一種ngr-peg-qd納米材料及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領域，特別涉及一種NGR-PEG-QD納米材料及其制備方法。
【背景技術】
[0002]膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率約為7.2/100, OOOo目前手術切除是治療該疾病最有效的方法，但由于腫瘤全切困難，殘留的腫瘤細胞無限增殖并導致膠質瘤復發(fā)，因此患者預后差，術后平均生存期通常少于14個月。因此對腫瘤細胞進行術前顯影并在手術中實時顯示出腫瘤輪廓以便盡可能有效全切膠質瘤將有助于避免術后復發(fā)，提高患者生存質量。
[0003]眾所周知，構成血腦屏障(blood-brain-barrier，BBB)和血瘤屏障(blood-tumor-barrier，BTB)的腦血管內(nèi)皮細胞與外周組織的血管內(nèi)皮細胞有很大區(qū)別，腦血管內(nèi)皮細胞有連續(xù)的緊密連接、不存在窗孔或孔隙很小，< 50nm(外周腫瘤細胞間隙為380-780nm，最大不超過2 μπι)、缺少胞飲作用等，這一堅固的屏障阻擾了絕大多數(shù)藥物從血液進入腦組織而發(fā)揮其作用。同時，外周血液循環(huán)中的物質或藥物要進入腦組織，除了需歷經(jīng)較長的體循環(huán)，躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞識別、吞噬和破壞，更主要的是還需依靠細胞旁路(被動轉運)和跨細胞途徑(主動轉運)兩種方式穿越血腦血瘤屏障。因此，一種能順利通過體循環(huán)、跨越血腦屏障的生物材料必須要以納米級粒徑作為前提，才能順利通過血腦屏障并靶向膠質瘤細胞。
[0004]量子點(Quantum Dot，QD)是一種能自發(fā)焚光的納米晶體，尺寸限制在納米量級。由于QD具有普通熒光物質無法比擬的光學特性，如熒光強度高，不易碎滅等，將其作為熒光探針用于生物醫(yī)學分子標記和檢測將擁有廣闊的臨床前景。CdSe/ZnS是構成QD的一種化學元素，它的激發(fā)波長范圍極廣，在350-650nm范圍內(nèi)均能被激發(fā)，尤其是在410-500nm范圍內(nèi)可激發(fā)出較強的綠光，且熒光可視濃度遠小于細胞毒性濃度，因而在細胞或活體成像過程中避免了該物質自身帶來的毒性作用。而且將QD進行聚乙二醇(PEG)化后，在很大程度上避免體內(nèi)巨噬細胞對該物質的吞噬，因此能使QD有效進入長循環(huán)并隨血流到達相應部位。
[0005]腫瘤的生長依靠周圍血管中營養(yǎng)物質的供給，由于腫瘤細胞高代謝和無限增殖的特點，導致營養(yǎng)供應不足，腫瘤細胞處于長期缺氧狀態(tài)，使之分泌大量血管生長相關因子，從而促進腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮細胞活化和新生血管的形成。已有文獻報道:腫瘤微環(huán)境中由于VEGF和bFGF等血管生長因子的釋放以及缺氧將活化RAS信號通路并引起其下游P1-3K和ERK激活導致新生血管內(nèi)皮細胞膜上⑶13表達顯著增高，而在正常靜息狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞中⑶13表達陰性。⑶13又名氨基肽酶N，是一種分子量約為150kDa的具有金屬蛋白酶活性的跨膜糖蛋白，由967個氨基酸構成，通過近N端的跨膜螺旋區(qū)固定在細胞膜上。⑶13基因編碼序列定位于染色體15q25_26，基因全長35kb，包含20個外顯子，擁有近端和遠端兩個啟動子。目前已有大量證據(jù)表明CD13在甲狀腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、前列腺癌、等惡性腫瘤中表達顯著升高，并有助于腫瘤細胞生長，侵襲，迀移，粘附，耐藥和血管形成。綜上所述，針對CD13可能對膠質瘤及其腫瘤血管具有雙靶向作用。
[0006]NGR多肽由天門冬氨酸-精氨酸-甘氨酸序列構成，是1998年用噬菌體展示技術篩選而得到的對活化的新生血管具有靶向性的短肽，能與活化的血管內(nèi)皮細胞膜上CD13特異性結合，因此可作為⑶13特異性配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種NGR-PEG-QD納米材料及其制備方法，所述將QD外表包被一層PEG使該納米材料能在長循環(huán)中不被巨噬細胞吞噬而順利通過血液循環(huán)，并將PEG-QD與NGR連接，使其能夠與腫瘤血管上的CD13特異性結合，同時利用QD的納米粒徑使其順利通過BBB或BTB并與膠質瘤細胞膜上的CD13結合，最終依靠量子點自發(fā)熒光的特點靶向膠質瘤及其血管熒光成像。以便能夠在熒光手術顯微鏡視野下確定膠質瘤切除程度及殘留部分，達到手術過程中盡可能全切腫瘤的目的。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0009]一種NGR-PEG-QD納米材料，所述納米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天門冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通過生物素與親和素的連接作用將NGR多肽與PEG-QD連接，即形成所述的NGR-PEG-QD納米材料。
[0010]本發(fā)明的另一目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0011]所述的NGR-PEG-QD納米材料的制備方法，包括以下步驟:
[0012]A) PEG-QD 的制備
[0013]將QD和PEG在避光條件下攪拌12?36h混勻，使PEG通過物理吸附作用，吸附在QD表面，并除去未與QD結合的PEG，即得到純化的PEG-QD ；
[0014]B) NGR-PEG-QD 的制備
[0015]將步驟A)制備得到的PEG-QD與NGR多肽攪拌混勻，所述NGR多肽通過生物素與親和素的連接作用將NGR多肽與PEG-QD連接，并除去未與PEG-QD連接的NGR，即形成純化的NGR-PEG-QD納米材料。
[0016]進一步的，步驟A)中除去未與QD結合的PEG的方法，以及為步驟B)中除去未與PEG-QD連接的NGR的方法，為離心法、透析法，或通過脫鹽柱去除多余的NGR，所述脫鹽柱為NAP_5Column0
[0017]進一步的，所述制備方法還包括對NGR-PEG-QD的無毒篩選處理，所述處理為MTT法。
[0018]進一步的，所述步驟A)中QD與PEG的混合比例為1: 100。
[0019]進一步的，所述步驟B)中PEG-QD與NGR的混合比例為1:6。
[0020]本發(fā)明利用了 NGR的靶向性，其靶向性主要由兩個因素產(chǎn)生:1.⑶13基因中有兩個不同啟動子，即近端啟動子和遠端啟動子，骨髓起源細胞中CD13表達主要源于遠端啟動子，而上皮細胞中CD13表達主要由近端啟動子形成。這兩個不同的啟動子串聯(lián)排列，中間間隔8kb，近端啟動子緊靠⑶13編碼區(qū)，而遠端啟動子在其下游。兩者編碼產(chǎn)生的⑶13中序列存在明顯差異，而NGR僅與近端啟動子所編碼產(chǎn)生的CD13結合；2.腫瘤細胞中近端啟動子出現(xiàn)部分突變，從而轉錄翻譯出的CD13也與正常上皮細胞中CD13在部分序列和空間結構中存在不同，而NGR對近端啟動子突變后產(chǎn)生的CD13蛋白親和力更強。因此將NGR與化療藥物結合后不僅能增加化療藥物結合聚集腫瘤部位殺滅腫瘤細胞的作用，還降低了藥物對機體的毒副作用，因此，本發(fā)明將靶向性應用在臨床腫瘤治療中。
[0021]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術的有益效果是:
[0022]1、本發(fā)明所述的NGR-PEG-QD為納米級，能夠順利通過體循環(huán)、穿過血腦屏障和血瘤屏障，并通過NGR多肽與膠質瘤細胞膜上的CD13特異性結合，通過依靠量子點自發(fā)熒光的特點，靶向膠質瘤及其血管熒光呈現(xiàn)，以便能夠在熒光手術顯微鏡視野下確定膠質瘤切除程度及殘留部分，達到手術過沖中盡可能全切除腫瘤的目的；
[0023]2、本發(fā)明所述的NGR-PEG-QD經(jīng)過無毒篩選，對人體無毒副作用，可供手術時放心使用；
[0024]3、本發(fā)明所述的NGR-PEG-QD納米微粒無創(chuàng)、高效、靶向性，使膠質瘤及其腫瘤血管熒光成像研宄，可改善對該疾病的診斷和治療，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0025]圖1為量子點電鏡檢測不意圖；
[0026]圖2為納米材料焚光強度檢測不意圖；
[0027]圖3為NGR-PEG-QD不同波長下的熒光強度檢測示意圖；
[0028]圖4為緊密連接蛋白表達的電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0029]實施例1
[0030]一種NGR-PEG-QD納米材料，所述納米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天門冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通過生物素與親和素的連接作用將NGR多肽與PEG-QD連接，即形成所述的NGR-PEG-QD納米材料。
[0031]所述生物素與親和素的結合具體為:PEG-QD上修飾了 streptavidin，NGR—端上修飾了 b1tin，主要是通過avidin-b1tin之間的結合，這兩個東西是自然界自發(fā)結合非常強的物質，把它們混在一起就能彼此之間有效結合