乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)是一類長期應(yīng)用于食品發(fā)酵業(yè)的有益微生物，這種食品級(jí)微生物能經(jīng)受胃腸液考驗(yàn)并在人體內(nèi)存活2?3天，其本身不攻擊腸黏膜并且不引起強(qiáng)的免疫反應(yīng)，其中最有前景的應(yīng)用即是乳酸乳球菌作為活載體將治療性蛋白或抗原傳遞至黏膜表面，繼而同時(shí)誘導(dǎo)黏膜免疫和系統(tǒng)免疫。乳酸乳球菌以其生長迅速、易于操作等優(yōu)點(diǎn)成為表達(dá)外源蛋白、作為活載體疫苗傳遞抗原的理想選擇。乳酸乳球菌不屬于人和動(dòng)物的正常微生物群，不會(huì)定植于口腔或胃腸道，在一定程度上避免了因?yàn)殚L期刺激形成的免疫耐受。
[0003]腸道作為一個(gè)免疫器官，起著阻隔細(xì)菌和內(nèi)毒素的屏障作用。正常情況下，胃腸道中絕大多數(shù)細(xì)菌是對(duì)人體有益的，我們稱之為“益生菌”，可幫我們消化乳糖、降解并排泄多余膽固醇；為我們的機(jī)體提供多種維生素；刺激我們的免疫器官發(fā)育，并促使其功能不斷地演進(jìn)、完善，有益人體健康。益生菌與我們的胃腸道粘膜共同筑成了一道生態(tài)屏障，抵御和抗擊各種外來的病原微生物，但在某些特定的情況下，如嚴(yán)重疾病、營養(yǎng)不良、過度疲勞或外來刺激時(shí)，機(jī)體的抵抗力會(huì)下降，一些原本無害的細(xì)菌可能會(huì)乘虛而入，對(duì)機(jī)體造成傷害，引起腸粘膜屏障功能下降。乳酸乳球菌是位于胃腸道中的益生菌，因此非常適合治療腸道疾病如腸道腫瘤等疾病。乳酸乳球菌能夠誘導(dǎo)表達(dá)白細(xì)胞介素-12(interleUkin12，IL-12)，IL-12主要由B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種功能的細(xì)胞因子。它能夠促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖和殺傷活性，誘導(dǎo)Y-干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)THl細(xì)胞的發(fā)育，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前已經(jīng)進(jìn)入抗腫瘤、抗病毒性疾病和治療哮喘的I期和II期臨床試驗(yàn)階段。人重組IL-12的臨床試驗(yàn)提示人重組IL-12在治療腫瘤中具有肯定的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明公開了乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。用于治療腸道腫瘤等疾病。
[0005]本發(fā)明通過以下實(shí)驗(yàn)證明乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法:用NsiI和EcoR I雙酶切pGEM-1L-12質(zhì)粒后，與經(jīng)同樣酶切的含有乳鏈桿菌肽A(nisA)啟動(dòng)子的pSEC-E7質(zhì)粒連接，從而構(gòu)建成pSEC-1L-12質(zhì)粒；經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，轉(zhuǎn)化子在含有氯霉素的腦心浸液培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用乳鏈桿菌肽(nisin)誘導(dǎo)IL-12表達(dá)，SDS-PACE、Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物；用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)IL-12的量?？山L-12乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)。在nisin的誘導(dǎo)下，NZ9000能夠產(chǎn)生并分泌IL-12約80ng/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明乳酸乳球菌能夠表達(dá)一定數(shù)量的IL-12，對(duì)腸道腫瘤具有一定的治療作用。
【具體實(shí)施方式】
[0006]下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0007]I質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)條件:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000和pSEC_E7質(zhì)粒為法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院Luis教授贈(zèng)送，大腸桿菌DH5a、pGEM_IL_12載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；其中大腸桿菌DH5 a用于質(zhì)粒PSEC-E及其衍生質(zhì)粒保存或擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)菌株，乳酸乳球菌NZ9000用作IL-12基因重組表達(dá)質(zhì)粒pGEC_IL_12的表達(dá)菌株。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基、乳酸乳球菌及其電穿孔轉(zhuǎn)化子用腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)。氨芐青霉素使用濃度為100mg/L，氯霉素使用濃度大腸桿菌為10mg/L、乳酸乳球菌為5mg/L。
[0008]2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化:用NSI I和EcoR I雙酶切pGEM_IL_12質(zhì)粒后，與經(jīng)同樣酶切的含有nisA啟動(dòng)子的pSEC-E7質(zhì)粒連接，從而構(gòu)建成pSEC-1L-12質(zhì)粒，pSEC-1L-12質(zhì)粒含有Usp45信號(hào)肽。乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化采用電穿孔轉(zhuǎn)化法(脈沖參數(shù)為1.25kV/mm, 25 μ F和200歐姆)ο重組質(zhì)粒經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌ΝΖ9000，轉(zhuǎn)化子在含有氯霉素的腦心浸液瓊脂糖平板上生長。再從重組乳酸乳球菌中提取質(zhì)粒PSEC-1L-12，進(jìn)行電泳鑒定。在DH5a和NZ9000中提抽到的質(zhì)粒DNA分子(條帶I和2)與轉(zhuǎn)化前的pSEC-1L-12 (條帶I)在Marker的對(duì)照下，條帶處于同一位置高度，說明轉(zhuǎn)化是成功的。本實(shí)驗(yàn)成功重組了能夠表達(dá)具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鑒于乳酸乳球菌為存在于胃腸道中的益生菌，因此非常適合于治療腸道疾病如腸炎、腸道腫瘤等疾病。
[0009]3血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，H0-1)是基因在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá):含重組質(zhì)粒pSEC-1L-12的乳酸乳球菌NZ9000在腦心浸液培養(yǎng)基中30°C靜置培養(yǎng)過夜，用新鮮培養(yǎng)基1:50稀釋，培養(yǎng)后加入誘導(dǎo)物Nisin至終濃度10mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h。終止培養(yǎng)后，取2ml培養(yǎng)菌液，4°C、8000?10000r/min離心5?8min，上清液濃縮50倍后經(jīng)電泳分離后，通過B1-Rad印跡儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上作Western_blot，以空載體Lactococcus Iactis為對(duì)照，取Iml培養(yǎng)菌液測(cè)定IL-12的產(chǎn)量。由于NICE表達(dá)系統(tǒng)具有食品級(jí)的誘導(dǎo)物和宿主菌、嚴(yán)謹(jǐn)性高、本底表達(dá)水平低、誘導(dǎo)效率高及表達(dá)產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表達(dá)。
[0010]實(shí)例一
[0011]臨床上，腸道腫瘤也是威脅人體健康的殺手，乳酸乳球菌能夠有效減輕或改善腸道菌群的失調(diào)，控制腸道內(nèi)環(huán)境的正常，對(duì)腸內(nèi)環(huán)境具有保護(hù)作用，在治療腸道疾病中，特別是在腸道腫瘤的治療中具有較好的效果。治療方法為口服咀嚼乳酸菌素片，4.8克/次，每天三次。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法。其特征在于:乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中能夠有效減輕或改善腸道菌群的失調(diào)，控制腸道內(nèi)環(huán)境的正常，對(duì)腸內(nèi)環(huán)境具有保護(hù)作用，在治療腸道疾病中，特別是在腸道腫瘤的治療中具有較好的效果。治療方法為口服咀嚼乳酸菌素片，4.8克/次，每天三次。
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及乳酸乳球菌在治療腸道腫瘤中的一種應(yīng)用方法。主要用于治療腸道腫瘤；本實(shí)驗(yàn)證明了乳酸乳球菌能夠有效減輕或改善腸道菌群的失調(diào)，控制腸道內(nèi)環(huán)境的正常，對(duì)腸內(nèi)環(huán)境具有保護(hù)作用，在治療腸道疾病中，特別是在腸道腫瘤的治療中具有較好的效果。
【IPC分類】A61K35-744, A61P35-00
【公開號(hào)】CN104523761
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410767495
【發(fā)明人】龐慶豐, 范紅斌, 杜斌, 陳俊良
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月12日