一種利用雙水相體系與超聲集成提取黃皮葉總黃酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于提取總黃酮的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用異丙醇-硫酸銨雙水相體 系與超聲集成提取黃皮葉總黃酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃皮[Clausena lansium(Lour. ) Skeels]屬蕓香科柑桔亞科植物，為多年生常綠 大灌木或小喬木，原產(chǎn)我國南部，臺(tái)灣、福建、廣東、海南、廣西、貴州南部、云南及四川金沙 江河谷均有栽培。枝葉可做藥材，具有解表散熱、順氣化痰、殺菌、止血等功效。黃酮類化合 物廣泛存在于植物組織中，黃皮葉中含有豐富的黃酮類化合物。黃酮類化合物能預(yù)防許多 疾病的突發(fā)，如心血管疾病等。傳統(tǒng)提取植物中黃酮的方法有超臨界CO 2萃取法、溶劑浸提 法等。雙水相萃?。ˋqueous two-phase extraction，ATPE)技術(shù)是一種新型分離技術(shù)，其 方法是一種或幾種物質(zhì)以適當(dāng)?shù)臐舛热芙庠谒?，在一定條件下形成的互不相溶的水溶液 系統(tǒng)，依據(jù)預(yù)分離物質(zhì)在雙水相體系（Aqueous two-phase system，ATPS)中分配的差異而 達(dá)到萃取目的。ATPE具有操作簡便、條件溫和、產(chǎn)物純度高、生物親和性好、溶劑易回收、易 于與其它技術(shù)集成等優(yōu)點(diǎn)。
[0003] CN103211926A提出了一種雙水相體系萃取葡萄籽中總黃酮的方法，該方法先用提 取劑提取植物成分，過濾后得到提取液，再向提取液中加入乙醇、硫酸銨或丙醇、硫酸銨形 成雙水相體系，萃取、分液得到主要成分，步驟多，時(shí)間長。
[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種新的提取黃皮葉總黃酮的方法，直接用 異丙醇和一定量的硫酸銨配成雙水相體系溶液，作為提取劑提取植物成分，邊提取邊萃取， 步驟少、時(shí)間短、效率高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種利用異丙醇-硫酸銨雙水相體系與超聲集成提取黃皮葉總黃 酮的方法，所述方法包括以下步驟：
[0006] S100 :將鮮黃皮葉經(jīng)陰干后粉碎，過40目篩，密封貯存?zhèn)溆茫?br>[0007] S200 :向粉碎的黃皮葉中加入雙水相體系；
[0008] S300:以超聲提取黃皮葉中總黃酮，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇 總黃酮的提取工藝條件。
[0009] 所述步驟S200中雙水相體系為無機(jī)鹽與異丙醇組成的雙水相體系。
[0010] 所述的無機(jī)鹽優(yōu)選為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、碳酸鈉、碳酸銨中的任一種，優(yōu)選為 硫酸銨。
[0011] 在所述雙水相體系中，所述無機(jī)鹽的濃度優(yōu)選為200-400mg/mL，所述異丙醇優(yōu)選 為20-40 %異丙醇水溶液。
[0012] 所述步驟S300中超聲波額定功率為250W，超聲提取時(shí)間為在20min。
[0013] 所述黃皮葉質(zhì)量與雙水相體系的體積比值為1 : 30。
[0014] 所述無機(jī)鹽濃度310mg/mL，所述異丙醇為40%異丙醇水溶液，黃皮葉與雙水相體 系的料液比I : 40(g/mL)，超聲時(shí)間20min。
[0015] 本發(fā)明的方法直接用異丙醇和一定量的硫酸銨配成雙水相體系溶液，作為提取劑 提取植物成分，邊提取邊萃取，步驟少、時(shí)間短、效率高。
[0016] 用本發(fā)明的方法提取黃皮葉成分，過濾、分液后取異丙醇部分，低溫蒸發(fā)烘干得總 提取物，稱重，分析其中黃酮含量為71. 34 %。
【附圖說明】
[0017] 圖1為不同鹽與異丙醇組成的雙水相體系對(duì)黃皮葉黃酮提取率的影響；圖中：a為 (NH 4)2SO4, b 為 Na2S04, c 為（NH4)2CO3, d 為 NaCl，e 為 Na2CO3;
[0018] 圖2為硫酸銨濃度對(duì)黃酮提取率的影響；
[0019] 圖3為異丙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響；
[0020] 圖4為超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響；
[0021] 圖5為料液比對(duì)黃酮提取率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 一種利用異丙醇-硫酸銨雙水相體系與超聲集成提取黃皮葉總黃酮的方法，所述 方法包括以下步驟：
[0024] SlOO :將鮮黃皮葉經(jīng)陰干后粉碎，過40目篩，密封貯存?zhèn)溆?；黃皮葉，采自柳州沙 塘鎮(zhèn)，經(jīng)覃逸明博士鑒定為黃皮屬蕓香科柑桔亞科植物鮮葉。
[0025] S200 :向粉碎的黃皮葉中加入雙水相體系；準(zhǔn)確稱取黃皮葉粉末1.0 Og置于IOOmL 圓底燒瓶中，分別按一定料液比加入不同濃度的異丙醇溶液與不同濃度的硫酸銨形成異丙 醇-硫酸銨雙水相溶液。
[0026] S300:以超聲提取黃皮葉中總黃酮，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇 總黃酮的提取工藝條件。
[0027] 將所述含有黃皮葉的雙水相溶液超聲一定時(shí)間，將黃皮葉過濾，濾液置于分液漏 斗中靜置2h，分液后取上層溶液，用30 %異丙醇定容至25mL，搖勻。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 本發(fā)明按下公式計(jì)算總黃酮提取率
[0030] 總黃酮提取率（％)=總黃酮質(zhì)量（g)/黃皮葉粉末的質(zhì)量（g) X 100%
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 鹽類的選擇
[0033] 取30mL 30%的異丙醇溶液，分別按300mg/mL加入硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、碳酸 鈉、碳酸銨固體，震蕩溶解，形成雙水相體系，準(zhǔn)確稱取黃皮葉粉末I. 〇〇g，超聲提取15min， 過濾，濾渣用少量30%異丙醇溶液洗滌幾次，收集濾液置于分液漏斗中靜置2h，取上層溶 液，用30%異丙醇定容至25mL，搖勻，按實(shí)施例2的方法測定黃酮含量，計(jì)算黃酮的提取率， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
[0034] 結(jié)果表明，用硫酸銨和異丙醇組成的雙水相體系作為提取液黃酮的提取率比其他 四種鹽高，其黃酮提取率為2. 68%，因此實(shí)驗(yàn)選用硫酸銨與異丙醇組成雙水相體系對(duì)黃酮 進(jìn)行提取。
[0035] 實(shí)施例4
[0036] 單因素實(shí)驗(yàn)
[0037] 硫酸銨用量對(duì)提取率的影響
[0038] 準(zhǔn)確稱取黃皮葉粉末1.0 Og 5份，取30mL 30%的異丙醇溶液，分別按240、260、 280、300、320mg/mL加入硫酸銨固體，震蕩溶解，形成穩(wěn)定的雙水相體系，超聲15min，過濾， 用少量30%異丙醇溶液洗滌幾次，收集濾液置于分液漏斗中靜置2h，取上層溶液，用30% 異丙醇定容至25mL，搖勻，按實(shí)施例2的方法測定黃酮含量，計(jì)算黃酮提取率。
[0039] 異丙醇濃度對(duì)提取率的影響
[0040] 稱取1.0 Og黃皮葉粉末6份，分別按濃度為300mg/mL加入硫酸銨，以料液比 (m : V)為1 : 30分別加入20%、25%、30%、35%、40%、45%的異丙醇溶液，超聲時(shí)間 15min，過濾，用少量30%異丙醇溶液洗滌幾次，收集濾液置于分液漏斗中靜置2h，取上層 溶液，用30%異丙醇定容至25mL，搖勻，按實(shí)施例2的方法測定黃酮含量，計(jì)算黃酮提取率。
[0041] 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響
[0042] 稱取1.0 Og黃皮葉粉末6份，分別按料液比（m : V)為1 : 30加入40%的異丙醇 溶液，分別超聲5、10、15、20、25、3011^11，過濾，用少量30%異丙醇溶液洗滌幾次，收集濾液 置于分液漏斗中靜置2h，分取上層溶液，用30%異丙醇定容至25mL，搖勻，按實(shí)施例2的方 法測定黃酮含量，計(jì)算黃酮提取率。
[0043] 料液比對(duì)提取率的影響
[0044] 稱取1.0(^黃皮葉粉末7份，分別按1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、 1 : 45加入40%異丙醇溶液和300mg/mL硫酸銨組成的雙水相體系溶液，超聲20min，過濾， 用少量30 %異丙醇溶液洗滌幾次，收集濾液置于分液漏斗中靜置2h，分液，取上層溶液，用 30%異丙醇定容至25mL，搖勻，按實(shí)施例2的方法測定黃酮含量，計(jì)算黃酮提取率。
[0045] 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0046] 硫酸銨濃度對(duì)黃酮提取率的影響
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
[0048] 圖2表明，總黃酮提取率隨硫酸銨濃度先增加后下降，硫酸銨濃度在240~300mg/ mL間，總黃酮提取率隨著硫酸銨濃度的增加而增大，而硫酸銨濃度達(dá)到320mg/mL后，總黃 酮提取率開始降低，可看出硫酸銨濃度為300mg/mL左右時(shí)總黃酮提取率最大。
[0049] 異丙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響
[0050] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
[0051] 由圖3可看出，隨異丙醇濃度的增大，總黃酮提取率先增后減；其濃度在20%~ 40%時(shí)，總黃酮提取率隨異丙醇濃度增大而增高；異丙醇為45%時(shí)總黃酮提取率下降。因 此，實(shí)驗(yàn)選擇40 %異丙醇效果較佳。
[0052] 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響
[0053] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
[0054] 由圖4可見，隨超聲時(shí)間的增加，總黃酮提取率逐步增高，在5~20min內(nèi)增加較 快，20min后增加幅度較小，這是因?yàn)辄S酮提取已接近完全，因此超聲時(shí)間為在20min左右 為宜。
[0055] 料液比對(duì)黃酮提取率的影響
[0056] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
[0057] 由圖5可看出，料液比在1 : 15~1 : 30時(shí)增長快，1 : 35后開始下降，可以看 出總黃酮提取率在料液比1 : 30時(shí)最大，因此料液比為1 : 30提取效果較好。
[0058] 實(shí)施例5
[0059] 正交實(shí)驗(yàn)
[0060] 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用L9(34)表設(shè)計(jì)安排正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，正交 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。
[0061] 表1正交實(shí)驗(yàn)因素水平表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用雙水相體系與超聲集成提取黃皮葉總黃酮的方法，其特征在于，所述方法 包括以下步驟： SlOO :將鮮黃皮葉陰干后粉碎，密封貯存?zhèn)溆茫? S200 :向粉碎的黃皮葉中加入雙水相體系； S300 :將含有黃皮葉的雙水相溶液超聲一定時(shí)間，將黃皮葉過濾，濾液置于分液漏斗中 靜置2h，分液后取上層溶液，得到黃皮葉總黃酮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，優(yōu)選的，所述步驟S300中總黃酮的提取率 計(jì)算公式如下： 總黃酮提取率（％ )=總黃酮質(zhì)量（g)/黃皮葉粉末的質(zhì)量（g) X100%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S200中雙水相體系為無機(jī)鹽與 異丙醇組成的雙水相體系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述的無機(jī)鹽為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、碳酸鈉、碳酸 銨中的任一種，優(yōu)選為硫酸銨。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，在所述雙水相體系中，所述無機(jī)鹽的 濃度為200-400mg/mL，所述異丙醇為20-40%異丙醇水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S300中超聲提取時(shí)間為在 20min〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述黃皮葉質(zhì)量與雙水相體系的體積比 值為1: 30。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽濃度310mg/mL，所述異丙醇為 40%異丙醇水溶液，黃皮葉與雙水相體系的料液比I : 40(g/mL)，超聲時(shí)間20min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用雙水相體系與超聲集成提取黃皮葉總黃酮的方法；所述方法首先將黃皮葉粉碎，加入一定濃度的異丙醇和硫酸銨水溶液形成雙水相體系，以超聲提取黃皮葉中總黃酮，所述方法在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)選出總黃酮的提取工藝條件；最佳提取條件確定為硫酸銨濃度310mg/mL，40％異丙醇溶液，超聲時(shí)間20min，料液比1∶40；本發(fā)明的方法操作簡便，縮短提取時(shí)間，有效的提高了提取效率。
【IPC分類】A61K36-75
【公開號(hào)】CN104644815
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510116170
【發(fā)明人】藍(lán)峻峰, 覃逸明
【申請(qǐng)人】柳州師范高等專科學(xué)校
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日