一種禽流感病毒h7n9神經(jīng)氨酸酶抑制劑的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的抗病毒藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃芩苷具有抑制禽 流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的用途。
【背景技術(shù)】：
[0002] H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感病毒中的一種，可以引起的一種禽類烈性傳染 病，屬于正黏病毒科，RNA病毒。研宄揭示H7N9病毒可能來自于歐亞大陸迀徙至東南亞地 區(qū)的野鳥所攜帶的禽流感病毒與中國上海、浙江、江蘇等地的鴨群和雞群所攜帶的禽流感 病毒發(fā)生的基因重組。流感病毒的神經(jīng)氨酸酶（NA)，是一種有酶活性的表面糖蛋白，在所有 A，B型流感病毒中均高度保守。
[0003] 常用的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑（扎那米韋、奧司他韋等）能夠同時抑制A型 和B型流感病毒，在流感的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要作用。但扎那米韋和奧司他韋在臨床 上的使用有一定的局限性，如扎那米韋的口服利用度低，體內(nèi)分布容積小，腎臟清除快，只 能作為局部用藥。奧司他韋（商品名達(dá)菲）作為抗流感特效藥，經(jīng)受了禽流感和甲型HlNl 流感的雙重考驗(yàn)，但由于價格較高，難以在發(fā)展中國家推廣，同時臨床上大量耐藥病毒株的 出現(xiàn)也已被報道。
[0004] 黃芩苷是黃芩中提取的多酚羥基黃酮類中藥單體，是黃芩的主要活性成分之一。 現(xiàn)代科學(xué)研宄結(jié)果證明黃芩苷有抑菌、抗炎、抗氧化作用，還具有抗病毒、抗腫瘤等作用。黃 芩苷的抗病毒譜較廣，資源豐富，在黃芩中含量超過9%，易于提取分離，是一種具開發(fā)潛力 的抗病毒藥物資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明中的黃芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的活性。研宄表明，黃芩 苷具有明顯的抑制野生型及耐奧司他韋的禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的活性，具有抗禽 流感病毒藥物的用途。所述的病毒神經(jīng)氨酸酶為在CHO-Kl細(xì)胞中重組表達(dá)的野生型及奧 司他韋耐藥的禽流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神經(jīng)氨酸酶。
[0006] 黃芩苷具有制備抗禽流感病毒H7N9藥物的用途。
【附圖說明】
[0007] 圖1是質(zhì)粒pCDNA3. I (+) -N9的雙酶切驗(yàn)證
[0008] 圖2是質(zhì)粒pCDNA3. I (+) -N9表達(dá)的RT-PCR驗(yàn)證
[0009] 圖3是N9的活性驗(yàn)證
[0010] 圖4是質(zhì)粒pCDNA3. I (+) -N9-R294K的雙酶切驗(yàn)證
[0011] 圖 5 是質(zhì)粒 pCDNA3. I (+) -N9-R294K 表達(dá)的 RT-PCR 驗(yàn)證
[0012] 圖6是N9-R294K的活性驗(yàn)證
[0013] 圖7是黃芩苷對N9活性的抑制作用
[0014] 圖8是黃芩苷對N9-R294K活性的抑制作用
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1
[0016] 流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神經(jīng)氨酸酶的表達(dá)
[0017] 從數(shù)據(jù)庫 GISAID (Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data)中 獲得流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神經(jīng)氨酸酶的基因序列（序列號：EPI439509)，對其 進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其適合在CHO-Kl細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)。該基因序列由人工合成，命名為 N9,通過Hind III和Xho I酶切，酶切產(chǎn)物連接到用相同酶切的pcDNA 3.1(+)質(zhì)粒中，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞后，涂布Amp ici 11 in抗性平板培養(yǎng)14~18h，挑取單個菌 落，該菌落經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)擴(kuò)增后后提取質(zhì)粒酶切鑒定后，并對克隆的神經(jīng)氨酸酶基因進(jìn)行 測序。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后在CHO-Kl細(xì)胞中表達(dá)，并建立穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0018] 穩(wěn)定細(xì)胞株的建立：使用Iipofectamine 2000將重組質(zhì)粒pCDNA3. I (+)-N9及空 載體pcDNA3. 1 (+)分別轉(zhuǎn)染到CHO-Kl細(xì)胞中，48h后將細(xì)胞按1 : 12傳代并加入200 μ g/ ml G418進(jìn)行克隆篩選。每3天換液，維持相同濃度的G418,直至單個穩(wěn)定細(xì)胞克隆形成， 然后挑取單克隆。陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)凍存，并抽提重組細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)率產(chǎn) 物為模板，設(shè)計基因 N9的上下游引物進(jìn)行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定。
[0019] 神經(jīng)氨酸酶的表達(dá)：24孔板中每孔接種穩(wěn)定細(xì)胞株IX IO5個細(xì)胞，培養(yǎng)48h后用 抽提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測N9基因 mRNA的表達(dá)。
[0020] 神經(jīng)氨酸酶活性的鑒定：24孔板中每孔接種IX IO5個穩(wěn)定細(xì)胞，培養(yǎng)48h后 收取細(xì)胞，每孔用100 μ 1通用蛋白裂解抽提試劑裂解細(xì)胞。同時制備流感病毒A/ FM/l/47(HlNl)，A/Beijing/32/92(H3N2)雞胚培養(yǎng)的尿囊培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)使用96孔黑板，每 孔先加35 μ I MES緩沖液，加入30 μ 1重組表達(dá)的流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神經(jīng)氨 酸酶液，再加入10 μ 1的不同濃度的黃芩苷，置于37°C孵育5min，避光操作每孔加入25 μ 1 的神經(jīng)氨酸酶特異性熒光底物MUNANA，置于37°C孵育20min，最后每孔加入100 μ 1加入終 止液150 μ I (14mm〇l/l的NaOH溶液，含83%的乙醇），用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長360nm發(fā) 射波長440nm處測定熒光。計算黃芩苷對于神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)置不加 藥的空白對照組。神經(jīng)氨酸酶酶活抑制率=(空白對照組的熒光值-加藥組的熒光值）/ 空白組的熒光值X 100%，IC5tl定義為神經(jīng)氨酸酶酶活下降50%時黃芩苷的濃度。以流感 病毒A/FM/1/47 (HlNl)及A/Bei jing/32/92 (H3N2)雞胚培養(yǎng)的尿囊培養(yǎng)液為陽性對照。
[0021] 結(jié)果見附圖1，2,3,圖1表明，提取重組質(zhì)粒p⑶NA3. 1(+)-Ν9,用1%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測，得到了大小為4. Ikb的質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xho I對質(zhì)粒 PCDNA3. 1(+)-Ν9進(jìn)行雙酶切，得到了 1395bp的基因片段，將其進(jìn)行測序，測序結(jié)果與基因 N9序列完全相符，說明重組質(zhì)粒pCDNA3. 1(+)-Ν9構(gòu)建成功。圖2表明，將重組細(xì)胞進(jìn)行 RT-PCR檢測，得到大小為1395bp的基因片段，將其進(jìn)行測序，測序結(jié)果與基因 N9序列完全 相符，說明目的基因 N9的mRNA在CHO-Kl細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。圖3表明，通過MUNANA熒光 底物法測得N9及陽性對照H1N1，H3N1的熒光強(qiáng)度均值分別為33864,41220, 59778,表明N9 具有神經(jīng)氨酸酶活性。
[0022] 實(shí)施例2
[0023] 突變流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神經(jīng)氨酸酶的表達(dá)
[0024] 在流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神經(jīng)氨酸酶基因序列中的294位精氨酸突變 為賴氨酸，將該基因命名為N9-R294K。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3. l(+)-N9-R294K，并構(gòu)建 穩(wěn)定細(xì)胞株，制備重組神經(jīng)氨酸酶N9-R294K。方法同上。
[0025] 結(jié)果見附圖4,5,6,圖4表明，提取重組質(zhì)粒pCDNA3. l(+)-N9-R294K，用1%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測，得到了大小為4. Ikb的質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xho I對質(zhì)粒 PCDNA3. l(+)-N9-R294K進(jìn)行雙酶切，得到了 1395bp的基因片段，將其進(jìn)行測序，測序結(jié)果 與基因 N9-R294K序列完全相符，說明重組質(zhì)粒pCDNA3. l(+)-N9-R294K構(gòu)建成功。圖5表 明，將重組細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測，得到大小為1395bp的基因片段，將其進(jìn)行測序，測序結(jié)果 與基因 N9-R294K序列完全相符，說明目的基因 N9-R294K的mRNA在CHO-Kl細(xì)胞中進(jìn)行了 轉(zhuǎn)錄。圖6表明，通過MUNANA熒光底物法測得N9-R294K及陽性對照HlNl，H3N2的熒光強(qiáng) 度均值分別為15196,41220, 59778,表明N9-R294K具有神經(jīng)氨酸酶活性，其神經(jīng)氨酸酶活 性比N9有所降低。
[0026] 實(shí)施例3
[0027] 黃芩苷對N9神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用
[0028] 實(shí)驗(yàn)使用96孔黑板，黃芩苷用PBS溶解并倍比稀釋至500、250、125、62.5μΜ。每 孔先加35 μ I MES緩沖液，加入30 μ 1重組表達(dá)的流感病毒A/Anhui/1/2013 (Η7Ν9)神經(jīng)氨 酸酶液，再加入10 μ 1的不同濃度的黃芩苷，置于37°C孵育5min，避光操作每孔加入25 μ 1 的神經(jīng)氨酸酶特異性熒光底物MUNANA，置于37°C孵育20min，最后每孔加入100 μ 1的終止 液150 μ I (14mm〇l/l的NaOH溶液，含83 %的乙醇），用熒光酶標(biāo)儀于激發(fā)波長360nm發(fā)射 波長440nm處測定熒光。計算黃芩苷對于神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)置不加藥 的空白對照組。神經(jīng)氨酸酶酶活抑制率=(空白對照組的熒光值-加藥組的熒光值）/空 白組的熒光值X100%，IC 5tl定義為神經(jīng)氨酸酶酶活下降50%時黃芩苷的濃度。以奧司他 韋羧酸鹽和扎那米韋作為陽性對照藥。
[0029] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖7,圖7表明，黃芩苷對N9的神經(jīng)氨酸酶活性均有明顯的劑量依 賴的抑制作用，隨著黃芩苷濃度升高，神經(jīng)氨酸酶活性下降越明顯。黃芩苷對N9的IC 5tl是 211. 8 μ M，證明了黃芩苷是一種流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神經(jīng)氨酸酶的有效抑制 劑。黃芩苷對N9及流感病毒HlNl及H3N2的神經(jīng)氨酸酶的IC5tl值如表1所示。
[0030] 表1藥物對各流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性抑制作用的IC5tl值
[0031]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 黃芩苷作為一種禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶抑制劑的用途。
2. 黃芩苷作為一種對奧司他韋耐藥的禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶抑制劑的用途。
3. 黃芩苷用于治療和/或預(yù)防禽流感病毒H7N9感染的藥物的用途。
4. 黃芩苷用于臨床治療人和/或動物禽流感病毒感染的藥物的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于天然活性物質(zhì)中的抗病毒藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶活性的用途。本發(fā)明中的黃芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的活性。研究表明，黃芩苷具有明顯的抑制野生型及耐奧司他韋的禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的活性，具有抗禽流感病毒藥物的用途。所述的病毒神經(jīng)氨酸酶為在CHO-K1細(xì)胞中重組表達(dá)的野生型及奧司他韋耐藥的禽流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神經(jīng)氨酸酶。研究結(jié)果表明，黃芩苷具有制備抗禽流感病毒H7N9藥物的用途。
【IPC分類】A61P31-16, A61K31-7048
【公開號】CN104666324
【申請?zhí)枴緾N201510096401
【發(fā)明人】周長林, 竇潔, 王婷婷, 郁潔, 王慧, 靳京
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月4日