短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于放療增敏劑制備領(lǐng)域，具體涉及短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 放射治療是腫瘤綜合治療的重要組成部分。約64. 3%的NSCLC患者在不同治療時(shí) 期需要放射治療，腫瘤的放射治療效果受到多種因素的影響，其中放射線對(duì)正常組織的損 傷和腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的抵抗是最重要的兩個(gè)方面，因此如何提高腫瘤對(duì)放射線的敏感性 即放射增敏成為了放射治療領(lǐng)域研宄的主要內(nèi)容。放射增敏指的是運(yùn)用物理方法、化學(xué)物 質(zhì)或生物方法使腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性增加進(jìn)而更容易被放射線殺死，但不增加對(duì)正常 組織的損傷，使治療增益比增大。目前的西藥無(wú)很好的放療增敏劑，新的靶向藥物初步證實(shí) 有一定的增敏作用，但尚須進(jìn)一步在臨床驗(yàn)證。中醫(yī)藥抗腫瘤的研宄表明，部分中藥或其單 藥提取物能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，對(duì)放射治療有一定的增效作用。因此，中醫(yī) 藥配合腫瘤的放射治療有其理論依據(jù)。由于毒副作用相對(duì)較少，在中藥中研發(fā)放射增敏劑 也是近來(lái)研宄的關(guān)注點(diǎn)。在已有的報(bào)道中，麥冬在放射治療中的應(yīng)用主要是關(guān)于減輕放射 的毒副反應(yīng)方面的研宄，而其是否具有放射增敏作用尚未見(jiàn)報(bào)道，還需進(jìn)一步的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng)用。中藥短葶山麥冬 即能潤(rùn)肺清火又能增加放射敏感性進(jìn)而提高腫瘤局部控制率，且相對(duì)西藥有較大的價(jià)格優(yōu) 勢(shì)，具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng)用：短葶山麥冬經(jīng)提取、純化制得短葶山麥冬提 取物皂苷C。
[0005] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于： (1)利用中藥的中國(guó)特色來(lái)解決非小細(xì)胞肺癌放射敏感性的問(wèn)題。
[0006] (2)選擇的中藥短葶山麥冬即能潤(rùn)肺清火又能增加放射敏感性進(jìn)而提高腫瘤局部 控制率。故有可能提高非小細(xì)胞肺癌的生存率和生活質(zhì)量這2項(xiàng)衡量新治療方法優(yōu)勢(shì)的關(guān) 鍵標(biāo)準(zhǔn)。與西藥相比毒性反應(yīng)非常少。
[0007] (3)中藥麥冬相對(duì)西藥有較大的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，故對(duì)患者在治療和經(jīng)濟(jì)上的獲利巨大， 并可減少社會(huì)醫(yī)療保險(xiǎn)的開(kāi)支?？梢哉f(shuō)該項(xiàng)目的產(chǎn)業(yè)化具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1是不同濃度DT-13對(duì)SPC-A1的生長(zhǎng)抑制率。
[0009] 圖2是SPC-A1細(xì)胞的劑量-存活曲線。注a:用GraphPad Prism5. 0軟件繪制曲 線。
[0010] 圖3是不同處理后SPC-A1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。注a:1 :后+IR組；2 : 中+IR組；3 :前+IR組；4:IR組；5 :DT-13 組；6:C組；M:Marker;注b:A:Bcl-2mRNA的表 達(dá)；B:BaxmRNA的表達(dá)；C:FasmRNA的表達(dá)。
[0011] 圖4是不同處理的SPC-A1細(xì)胞Bcl-2、Bax、Fas蛋白的的表達(dá)。注a:l:C組； 2:DT-13 組；3:IR組；4:前+IR組；5:中+IR組；6:后+IR組。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 方法： 1、采用MTT法檢測(cè)短葶山麥冬中有效提取物皂苷C(DT- 13)對(duì)體外培養(yǎng)的SPC-A1 細(xì)胞的增殖抑制作用，并計(jì)算不同作用時(shí)間下的IC30和IC50 ;根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0013] 2、選擇麥冬皂苷C作用48小時(shí)的IC30用于集落形成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：將SPC-A1 細(xì)胞分為：（1)對(duì)照組（C):未經(jīng)DT-13和X射線干預(yù)；（2)單純照射組（IR):給予X射線 照射，照射劑量與下述各加藥聯(lián)合照射組相同；（3)單純給藥組（DT-13):給予DT-13藥物 8.034yg/mL(IC30)，藥物作用時(shí)間48h;(4)照射前加藥聯(lián)合照射組（前+IR):于照射前 給予DT-13藥物8. 1yg/mL作用48h后去除藥液并進(jìn)行照射；（5)照射同時(shí)加藥聯(lián)合照射 組（中+IR):于照射中同步給予DT-13藥物8. 034yg/mL，作用48h后去除藥液；（6)照射 后加藥聯(lián)合照射組（后+IR):于照射后24h給予DT-13藥物8. 034yg/mL作用48h后去除 藥液。檢測(cè)麥冬皂苷C于照射前、照射中、照射后給藥與放射聯(lián)用對(duì)SPC-A1細(xì)胞的集落形 成率的影響，計(jì)算放射敏感性相關(guān)的參數(shù)平均致死劑量（％)、準(zhǔn)域劑量（Dq)和2Gy照射存 活分?jǐn)?shù)（SF2)以及放射增敏比（SER); 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)麥冬皂苷C及其與放射聯(lián)用后SPC-A1細(xì)胞周期的改變及細(xì)胞凋亡 的情況；將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞用胰酶消化，并制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2*105/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，按照集落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)處理，給予照射的實(shí)驗(yàn)組 照射劑量為6Gy，48h后收集細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為l*106/mL。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 分析細(xì)胞周期和凋亡。
[0014] 4、RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和FasmRNA的表達(dá)情況；按照集 落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組，收集各組細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)行cDNA的合成。采用Primer5. 0軟件 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)Bcl-2、BaX、Fas及0-actin的cDNA保守區(qū)的序列設(shè)計(jì)PCR引物。PCR 產(chǎn)物行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)（GelDocXR+，Bi〇-Rad公司)進(jìn)行圖像 采集。利用quantityone軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。
[0015] 5、WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達(dá)情況。按照集 落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組，收集各組細(xì)胞用超聲細(xì)胞粉碎儀器中冰浴破碎，Micro-BCA試劑盒法 進(jìn)行蛋白定量，WesternBlot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。
[0016]結(jié)果： 1.DT-13對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT法檢測(cè) 6. 7yg/mL-11. 47yg/mL濃度范圍內(nèi)，DT-13 作用于SPC-A1 細(xì)胞 24、48、72 小時(shí)后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示DT-13對(duì)SPC-A1細(xì)胞有明顯的抑制作用， 隨著濃度的增加抑制率逐漸提高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也逐漸提高。根據(jù)公式計(jì)算所 得的DT-13作用于SPC-A1細(xì)胞的IC30、IC50為：24小時(shí)的IC30值為9. 781yg/mL，IC50 值為 12. 054yg/mL;48 小時(shí)的IC30 值為 8. 034yg/mL，IC50 值為 9. 279yg/mL;72 小時(shí)的IC30 值為 7. 553yg/mL，IC50 值為 8. 581yg/mL。
[0017] 2.DT-13對(duì)SPC-A1細(xì)胞的放射效應(yīng)的影響 DT-13對(duì)接受不同照射劑量的SPC-A1細(xì)胞存活率的影響，見(jiàn)表1。在2Gy、4Gy、6Gy照 射劑量下，DT-13與照射聯(lián)用組的存活率均低于單純照射組；各聯(lián)用組的％、SF2均低于單 純照射組，而SER均提高，見(jiàn)表2。單純照射組的SF2分別是前+IR組、中+IR組、后+IR組 的1.24、2. 35、1.68倍。根據(jù)單擊多靶模型S=l-(l-e_D/D°)N擬合細(xì)胞存活曲線（圖2)，可 見(jiàn)DT-13與照射聯(lián)用組細(xì)胞存活率均低于單純照射組。
[0018] 表1DT-13對(duì)接受不同照射劑量的SPC-A1細(xì)胞存活率的影響（ x ± s )
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng)用，其特征在于：短葶 山麥冬經(jīng)提取、純化制得短葶山麥冬提取物皂苷C。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了短葶山麥冬在制備放療增敏劑中的應(yīng)用。中藥短葶山麥冬即能潤(rùn)肺清火又能增加放射敏感性進(jìn)而提高腫瘤局部控制率，且相對(duì)西藥有較大的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
【IPC分類(lèi)】A61P35-00, A61K31-7048
【公開(kāi)號(hào)】CN104523738
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510026019
【發(fā)明人】潘建基, 李建成
【申請(qǐng)人】泉州東南中藥材種植有限公司, 潘建基
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月20日