一種蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬蛔蟲(chóng){Ascaris suum)是豬體內(nèi)常見(jiàn)的寄生線蟲(chóng)之一，屬于蛔科蛔屬，寄生于豬小腸。豬蛔蟲(chóng)病流行廣泛，極大地危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，尤其是在衛(wèi)生條件差的豬場(chǎng)，感染率甚高。病豬主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育不良，嚴(yán)重者可造成生長(zhǎng)發(fā)育停滯，甚至死亡。而長(zhǎng)期過(guò)度使用抗蠕蟲(chóng)藥物已造成了呈全球性分布的寄生蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題以及動(dòng)物產(chǎn)品及環(huán)境中的藥物殘留問(wèn)題。因此，加快對(duì)豬蛔蟲(chóng)的研宄、尋找有效防治豬蛔蟲(chóng)的新途徑已經(jīng)迫在眉睫。
[0003]MicroRNA (miRNA)是生命體內(nèi)源性長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸的一類(lèi)非編碼小RNA，廣泛存在于真核生物中，通過(guò)與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。具有發(fā)育階段的特異性、時(shí)序性或者組織特異性的表達(dá)特點(diǎn)，其功能主要為從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的水平調(diào)節(jié)個(gè)體生長(zhǎng)及發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)。通過(guò)miRNA抑制劑選擇性地抑制或阻斷某一特定發(fā)育期線蟲(chóng)的發(fā)育，從而減少或阻斷寄生線蟲(chóng)的傳播，這很可能成為防治線蟲(chóng)感染的新思路、新途徑。豬蛔蟲(chóng)物種特異性miRNA有可能成為豬蛔蟲(chóng)免疫預(yù)防或化學(xué)防治的新的“關(guān)鍵”分子，為核酸疫苗制備提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有的抗蠕蟲(chóng)藥物造成的寄生蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題，以及動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境中的藥物殘留問(wèn)題，提供一種蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑。本發(fā)明另一目的在于提供上述蛔蟲(chóng)抑制劑的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供一種蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑，所述抑制劑的核苷酸序列為:UCUACCCGAGAAUCGAACAGUG。
[0006]優(yōu)選地，所述蛔蟲(chóng)為豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述抑制劑在抑制蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和感染性中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述抑制劑在制備抗蛔蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
[0009]優(yōu)選地，所述蛔蟲(chóng)為豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)。
[0010]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種抗蛔蟲(chóng)藥物，所述藥物包括以下核苷酸序列:UCUACCCGAGAAUCGAACAGUG。
[0011]優(yōu)選地，所述蛔蟲(chóng)為豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)。
[0012]本發(fā)明所提供的蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑是一條核苷酸序列，是根據(jù)豬蛔蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育史均表達(dá)的asu-miR-lOOb而發(fā)明，其序列長(zhǎng)度為22nt。本申請(qǐng)人對(duì)豬蛔蟲(chóng)miRNA進(jìn)行深度測(cè)序研宄發(fā)現(xiàn)，asu-miR-100b在豬蛔蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育史均有表達(dá)，因此asu-miR-100b對(duì)豬蛔蟲(chóng)的發(fā)育調(diào)節(jié)是必不可少的。豬蛔蟲(chóng)的感染性幼蟲(chóng)為第三期幼蟲(chóng)，此時(shí)asu-miR-lOOb也表達(dá)，因此asu-miR-lOOb的表達(dá)也可能參與豬蛔蟲(chóng)的感染性調(diào)節(jié)。對(duì)于豬蛔蟲(chóng)第三期幼蟲(chóng)采用asu-miR-lOOb抑制劑可以減少或者抑制asu-miR-100b的表達(dá)，進(jìn)而可能影響豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)生理功能或與感染性相關(guān)的功能，從而將豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)致死或者降低其感染性。此夕卜，鑒于豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)物種的相似性，本發(fā)明所提供的豬蛔蟲(chóng)asu-miR-lOOb抑制劑亦可應(yīng)用于影響人蛔蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育或與其感染性相關(guān)的功能。因此，本發(fā)明豬蛔蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育史都高表達(dá)的asu-miR-100b的抑制劑可用于抗蛔蟲(chóng)感染藥物，特別是抗豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)藥物。
[0013]本申請(qǐng)人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有如下有益效果:由于豬蛔蟲(chóng)的asu-miR-lOOb在豬蛔蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育史均有表達(dá)，具有表達(dá)的穩(wěn)定性；而本發(fā)明豬蛔蟲(chóng)asu-miR-lOOb抑制劑能夠選擇性的抑制或阻斷asu-miR-lOOb的表達(dá)，從而影響豬蛔蟲(chóng)的正常發(fā)育，進(jìn)而將豬蛔蟲(chóng)致死或者降低其感染性。本發(fā)明asu-miR-lOOb抑制劑制備成為抗蛔蟲(chóng)藥物時(shí)，既可以避免傳統(tǒng)抗蠕蟲(chóng)藥物造成的全球性分布的寄生蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題，也不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品或環(huán)境中藥物的殘留。
[0014]本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，asu-miR-100b抑制劑通過(guò)與asuniR-lOOb結(jié)合，顯著降低了 asu-miR-lOOb的豐度，并且顯著影響了豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)的發(fā)育及降低了感染率。因此本發(fā)明可以為防治豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)提供新的方法，為防治豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)藥物的開(kāi)發(fā)提供新的思路。
【附圖說(shuō)明】
[0015]附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1為本發(fā)明的蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑對(duì)豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)感染率的影響(P〈0.05)；
圖2為本發(fā)明的蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑對(duì)豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)長(zhǎng)度的影響(P〈0.05)；
圖3為本發(fā)明的蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑對(duì)豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)寬度的影響(P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。
[0017]實(shí)施例1
本發(fā)明的蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑對(duì)蛔蟲(chóng)抑制效果實(shí)驗(yàn):
1.豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)的制備從自然感染的屠宰豬小腸中收集豬蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)雌蟲(chóng)，解剖取下子宮叉端1/2左右，取出蟲(chóng)卵，將其放入研缽中，用滅菌的PBS液(Na2HPO4.12H209.670g ；KH2PO41.429g ；NaCl
2.125g ;H20500ml)在研缽內(nèi)稍加研磨，加PBS液及1.5%福爾馬林液各清洗、離心兩次，棄上清，將沉淀放入培養(yǎng)皿中，28°C溫箱培養(yǎng)28天。用7.5%的次氯酸脫殼，獲得豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)。
[0018]2.培養(yǎng)基的配制配制含有50%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并在其中加入青霉素(1000U/ml)、鏈霉素(lmg/ml)和兩性霉素(10 μ g/ml )。青霉素、鏈霉素和兩性霉素的加入能夠預(yù)防雜菌生長(zhǎng)。
[0019]3.asu-miR-100b抑制劑及抑制劑對(duì)照溶液的配制 asu-miR-lOOb抑制劑為一段核苷酸序列，是依據(jù)asu-miR-100b序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以特異的與asu-miR-100b序列結(jié)合從而影響其功能發(fā)揮，由Invitrogen公司按照常規(guī)核酸序列合成方法進(jìn)行合成。具體核苷酸序列為:UCUACCCGAGAAUCGAACAGUG。合成的asu-miR-lOOb抑制劑每管為10D，在每管加入250 μ I的DEPC水配置成20 μ M溶液；同樣方法配制抑制劑對(duì)照溶液。包括陰性對(duì)照及空白對(duì)照。陰性對(duì)照采用與本申請(qǐng)核苷酸序列無(wú)關(guān)的任意一段核苷酸序列，空白對(duì)照為等量的生理鹽水。
[0020]4.浸泡三期幼蟲(chóng)
將配置好的培養(yǎng)基分裝到細(xì)胞培養(yǎng)板的3個(gè)孔中，每孔400 μ I。每孔加約50000條上述得到的豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)。再分別加入濃度為40U/ μ I的RNA酶抑制劑(購(gòu)自Thermo公司，貨號(hào)為Ε00381) 200 μ 1，RNA酶抑制劑是為了防止手上汗液等蛋白污染培養(yǎng)基；然后分別加入已經(jīng)配置好的asu-miR-100b抑制劑溶液、陰性對(duì)照(inhibitor negative control)及空白對(duì)照各400 μ I。在含5% 0)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h。培養(yǎng)期間，每天定時(shí)將培養(yǎng)液輕搖均勻。
[0021]5.三期幼蟲(chóng)感染小鼠
八周齡的BALB/c小鼠分成三組，每組十只。將上述三組三期幼蟲(chóng)以約3000條/只的劑量通過(guò)灌胃分別感染這三組小鼠，并對(duì)每組小鼠做好標(biāo)記。
[0022]6.回收豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)
四天后，取上述實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟和肺臟，用貝爾曼法回收豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)，對(duì)各組回收的幼蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)減蟲(chóng)率；并測(cè)量其長(zhǎng)度和寬度以觀測(cè)asu-miR-lOOb抑制劑對(duì)豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。具體結(jié)果參見(jiàn)圖1-3。由圖1-圖3可知，本發(fā)明的抑制劑能夠有效降低豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)的感染率，并且顯著影響了豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。
[0023]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑，其特征在于:所述抑制劑的核苷酸序列為:UCUACCCGAGAAUCGAACAGUG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑，其特征在于:所述蛔蟲(chóng)為豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)。
3.權(quán)利要求1所述的抑制劑在抑制蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和感染性中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的抑制劑在制備抗蛔蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述蛔蟲(chóng)為豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)。
6.—種抗蛔蟲(chóng)藥物，其特征在于:所述藥物包括以下核苷酸序列:UCUACCCGAGAAUCGAACAGUG。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗蛔蟲(chóng)藥物，其特征在于:所述蛔蟲(chóng)為豬蛔蟲(chóng)或人蛔蟲(chóng)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種蛔蟲(chóng)miRNA抑制劑，所述抑制劑的核苷酸序列為：UCUACCCGAGAAUCGAACAGUG。本發(fā)明的抑制劑通過(guò)與asu-miR-100b結(jié)合，顯著降低了asu-miR-100b的豐度，并且顯著影響了豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)的發(fā)育及降低了感染率。本發(fā)明所提供的蛔蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育期均表達(dá)的asu-miR-100b抑制劑可應(yīng)用于影響豬蛔蟲(chóng)和人蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育或與其感染性相關(guān)的功能。
【IPC分類(lèi)】A61P33-10, A61K48-00, A61K31-7088
【公開(kāi)號(hào)】CN104857527
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510207060
【發(fā)明人】徐民俊, 邵長(zhǎng)春, 朱興全, 馮勝勇
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日