一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，具體地，本發(fā)明涉及一種含禽流感病毒樣顆?？乖?以及新城疫病毒顆粒抗原的疫苗組合物，以及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLPs),是由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成的介 于15nm~400nm的空心顆粒。VLPs的制備原理是在體外高效表達(dá)某種病毒的一種（或幾 種)結(jié)構(gòu)蛋白，使其自動裝配成在形態(tài)上類似于天然病毒的空心顆粒。其方法主要是將病毒 結(jié)構(gòu)蛋白基因克隆到表達(dá)載體中，再將這些載體轉(zhuǎn)入原核或真核細(xì)胞中進行表達(dá)。
[0003] 禽流感（Avian influenza, Al)是禽流行性感冒的簡稱，由禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV)引起的多種禽類感染的急性呼吸道傳染病，也能感染人類，被國際 獸醫(yī)局（OIE)和我國《家畜家禽防疫條例》列為A類烈性傳染病。截止到目前，接種疫苗仍 然是預(yù)防和控制禽流感病毒大流行的最有效手段。由于禽流感病毒的變異速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于變 異株相應(yīng)疫苗的制備速度，而且不同亞型之間幾乎不產(chǎn)生交叉免疫保護。因為禽流感疫苗 的生產(chǎn)需要隨著病毒的變異而不斷更新，針對流感病毒流行株相應(yīng)疫苗的生產(chǎn)周期較長、 生產(chǎn)成本較高，造成人力、物力的浪費，還可能達(dá)不到預(yù)想的防控效果。
[0004] 新城疫（ND)是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的一種重要的病毒性傳染病，病原是新城疫病毒 (NDV)。NDV只有一個血清型，但是可以分為不同的基因型，疫苗免疫接種是預(yù)防該病的主 要措施之一。有學(xué)者研究證明，近十多年來，從不同種類宿主臨床病例中所分離到的NDV毒 株絕大多數(shù)屬于VII型。基因 W型毒株流行和傳播越來越普遍并對養(yǎng)殖場亦造成的現(xiàn)實損 失，疫苗免疫接種是預(yù)防該病的主要措施之一，盡管大面積和普遍的新城疫基因 II和III型 的弱毒苗及滅活苗使用對新城疫的大規(guī)模擴散和傳播仍能起到一定的防控作用，但這些傳 統(tǒng)基因型疫苗誘導(dǎo)的免疫對新城疫基因 W型流行株防控能力在逐漸的下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明將H9N2亞型禽流感病毒樣顆粒以及基因 VII型新 城疫病毒顆粒制備二聯(lián)疫苗，與雞胚生產(chǎn)的二聯(lián)苗相比，該二聯(lián)苗的生產(chǎn)可利用大體積生 物反應(yīng)器技術(shù)、規(guī)?；囵B(yǎng)昆蟲細(xì)胞制備抗原、保證產(chǎn)量的同時，產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一 性也得到保障，且在生產(chǎn)過程中不涉及活的病毒，無生物安全方面的隱患。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)路線：本發(fā)明以Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，將編碼 H9N2亞型禽流感病毒SZ株的HA和NA基因克隆至桿狀病毒表達(dá)載體，形成重組桿狀病毒， 轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，擴大培養(yǎng)，蔗糖密度梯度離心收獲AIV的VLP。將編碼基因 VII型新城疫的 F基因、HN基因和M基因，克隆至桿狀病毒表達(dá)載體，形成重組桿狀病毒，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，擴 大培養(yǎng)，蔗糖密度梯度離心收獲NDV的VLP。在此基礎(chǔ)上，將兩種病毒樣顆粒以適當(dāng)?shù)谋壤?配比，輔以佐劑，制備H9N2亞型禽流感與基因 VII型新城疫病毒的病毒樣顆粒二聯(lián)疫苗。
[0007] 因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括流感病 毒樣顆粒抗原和新城疫的病毒樣顆?？乖?。
[0008] 優(yōu)選地，所述流感病毒樣顆?？乖瓰镠9亞型禽流感病毒樣顆粒抗原，所述新城疫 的病毒樣顆粒抗原為基因 VII型新城疫的病毒樣顆?？乖?br>[0009] 更優(yōu)選地，所述H9亞型禽流感病毒樣顆?？乖℉9亞型禽流感病毒的表面抗 原紅細(xì)胞凝集素 HA、H9亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶NA和H9亞型禽流感病毒的基質(zhì)蛋白 Ml的自我裝配體；以及所述基因 VII型新城疫的病毒樣顆?？乖ɑ?VII型新城疫病 毒的融合蛋白F、核衣殼蛋白NP和基質(zhì)蛋白M的自我裝配體。
[0010] 優(yōu)選地,所述疫苗組合物還包括佐劑。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種疫苗組合物的制備方法，所述方法包括：（1)克 隆表達(dá)權(quán)利要求1所述的流感病毒的抗原蛋白，所述流感病毒的抗原蛋白能夠自我裝配為 所述流感病毒樣顆粒抗原；（（2)克隆表達(dá)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒的抗原蛋白，所述 新城疫病毒的抗原蛋白能夠自我裝配為所述新城疫的病毒樣顆?？乖?；以及（3)按比例將 所述流感病毒樣顆粒抗原和新城疫的病毒樣顆?？乖旌?，加入佐劑。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中流感病毒的抗原蛋白包括H9亞型禽流感病毒的表面抗原 紅細(xì)胞凝集素 HA、H9亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶NA和H9亞型禽流感病毒的基質(zhì)蛋白 Ml ;以及所述步驟（2)中新城疫病毒的抗原蛋白包括基因 VII型新城疫病毒的融合蛋白F、 核衣殼蛋白NP和基質(zhì)蛋白M。
[0013] H9N2亞型禽流感病毒樣顆粒疫苗的制備包括如下步驟：
[0014] 1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建與提取；
[0015] 2)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救重組桿狀病毒，在Sf9細(xì)胞 內(nèi)裝配病毒樣顆粒；
[0016] 3)?；疭f9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。
[0017] 基因 VII型新城疫病毒樣顆粒疫苗的制備包括如下步驟：
[0018] 1)重組質(zhì)粒PAcAb4-F-HN-M的構(gòu)建與提??；
[0019] 2)將重組質(zhì)粒PAcAb4-F-HN-M轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救重組桿狀病毒，在Sf9細(xì)胞 內(nèi)裝配病毒樣顆粒；
[0020] 3)規(guī)模化Sf9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。
[0021] 更優(yōu)選地，所述步驟（1)中所述HA、NA和Ml克隆于同一個表達(dá)載體于昆蟲細(xì)胞表 達(dá)體系進行表達(dá)；所述步驟（2)中所述F、NP和M克隆于同一個表達(dá)載體于昆蟲細(xì)胞表達(dá)體 系進行表達(dá)。
[0022] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備治療和預(yù)防流感病毒和新 城疫病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0024] 實施例1. H9N2亞型禽流感病毒樣顆粒（VLPs)的構(gòu)建與檢測
[0025] 1.引物的設(shè)計與合成根據(jù)本公司保存的禽流感病毒SZ株(保藏號為CCTCC V201240,保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心）基因組序列中血凝素 HA編碼序列、神經(jīng)氨 酸酶NA序列和基質(zhì)蛋白M序列，分別設(shè)計合成三對特異性引物，分別擴增HA、NA和Ml基 因；設(shè)計一條A型流感病毒通用引物用于cDNA合成；各引物由上海生物工程技術(shù)有限公司 合成了各引物的序列如下：
[0026] UHA基因 PCR擴增引物
[0027] 上游引物 AlV-Pl:
[0028] 5' -AGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3'
[0029] 下游引物 AIV-P2:
[0030] 5 '-AGGTA-CCTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3'
[0031] 2) NA基因 PCR擴增引物
[0032] 上游引物 AIV-P3:
[0033] 5 '-AGAATTC-ATGAATCCAAATCAAAAGATAATA-3，
[0034] 下游引物 AIV-P4:
[0035] 5' -AGATAT-CTTATATAGACATGAAATTGATATTC-3'
[0036] 3) Ml基因 PCR擴增引物
[0037] 上游引物 AIV-P5:
[0038] 5' -AGAA-TTCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG-3'
[0039] 下游引物 AlV-P6:
[0040] 5 '-AGGT-ACCTCACTTGAATCTCTGCATTTGC-3'
[0041] 4) A型流感病毒通用逆轉(zhuǎn)錄引物：5 '-AGCAAAAGCAGG-3'
[0042] 2· H9N2禽流感病毒SZ株總RNA提取及cDNA合成
[0043] 取250 μ ISZ株尿囊液，用總RNA提取試劑盒(一步法總RNA提取試劑盒，BSC5ISl， 上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品)，按試劑盒操作說明書介紹的方法提取病毒總RNA。提取 的RNA溶于16μ IDEPC處理過的水中，加入1μ 1通用逆轉(zhuǎn)錄引物，70°C反應(yīng)5min，迅速冰浴 5min，加入逆轉(zhuǎn)錄混合液：5X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液（RT Buffer) 5μ 1，dNTPs (10μΜ)0. 5μ 1， RNA酶抑制劑（RNsin) 0. 5 μ 1，M-MLVly 1。在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)：42°C 60min， 95°C 5min，置冰浴，產(chǎn)物即為病毒基因組cDNA，凍存?zhèn)溆谩?br>[0044] 3. PCR 擴增
[0045] 以步驟2合成的H9N2禽流感病毒cDNA為模板，PCR分別擴增HA，NA和Ml基因， 擴增反應(yīng)體系和具體反應(yīng)條件如下：
[0046] I) HA基因擴增
[0047]
【主權(quán)項】
1. 一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括流感病毒樣顆粒抗原和新城疫的病毒樣顆粒 抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述流感病毒樣顆?？乖瓰镠9亞型禽 流感病毒樣顆粒抗原，所述新城疫的病毒樣顆?？乖瓰榛騐II型新城疫的病毒樣顆?？?原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述H9亞型禽流感病毒樣顆?？乖?H9亞型禽流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA、H9亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶NA和H9 亞型禽流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml的自我裝配體；以及 所述基因VII型新城疫的病毒樣顆粒抗原包括基因VII型新城疫病毒的融合蛋白F、核 衣殼蛋白NP和基質(zhì)蛋白M的自我裝配體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物還包括佐劑。
5. -種疫苗組合物的制備方法，所述方法包括： (1) 克隆表達(dá)權(quán)利要求1所述的流感病毒的抗原蛋白，所述流感病毒的抗原蛋白能夠 自我裝配為所述流感病毒樣顆粒抗原； (2) 克隆表達(dá)權(quán)利要求1所述的新城疫病毒的抗原蛋白，所述新城疫病毒的抗原蛋白 能夠自我裝配為所述新城疫的病毒樣顆?？乖?；以及 (3) 按比例將所述流感病毒樣顆粒抗原和新城疫的病毒樣顆?？乖旌?，加入佐劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，所述步驟（1)中流感病毒的抗原蛋白包括H9 亞型禽流感病毒的表面抗原紅細(xì)胞凝集素HA、H9亞型禽流感病毒的神經(jīng)氨酸酶NA和H9亞 型禽流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml ;以及 所述步驟（2)中新城疫病毒的抗原蛋白包括基因VII型新城疫病毒的融合蛋白F、核衣 殼蛋白NP和基質(zhì)蛋白M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中，所述步驟（1)中所述HA、NA和Ml克隆于同 一個表達(dá)載體于昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系進行表達(dá)；所述步驟（2)中所述F、NP和M克隆于同一個 表達(dá)載體于昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系進行表達(dá)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述的疫苗組合物在制備治療和預(yù)防流感病毒和新城疫 病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括流感病毒樣顆粒和新城疫的病毒樣顆粒。本發(fā)明將禽流感病毒樣顆粒以及新城疫病毒顆粒制備疫苗組合物，與雞胚生產(chǎn)的疫苗組合物相比，該疫苗組合物的生產(chǎn)可利用大體積生物反應(yīng)器技術(shù)、規(guī)?；囵B(yǎng)昆蟲細(xì)胞制備抗原、保證產(chǎn)量的同時，產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性也得到保障，且在生產(chǎn)過程中不涉及活的病毒，無生物安全方面的隱患。CCTCC NO:V20124020120916
【IPC分類】A61K39-17, A61K39-145, A61P31-16, A61P31-14
【公開號】CN104721817
【申請?zhí)枴緾N201310706741
【發(fā)明人】張許科, 孫進忠, 白朝勇, 田克恭
【申請人】普萊柯生物工程股份有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年12月19日