替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是嚴(yán)重危害人類生命與健康的常見多發(fā)病，已成為新世紀(jì)人類的第一殺手，是全球最大的公共衛(wèi)生問題之一(Globocan，IARC, 2010, 2008)。根據(jù)《2012中國腫瘤登記年報(bào)》對外發(fā)布:“全國每6分鐘就有一人被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每七到八人中就有一人死于癌癥?！?“全國癌癥發(fā)病形勢嚴(yán)峻，發(fā)病率與死亡率呈持續(xù)上升趨勢，每年新發(fā)癌癥病例約350萬，因癌癥死亡約250萬”。放射治療連同手術(shù)和化療是目前癌癥治療的三大常規(guī)手段，在現(xiàn)有的患者治療中，80%左右的患者都需要進(jìn)行不同程度的放射治療。常規(guī)的X-射線與γ-射線技術(shù)在治療惡性腫瘤的同時(shí)也對正常組織造成損傷，甚至造成嚴(yán)重的毒副作用。因此，如何提高放射治療中腫瘤組織的輻照劑量殺死腫瘤，同時(shí)減少對正常組織的損傷一直是放療領(lǐng)域研宄所追求的目標(biāo)。
[0003]一方面，通過化學(xué)協(xié)同的作用，可以提供腫瘤部位的輻照劑量。1980年Matsudaira等人發(fā)現(xiàn)碘可以提高X-射線對細(xì)胞的損傷，并提出了利用高原子序數(shù)的材料可以增加放療中腫瘤劑量(H.Matsudaira, A.Μ.Ueno and 1.Furuno, 1dine contrastmedium sensitizes cultured mammalian cell to X rays but not to γ -rays.Radiat.Res.，1980，84，144-8)。另一方面，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，利用納米粒子的被動(dòng)靶向性，可以提供藥物對腫瘤的靶向性。雖然有機(jī)納米顆粒藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)利用已經(jīng)取得長足的發(fā)展。例如由脂質(zhì)和/或合成聚合物組成的有機(jī)納米顆粒已經(jīng)在市場上用于治療藥物的藥物傳遞系統(tǒng)(Davis, S.S.，Coming of Age of Ligid-based Drug Delivery Systems, Adv.Drug Deliv.Rev.2004, 56，1241-1242.)，還有一些聚合藥物傳輸系統(tǒng)正在臨場試驗(yàn)階段。但是，相比于有機(jī)納米顆粒的藥物傳輸系統(tǒng)，基于無機(jī)納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)所取得的進(jìn)展要少得多。
[0004]金納米粒子作為一種新型的納米材料，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品、材料、傳感器、生物標(biāo)記、納米傳導(dǎo)、記錄元件、DNA芯片等很多工業(yè)領(lǐng)域。由于金納米粒子的低的毒性和良好的生物相容性，所以在腫瘤診斷和治療領(lǐng)域金納米粒子作為藥物或傳輸材料也備受人們關(guān)注。金納米粒子穩(wěn)定、惰性、且具有比碘更大的原子序數(shù)，通過外層的修飾具有很好的生物相容性。2004年Hainfield首次在老鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)金納米粒子具有輻射增強(qiáng)效應(yīng)(Hainfeld J F，Slatkin D N, Smilowitz H M, The use of gold nanoparticlesto enhance rad1therapy in mice.Phys.Med.B1l.2004，49:N309-N315).目前已經(jīng)證實(shí)金納米粒子對光照、X-射線、γ-射線、質(zhì)子束和重離子束都具有顯著的增效功能(Tsiamas P, Liu B,Cifter F，Ngwa WF, Berbeco RI, Kappas C, TheodorouK, Marcus K, Makrig1rgos MG, Sajo E, Zygmanski P.1mpact of beam quality onmegavoltage rad1therapy treatment techniques utilizing gold nanoparticlesfor dose enhancement.Phys.Med.B1l.2013 58, 451-464 ；S.Jain, J.A.Coulter, A.R.Hounsellj K.T.Butterworthj S.J.Mcmahonj Cell-Specific Rad1sensitizat1n byGold Nanoparticles at Megavoltage Radiat1n Energies.1nt.J.Radiat.0ncol.B1l.Phys.，2011，79，531-539 ；X.-D.Zhang, D.Wuj X.Shenj J.Chen, Y.-M.Sun, P.-X.LiujX.-J.Liang,Size-dependent rad1sensitizat1n of PEG-coated goldnanoparticles for cancer radiat1n therapy.B1materials, 2012，33，6408 ；D.WujX.D.Zhang, P.X.Liuj L.A.Zhang, F.Y.Fan, M.L.Guo，Gold nanostructure: fabricat1n，surface modificat1n, targeting imaging, and enhanced rad1therapy.Curr.Nanosc1.,2011，7(1)，110-118 ；Jong-Ki KimjSeung-Jun SeojHong-Tae KimjK1-HongKimj Myung-Hwan Chung, K.-R.Kim and S.-J.Yej Enhanced proton treatment inmouse tumors through proton irradiated nanoradiator effects on metallicnanoparticles, Phys.Med.B1l.，2012，578309-8323 ； J._K.Kimj S.-J.Seoj K.-H.Kimj T.-J.Kimj M.-H.Chung, K.-R.Kim and T.-K.Yang, Therapeutic applicat1n ofmetallic nanoparticles combined with particle-1nduced χ-ray emiss1n effect，Nanotechnology, 2010，21，425102-425102 ； J.C.Polfj L.F.Bronkj W.H.P.Driessenj W.ArapjR.Pasqualini and M.GillinjApp.Phys.Lett.，2011，98，193702 ；H.KaurjG.PujarijM.K.Semwaljet al.1n vitro studies on rad1sensitizat1n effect ofglucose capped gold nanoparticles in photon and 1n irradiat1n of Hela cells.Nucl Instr and Meth in Phys Res B，2013，301，7_11)。金納米粒子不僅可以作為藥物傳輸載體，而且還具有顯著的放射增敏效應(yīng)，其有望成為新型的放射用增敏材料。
[0005]目前所用的作為輻射增敏劑的金納米粒子都僅僅是表面活性劑包被的金納米粒子，不帶有其他的功能基團(tuán)。增敏機(jī)制主要利用的是金納米粒子受到輻照后，輻射產(chǎn)生的二次電子誘導(dǎo)金原子內(nèi)層的光吸收、發(fā)射、電離等，從而增強(qiáng)了俄歇效應(yīng)，表現(xiàn)出輻射生物學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，為避免現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用。
[0008]腫瘤組織中乏氧細(xì)胞的周期狀態(tài)嚴(yán)重影響了常規(guī)放射治療效果，腫瘤乏氧增敏劑可以改變放射治療中乏氧細(xì)胞的放射敏感性，從而增加腫瘤組織放射損傷，提高臨床治療效果。目前臨床常用的腫瘤乏氧增敏劑有Misonodaxole、硝基咪挫的酰胺衍生物SR-2508 (Etanidacole)、硝基咪唑類化合物AK-2123、吉西他濱、順鉑、甘氨雙唑鈉、替拉扎明(TPZ)等。其中替拉扎明對乏氧細(xì)胞的毒性比正常細(xì)胞要高50-3004倍(ReddyS.B., Williamson S.K.Tirapazamine:a novel agent targeting hypoxic tumor cells.Expert Opin.1nvestig.Drugs 2009，18，77-87)，顯示出對乏氧細(xì)胞特異的細(xì)胞毒性。在乏氧狀態(tài)下，TPZ可以通過細(xì)胞還原產(chǎn)生的電子釋放羥基自由基，從而達(dá)到殺死細(xì)胞的作用。
[0009]本發(fā)明以金納米粒子為載體，結(jié)合替拉扎明對乏氧細(xì)胞的特異選擇性，提出設(shè)計(jì)替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物。利用電離輻射與金納米粒子相互作用所產(chǎn)生的次級(jí)電子，結(jié)合替拉扎明在俘獲電子后被還原釋放出羥基自由基的機(jī)制，兩者協(xié)同作用可以放大電離輻射對自由基的產(chǎn)額，從而達(dá)到提高腫瘤組織輻照劑量效應(yīng)增強(qiáng)的功效。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物，其主要特點(diǎn)在于由外層的替拉扎明通過連接部分與內(nèi)核金納米粒子相連接組成，其結(jié)構(gòu)可簡化為式(I)。見圖1。
[0011]所述的金納米粒子為1.5-400nm,并具有磁性-金納米粒子核殼結(jié)構(gòu)；所述金納米粒子的表面包護(hù)有保護(hù)基團(tuán)(PG)，所述保護(hù)基團(tuán)包括有巰基聚乙二醇(PEG)、檸檬酸鈉、N-(2-巰基丙酰基)-甘氨酸(t1pronin)、含巰基的氨基酸及其鹽、硫辛酸、含巰基的C3-C18酸及其鹽的某一種或多種混合組合；
[0012]所述的TPZ為替拉扎明；
[0013]連接部分選自于SH-(CH2)n-(CHR1)m-CO-, SH-(CH2)n-(CH2O)m-CH2-CO-, R13N+-(CH2) n-CO-，R13N+- (CH2) n- (CH2O) m-CH2-C0-, R1S-S-CH (R2) - (CH2) η-⑶-，R1S-S-CH (R2) - (CH2)η-(OCH2)m-CO-,其中 η = 1-18, m = 1-18，R1 和 R 2為 C「C5的烷基，或 R 1和 R 2相連與 S-S 形成(取代的)五元、六元、七元、八元環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0014]所述的替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物，所述的金納米粒子尺寸優(yōu)選為1-1OOnm金納米粒子或具有核殼結(jié)構(gòu)的四氧化三鐵磁性-金納米粒子；所述的連接部分優(yōu)選為結(jié)構(gòu)式(2,3):見圖 2。
[0015]其中η = 1-18，m = 1-18，R1和R 2為C廠仏的烷基。
[0016]本發(fā)明的通式(I)的所有立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體，其中各原子包括所有同位素的情況。當(dāng)分子中存在一個(gè)或多個(gè)手性中心時(shí)，根據(jù)式(I)的復(fù)合物可以是藥學(xué)上可以接受的消旋體混合物形式或者單一立體異構(gòu)體形式。本發(fā)明的復(fù)合物還包括互變異構(gòu)體形式?；プ儺悩?gòu)體形式來源于一個(gè)單鍵與相鄰的雙鍵交換并一起伴隨一個(gè)質(zhì)子的迀移；本發(fā)明的復(fù)合物還包括所有同位素的原子，無論是在中間體或最后的化合物。同位素的原子包括具有相同的原子數(shù)，但不同質(zhì)量數(shù)。例如，氫的同位素包括氚和氘。
[0017]本發(fā)明的復(fù)合物還可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。藥學(xué)上可接受的鹽是指把母體化合物中的基團(tuán)轉(zhuǎn)換成鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽的形式，可以是無機(jī)酸形成的鹽(如鹽酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽等)，也可以是與胺形成的銨鹽(如三乙胺鹽、哌啶鹽或者堿性藥等)，也可以是與堿金屬或堿土金屬形成的金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽、鈣或鎂鹽等)。
[0018]所述的替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物的制備方法，其主要特點(diǎn)在于它包括下述三個(gè)步驟為:
[0019](I):替拉扎明與含巰基或含二硫鍵的羧酸在縮合劑作用下縮合成替拉扎明-連接部分；
[0020](2)金納米粒子的制備；
[0021]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(TapanK.Sau and Catherine J.Murphy, Roomtemperature, high-yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticles inaqueous solut1n, J.Am.Chem.Soc., 2004, 126(28)，8648 - 8649)的方法合成不同包被的不同尺寸的金納米粒子。
[0022](3)替拉扎明-連接部分溶解在溶劑中，加入到上述步驟(2)制備的水溶性金納米粒子中，經(jīng)配體交換反應(yīng)制備替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物。
[0023].先將含巰基或二硫鍵的酸0.1?1.0g溶解在二氯甲烷2?50mL中，加入三乙胺0.1?5.0mL,攪拌過夜，然后加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽0.1?1.0g,和N-羥基苯并三唑0.1?0.8g，室溫?cái)嚢?.5?5.0小時(shí)，然后加入替拉扎明0.1?2.0g,攪拌過夜；加水20mL，分液，有機(jī)相濃縮后柱層析，得產(chǎn)物替拉扎明；根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Tapan K.Sau and Catherine J.Murphy, Room temperature, high-yieldsynthesis of multiple shapes of gold nanoparticles in aqueous solut1n, J.Am.Chem.Soc.，2004，126(28)，8648 - 8649)的方法合成不同包被的不同尺寸的金納米粒子連接部分；
[0024]所述的替拉扎明-金納米粒子復(fù)合物的制備方法，還包括有所述的第一步替拉扎明-連接部分合成的步驟為:以下為三種替拉扎明-連接部分的合成。
[0025](I)替拉扎明的合成:將鄰硝基苯胺0.1?10g與氰胺0.12?121.8g(l?40eq)，直接混合與10?2500mL圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢瑁訜嵘郎兀?0?70°C熔化，繼續(xù)加熱至80-150°C，形成深棕色溶液；降溫至20-60 °C，緩慢滴加濃鹽酸1.0?400mL，并保持溫度不超過80-120°C，滴完緩慢加熱至120-150°C，反應(yīng)0.5-5.0小時(shí)停止加熱，冷卻；冷卻至30-55°C，緩慢滴加配制好的NaOH溶液16M，40mL，并保持溫度于50_85°C，滴加過程中有黃色固體析出，體系顏色逐漸變淺；滴完升溫至90-120°C，過程中顏色繼續(xù)變淺，固體增多，變?yōu)辄S色，不易攪動(dòng)；保持90-120°C反應(yīng)0.5-5.0小時(shí)；加入1.0?400mL水，冷卻至室溫，過夜攪拌；抽濾，水洗，EA洗，25-80°C真空烘箱干燥過夜，得到亮黃色固體3-氨基-1，2，4-苯并三唑-1-氧化物；
[0026]將3-氨基-1，2，4-苯并三唑-1-氧化物0.1?105g，加入2.0?2000mL三口瓶，溶于乙酸0.5?800mL，加熱升溫至40?80°C，得到黃色溶液。緩慢滴加30%雙氧水0.3?600mL，保持溫度在40?80°C ;滴完用黑色塑料袋遮住瓶子，保持40?80°C避光反應(yīng)2?48h，直至波層色譜分析顯示原料已耗盡，體系變?yōu)槌壬粶p壓下除去大部分溶劑，凍干或放入40°C真空。烘箱干燥過夜。MeOH重結(jié)晶，得到橙色晶體3-氨基-1，2，4-苯并三唑-1，
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