-〇_acylated monophosphoryl lipid A) (MPL)(參 見 GB 2220211)，MF59 (Novartis)，AS03 (GlaxoSmithKline)，AS04 (GlaxoSmithKline)，聚 山梨醇酯80(Tween80 ;ICL Americas, Inc.)，咪唑并吡啶化合物（參見國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/ US2007/064857,公布為國(guó)際公開號(hào)W02007/109812)，咪唑并喹喔啉化合物（參見國(guó)際申 請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/064858,公布為國(guó)際公開號(hào)W02007/109813)和皂角苷，如QS21 (參見 Kensil 等，in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(在疫苗設(shè)計(jì)中：亞 基和佐劑方法）（eds. Powell&Newman, Plenum Press, NY, 1995);美國(guó)專利號(hào) 5, 057, 540)。 在一些實(shí)施方式中，佐劑是弗氏佐劑（完全或不完全的）。其他佐劑是水包油乳液（如 藍(lán)稀或花生油），任選地聯(lián)合免疫刺激劑，如單磷酰脂質(zhì)A (參見Stoute等，N. Engl. J. Med. 336,86-91(1997))。另一種佐劑是 CpG (Bioworld Today, 1998 年 11 月 15 日）。
[0138] 5. 6 用途
[0139] 在一種實(shí)施方式中，本文提供了治療受試者中的感染的方法，包括向所述受試者 施用本文描述的生物綴合物或其組合物。在一種【具體實(shí)施方式】中，本文描述了一種用于治 療感染的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的本文描述的生物綴合物或其組合物。
[0140] 在另一種實(shí)施方式中，本文提供了用于在受試者中誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向 所述受試者施用本文描述的生物綴合物或其組合物。在一種【具體實(shí)施方式】中，本文提供了 一種對(duì)本文描述的生物綴合物誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的 本文描述的生物綴合物或其組合物。
[0141] 在一種【具體實(shí)施方式】中，對(duì)其施用生物綴合物或其組合物的受試者受到感染或易 感感染，例如細(xì)菌感染。在另一種【具體實(shí)施方式】中，對(duì)其施用生物綴合物或其組合物的受試 者受到腸道沙門氏菌感染或者易感腸道沙門氏菌的感染。在另一種【具體實(shí)施方式】中，對(duì)其 施用生物綴合物或其組合物的受試者受到傷寒沙門氏菌感染或易感傷寒沙門氏菌的感染。
[0142] 在另一種實(shí)施方式中，本文描述的生物綴合物可以用于產(chǎn)生抗體，該抗體用于例 如診斷和研宄目的，例如，這樣的抗體可用于確定施用包含本文描述的生物綴合物的免疫 原性組合物、或用于治療腸道沙門氏菌感染的任何其他組合物是否導(dǎo)致足以殺滅腸道沙門 氏菌或使其無(wú)效的宿主免疫應(yīng)答（例如，這樣的抗體可以用于血清殺菌測(cè)定）。
[0143] 5. 7 測(cè)定
[0144] 5. 7. 1用于評(píng)估生物綴合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力的測(cè)定
[0145] 可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或本文描述的任何方法來(lái)評(píng)估本文描述的生物 綴合物在能夠與腸道沙門氏菌（S.enterica)的Vi多糖交叉反應(yīng)的受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答 的能力。在一些實(shí)施方式中，本文描述的生物綴合物在能夠與腸道沙門氏菌的Vi多糖交叉 反應(yīng)的受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力可以通過(guò)用本文描述的生物綴合物使受試者（例如， 小鼠）或受試者組免疫并且用對(duì)照（PBS)使額外的受試者（例如，小鼠）或受試者組免疫 進(jìn)行評(píng)估。這樣的受試者可以代表疾病的動(dòng)物模型，例如，傷寒癥的動(dòng)物模型（參見，例如， Libby等，2010, PNAS USA 107 (35): 15589-15594)?？梢噪S后用毒性的腸道沙門氏菌攻擊 所述受試者或受試者組并且可以確定該毒性的腸道沙門氏菌在所述受試者或受試者組中 引起疾病（例如，傷寒癥）的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，如果用對(duì)照免疫的受試者或 受試者組在用腸道沙門氏菌攻擊后患?。ɡ纾瑐Y）而用本文描述的生物綴合物免疫 的受試者或受試者組沒(méi)有患病，則該生物綴合物能夠在能夠與腸道沙門氏菌的Vi多糖交 叉反應(yīng)的受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^(guò)例如免疫測(cè)定（如ELISA)來(lái)測(cè)試本文描述的 生物綴合物誘導(dǎo)與腸道沙門氏菌的Vi多糖交叉反應(yīng)的抗血清的能力。
[0146] 5. 7. 2血清殺菌測(cè)定
[0147] 可以使用血清殺菌測(cè)定（SBA)來(lái)評(píng)估本文描述的生物綴合物在能夠與腸道沙門 氏菌的Vi多糖交叉反應(yīng)的受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。這樣的測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的并 且簡(jiǎn)單地包括產(chǎn)生和分離針對(duì)關(guān)注的靶標(biāo)（例如，腸道沙門氏菌的Vi多糖）的抗體的步 驟，其中通過(guò)向受試者（例如，小鼠）施用激發(fā)出這樣的抗體的化合物。隨后，可以例如通 過(guò)以下來(lái)評(píng)估抗體的殺菌能力：在所述抗體和補(bǔ)充物存在下培養(yǎng)所討論的細(xì)菌（例如，腸 道沙門氏菌），并例如使用標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)方法測(cè)定所述抗體殺滅該細(xì)菌和/或使其無(wú)效 的能力。
[0148] 6.實(shí)施例
[0149] 本實(shí)施例證實(shí)，能夠成功地形成修飾的大腸桿菌0121 0-抗原并且施用包含這樣 的抗原的生物綴合物能夠在與腸道沙門氏菌的Vi多糖交叉反應(yīng)的小鼠中產(chǎn)生抗體。
[0150] 6.1材料和方法
[0151] (a)菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件。
[0152] 本實(shí)施例中描述的菌株和質(zhì)粒列于表1中。質(zhì)粒的構(gòu)建在下文中描述。將大腸 桿菌株在37°C在LB培養(yǎng)基（每升IOg胰蛋白胨、5g酵母膏和5g NaCl)或LB瓊脂（每升 添加了 15g瓊脂的LB培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。使傷寒沙門氏菌BRD948在37°C在補(bǔ)充了 l%v/ V Aro-mix (在IOml ddH20中的40mg L-苯丙氛酸、40mg L-色氛酸、IOmg 4_氛基苯甲酸和 1〇11^2,3-二羥基苯甲酸）和1%￥八171'-11111(在1〇1111(1(11120中的4〇11^1^-酪氨酸二鈉） 的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如果適當(dāng)，該培養(yǎng)基含有四環(huán)素（20yg mr1)、壯觀霉素（80yg mr1) 或氨芐西林（100 y g mr1)。
[0153] 表1.本研宄中使用的菌株和質(zhì)粒。

[0156] * 哥德堡大學(xué)微生物保藏中心（CultureCollectionUniversityofGStcborg)， 保藏人：瑞典哥德堡E. R. B. Moore教授
[0157] **Coligenetic Stock Center，耶魯大學(xué)，美國(guó)康奈提格州紐黑文
[0158] (b) DNA 操作
[0159] 使用 NucleoSpin Plasmid 或 NucleoBond Xtra Maxi Plus 試劑盒 (Macherey-Nagel)分離質(zhì)粒 DNA。使用 NucleoSpin Tissue 試劑盒（Macherey-Nagel)分 離總?cè)旧wDNA。根據(jù)制造商說(shuō)明使用限制酶（Fermentas)、奸堿性磷酸酶（Fermentas)、 T4DNA 連接酶（Fermentas)和 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（Finnzyme)。使用 NucleoSpin Extract II試劑盒（Macherey-Nagel)，純化PCR和限制片段用于克隆。所有DNA測(cè)序通過(guò) Synergene Biotech GmbH (瑞士）完成并且合成的寡核苷酸在Microsynth AG (瑞士）訂 購(gòu)。
[0160] (C)質(zhì)粒構(gòu)建
[0161] 質(zhì)粒1含有合成的寡核苷酸盒，其形成自退火連接入EcoRI-消化的PLAFRl中的 5' -AATTGGCGCGCCCGGGACTAGTCTTGGG(SEQ ID NO. :1)和 5' -AATTCCCAAGACTAGTCCCGGGCGC GCC (SEQ ID NO. : 2) [Friedman, A. M. , Long, S. R. , Brown, S. E. , Buikema, ff. J. , Ausubel, F. M. : Construction of a broad host range cosmid cloning vector and its use in the genetic analysis of Rhizobium mutants (寬宿主范圍粘?？寺≥d體的構(gòu)建及其在根瘤菌 突變體的遺傳分析中的用途）.Gene 18 (3)，289-296 (1982)]，由此引入獨(dú)特的AscI和SpeI 單個(gè)限制位點(diǎn)。使用引物 5'-AAAGGCGCGCCGCGAAGGTAAAGTCAGCCG(SEQ ID NO. :3)和 5'-AA AACTAGTCAGGAGTGAATTAAGTCAITG(SEQ ID NO. :4)，將大腸桿菌0121 0抗原簇由制備自大腸 桿菌0121 (CCUG 11422)的基因組DNA擴(kuò)增。將該消化的PCR片段連接到Ascl/Spel消化 的質(zhì)粒1中，產(chǎn)生質(zhì)粒2。質(zhì)粒3通過(guò)如下構(gòu)建：將形成自退火5' -TGAATGAATGAACTAGTTCA ATCACTCA(SEQ ID NO. :5)和 5' -TGAGTGAITGAACTAGITCAITCAITCA(SEQ ID NO. :6)的合成 寡核苷酸盒插入到單個(gè)限制位點(diǎn)PmlI中，中斷wbqG的開放閱讀框。
[0162] (d) LPS 分析
[0163] 收集相當(dāng)于A_為1的過(guò)夜培養(yǎng)物的細(xì)胞，再懸浮在100 y 1的根據(jù)Laemmli的 Ix 樣品緩沖液[Laemmli, U. K.，F(xiàn)avre, M. :Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events( 菌體 T4. I. DNA 包裝事件的頭部的突變）.J Mol Biol 80 (4)，575-599 (1973)]并在 95 °C 煮 10 分鐘。加入蛋白酶 K (Fermentas)至 200 y g/ ml的最終濃度，并將樣品在60°C溫育1小時(shí)。根據(jù)制造商說(shuō)明，使用來(lái)自Invitrogen 的12 % BisTris NuPAGE凝膠和MES運(yùn)行緩沖液，通過(guò)SDS-PAGE分離來(lái)自蛋白酶 K-消化的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物的LPS分子物質(zhì)。通過(guò)用銀染色使LPS可視化[Tsai, C. M. ,Frasch, C. E. :A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels(用于檢測(cè)聚酰胺凝膠中的脂多糖的靈敏銀染色）.Anal Biochem 119(1)，115-119(1982)]。0抗原的免疫學(xué)性質(zhì)使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析。大腸 桿菌0121 0抗原的結(jié)構(gòu)與痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae)類型70抗原相同，因此 抗-痢疾志賀氏菌類型7血清購(gòu)自Reagensia AB (瑞典）并以1:100稀釋液使用。抗-Vi 多克隆抗體購(gòu)自Murex Biotech Ltd(英格蘭）并以1:100稀釋液使用。
[0164] (e) ^^一異戊二烯焦磷酸（Und-PP)-連接的0抗原聚糖的分析
[0165] 0抗原聚糖在大腸桿菌菌株SCM6中分析，該菌株在多個(gè)多糖基因簇中含有染色體 缺失。〇多糖通過(guò)用編碼〇抗原簇的質(zhì)粒和WecA表達(dá)質(zhì)粒（質(zhì)粒4)轉(zhuǎn)化SCM6細(xì)胞而表 達(dá)。用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的SCM6用作陰性對(duì)照以鑒別0抗原特異信號(hào)。菌株在搖瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。 收獲相當(dāng)于A_為400的細(xì)胞，用0. 9% NaCl洗滌一次，并凍干。通過(guò)重復(fù)的多輪渦旋和冰 上溫育10分鐘，用95%甲醇（MeOH)從干燥的細(xì)胞中提取脂質(zhì)。通過(guò)添加CldH 2O將該懸浮液 轉(zhuǎn)換成85% MeOH并在規(guī)則渦旋的同時(shí)再溫育10分鐘。在離心后，收集上清并且提取物在 N2下干燥。將干燥的脂質(zhì)溶解在含有IOmM磷酸四丁銨（TBAP)的1:1甲醇/水（M/W)中并 經(jīng)過(guò) C18SepPak柱（Waters Corp.，Milford, MA)。該柱用 10ml MeOH調(diào)節(jié)，接著用以 1:1M/W 的IOmllOmM TBAP調(diào)節(jié)。在上樣后，用1:1M/W的IOml IOmM TBAP洗滌該柱并用5ml MeOH 接著用5ml 10:10:3氯仿/甲醇/水（C/M/W)洗脫。合并的洗脫流分在隊(duì)下干燥。
[0166]根據(jù) Glover 等[Glover, K. J.，Weerapana，E.，Imperiali，B. : In vitro assembly of the undecaprenyIpyrophosphate-1 inked heptasaccharide for prokaryotic N-Iinked glycosylation (用于原核N-連接的糖基化的^^一異戊二稀焦磷酸-連接的七 糖的體外組裝）.proc Natl Acad Sci U S A 102(40)，14255-14259(2005)]，通過(guò)將在2ml IM三氟乙酸（TFA)中的干燥樣品溶解在50%正丙醇中并加熱至50°C達(dá)15分鐘來(lái)水解脂質(zhì) 樣品。水解的樣品在N 2下干燥，溶解在4ml 3:48:47C/M/W中并經(jīng)過(guò)C 18S印Pak柱（Waters Corp. ,Milford, MA)以從水解的聚糖分離脂質(zhì)。該柱用10ml MeOH調(diào)節(jié)，接著用IOml 3:48:47C/M/W平衡。將樣品上樣至柱并收集流出物（flow-through)。用4ml 3:48:47C/M/ W洗滌柱并且利用SpeedVac干燥合并的流出流分。
[0167]根據(jù) Bigge 等[131886，]\〇.，？&七61，1'.?.，131'11。6，]\六.，6〇111(1;[叫，？. N. , Charles, S. M. , Parekh, R. B. :Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid(聚糖使用 2_ 氨基 苯甲酰胺和鄰氨基苯甲酸的非選擇性和有效焚光標(biāo)記）.Analytical biochemistry 230 (2)，229-238 (1995)]，用2-氨基苯甲酰胺（2AB)標(biāo)記干燥的樣品。使用如在 Merry 等[Merry, A. H.，Neville, D. C.，Royle，L.，Matthews, B.，Harvey, D. J.，Dwek，R. A. , Rudd, P. M. : Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled 0-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis (通過(guò)肼解釋放自糖蛋白的完整2-氨基苯甲 酰胺-標(biāo)記的 0_ 聚糖的回收）?Analytical biochemistry304 (1),91-99 (2002)]中描 述的紙片法（paper disk method)，進(jìn)行聚糖清理。根據(jù) Royle 等[1?0716，]^.，]\&11:1：11，1'. S. , Hart, E. , Langridge, J. I. , Merry, A. H. , Murphy, N. , Harvey, D. J. , Dwek, R. A. , Rudd, P. M. :An analytical and structural database provides a strategy for sequencing 〇-glycans from microgram quantities of glycoproteins (分析和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)提 供用于對(duì)來(lái)自微克量的糖蛋白的〇-聚糖測(cè)序的策略）.Analytical biochemistry 304 (I)，70-90 (2002)]，但改變?yōu)槿軇┫到y(tǒng)，使用GlycoS印N正相柱，通過(guò)HPLC進(jìn)行2-AB 標(biāo)記的聚糖的分離。溶劑A:在80%乙腈中的IOmM甲酸銨pH 4.4。溶劑B :在40%乙腈中 的30mM甲酸銨pH 4.4。溶劑(：：0.5%甲酸。柱溫度為30°〇并且248-標(biāo)記的聚糖通過(guò)熒 光檢測(cè)（人ex = 330nm,人em = 420nm)。梯度條件：在160分鐘內(nèi)100 % A至100 % B的線 性梯度，流速為0. 4ml HiirT1，接著2分鐘100% B至100% C，在2分鐘內(nèi)恢復(fù)至100% A并 以100% A在Iml HiirT1流速運(yùn)行15分鐘，然后恢復(fù)至0. 4ml min 4達(dá)5分鐘。將樣品注入 到 CldH2O 中。
[0168] 為了鑒別0抗原特異性聚糖，從獲自含有0抗原簇的細(xì)胞的痕跡減去來(lái)自帶有空 白質(zhì)粒對(duì)照的細(xì)胞的2AB聚糖分布圖。收集0抗原特異性峰并且2AB聚糖在MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF系統(tǒng)（Waters Corp.，Milford, MA)上進(jìn)行分