一種促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物以及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物以及肺癌細(xì) 胞凋亡的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是一種常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤，近年來(lái)的發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類(lèi)健 康安全的威脅也越來(lái)越大。惡性腫瘤是危害人類(lèi)生命健康的細(xì)胞性疾病，腫瘤細(xì)胞從生物 體內(nèi)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，其形態(tài)、功能、代謝和增殖等都會(huì)發(fā)生變化，可以看作是細(xì) 胞的異常分化導(dǎo)致其具有永生性。
[0003] 水飛薊賓（Silybin)是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取所得的一種天 然黃酮木脂素類(lèi)化合物。水飛薊賓呈黃色粉末，味苦，可溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇， 微溶于氯仿，幾乎不溶于水。其分子式為C 25H22Oltl，摩爾質(zhì)量為482. 12。水飛薊賓臨床上主 要用于治療中毒性及酒精相關(guān)性肝病的治療，還可作為抗氧化食品添加劑。藥理學(xué)研宄表 明，水飛薊賓能夠清除機(jī)體內(nèi)自由基，延緩衰老，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制一氧化氮的產(chǎn)生，減 輕對(duì)組織細(xì)胞的毒素，保護(hù)肝細(xì)胞膜、改善肝功能，降血脂和保護(hù)心肌等作用。孫羿等在《水 飛薊賓對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株5637增殖的抑制作用及其機(jī)制》一文中指出水飛薊賓可抑制人 膀胱癌細(xì)胞株5637的增殖，并能降低凋亡抑制因子Survivin的mRNA表達(dá)。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) 201010238453. X公開(kāi)了水飛薊賓在治療神經(jīng)受損方面的用途。
[0004] 替加氟是氟尿嘧啶的衍生物，在體內(nèi)經(jīng)肝臟活化轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏ざ鹂鼓[瘤作 用，能干擾和阻斷DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，主要作用于S期，是抗嘧啶類(lèi)的細(xì)胞周期特異性 藥物。藥理學(xué)研宄表明，替加氟對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌具有一定的 療效。
[0005] 自從順鉑被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性以來(lái)，鉑類(lèi)抗癌藥物的應(yīng)用和研宄得到了迅速發(fā) 展，臨床上常用的鉑類(lèi)抗癌藥物有順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等。奧沙利鉑為第三代鉑類(lèi)抗癌藥 物，是第一個(gè)顯現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌有效的絡(luò)鉑類(lèi)烷化劑及在體內(nèi)外均有廣譜抗腫瘤活性的鉑類(lèi)抗 癌藥。奧利沙鉑對(duì)大腸癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌及乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞株，包括對(duì)順鉑 和卡鉑耐藥株均有顯著的抑制作用。
[0006] 目前，市場(chǎng)上仍缺少可以顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合 物，并提供了相應(yīng)的肺癌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法。
[0008] 一種促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，包括水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物；所述肺 癌細(xì)胞選自非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549。
[0009] 發(fā)明人對(duì)現(xiàn)有的具有抗癌效果的藥物進(jìn)行了大量篩選和復(fù)配，預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn)： 通過(guò)水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物以一定重量比組合得到的藥物組合物具有良好的肺癌細(xì) 胞抑制效果，且可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。
[0010] 通常情況下，水飛薊賓主要用于肝臟疾病的治療，替加氟主要用于治療消化系癌。 鉑類(lèi)藥物雖然具有較廣泛的抗癌作用，但尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道鉑類(lèi)藥物可與水飛薊賓、替加氟聯(lián) 合作為組合物聯(lián)合使用。替加氟即1_(四氫-2-呋喃基）-5-氟-2, 4 (1H，3H)-嘧啶二酮。
[0011] 優(yōu)選地，所述藥物組合物中，水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物的質(zhì)量比為（1~2): (1~2) ： (0. 5~1) 〇
[0012] 優(yōu)選地，所述藥物組合物中，水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物的質(zhì)量比為2 :2 :1。
[0013] 優(yōu)選地，所述鉑類(lèi)藥物選自卡鉑或奧沙利鉑。
[0014] 優(yōu)選地，所述藥物組合物由水飛薊賓、替加氟、鉑類(lèi)藥物和藥學(xué)上可接受的載體制 得。
[0015] 優(yōu)選地，所述藥物組合物為注射劑。
[0016] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種肺癌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法，包括如下步驟： A) 培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于6孔板中培養(yǎng)； B) 采用所述的藥物組合物對(duì)所述肺癌細(xì)胞進(jìn)行處理； C) 采用不含EDTA的胰酶消化所述肺癌細(xì)胞，并采用含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止對(duì)肺 癌細(xì)胞的消化，將終止消化后的肺癌細(xì)胞進(jìn)行離心，棄除上清液，采用預(yù)冷的PBS緩沖液重 懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)入無(wú)菌的離心管中，離心收集細(xì)胞； D) 加入Binding Buffer重懸，加入Annexin V-FITC后輕輕混勻，避光孵育，再加入PI， 輕輕混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0017] 細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，受內(nèi)在遺傳機(jī)制的控制自動(dòng)結(jié)束 生命的過(guò)程。細(xì)胞凋亡的過(guò)程大致可分為四個(gè)階段：（1)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；（2)凋亡基因激活； (3)凋亡的執(zhí)行；（4)凋亡細(xì)胞的清除。將Annexin V進(jìn)行綠色熒光FITC (異硫氰酸熒光 素）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡 的發(fā)生。碘化丙啶（PI)是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早 期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜在嵌 入細(xì)胞核的雙鏈DNA后釋放紅色熒光。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不 同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供藥物組合物包括水飛薊賓、替 加氟和鉑類(lèi)藥物，具有良好的肺癌細(xì)胞抑制效果，且可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，對(duì)肺癌細(xì) 胞的增殖能力有顯著的協(xié)同抑制作用，尤其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549具有非常好的抑 制效果。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為效果實(shí)施例二中的對(duì)照組流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖。
[0020] 圖2為效果實(shí)施例二中的實(shí)施例一組流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖。
[0021] 圖3為效果實(shí)施例二中的對(duì)比例一組流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0023] 本發(fā)明中，肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，SPF 級(jí)BALB/c-nu小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所使用的試劑均為常規(guī)市售試劑。
[0024] 實(shí)施例一促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其特征在于：包括水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi) 藥物；所述肺癌細(xì)胞選自非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其特征在于：所述藥物組 合物中，水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物的質(zhì)量比為（1~2) :(1~2) :(0. 5~1)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其特征在于：所述藥物組 合物中，水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物的質(zhì)量比為2 :2 :1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其特征在于： 所述鉑類(lèi)藥物選自卡鉑或奧沙利鉑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其特征在于： 由水飛薊賓、替加氟、鉑類(lèi)藥物和藥學(xué)上可接受的載體制得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，其特征在于： 所述藥物組合物為注射劑。
7. -種肺癌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步驟： A) 培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于6孔板中培養(yǎng)； B) 采用權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的藥物組合物對(duì)所述肺癌細(xì)胞進(jìn)行處理； C) 采用不含EDTA的胰酶消化所述肺癌細(xì)胞，并采用含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止對(duì)肺 癌細(xì)胞的消化，將終止消化后的肺癌細(xì)胞進(jìn)行離心，棄除上清液，采用預(yù)冷的PBS緩沖液重 懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)入無(wú)菌的離心管中，離心收集細(xì)胞； D) 加入BindingBuffer重懸，加入AnnexinV-FITC后輕輕混勻，避光孵育，再加入PI， 輕輕混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，包括水飛薊賓、替加氟和鉑類(lèi)藥物；所述肺癌細(xì)胞選自非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549。本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的藥物組合物具有良好的肺癌細(xì)胞抑制效果，且可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。
【IPC分類(lèi)】A61K31-282, A61K31-357, A61P35-00, A61K31-513, C12Q1-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104840463
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510240171
【發(fā)明人】燕啟江
【申請(qǐng)人】廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月13日