用于其它獲自任意的不同分離株的免疫原性元件中，包括任意的不同的外殼蛋白例如gp160和gp41，gag抗原例如p24gag和p55gag，以及得自HIV的pol，env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR區(qū)域的蛋白。從其它病毒來源或獲得的抗原也將會用于本文，例如沒有限制地，來自小RNA病毒家族(Picornaviridae)家族成員(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒等)的抗原；杯狀病毒；披膜病毒(例如，風疹病毒，登革熱病毒等)；黃病毒；冠狀病毒；呼腸孤病毒；Birnaviridae病毒；彈狀病毒(例如，狂犬病病毒等)；線狀病毒；副粘病毒(例如，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒等)；布尼亞病毒；沙粒病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也以HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等聞名))包括但不限于來自分離株HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN的抗原)；HIV-1CM235，HIV-1US4；HIV-2，在其它的之中；參見，如病毒學(xué)，第三版(W.K.Jokliked.1988)；基礎(chǔ)病毒學(xué)(FundamentalVirology)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.1991)，得到這些和其它病毒的描述。編碼合適的細菌和寄生蟲抗原的序列被得自獲獲自已知的引起疾病的病因，例如白喉，百日咳，破傷風，肺結(jié)核，細菌或真菌肺炎，霍亂，傷寒，鼠疫，志賀氏菌病或沙門氏菌病，軍團病，萊姆病，麻瘋病，瘧疾，鉤蟲病，盤尾絲蟲病，血吸蟲病，錐蟲病，Lesmaniasis，賈第蟲病，阿米巴病，絲蟲病，Borelia，以及旋毛蟲病。另一種抗原可被獲得或來源于非常規(guī)的病毒或類病毒因子例如庫魯病、克羅伊茨費爾特-雅各布綜合癥(CJD)，瘙癢病，可傳染的水貂腦病和慢性消耗性疾病的病原體因子，或獲自與瘋牛病相關(guān)的朊蛋白的傳染性顆粒例如朊病毒。編碼合適的變態(tài)反應(yīng)原的序列可被用于本發(fā)明中，其包括但不限于，來自花粉，動物皮屑，草，霉菌，粉塵，抗生素，螫咬昆蟲的毒液，以及不同的環(huán)境，藥物和食物變態(tài)反應(yīng)原。普通的樹木變態(tài)反應(yīng)原包括來自三角葉楊，popular，桉樹，樺樹，楓木，橡樹，榆樹，山核桃樹，和美洲山核桃樹的花粉；通常的植物變態(tài)反應(yīng)原包括來自黑麥，豚草，長葉車前草，酸尾草(sorreldock)和藜草的變態(tài)反應(yīng)原；植物接觸變態(tài)反應(yīng)原包括這些來自有毒橡樹，有毒常春藤和蕁麻的；普通的草變態(tài)反應(yīng)原包括梯牧草，Johnson，百慕大草，羊矛草和六月禾變態(tài)反應(yīng)原；普通的變態(tài)反應(yīng)原也可獲自霉菌或真菌例如鏈格孢屬，鐮刀菌屬，單孢枝霉屬，曲霉屬，小多孢屬，白霉屬和嗜熱放線菌；青霉素和四環(huán)素是普通的抗生素變態(tài)反應(yīng)原；表皮的變態(tài)反應(yīng)原可被獲自居住環(huán)境的或有機粉塵(典型的真菌來源的)，來自昆蟲例如家螨(dermatphagoidespterosinyssis)，或來自動物來源的例如羽毛，以及貓和狗皮屑；通常的食物包括奶和干酪(日用的)，蛋，小麥，堅果(例如，花生)，海鮮(例如貝殼類)，豌豆，黃豆和麩質(zhì)變態(tài)反應(yīng)原；通常的藥物變態(tài)反應(yīng)原包括局部麻醉藥和水楊酸鹽變態(tài)反應(yīng)原；抗生素變態(tài)反應(yīng)原包括青霉素和磺胺類變態(tài)反應(yīng)原；通常的昆蟲變態(tài)反應(yīng)原包括蜜蜂，黃蜂，和螞蟻毒液，以及蟑螂萼(cockroachcalyx)變態(tài)反應(yīng)原。特定恰當特性的變態(tài)反應(yīng)原包括但不限于，DerpI變態(tài)反應(yīng)原的主要和隱蔽的表位(Hoyne等(1994)免疫學(xué)83190-195)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等(1996)J.Clin.Invest.981676-1683)，樺樹花粉變態(tài)反應(yīng)原Betv1(Bauer等(1997)Clin.Exp.Immunol.107536-541)，以及多表位重組草變態(tài)反應(yīng)原rKBG8.3(Cao等(1997)免疫學(xué)9046-51)。這些和其它合適的變態(tài)反應(yīng)原可通過商業(yè)獲得和/或可通過下面的技術(shù)被較容易地制備。通過已知的技術(shù)目的抗原的編碼序列可被獲得和/或制備。例如，大體上純的抗原制劑可通過利用標準的分子生物學(xué)工具獲得。也即，編碼這些上述抗原的多核苷酸序列可通過利用重組技術(shù)獲得，例如通過從表達基因的細胞中篩選cDNA和基因組文庫，或通過來自包括相同基因的載體獲得基因。此外，所期望的序列可被直接從含有其的細胞和組織分離，通過常規(guī)的技術(shù)，例如，苯酚萃取以及cDNA或基因組DNA的PCR.參見，例如，Sambrook等，supra，來描述用于獲得和分離DNA的標準技術(shù)。除了克隆，多核苷酸序列也可通過合成來產(chǎn)生。另一個傳統(tǒng)的用于分離特異性核酸分子的方法是通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR).Mullis等(1987)MethodsEnzymol.155335-350。此技術(shù)利用DNA聚合酶，通常為耐熱的DNA聚合酶，來復(fù)制DNA的目的區(qū)域。將被復(fù)制的DNA區(qū)域通過互補于目的DNA的相對末端和相對鏈的特定序列的寡核苷酸引發(fā)復(fù)制反應(yīng)被鑒定。復(fù)制第一輪的產(chǎn)物其本身是隨后復(fù)制的模板，因此復(fù)制的反復(fù)連續(xù)的循環(huán)產(chǎn)生通過所用引物堿基界定的DNA片段的幾何級數(shù)的擴增。一旦獲得特定的目的編碼序列，其可通過標準的克隆或分子生物學(xué)技術(shù)被可操作的連接于合適的調(diào)控元件來提供可表達的核酸分子。參見，例如，Edge(1981)Nature292756；Nambair等(1984)Science2231299；以及Jay等(1984)J.Biol.Chem.2596311。然后核酸分子本身被使用或僅被插入到合適的載體例如表達質(zhì)?；虿《据d體構(gòu)建體中。因此，本發(fā)明的核酸分子典型的含有同源或異源的啟動子序列以及其它合適的調(diào)控序列。這些其它的調(diào)控序列可包含終止和/或翻譯起始序列(例如GCCACCATGG或GCCCCCATGG)和/或翻譯終止密碼子(例如TAA，TAG或TGA)和/或多(聚)腺苷酸信號和/或RNA休止位點。此外，可以存在天然或異源啟動子序列的增強子序列。一旦被構(gòu)建，核酸分子可通過常規(guī)的基因遞送方法被給藥。基因遞送的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，U.S專利5399346，5580859，5589466。基因可被直接遞送給受試者或，可選擇的，體外遞送到受試者的細胞中且細胞重植入到受試者中。佐劑本發(fā)明的新化合物的第二組分是佐劑成分其可含有任意合適的佐劑或佐劑組合物。例如，合適的佐劑包括，但不限于，由鋁鹽形成的佐劑(alum)，例如氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁等等；水包油和油包水乳劑，例如完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；無機物凝膠；嵌段共聚物；AvridineTM脂類-胺；SEAM62；由細菌細胞壁形成的佐劑包括例如脂多糖類(例如脂A或單磷酰脂A(MPL)，Imoto等(1985)Tet.Lett.261545-1548)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，以及細胞壁骨架(CWS)；熱激蛋白或其衍生物；來自ADP核糖基化毒素的佐劑，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍亂毒素(CT)，E.coli熱不穩(wěn)定性毒素(LT1和LT2)，假單胞菌內(nèi)毒素A，假單胞菌屬內(nèi)毒素S，仙人掌(B.cereus)胞外酶，B.sphaericus毒素，C.肉毒梭菌(botulinum)C2和C3毒素，C.limosum胞外酶，以及來自產(chǎn)氣莢膜梭菌、spiriforma梭菌、差異(difficile)梭菌金黃色葡萄球菌EDIN的毒素，以及ADP核糖基化細菌毒素突變體例如CRM197，非毒素白喉毒素突變體(參見，例如，Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251175；以及Constantino等(1992)Vaccine)；皂甙佐劑例如QuilA(US專利5,057,540)，或來自皂甙的顆粒例如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物)；趨化因子和細胞因子，例如白介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，等等)，干擾素(例如γ干擾素)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，防衛(wèi)素1或2，RANTES，MIP1-a和MIP-2，等等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(正-MDP)，N-乙酰胞壁酰L-丙氨酰-D-異谷氨二?；?L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕櫚酰-sn-甘油-3huydroxyphosphoryloxy)-乙胺(MTP-PE)等等；獲自CpG分子家族，CpG二核苷酸和合成的含有CpG元件的寡核苷酸的佐劑(參見，例如，Krieg等Nature(1995)374546，Medzhitov等(1997)Curr.Opin.Immunol.94-9，以及Davis等JImmune(1998)160870-876)例如TCCATGACGTTCCTGATGCT和ATCC.limosum胞外酶GACTCTCGAGCGTTCTC；以及合成的佐劑例如PCPP聚-二(苯氧基羧酸酯)膦腈(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene](Payne等Vaccines(1998)1692-98)。此佐劑可購自大量的銷售商例如AccurateChemicals；RibiImmunechemicals，Hamilton，MT；GIBCO；Sigma，St.Louis，MO。用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選的佐劑為這些在乙醇中至少部分溶解的。本文特定優(yōu)選使用的一類佐劑為被歸為“皂甙”的佐劑，也即，來自皂樹，肥皂草，或絲石竹屬的皂甙產(chǎn)生植物的佐劑。皂甙為糖甙天然植物的產(chǎn)物，包括一個環(huán)結(jié)構(gòu)(糖苷配基)其上連接一或多個糖鏈。糖苷配基可以為紫菀屬的，三萜系化合物或甾醇[固醇]載體蛋白，且連接到糖甙鍵上的糖的數(shù)目可顯著的變化。大多數(shù)普通的被用作藥物佐劑的皂甙為提取自南美樹Quillajasaponaria的三萜烯糖甙且如QuilA所描述的(參見，例如US專利5,688,772；5,057,540；和4,432,969；以及國際公布No.WO88/09336，公開于1988.12.1)，其活性成分被稱為QS-21。另一種優(yōu)選的佐劑為稱作″GMTP-N-DPG″的胞壁酰二肽類似物(N-acetylglucosaminyl-N-乙酰胞壁酰--L-丙氨酰-D-isoglutamyl-L-丙氨酰-dipalmitoylpropylamide)。參見Fast等(1997)Vaccine15l748-1752。許多佐劑優(yōu)選在本發(fā)明中被用作免疫改變佐劑。此種佐劑的關(guān)鍵特征是相對于編碼抗原的DNA單獨使用時其以理想的方向重引導(dǎo)引發(fā)的免疫應(yīng)答。如果佐劑具有引導(dǎo)或改變免疫應(yīng)答有利于Th1而不同于Th2應(yīng)答的特性則是特別理想的。因為所有對抗原的免疫應(yīng)答是復(fù)雜的，且很多如果并非所有的免疫應(yīng)答涉及Th1及Th2應(yīng)答的元件，去尋找所有應(yīng)答的重新引導(dǎo)是不實際的。反之，所設(shè)想的是免疫應(yīng)答類型的相對的改變。例如，其中已被發(fā)現(xiàn)特定的抗原產(chǎn)生占優(yōu)勢的Th2應(yīng)答，且Th1應(yīng)答是更理想的結(jié)果，Th1的引導(dǎo)上的改變將顯示出來自疫苗較大的臨床效果。本文所述的免疫改變佐劑可能或不導(dǎo)致個體中的所有免疫應(yīng)答的總量的增加。反之，免疫改變佐劑意指改變或重新引導(dǎo)免疫應(yīng)答的特性或質(zhì)量而不是大小或數(shù)量。免疫改變佐劑的有利于Th1應(yīng)答的一個實施例是單磷酰脂A，或獲自RibiImmunochemicalResearch，Inc的MPL。免疫改變佐劑的有利于Th2應(yīng)答的一個實施例是1，25二羥基維生素D3。其它可能的免疫改變佐劑包括PPD，卡介苗(BCG)的純化的蛋白衍生物，海藻糖二霉菌酸酯，以及分支桿菌細胞壁骨架材料。佐劑可以單獨存在于暫時的組合物中或存在于兩種或多種佐劑組合中。在這點上，結(jié)合的佐劑可能具有在引發(fā)或改變免疫應(yīng)答上的累加的或協(xié)同的作用。協(xié)同的作用是其中的通過結(jié)合兩或多種佐劑作用得到的結(jié)果大于每一種佐劑分別給藥產(chǎn)生僅僅相加獲得的結(jié)果。不幸的是，已知大部分的上述佐劑是高度有毒的，且因此通常考慮對于人用而言有太多的毒性。因此目前允許用于人用途的唯一佐劑為明礬，一種鋁鹽組合物。雖然如此，大量的上述佐劑通常被用于動物且因此適于大多數(shù)的受試者，并且其中的一些正進行臨床前和臨床研究來用于人類用途。然而，人們發(fā)現(xiàn)通過被考慮對人用毒性太高的佐劑可通過粉末注射技術(shù)給藥(例如優(yōu)選在此使用顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù))而沒有伴隨的毒性問題。沒有被特定的理論所限制，少量的佐劑遞送到皮膚使得與皮膚皮層的表皮朗格罕氏細胞和鼠突狀細胞作用。這些細胞在免疫應(yīng)答的引發(fā)和維持中是很重要的。因此，增強的佐劑作用效果可以被獲得，通過靶向遞送到此細胞中或其附近。此外，佐劑在本發(fā)明實施中的皮膚遞送避免了毒性問題因為(1)皮膚的表層基本不形成血管，佐劑進入到系統(tǒng)循環(huán)中的量被減少從而降低了毒效；(2)皮膚細胞時常脫落，因此殘留的佐劑被除去而不是被吸收；以及(3)實質(zhì)上較少的佐劑可被給藥來產(chǎn)生合適的佐劑作用(與通過傳統(tǒng)技術(shù)例如肌內(nèi)注射的遞送佐劑相比)。一旦選擇，一或多種佐劑可以合適用于非腸道遞送的藥物形式被提供，此形式的制備時本領(lǐng)域的普通技術(shù)技能之內(nèi)。參見，例如Remington′sPharmaceuticalSciences(1990)MackPublishingCompany，Easton，Penn.，第18版?？蛇x擇的，佐劑可如下面詳述被制備成特定的形式。佐劑以有效量存在于藥物形式中來帶來理想的效力，也就是說，增強抵抗共同給藥的目的抗原的粘膜的應(yīng)答，和/或引導(dǎo)抵抗目的抗原的粘膜應(yīng)答。通常大約0.1μg到1000μg的佐劑，更優(yōu)選的大約1μg到500μg的佐劑，且更優(yōu)選的大約5μg到300μg的佐劑將有效的增強所給抗原的免疫應(yīng)答。因此，例如對于QuilA，大約0.5到50μg，優(yōu)選大約1到25μg，且更優(yōu)選大約5到20μg范圍的劑量，用于本發(fā)明的方法中。對于MPL，大約1到250μg，優(yōu)選大約20到150μg，且更優(yōu)選大約40到75μg范圍的劑量，用于本發(fā)明的方法中。其它佐劑的劑量可很容易地被本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過常規(guī)的方法來檢測。給藥的量依賴于許多因子包括共同給藥的抗原，以及佐劑充當免疫應(yīng)答的刺激器或充當免疫改變佐劑的能力。組合物的制備一旦被獲得，編碼目的抗原的核酸分子和，在大多數(shù)的實施方案中，所選的佐劑可被配制在一起作為單一的藥物制劑。在其它的實施方案中，佐劑可被制備以藥學(xué)上可接受的形式，例如液體溶液或懸浮液的形式(適于注射或局部給藥)或作為乳膏，乳液，軟膏劑，凝膠或其它合適的局部藥物的形式。例如，抗原編碼序列和/或佐劑可被結(jié)合于一或多個藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體來提供疫苗，佐劑或佐劑化(adjuvanted)的基因疫苗組合物。輔助的物質(zhì)，例如加濕劑或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)，等等，可存在于賦形劑和載體中。這些賦形劑，載體，和輔助物質(zhì)是其本身在接受組合物的個體中不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物因子，且其可被給藥而沒有過度的毒性。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于液體例如水，鹽水，聚乙二醇，透明質(zhì)酸，甘油和乙醇。藥學(xué)上可接受的鹽可被包括在此，例如無機酸鹽例如鹽酸鹽，氫溴化物，磷酸酯，硫酸鹽，等等；以及有機酸的鹽例如醋酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽，苯甲酸鹽，等等?？杀豢紤]但不是必需的是，組合物可含有充當穩(wěn)定劑的藥學(xué)上可接受的載體，特別是對于核酸和/或肽，蛋白或其它的佐劑?？勺鳛楹怂岷碗牡姆€(wěn)定劑的合適載體的實施例包括但不限于，藥物級的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇，肌醇，右旋糖酐等等。其他合適的載體包括但不限于淀粉，纖維素，磷酸鈉或鈣，檸檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量聚乙烯乙二醇(PEGs)，及其組合。藥學(xué)上可接受的賦形劑，載體，穩(wěn)定劑和其它的輔助物質(zhì)的詳細討論可得自REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.，N.J.1991)，引入本文作為參考。由于本發(fā)明疫苗組合物計劃被直接遞送到位于靶位點的細胞中，顆粒介導(dǎo)的遞送是本發(fā)明的實施中優(yōu)選的來給藥組合物的方法。相應(yīng)的，核酸分子和/或佐劑可包被在適于胞內(nèi)運輸?shù)暮诵妮d體顆粒上，例如，金或鎢。顆粒介導(dǎo)的用于遞送此疫苗制劑的方法是本領(lǐng)域公知的。更具體的，一旦被制備和適當?shù)丶兓幋a抗原的核酸和/或佐劑可被包被在載體顆粒上(例如沖擊(ballistic)核心載體)通過各種本領(lǐng)域公知的技術(shù)。載體顆粒被選自具有合適在典型的用于基因槍裝置的胞內(nèi)遞送的顆粒大小范圍中的密度的材料。最佳的載體顆粒大小將，當然，依賴于靶細胞的直徑。優(yōu)選利用顆粒介導(dǎo)技術(shù)的遞送因多個原因。一個重要的原因是迄今為止此基因遞送到哺乳動物的技術(shù)已顯示在所有實驗的哺乳動物的系統(tǒng)中具有相同效力的水平。此事實的重要意義在于動物模型的數(shù)據(jù)比其他的技術(shù)更直接的適用于和可轉(zhuǎn)移到人類的治療上，例如肌內(nèi)的基因遞送在嚙齒動物中已顯示出較大不同的效力。顆粒介導(dǎo)遞送裝置通常加速遺傳物質(zhì)到動物中通過使用合適的推動的外力，電火花放電或壓縮氣體的排出，因此使得很容易的選擇將核酸疫苗組合物導(dǎo)入的靶組織成為可能。與確定的顆粒介導(dǎo)遞送技術(shù)相一致，被導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)可在水性溶液中制備且然后沉淀到小的生物學(xué)惰性的核心載體顆粒上。任意合適的載體顆粒可被使用，例如由聚合物和金屬形成的顆粒(例如鎢，金，鉑和銥)；然而鎢和金載體顆粒是優(yōu)選的。鎢顆粒很容易的獲得平均直徑在0.5到2.0μm的大小。盡管此顆粒具有最佳的密度來用于顆粒介導(dǎo)的遞送方法，且允許非常高效的DNA包被，鎢可能對某些細胞類型潛在地有毒。金顆粒或微晶金(例如金粉末A1570，獲自EngelhardCorp.，EastNewark，NJ)也被用于本發(fā)明的方法中。金顆粒提供了均一的大小(獲自AlphaChemicals且顆粒大小為1-3μm，或獲自Degussa，SouthPlainfield，NJ，顆粒大小的范圍包括0.95μm)以及降低的毒性。微晶的金提供了不同大小的顆粒分布，典型的在0.5-5μm的范圍內(nèi)。然而，微晶金的不規(guī)則的表面區(qū)域提供了高度有效的核酸，抗原和佐劑的包被。本文所用的顆粒具有0.1μm-10μm的表稱尺寸。大量的方法是已知的且被用于描述包被或沉淀DNA或RNA到金或鎢顆粒上。此方法通常用質(zhì)粒DNA，CaCl2和亞精胺結(jié)合已預(yù)測量的金或鎢。產(chǎn)生的溶液在包被過程中不停地渦旋來確保反應(yīng)混合物的均一性。在核酸沉淀之后，包被的顆?？杀晦D(zhuǎn)到合適的膜上并在使用之前進行干燥，包被在簡單組件，藥筒或盒的表面，或裝入運輸盒中來用于顆粒介導(dǎo)的遞送裝置(例如，基因槍儀器)。肽佐劑可被吸附到相同或不同的核心載體顆粒上通過簡單混合兩種組分以依據(jù)經(jīng)驗確定的比率，通過硫酸銨沉淀或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的的溶劑沉淀方法，或通過化學(xué)耦合肽到載體顆粒上。L-半胱氨酸殘基到金上的耦合以前已被描述(Brown等(1980)ChemicalSocietyReviews9271-311)。其它的方法包括，例如，在純乙醇，水，或乙醇/水混合物中溶解肽，將一定量的載體顆粒加到溶液中，且然后當渦流時在空氣或氮氣的氣流中干燥混合物?？蛇x擇的，肽可通過在真空中離心被干燥到載體顆粒上。一旦被干燥，被包被的顆?？杀恢貞腋≡诤线m的溶劑中(例如，乙基醋酸鹽或丙酮)并研碎(例如通過超聲波)來提供大體上均一的懸浮液。在一個實施方案中，本發(fā)明在基因疫苗組合物中使用了MPL佐劑，MPL是一種復(fù)合的脂類分子。某些復(fù)合物在被包被到載體顆粒上之前可被簡單的混入到水性核酸(例如DNA)制劑中，且此在為MPL的情況下起作用，MPL或其它的乙醇可溶解的化合物可被簡單加入到典型用于懸浮DNA包被的金顆粒的乙醇溶液中。即使乙醇最后被從DNA包被的金顆粒蒸發(fā)干燥，在蒸發(fā)后仍保留充分佐劑(例如，MPL其是不揮發(fā)的)。這些相同的常規(guī)技術(shù)可在顆粒介導(dǎo)的基因遞送方法中與其它種類的生物材料一起使用，例如由非蛋白激素，維生素，或其類似物形成的佐劑。盡管用在載體顆粒上的DNA預(yù)包裝佐劑是很方便的，人們也發(fā)現(xiàn)即使從遺傳材料單獨的遞送佐劑可以是有效的。例如，通過顆粒介導(dǎo)技術(shù)的表皮遞送，佐劑可很容易的被用于用基因疫苗治療的區(qū)域。目前尚不知是否顆粒攜帶佐劑到基因表達的位點或是否佐劑僅因為其在基因遞送位點擴散而有效。對于顆粒介導(dǎo)的基因遞送來說，區(qū)別是不重要的。佐劑可與基因一起遞送或單獨被局部應(yīng)用，例如通過擦洗。顆粒介導(dǎo)技術(shù)使得疫苗組合物被直接遞送到體內(nèi)的任意靶組織類型或種類。然而，最方便的是遞送攜帶DNA的載體顆粒到表皮中。方便地，表皮被證明是DNA疫苗遞送的特別理想的場所。人們也已經(jīng)證明與其它可能的靶組織相比基因疫苗在表皮中可引發(fā)較大量的免疫應(yīng)答?；蜻f送到表皮引起的強烈的免疫應(yīng)答可能取決于免疫細胞，例如朗格罕氏細胞或其它的抗原呈遞細胞，其經(jīng)常融合到皮膚的表皮層來尋戰(zhàn)抗原目標。因此，在形成以后，用抗原或/和佐劑制劑包被的載體顆粒被遞送到靶皮膚位點，通過顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)。適于顆粒介導(dǎo)遞送的不同顆粒加速裝置是本領(lǐng)域公知，且均適于本發(fā)明實踐中的應(yīng)用。目前的裝置設(shè)計利用了爆炸的，電動的或氣體釋放來推動包被的載體顆粒到靶細胞。包被的載體顆粒本身可被釋放吸附到活動的載體薄片上，或可活動的吸附到氣流經(jīng)過的表面，從表面移動顆粒且加速推動其到靶細胞。氣體交換的實施例被描述于美國專利5,204,253。爆炸裝置被描述于美國專利4,945,050。氦交換型顆粒加速裝置的一個實施例為PowderJectsXR儀器(PowderJectVaccines，Inc.，Madison)，WI，此裝置被描述于美國專利5,120,657。適于此應(yīng)用的電動交換裝置被描述于美國專利5,149,655。所有的這些公開引入本文作為參考。單一劑量的包被載體顆?？杀惶峁┰诤线m的容器中，例如提供在含有包括包被在其內(nèi)表面的顆粒的管道節(jié)段的藥筒中。制備此容器的方法被描述在共同擁有的美國專利5,733,600和5,780,100中，其內(nèi)容引入本文作為參考。顆粒組合物或包被的顆粒通過與配藥制劑相適合的方式被給藥于個體，且其用量對于發(fā)明的目的是有效的。將被遞送的組合物的量(例如大約0.01μg到10mg，更優(yōu)選的1到50μg的抗原序列)，依賴于被試驗的個體以及被給藥的特定抗原或變態(tài)反應(yīng)原。必要的精確的量將依據(jù)年齡和被治療的個體的基本條件而變化，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀說明書可很容易地測定合適的有效的量。給藥和劑量安排疫苗組合物(含有編碼抗原的序列和/或佐劑)以與適合配藥藥劑的相容的方式被給藥于受試者，且以有效量來產(chǎn)生期望的粘膜免疫應(yīng)答。每次給藥的抗原的量為，在為編碼抗原的核酸分子的情況下，通常為大約從0.001μg到10mg的范圍，優(yōu)選大約0.01到5000μg的核酸分子每劑量(通常為大約0.5μg/kg到100μg/kg的核酸分子每劑量)。精確的量，當然，依據(jù)受試者及其治療或預(yù)防的條件二者。更具體的，所需的精確的量將依據(jù)年齡和個體的基本情況，和所選的特定抗原和佐劑以及其它的因素而變化。適當?shù)挠行Я靠杀槐绢I(lǐng)域的技術(shù)人員閱讀本說明書后很容易的測定和/或通過常規(guī)的實驗被檢測。劑量療法可以是單劑量進程或多劑量進程的，對疫苗組合物來說，多劑量進程的安排是一個基本的可為1-10個單獨劑量的接種過程，然后在其后的時間間隔給與其它的劑量，被選擇來維持和/或加強免疫應(yīng)答。例如在1-4月進行第二次給藥，且如果必要，其后的給藥在幾個月后。劑量可控制，至少部分決定于受試者的需要以及決定于醫(yī)師的分析判斷。此外，如果疾病的預(yù)防是理想的，組合物通常在目的病原體的初步感染之前給藥。如果治療是理想的，例如，癥狀的減輕或復(fù)發(fā)的減少，組合物通常在最初的感染之后被給藥。C.實施例下面是用來實施本發(fā)明的具體實施方案的實施例。實施例僅僅是用來闡述發(fā)明的目的，且并不是以任何方式來限定本發(fā)明的范圍。我們已經(jīng)努力來確保所用數(shù)字的精確度(例如，量，溫度，等等)，但一些實驗錯誤和誤差將，當然，被允許。實施例1利用顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)來重新引導(dǎo)對CEA的免疫應(yīng)答為了證明MPL佐劑對裸DNA疫苗免疫應(yīng)答的影響，進行下面的研究。佐劑和含有編碼目的抗原的序列的核酸分子被通過顆粒介導(dǎo)的遞送利用基因槍共同給藥。此實施例所用的特定的抗原為人癌初期抗原(″CEA″)，人腫瘤抗原被廣泛的用于癌治療研究的實驗中。以前的工作揭示了當一個編碼CEA的基因通過顆粒介導(dǎo)的遞送被遞送到小鼠中時，Th2型的免疫應(yīng)答為優(yōu)勢的，其通過IgG1在動物的血清抗體的滴度優(yōu)勢被顯示。沒有佐劑時，Th2型CEA特異性抗體(IgG1)在大于Balb/c小鼠的Th1型CEA特異性抗體(IgG2a)20倍的水平被檢測。在此進行的工作被用于論證Th2免疫應(yīng)答能夠被改變?yōu)門h1應(yīng)答通過使用免疫改變佐劑。為達到此方案的目的，含有CEA抗原的在巨細胞病毒啟動子和編碼區(qū)域之間帶有CMV內(nèi)含子的立即早期啟動子的調(diào)控下的編碼區(qū)的質(zhì)粒構(gòu)建體被使用。為了形成組合物，在120μL水中的64μg的被稱為WRG7083的質(zhì)粒被加到Eppendorf管中的32毫克的0.9微米金珠中，例如2μgDNA/mg金。然后，13.5μL的醋酸銨溶液和135μL的異丙醇被加入，且試管被簡單地渦旋?；旌衔镌?20℃溫育15分鐘來沉淀DNA到金上。DNA包被的珠被沉淀下來通過10分鐘旋轉(zhuǎn)并除去上清液。金/DNA顆粒通過在1mL乙醇中渦旋洗滌四次，微量離心(microfuging)10秒鐘，并除去上清。在最后洗滌后，DNA包被的金載體顆粒被重懸浮在1.14mL乙醇中，使得每250μ的乙醇懸浮液含有7mg的金載體顆粒，其中每毫克金帶有2μg的DNA。分別的，乙醇中1mg/mLMPL的溶液被制備并被用作MPL貯存液。然后制備下列的各種溶液(0MPL)-250μL載體顆粒懸浮液，750μL額外的乙醇，以及0μLMPL貯存液。(0.05mg/mLMPL)-250μL載體顆粒懸浮液，750μL額外的乙醇，以及50μLMPL貯存液。(0.2mg/mLMPL)-250μL載體顆粒懸浮液，750μL額外的乙醇，以及200MPL貯存液。(0.5mg/mLMPL)-250μL載體顆粒懸浮液，750μL額外的乙醇，以及500MPL貯存液。(1mg/mLMPL)-250μL載體顆粒懸浮液，通過離心除去乙醇并用MOL貯存液替換。每一種制劑在水浴超聲儀中超聲作用10秒鐘以在乙醇中產(chǎn)生均一的金載體顆粒懸浮液。這里所述的顆粒介導(dǎo)的遞送利用通過壓縮氣推動的基因遞送裝置實施。此設(shè)備獲自Agracetus，Inc.且被稱為ACCELL裝置，大體上相同的設(shè)備目前可獲自PowderJectVaccines，Inc.且被稱為PowderJectTMXR裝置。此裝置的基本樣式，描述于PCT專利申請PCT/US95/00780和美國專利5,865,796及5,584,807，這些公開引入本文作為參考，構(gòu)建以便DNA包被的載體顆粒被放置，或包被其本身到圓柱形的顆粒載體的內(nèi)部。對于這一載體，TefzelTM管的圓柱形部分被利用。利用帶有為此目的制備的裝置接頭的注射器，上述每一種懸浮液被注入到30英寸長的TefzelTM管中，1毫升(7mgDNA包被的金顆粒)的每一懸浮液灌注到7英寸長的管中，每英寸的管產(chǎn)生極小分散的1mg的含有或不含有MPL的DNA-包被的金載體顆粒。管被轉(zhuǎn)到使管保持線性水平狀態(tài)的固定裝置中。在載體顆粒被允許片刻的明顯沉淀后，過量的乙醇被從管的一端排出且管被旋轉(zhuǎn)三十秒來更平均地分散顆粒包圍在圓柱形管的內(nèi)部。殘留的乙醇然后用氮氣通過管30分鐘被除去。管被分割成很多部分，每一部分為1/2英寸長。每一部分管被用作一份藥劑用于加速裝置，其釋放噴射的壓縮氦氣通過管部分內(nèi)部來從管獲取載體顆粒并攜帶其用于實驗的受試者。模型動物為6到8周齡的Balb/c小鼠(Harlan/Sprague/Dawley，IndianapolisIndiana)，其已被麻醉且除去腹部毛發(fā)。在每一動物腹部的兩個相鄰位置的每一處，單劑量的DNA包被的載體顆粒被遞送到表皮中通過具有400psi壓力的氮氣交換。因此每一位點接收到1μg的在0.5mg含有不同量MPL的金載體顆粒上的DNA，且每一動物具有兩個位置。在平行實驗中，MPL貯存液在基因遞送之前通過擦拭被直接用于動物的治療位點的皮膚。通過用浸入過MPL貯存液溶液的棉花涂藥器在動物腹部的擦拭，其后在遞送相應(yīng)劑量的DNA包被的載體顆粒之前乙醇被允許蒸發(fā)10分鐘。在處理4周后，血清樣從免疫的動物獲得并利用得自SouthernBiotech的ELISA試劑盒定量測定CEA特異性抗體(IgG和IgG2a)。通過與已知濃度的標準免疫球蛋白同種型比較，CEA-特異性免疫球蛋白的定量測定得以進行。研究的結(jié)果描述于附圖1。如所顯示的，受試于基因疫苗的佐劑和佐劑的每一劑量水平的三個小鼠在圖表中用單個的棒條表示。在圖表的左端，三個棒條表示接受不含MPL的藥劑的動物，這些動物的免疫應(yīng)答，如所看到的，為顯著的Th2-類，IgG1類型抗體與IgG2a抗體的比平均為27.5倍。在治療動物中免疫應(yīng)答的性質(zhì)變化最大的為0.2mg/mLMPL的比率，其中IgG1與IgG2a的比降低為4.5。當MPL被擦拭于動物時，如附圖1的最右邊所顯示的，結(jié)果可比較于0.2mg/mL基因槍遞送方法，IgG1與IgG2a的比約為4.0。其它的MPL劑量顯示了免疫應(yīng)答的重新引導(dǎo)的水平的變化，但是全部清楚顯示了比沒有佐劑的基因疫苗所獲得的更強烈的IgG2a應(yīng)答。這些結(jié)果證明MPL佐劑的應(yīng)用通過改變應(yīng)答中Th1型抗體的產(chǎn)生的確改變了針對基因疫苗的免疫應(yīng)答的性質(zhì)。下面描述的實施例2-5的研究，被進行來評價不同編碼抗原的序列和QuilA佐劑的胞內(nèi)共同給藥所提供的佐劑的效果。在每一研究中含有編碼病毒抗原的序列的DNA分子被與QuilA佐劑結(jié)合并包被在金顆粒上來提供與本發(fā)明相符的示范的組合物。包被的顆粒給藥于動物受試者，且組合物引發(fā)抗原特異性Th的能力，CTL和抗體應(yīng)答的能力與QuilA佐劑在DNA遞送之前的直接胞外皮內(nèi)給藥或皮下給藥比較。在每一研究中，使用下面的常規(guī)方法。包被核心載體顆粒稱重合適重量的金顆粒直接加到1.5mLEppendorf管中。然后加入400-500μL的0.05M亞精胺，金/亞精胺溶液的凝塊通過使用水浴超聲波3-5秒打碎。DNA貯存液，含有相應(yīng)的DNA質(zhì)粒分子，被加入到金/亞精胺溶液中來產(chǎn)生2.0μgDNA/mgAu的裝載率的珠子，且管被蓋蓋并倒置混合，然后短暫渦旋。在調(diào)低渦旋速度后，且當輕輕地渦旋時，10％CaCl2被滴加加入到等于加到干燥金顆粒上的亞精胺的體積。一旦全部的CaCl2被加入，產(chǎn)生的溶液被高速渦旋5秒鐘。溶液然后被允許在室溫下沉淀至少10分鐘。同時，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)/乙醇貯存液以0.03mgPVP/mLEtOH的濃度被形成。在10分鐘的沉淀后，管被短暫離心(10-15秒)來沉淀所有的金。上清液被抽出，且管被“傾斜”穿過Eppendorf支架來分散金顆粒。800μL的EtOH被加入，且管被倒置幾次來洗滌DNA-包被的金。此步驟被重復(fù)兩次。在此管被再次離心和抽去上清后，洗滌的DNA包被的金顆粒家道PVP貯存液，加50μg的QuilA到PVP-DNA包被的金顆粒溶液中，超聲波處理3秒。產(chǎn)生用DNA+QuilA疫苗組合物包被的顆粒，其然后裝載到TefzelTM管的如實施例1所述的節(jié)段。鼠ELISPOT分析材料和試劑如下。包被的載體包括大鼠(Rat)抗鼠IFN-γAb，大鼠抗鼠IL-4AB或大鼠抗鼠IL-5Ab(Pharmigen)；檢測抗體包括生物素標記的大鼠抗鼠IFN-γ，生物素標記大鼠抗鼠IL-4或生物素標記大鼠抗鼠IL-5(Pharmingen)；無菌過濾的碳酸鹽緩沖液pH9.6(Pierce)，96孔ELISPOT板(Millipore)，無菌1X磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS，Gibco)，鏈霉抗生物素堿性磷酸酶耦合物(Mabtech)；堿性磷酸酶底物試劑盒(BioRad)，以及RPMI-10％FCS細胞培養(yǎng)基(Sigma)。細胞刺激按如下進行。對T輔助細胞因子釋放(T-HelperCellCytokineRelease)而言，來自接種動物的脾細胞被培養(yǎng)在6×106細胞/mL的補充了丙酮酸鈉和非必需氨基酸的RPMI10％FCS中。1mL的細胞被轉(zhuǎn)到24孔板的每一孔中，對于每一個受試者，1孔＝僅培養(yǎng)基(用于本底對照)，以及1孔＝所選的抗原或所選的II型肽。板然后被溫育在組織培養(yǎng)恒溫箱3天。為了CTL前體IFN-γ釋放(CTLPrecursorIFN-γRelease)，來自接種動物的脾細胞被培養(yǎng)在6×106細胞/mL的補充了丙酮酸鈉和非必需氨基酸的RPMI-10％FCS中。1mL的細胞被轉(zhuǎn)到24孔板的每一孔中，板被溫育兩天。其后加入CTL肽到肽孔中后，對于每一個受試者，1孔＝僅培養(yǎng)基(用于本底對照)，1孔＝10-5M的CTL肽，以及1孔＝不相關(guān)的CTL肽。板在加入肽之后且放置細胞到ELISPOT板之前被溫育。ELISPOT板的包被和阻斷被進行如下。ELISPOT板在放置細胞之前利用50μL每孔的15μg/mL包被抗體在pH9.6的無菌碳酸鹽緩沖液中包被一天。包被的板在其被用100μLPBS洗滌6次除去未結(jié)合的包被Ab之前4℃溫育過夜，然后輕輕地涂布。每一孔被用200μLRPMI-10％FCS阻斷1-2個小時，室溫下在組織培養(yǎng)箱中。所有的阻斷介質(zhì)在細胞被放置之前除去。細胞被放置如下，在3天后，每孔的細胞和上清液被收集并轉(zhuǎn)到15mL圓錐形管中。細胞被旋轉(zhuǎn)離心來收集上清，然后-80℃保存直至被用于細胞因子ELISA分析。沉淀的細胞被重懸浮在2-5mL介質(zhì)中，然后使之達到終濃度為1×107/mL。細胞被加至ELISPOT孔中濃度為1×106/孔。ELISPOT板被顯色(developed)如下。細胞被輕輕拂出且通過噴瓶用PBS洗滌兩次板?？妆挥肈I水洗滌(將水留在孔中幾分鐘來溶解殘留的細胞)，板被洗滌兩次或更多次。檢測抗體在無菌PBS中被稀釋到1μg/mL且然后被加至50μL/孔并室溫下溫育2小時。板用PBS洗滌5次并加入50μL鏈霉抗生物素堿性磷酸酶偶合物(在PBS中稀釋1∶1000)，且板在室溫下被溫育2小時。板然后用PBS洗滌5次，且50μL的產(chǎn)色堿性磷酸酶底物被加入，且板被允許在室溫下溫育直至暗斑點出現(xiàn)(大約2小時)。顏色反應(yīng)通過用200μL的自來水洗滌三次被終止，板允許被干燥，并在解剖顯微鏡(40x)下計算點數(shù)。小鼠肽-脈沖CTL分析材料和試劑如下。RPMI-10培養(yǎng)基(500mLRPMI1640含有L-谷酰胺和羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，55mL熱失活的胎牛血清(FBS)，0.5mL慶大霉素，5.5mL抗生素(抗真菌溶液)；致敏培養(yǎng)基(SensitizationMedia)(″SM″)不含IL-2(500mLRPMI-10，5.0mL100mM丙酮酸鈉，5.0mL100X非必需氨基酸)；以及含有IL-2的SM(SM含有終濃度為20U/mL的重組鼠IL-2)；CTL表位肽(肽被溶解在組織培養(yǎng)級的DMSO中到10-2M的備用濃度)；ACK溶解緩沖液(BioWhittaker)；重組鼠IL-2(Collaborative)；絲裂霉素CC(Aldrich溶解在無菌PBS中來獲得500μLg/mL的貯存液；50mL圓錐形管(Falcon)，尼龍網(wǎng)過濾器cupinserts(Falcon)；51Cr和Lumaplates(Packard)。為了進行肽-脈沖刺激，通過收集脾臟和通過在兩片高壓磨砂玻片之間壓榨研磨來破碎液囊以提供年幼同源的(syngeneic)脾臟(approx.1.2x刺激物/小鼠)并釋放細胞到小陪替氏培養(yǎng)皿中。細胞塊通過用3mL的吸移管上下吸吹被破壞，且產(chǎn)生的細胞懸浮物被通過70μm尼龍細胞濾過器過濾到50mL圓錐形管中使用5-10mLRPMI-10培養(yǎng)基來洗滌細胞。通過回收的脾細胞1500rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘來沉淀，且棄去上清液。RBCs通過重懸浮脾細胞在5mLACK溶解緩沖液中1-2分鐘被溶解，然后在細胞用20mL未補充的RPMI洗滌兩次和RPMI-10洗滌一次。細胞然后被重懸浮大約1×107細胞/mL。刺激物用絲裂霉素C(對于每10mL細胞，500μL的0.5mg/mL的絲裂霉素C被加入)處理，且細胞與絲裂霉素C一起37℃，5％CO2下溫育25-45分鐘。在處理后，細胞用未補充的RPMI洗滌兩次以及用RPMI-10洗滌一次。洗滌后的細胞在含有20U/mL大鼠IL-2的SM中重懸浮到2×106細胞/mL，且儲存的CTL表位肽被加入。刺激物細胞被以3/1響應(yīng)物(responder)/刺激物分散到24孔板中并37℃，5％CO2溫育過夜。如下進行響應(yīng)器細胞的體內(nèi)刺激。脾臟從接種的和對照小鼠中收集，響應(yīng)器脾細胞通過如上所述研磨脾臟被分離。RBCs被用5mLACK溶解緩沖液溶解2-3分鐘，細胞被用20mL的未補充的RPMI洗滌兩次以及用RPMI-10洗滌一次。脾細胞然后重懸浮在沒有IL-2的SM中到6×106細胞/mL的濃度。對于每一個小鼠，1mL的脾細胞分散到含有1mL的2×106細胞/mL如上述含有IL-2的SM中的肽脈沖刺激器細胞的24孔板的每一孔中(IL-2的終濃度為10U/mL)，板37℃，5％CO2溫育5-7天。CTL51Cr釋放試驗對于肽特異性溶解來說，利用下面的技術(shù)。對數(shù)期同源的靶細胞被沉淀于96孔板中，大約30,000靶(細胞)/孔。合適量的靶細胞沉淀(pellet)圓錐形管中并在20μL的熱失活FBS中重懸浮。每一沉淀物中加100-200μL的51Cr(鉻酸鈉)。混合小孔。然后在37℃溫育1小時。細胞然后以每沉淀6-10mLRPMI-10洗滌，然后懸浮在3×105細胞/mLRPMI-10中。為了肽-脈沖靶，適當量的貯存Ctl表位肽被加入來達到最佳的終濃度(大約10-5M)。靶細胞在用效應(yīng)器細胞涂板(plating)之前被允許用肽脈沖至少30分鐘(37℃)。在體外刺激5-7天后，從24孔板中收集效應(yīng)器脾細胞且來自各小鼠的細胞在15mL圓錐管中凝聚(pool)，然后重懸浮為1.5×107細胞/mL。為了涂板，來自各小鼠的脾細胞以50，17，5.6和1.9效應(yīng)器/靶的比率被涂板。在稀釋后，100μL的51Cr-標記的靶被加至各小孔中。短暫旋轉(zhuǎn)板后溫育在37℃4-6小時。測定抵抗各小鼠肽脈沖和未脈沖對照的靶的溶解。對非特異性溶解來說，相同的方法如下除了100μL的未脈沖的靶(細胞)也被涂板。在4-6小時溫育后，旋轉(zhuǎn)板來沉淀細胞和溶解。25μL的上清液被轉(zhuǎn)到Lumaplates中并允許2小時或過夜干燥。密封板并通過標準方法進行51Cr-固體計數(shù)。為了計算溶解的百分率，(試驗的cpm-spont.cpm)除以(最大cpm-spont.cpm)并乘以100。為獲得％特異性溶解，從％溶解的肽脈沖靶細胞中減去％溶解的未脈沖靶細胞。ELSA抗體對不同疫苗組合物的應(yīng)答被通過標準的ELISA方法測定。更具體的，培養(yǎng)基結(jié)合板(Costar)用含有1μg/mL抗原貯存液溶液(在PBS中)以100μL/孔包被并于4℃溫育過夜?？乖芤罕怀槲野逵?％奶粉(drymilk)/PBS室溫下阻斷至少1小時。板用洗滌緩沖液(10mMTBS/0.1％Brij-35)洗滌三次，且100μL的樣品血清被加入并室溫下溫育兩個小時(稀釋緩沖液2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20)。板被洗滌三次且用生物素標記的對鼠免疫球蛋白IgG特異或?qū)gG亞組特異的的山羊抗體室溫下溫育1小時。洗滌三次后，ELISA板用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶偶合物室溫下溫育1小時。最終，板被洗滌并用TMB底物顯影(試劑盒來自Bio-Rad，Richmond，CA)并允許顯影30分鐘。反應(yīng)用1NH2SO4終止，且板在A450處讀數(shù)。平均的背景吸光度通過接受除測試血清外所有試劑的小孔來被檢測。實施例2QuilA與金珠上的DNA胞內(nèi)共同給藥來增強流感NP-特異的免疫應(yīng)答為了檢測是否含有編碼流感NP抗原的DNA疫苗載體的組合物和QuilA佐劑直接進入細胞的共同給藥能夠增強抗原特異的免疫應(yīng)答，進行下面的研究。設(shè)立如下Balb/c小鼠的實驗組(組1)3個通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置接受包被不相關(guān)DNA的金珠的對照小鼠；(組2)3個通過PowderJectTMXR裝置接受僅包被NPDNA載體的金珠的小鼠；(組3)4個通過PowderJectTMXR裝置接受僅包被NPDNA載體的金珠并在DNA給藥之前以海藻糖或生理鹽水接種的小鼠；(組4)3個接受包被NPDNA載體的金珠和QuilA佐劑的小鼠；(組5)3個在QuilA的皮內(nèi)注射后立即接受包被NPDNA載體的金顆粒的共同給藥的小鼠；以及(組6)3個在QuilA的皮下注射后立即接受包被NPDNA載體的金顆粒的共同給藥的小鼠。包含編碼流感NP抗原(來自PR8菌株)的序列的NPDNA載體被描述在Pertmer等(1995)Vaccine131427-1430。所有的金顆粒如上所述以0.5mgAu/靶的珠裝載率和2.0μg/mgAu的DNA裝載率被裝載。用PowderJectTMXR裝置在兩個靶位點以400psi的運作壓力給藥，且是一個僅為初次免疫(prime-only)的實驗。在一個月后，小鼠被處死且收集血液和脾臟樣本用于上面所述的分析。對于ELISPOT分析而言，被用于刺激CTL前體的肽為TYQRTRALV(10-8M)且溶解的5μg/mL的流感PR8病毒被用于Th刺激。為了進行鉻分析，用于刺激響應(yīng)器的肽為TYQRTRALV(10-8M)；且用于脈沖靶的肽為TYQRTRALV(10-5.5M)。為進行ELISA，捕獲的抗原為1mg/mL的PR8NP抗原(Sprafas)。研究的結(jié)果描述在表1中，如所看到的，QuilA與DNA載體(組4)的聯(lián)合給藥增強了抗原特異的T輔助細胞應(yīng)答，CTL和抗體應(yīng)答，且優(yōu)于在DNA遞送之前立即進行QuilA來產(chǎn)生CTL和抗體應(yīng)答的細胞外皮內(nèi)(組5)或皮下(組6)的共同給藥。表1實施例3QuilA與金珠上的DNA胞內(nèi)共同給藥來增強流感NP-特異的免疫應(yīng)答為了輔助證實上述實施例2的結(jié)果，進行下面的研究。設(shè)立如下Balb/c小鼠的實驗組(組1)4個通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置接受包被不相關(guān)DNA的金珠的對照小鼠；(組2)4個通過PowderJectTMXR裝置接受包被非相關(guān)DNA的金珠和QuilA佐劑共同給藥的小鼠；(組3)4個通過PowderJectTMXR裝置接受僅包被NPDNA載體的金珠的小鼠；以及(組4)4個接受包被NPDNA載體的金珠和QuilA佐劑的小鼠。再一次的，包含編碼流感NP抗原(來自PR8菌株)的序列的NPDNA載體被描述在Pertmer等(1995)Vaccine131427-1430。所有的金珠如上所述以0.5mgAu/靶的珠裝載率和2.0μg/mgAu的DNA裝載率被裝載。用PowderJectTMXR裝置在兩個靶位點以400psi的運作壓力給藥，且是一個僅為初次免疫的實驗。僅接種一次，在一個月后，小鼠被處死且收集血液和脾臟樣本用于上面所述的分析。對于ELISPOT分析而言，被用于刺激CTL前體的肽為TYQRTRALV(10-8M)且溶解的5μg/mL的流感PR8病毒被用于Th刺激。為了進行鉻分析，被用于刺激響應(yīng)器的肽為TYQRTRALV(10-8M)；且用于脈沖靶的肽為TYQRTRALV(10-5.5M)。為進行ELISA，捕獲抗原為1mg/mL的PR8NP抗原(Sprafas)。研究的結(jié)果被描述在表2中。如所顯示的，QuilA與DNA載體(組4)的聯(lián)合胞內(nèi)給藥提供了增強的抗原特異的T輔助細胞應(yīng)答，CTL應(yīng)答，和抗體應(yīng)答。表2實施例4QuilA與金珠上的DNA胞內(nèi)共同給藥來增強HIVgp120-特異的CTL免疫應(yīng)答為了檢測是否含有編碼人免疫缺陷病毒(HIV)gp120抗原的DNA疫苗載體的組合物和QuilA佐劑直接在細胞中的共同給藥能夠增強抗原特異的免疫應(yīng)答，進行下面的研究。設(shè)立如下Balb/c小鼠的實驗組(組1)4個通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置接受包被不相關(guān)DNA載體的金珠的對照小鼠；(組2)4個通過PowderJectTMXR裝置接受包被不相關(guān)DNA的金珠和QuilA的小鼠；(組3)3個通過PowderJectTMXR裝置接受包被HIVgp120DNA育的金珠的小鼠，初次免疫1次，并加強3次；(組4)3個通過PowderJectTMXR裝置接受包被HIVgp120DNA載體的金珠的小鼠，初次免疫1次，并加強1次；(組5)3個通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置接受包被HIVgp120DNA載體的金珠和QuilA佐劑共同給藥的小鼠，初次免疫1次，并加強3次；以及(組6)3個通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置接受包被HIVgp120DNA載體的金珠和QuilA佐劑共同給藥的小鼠，初次免疫1次，并加強1次。HIVgp120DNA載體含有編碼HIVgp120抗原(來自LAI菌株)的序列且被描述于Heydenburg等(1994)AIDSRes.andHum，Retroviruses101433-1441。所有的金顆粒如上所述以0.5mgAu/靶的珠裝載率和2.0μg/mgAu的DNA裝載率被裝載。用PowderJectTMXR裝置在兩個靶位點以400psi的運作壓力給藥。進行不同數(shù)目的接種(一些加強免疫1次，另一些加強3次)，每四周進行一次接種給藥。在研究的第14周處死小鼠，并收集脾臟樣本用于上述的分析。對ELISPOT分析來說，用于刺激CTL前體的肽為RGPGRAFVTI(10-7M)。對于鉻實驗來說，用于刺激CTL響應(yīng)器和脈沖靶的肽為RGPGRAFVTI(10-7M)。研究的結(jié)果被描述在表3中。如所顯示的，結(jié)果證明了上面流感抗原的在初次免疫1次，并加強1次后，胞內(nèi)QuilA和DNA共同給藥中增強了HIVgp120-特異性CTL應(yīng)答的數(shù)據(jù)，當小鼠被加強免疫三次時沒有顯著的區(qū)別。表3實施例5QuilA與金珠上的DNA胞內(nèi)共同給藥來增強HBsAg-特異的CTL免疫應(yīng)答為了檢測是否含有編碼肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)的DNA疫苗載體的組合物和QuilA佐劑直接在細胞中的共同給藥能夠增強抗原特異的免疫應(yīng)答，進行下面的研究。設(shè)立如下Balb/c小鼠的實驗組(組1)4個通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置接受包被不相關(guān)DNA的金珠的對照小鼠；(組2)4個接受包被HbsAgDNA載體的金珠并通過PowderJectTMXR顆粒介導(dǎo)的遞送裝置給藥的小鼠；以及(組3)4個通過PowderJectTMXR裝置接受包被HbsAgDNA載體的金珠和QuilA佐劑的小鼠。實驗通過利用完全相同的試驗組重復(fù)多次。含有編碼HBV表面抗原的序列的HbsAgDNA載體被稱為pWRG7128。質(zhì)粒pWRG7128除了合適調(diào)控元件外，含有在巨細胞病毒(CMV)啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下編碼肝炎B表面抗原(HbsSAg)的序列，其被轉(zhuǎn)染到大多數(shù)的細胞類型中后，顯示產(chǎn)生HbsAg顆粒。pWRG7128質(zhì)粒構(gòu)建如下。克隆載體pWRG7077(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)被制備來接受HbsAg編碼序列通過用BamH1來完全消化載體，然后，用Hind3部分消化。通過用Klenow片段和脫氧核苷酸平截5′端的突出部份之后，4.3kB的載體片段被分離。1.35kBHbsAg插入片段(含有非翻譯的pre-S2序列，adw菌株的226個氨基酸HbsAg編碼序列，以及HBV增強子元件)通過用BamHl消化被從質(zhì)粒pAM6(ATCC，Rockford，MD)上切除。在通過用Klenow片段和脫氧核糖核苷酸處理平末端后，片段被分離并結(jié)合到4.3kB的上述載體片段上。產(chǎn)生的重組體篩選正確的插入方向且正確的分離子被鑒定并被稱為中間體質(zhì)粒(pWRG7074)。為了去除X蛋白的密碼子的啟動點(start)(存在于pAM61.35kB插入子的3′末端)，一個4.86kB的載體片段被分離自WRG7074質(zhì)粒通過用Bg12消化，用Klenow片段和脫氧核糖核苷酸處理平末端，然后用BstX1消化。接著，754bp的插入片段被分離自pWRG7074構(gòu)建體通過用Ncol消化，用綠豆核酶處理，以及用BstX1消化。產(chǎn)生的載體和插入片段然后被結(jié)合在一些來形成臨床質(zhì)粒pWRG7128。所有的金珠如上所述以0.5mgAu/靶的珠裝載率和2.0μg/mgAu的DNA裝載率被裝載。用PowderJectTMXR裝置在兩個靶位點以400psi的運作壓力給藥。僅接種一次，在一個月后，小鼠被處死并收集脾臟樣本并如上所述用于鉻釋放(特異性溶解)分析。對于ELISPOT分析，用于刺激CTL前體的肽為IPQSLDSWWTSL(10-6M)。對于鉻分析，使用表達HBV表面抗原的P815細胞系代替肽用于刺激響應(yīng)器(40,000/孔)和用于效應(yīng)器(30,000/孔)。研究的結(jié)果被描述在表4中。如所顯示的，結(jié)果證明了上面流感抗原和HIV抗原在胞內(nèi)的QuilA和DNA共同給藥中增強了HBsAg-特異性CTL應(yīng)答的數(shù)據(jù)。表4相應(yīng)的，公開了新的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗組合物和方法。雖然描述了主題發(fā)明優(yōu)選實施方案的一些細節(jié)，應(yīng)當理解可以進行不離開由附加權(quán)利要求所定義的本發(fā)明精神和范圍的明顯的變化。權(quán)利要求1.一種組合物含有一種包含編碼抗原的序列的核酸分子；以及一種佐劑，其有效地增強至少一種引發(fā)抵抗抗原的免疫應(yīng)答的組分，其中的佐劑以非DNA的形式存在于組合物中。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的核酸分子存在于載體構(gòu)建體中。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的核酸分子和佐劑被包被在核心載體顆粒上。4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中的核心載體顆粒是金顆粒。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的核酸分子和佐劑被包被在標稱大小約0.1到10μm大小的核心載體顆粒上。6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑以蛋白的形式存在于組合物中。7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑以脂的形式存在于組合物中。8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑以非蛋白激素或其類似物的形式存在于組合物中。9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑以維生素或其類似物的形式存在于組合物中。10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑包括來自卡介苗(BCG)的純化蛋白。11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑包括分支桿菌細胞壁骨架物質(zhì)。12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑是單磷酰脂A。13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑是皂草苷或其衍生物。14.權(quán)利要求13的組合物，其中的佐劑是Quil-A。15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑至少部分溶于乙醇。16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的佐劑是免疫改變佐劑。17.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的抗原是來自傳染性的或寄生蟲疾病的因子。18.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的抗原來自病毒。19.權(quán)利要求18的組合物，其中的病毒選自由肝炎B病毒(HBV)，人免疫缺陷病毒(HIV)以及流感病毒組成的組。20.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中的抗原來自寄生蟲病因子。21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中的抗原是來自瘧疾寄生蟲的環(huán)子孢子(CS)抗原。22.適用于顆粒介導(dǎo)的核酸免疫的包被顆粒，其中的顆粒包括用含有佐劑和包含編碼抗原的編碼序列的核酸分子的組合物包被的核心載體顆粒，其中佐劑以非DNA的形式存在于組合物中。23.如權(quán)利要求22所述的包被顆粒，其中所述的顆粒為鎢或金顆粒。24.如權(quán)利要求22所述的包被顆粒，其中所述的抗原為病毒，細菌，寄生蟲或真菌病原體抗原。25.如權(quán)利要求22所述的包被顆粒，其中所述的抗原是腫瘤特異性抗原或與自身免疫病相關(guān)的抗原。26.一種適于顆粒介導(dǎo)的核酸免疫的顆粒加速裝置，其中的裝置用權(quán)利要求22的包被顆粒裝載。27.權(quán)利要求1的組合物在用于核酸免疫的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。28.權(quán)利要求3的組合物在用于核酸免疫的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。29.一種用于在個體中引發(fā)抵抗所選抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述的方法包括遞送權(quán)利要求1的組合物直接到存在于個體靶位點的細胞中以充分的量來產(chǎn)生所述的免疫應(yīng)答。30.權(quán)利要求29的方法，其中的核酸分子和佐劑被包被到核心載體顆粒上。31.權(quán)利要求30的方法，其中的組合物通過顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)被遞送。32.權(quán)利要求29的方法，其中的靶位點是表皮組織。33.一種組合物，其含有一種包含編碼抗原的序列的核酸分子；以及一種免疫改變佐劑，其在接受所述組合物的個體中有效地增強引發(fā)抵抗抗原免疫應(yīng)答的T輔助細胞1(Th1)組分，其中的免疫改變佐劑以非DNA的形式存在于所述組合物中。34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中的抗原是來自傳染性的或寄生蟲疾病的因子。35.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中的免疫改變佐劑是單磷酰脂A。36.一種含有用權(quán)利要求33的組合物包被的核心載體顆粒的藥物制劑。37.一種用于在個體中引發(fā)抵抗所選抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述的方法包括(a)遞送核酸分子到存在于個體的靶位點的細胞中，其中所述的核酸分子含有一個序列，其在所述細胞中表達在充分的水平上產(chǎn)生所選抗原來引發(fā)個體中的抗原特異的免疫應(yīng)答；和(b)給藥免疫改變佐劑到靶位點，其中的佐劑被給藥以充分的量來改變抗原特應(yīng)的免疫應(yīng)答有利于T輔助細胞1(Th1)型或T輔助細胞2(Th2)型應(yīng)答。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的抗原來自傳染性的或寄生蟲疾病的因子。39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的核酸分子存在于載體構(gòu)建體中。40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的核酸分子通過顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)被遞送。41.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的免疫改變佐劑被局部給藥于靶位點。42.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的免疫改變佐劑通過顆粒介導(dǎo)的遞送技術(shù)給藥于靶位點。43.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的免疫改變佐劑是單磷酰脂A。44.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的核酸分子含有編碼來的自瘧疾寄生蟲的環(huán)子孢子(CS)抗原的序列。45.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的靶位點是表皮組織。46.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的核酸分子和佐劑被同時給藥。47.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的核酸分子和佐劑被結(jié)合來提供一種單一的組合物。全文摘要描述用于核酸免疫技術(shù)的試劑。更具體的，描述了佐劑化的基因疫苗組合物，以及利用這些組合物來誘導(dǎo)增強的抵抗所選抗原的免疫應(yīng)答的方法。文檔編號A61K39/39GK1426309SQ99817039公開日2003年6月25日申請日期1999年11月3日優(yōu)先權(quán)日1999年11月3日發(fā)明者喬·R·海恩斯,喬治·韋德拉,詹姆士·T·富勒,蒂莫西·希伯雷,黛博拉·富勒,瑪麗·吳申請人:寶德杰克特疫苗有限公司