乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種乳腺癌前哨淋巴結(jié)的特異性示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 前哨淋巴結(jié)是乳腺癌轉(zhuǎn)移的第一站淋巴結(jié)，其病理情況對乳腺癌外科手術(shù)方式及 術(shù)后綜合治療有重要的指導(dǎo)價值。前哨淋巴結(jié)活檢是乳腺癌淋巴結(jié)分期的技術(shù)手段，準(zhǔn)確 定位前哨淋巴結(jié)是乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢研宄一直關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域。前哨淋巴結(jié)定位的傳 統(tǒng)示蹤劑包括染料、核素、熒光等，這些均為非特異性示蹤劑。其中染料法（美蘭、專利藍(lán)和 納米碳）定位前哨淋巴結(jié)主要是通過術(shù)前在乳腺原發(fā)腫瘤周圍和（或）皮下注射染料后， 然后于腋窩區(qū)域循著被染料染色的淋巴管精細(xì)解剖找到第一枚被染色的淋巴結(jié)，從而確定 前哨淋巴結(jié)的具體位置，然而這種方法需要精湛的外科解剖技巧，并且經(jīng)過學(xué)習(xí)曲線后仍 存在較高的前哨淋巴結(jié)活檢假陰性率，這導(dǎo)致前哨淋巴結(jié)活檢的準(zhǔn)確性難以把握；而核素 法（ 99mTc-硫膠體）定位前哨淋巴結(jié)是通過術(shù)前于乳腺原發(fā)腫瘤周圍腺體和（或）皮下注 射放射性核素后，術(shù)中利用y探測儀探測放射性計數(shù)，依據(jù)放射性計數(shù)找到計數(shù)較高的淋 巴結(jié)，從而確定前哨淋巴結(jié)（大于最高放射性計數(shù)10%的淋巴結(jié)）的具體位置，雖然該方法 前哨淋巴結(jié)活檢的準(zhǔn)確率高、特異性好，但是在實際操作時存在放射性核素污染及醫(yī)務(wù)人 員放射性損害的問題，而且其中的硫膠體并沒有通過中國食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，限 制了其在臨床實際工作中的推廣使用；熒光法（吲哚菁綠）定位前哨淋巴結(jié)的方法與染料 法相似，主要是通過術(shù)前在乳腺原發(fā)腫瘤周圍和（或）皮下注射熒光示蹤劑后，術(shù)中利用近 紅外熒光顯像儀循熒光顯像發(fā)亮的淋巴管找到第一枚熒光顯像陽性的淋巴結(jié)，從而定位前 哨淋巴結(jié)的具體位置，然而由于熒光示蹤劑分子需要近紅外光源激發(fā)，其被激發(fā)所釋放出 熒光的穿透力只有9_左右，所以活檢過程中很難發(fā)現(xiàn)位置較深的淋巴管，從而導(dǎo)致前哨 淋巴結(jié)的漏檢，而位置較淺的淋巴管雖然可以清晰地發(fā)現(xiàn)熒光顯像但在離斷后其內(nèi)的熒光 示蹤劑隨淋巴液一起漏出，極易造成淋巴管周圍組織熒光示蹤劑顯像污染，導(dǎo)致難以辨識 淋巴管的位置，最終造成前哨淋巴結(jié)漏檢，這也不是理想的前哨淋巴結(jié)示蹤劑。另外，目前 特異性的前哨淋巴結(jié)顯像劑 99mTc-利妥昔單抗的制備工藝較復(fù)雜，需經(jīng)過抗體修飾、修飾后 分離、抗體分裝、抗體標(biāo)記以及分離純化等等步驟，而且在制備、使用等過程中相關(guān)人員不 可避免的會直接接觸到放射性物質(zhì)，因此極易造成實驗技師、外科醫(yī)生、病理科醫(yī)生等相關(guān) 人員的放射性損傷，另外該方法制備的利妥昔單抗與放射性核素的標(biāo)記率有時僅為90%， 難以滿足前哨淋巴結(jié)顯像和定位的要求，容易導(dǎo)致顯像不準(zhǔn)確情況的出現(xiàn)。
[0003]吲哚菁綠是乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢的傳統(tǒng)熒光示蹤劑，可以被熒光脈管系統(tǒng)成像 儀（MDM-I型熒光脈管系統(tǒng)成像儀，廊坊明德生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）前的近紅外光源 (760nm)激發(fā)產(chǎn)生熒光（820-830nm)，所產(chǎn)生的熒光可以穿透人體組織，利用成像儀可清晰 直觀地觀察到淋巴管的引流途徑和前哨淋巴結(jié)的顯像位置，但是其在前哨淋巴結(jié)活檢方面 的顯像率高、敏感性高和準(zhǔn)確性低，極易導(dǎo)致前哨淋巴結(jié)以外的次級淋巴結(jié)顯像。
[0004]目前存在利妥昔單抗與吲哚菁綠結(jié)合的制備方法并無詳細(xì)操作步驟和具體配備 劑量的說明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乳腺癌前哨淋巴結(jié)特異性示蹤劑 吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法，該制備方法簡單、安全，制得的吲哚菁綠-利妥昔單抗 能滿足前哨淋巴結(jié)特異性顯像和精確定位的要求。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] 乳腺癌前哨淋巴結(jié)特異性示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法，包括以下步 驟：
[0008] 在室溫條件下，將利妥昔單抗溶液和吲哚菁綠溶液迅速振蕩混勻反應(yīng)；然后移入 用半透膜制成的透析袋中，在室溫避光條件下浸入滅菌注射用水的透析液中進(jìn)行透析，連 續(xù)透析至無吲哚菁綠浸入透析液，收集透析袋中的利妥昔單抗與吲哚菁綠的偶聯(lián)物，制成 口引噪青綠 -利安昔單抗結(jié)合的新型不蹤劑。
[0009] 具體包括以下步驟：
[0010] (1)分別配制利妥昔單抗溶液和吲哚菁綠溶液；
[0011] (2)將吲哚菁綠溶液緩慢滴入利妥昔單抗溶液中，此時形成混合溶液，在室溫下迅 速振蕩混勻反應(yīng)，從而使大分子利妥昔單抗與小分子吲哚菁綠進(jìn)行充分的偶聯(lián)反應(yīng)；
[0012] (3)偶聯(lián)反應(yīng)后將裝有偶聯(lián)反應(yīng)物的離心管進(jìn)行離心沉淀，觀察有無沉淀生成，若 有沉淀生成，則去除離心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；若無沉淀 生成，則直接將混合液置于半透膜制成的透析袋中；
[0013] (4)在室溫避光條件下將步驟（3)中的透析袋浸入滅菌注射用水的透析液中，以 偶聯(lián)反應(yīng)物混合液與滅菌注射用水體積比1:200的比例進(jìn)行透析，先用流水進(jìn)行透析5分 鐘，隨后將透析袋置于滅菌注射用水中繼續(xù)進(jìn)行透析，每2小時更換透析液，取每次透析 結(jié)束更換的透析液進(jìn)行熒光脈管系統(tǒng)成像儀檢測，確定偶聯(lián)物中有無游離的小分子吲哚菁 綠，通過此方法能將透析袋中的小分子吲哚菁綠完全洗脫出去，透析12小時后，吲哚菁綠 經(jīng)過偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合到利妥昔單抗上，然后收集利妥昔單抗與吲哚菁綠的偶聯(lián)反應(yīng)物，制成 口引噪青綠 -利安昔單抗結(jié)合的新型不蹤劑。
[0014] 步驟（1)中，配制利妥昔單抗溶液的步驟如下：在室溫條件下，按照無菌操作原則 將IOOmg利妥昔單抗用IOml滅菌注射用水配制成lOmg/ml的溶液，置于50ml無菌離心管 內(nèi)冷藏（2-8°C)，保存?zhèn)溆谩?br>[0015] 步驟（1)中，配制吲哚菁綠溶液的步驟如下：在室溫條件下，將25mg吲哚菁綠用 IOml滅菌注射用水配制成濃度為2. 5mg/ml的溶液，置于50ml無菌離心管內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?br>[0016] 步驟（2)中，吲哚菁綠溶液需在5分鐘內(nèi)完全加入利妥昔單抗溶液，注意避免氣泡 的產(chǎn)生。具體的反應(yīng)原理為小分子吲哚菁綠中的含硫活性基團(tuán)在室溫中性環(huán)境條件下與大 分子利妥昔單抗中的自由氨基相結(jié)合，主要為賴氨酸的e-氨基，可標(biāo)記15-20個小分子吲 哚菁綠。大分子利妥昔單抗與小分子吲哚菁綠的偶聯(lián)反應(yīng)式如下：
[0017]
【主權(quán)項】
1. 乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法，其特征是，包括以下 步驟：在室溫條件下，將利妥昔單抗溶液和吲哚菁綠溶液迅速振蕩混勻反應(yīng)；然后移入用 半透膜制成的透析袋中，在室溫避光條件下浸入滅菌注射用水的透析液中進(jìn)行透析，連續(xù) 透析至無吲哚菁綠浸入透析液，收集透析袋中的利妥昔單抗與吲哚菁綠的偶聯(lián)物，制成吲 哚菁綠-利妥昔單抗結(jié)合的新型示蹤劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：具體包括以下步驟： (1) 分別配制利妥昔單抗溶液和吲哚菁綠溶液； (2) 將吲哚菁綠溶液緩慢滴入利妥昔單抗溶液中，此時形成混合溶液，在室溫下迅速振 蕩混勻反應(yīng)，從而使大分子利妥昔單抗與小分子吲哚菁綠進(jìn)行充分的偶聯(lián)反應(yīng)； (3) 偶聯(lián)反應(yīng)后將裝有偶聯(lián)反應(yīng)物的離心管進(jìn)行離心沉淀，觀察有無沉淀生成，若有 沉淀生成，則去除離心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；若無沉淀生 成，則直接將混合液置于半透膜制成的透析袋中； (4) 在室溫避光條件下將步驟（3)中的透析袋浸入滅菌注射用水的透析液中，以偶聯(lián) 反應(yīng)物混合液與滅菌注射用水體積比1:200的比例進(jìn)行透析，先用流水進(jìn)行透析5分鐘，隨 后將透析袋置于滅菌注射用水中繼續(xù)進(jìn)行透析，每2小時更換透析液，取每次透析結(jié)束更 換的透析液進(jìn)行熒光脈管系統(tǒng)成像儀檢測，確定偶聯(lián)物中有無游離的小分子吲哚菁綠，通 過此方法能將透析袋中的小分子吲哚菁綠完全洗脫出去，透析12小時后，吲哚菁綠經(jīng)過偶 聯(lián)反應(yīng)結(jié)合到利妥昔單抗上，然后收集利妥昔單抗與吲哚菁綠的偶聯(lián)反應(yīng)物，制成吲哚菁 綠-利妥昔單抗結(jié)合的新型示蹤劑。
3. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（1)中，配制利妥昔單抗溶液的步驟如下：在室溫條件下，按照無菌操作原 則將IOOmg利妥昔單抗用IOml滅菌注射用水配制成10mg/ml的溶液，置于50ml無菌離心 管內(nèi)冷藏（2-8 °C )，保存?zhèn)溆谩?br>4. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（1)中，配制吲哚菁綠溶液的步驟如下：在室溫條件下，將25mg吲哚菁綠用 IOml滅菌注射用水配制成濃度為2. 5mg/ml的溶液，置于50ml無菌離心管內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?br>5. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（2)中，吲哚菁綠溶液需在5分鐘內(nèi)完全加入利妥昔單抗溶液，注意避免氣 泡的產(chǎn)生。
6. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（2)中，利妥昔單抗與吲哚菁綠的偶聯(lián)反應(yīng)式如下： 利安昔單抗-賴氣酸ε-氣基+呵噪青綠-含硫活性基團(tuán)引噪青綠-利安昔單抗偶聯(lián)物 中性
7. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（2)中，采用電磁攪拌器振蕩混勻反應(yīng)，時間為5分鐘。
8. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（2)中，所述混合溶液中利妥昔單抗和吲哚菁綠的質(zhì)量比為4~32:1，其 中，利妥昔單抗的質(zhì)量濃度為5mg/ml~8. 89mg/ml。
9. 如權(quán)利要求7所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法， 其特征是：步驟（3)中，所述半透膜的直徑為22mm，截留分子量為4000-6000道爾頓。
10. 如權(quán)利要求1至9任一所述的乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑的制備方法所制得的偶聯(lián) 反應(yīng)物剛噪菁綠-利受昔單抗。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳腺癌前哨淋巴結(jié)示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗的制備方法，將吲哚菁綠溶液緩慢滴入利妥昔單抗溶液中，迅速振蕩混勻反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)后將裝有偶聯(lián)反應(yīng)物的離心管進(jìn)行離心沉淀，觀察有無沉淀生成，若有沉淀生成，則去除離心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；將透析袋浸入滅菌注射用水的透析液中透析，吲哚菁綠經(jīng)過偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合到利妥昔單抗上，制成吲哚菁綠-利妥昔單抗結(jié)合的新型示蹤劑。該制備方法簡單、安全、無輻射，制得的吲哚菁綠-利妥昔單抗能滿足前哨淋巴結(jié)顯像和定位的要求。
【IPC分類】A61K49-00
【公開號】CN104740652
【申請?zhí)枴緾N201510098051
【發(fā)明人】王永勝, 叢斌斌, 孫曉, 宋現(xiàn)讓, 楊國仁, 曹曉珊, 田崇麟, 張燕, 李盼盼
【申請人】王永勝
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月5日