一種高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法及其抗氧化作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到一種從麥飯石中 提取高濃度硒的方法，并研究了此高濃度硒的麥飯石濃縮液對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù) 作用研究。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease, AD)最顯著的神經(jīng)病理學(xué)特征是：在大腦 皮層和海馬區(qū)域出現(xiàn)細(xì)胞外老年斑（SP)、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFThAP是老年斑的主 要組成成分，在AD患者腦中廣泛沉積，在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。氧化應(yīng)激損 傷是Αβ神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一，研究發(fā)現(xiàn)微摩爾質(zhì)量濃度的Αβ可引起體外培養(yǎng)的神 經(jīng)元過(guò)氧化氫（H 2O2)生成增多，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡。H2O2介導(dǎo)了 Αβ的神經(jīng)毒性。 在研究防治AD的藥物過(guò)程中，H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型是常用的細(xì)胞模型之一。
[0003] AD的具體病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，但其發(fā)病率，除了表現(xiàn)出家族性特征，即 與遺傳因素有關(guān)外，越來(lái)越多的研究表明，還與體內(nèi)微量元素的代謝異常以及一些神經(jīng)毒 性金屬元素在人體中的累積有著密切關(guān)系。研究表明，補(bǔ)充Se對(duì)AD是有益的，如：Se可以 有效的阻止AD大鼠的認(rèn)知能力下降以及氧化損傷；Se可特異性激活使AD大鼠的PP2A磷 酸酶，使磷酸化Tau蛋白含量降低，改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；Se還可以減緩AD大鼠 Tau蛋白的病理學(xué)特征、神經(jīng)變性以及功能缺陷。根據(jù)法國(guó)科學(xué)家Bertrand的"最適營(yíng)養(yǎng) 濃度定律":微量元素同其他元素一樣，受體內(nèi)平衡機(jī)制的調(diào)節(jié)和控制，攝入過(guò)量和不足均 會(huì)所引起不良后果；而且某種元素在體內(nèi)的失衡必將影響到其他元素的生理功能，因此，調(diào) 節(jié)體內(nèi)某種已失衡的元素時(shí)，也要盡可能使其他元素處于最適營(yíng)養(yǎng)濃度范圍。
[0004] 麥飯石在我國(guó)多個(gè)地區(qū)存在，因產(chǎn)地不同，其成分略有差異。不同產(chǎn)地麥飯石的溶 出微量元素及含量在相同條件下不盡相同，即使同一產(chǎn)地的麥飯石在不同條件下溶出的元 素含量也不相同。我們研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)100目的IOg桂平麥飯石浸入常溫下的100mL去離子 水中30分鐘后，再在80°C條件下回流濃縮60分鐘，所得的各元素濃度（ppm)經(jīng)ICP-AES測(cè) 定為 Fe 0· 068, Cu0.0 22, Mn 0· 049, Zn 0· 037, Se 0· 015,以及 Al 0· 001。我們研究發(fā)現(xiàn)， 此麥飯石濃縮液具有防治AD的潛在可能，原因是其能調(diào)節(jié)AD大鼠海馬區(qū)內(nèi)已異常變化的 Al、Fe、Cu、Mn、Zn和Se含量，使其盡可能的達(dá)到正常對(duì)照組水平。
[0005] 為提高麥飯石濃縮液中硒的濃度，采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法得到了最佳實(shí)驗(yàn)條件；并 研究此濃縮液對(duì)PC12細(xì)胞是否具有抗氧化作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] (I) ICP-AES測(cè)定麥飯石水浸液中Se含量結(jié)果如下表：
[0007]
[0008] 結(jié)果分析表明，Se的最佳溶出條件為：麥飯石粒度10目，濃度15(以麥飯石質(zhì)量 除以水的質(zhì)量表示），常溫浸泡時(shí)間60min，加熱溫度70°C，加熱時(shí)間20min，pH值6. 00。此 條件下各元素的濃度（ppm)為：Fe 0.099, Cu 0.035, Mn 0.051，Zn 0.019, Se 0.028, Al 0. 000〇
[0009] (2)當(dāng)H2O2濃度超過(guò)50 μ M，或作用時(shí)間延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞存活率逐漸降低（如圖 1，2)，而LDH釋放量逐漸增加（如圖4,5)。100μΜ H2O2處理PC12細(xì)胞24h，細(xì)胞存活率 明顯下降，而LDH釋放量增加。不同濃度的麥飯石濃縮液預(yù)孵育PC12細(xì)胞12h后，再加入 100 μ MH2O2共同作用24h，可明顯減輕細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率（如圖3)，并降低LDH釋放 量（如圖6)。100μΜ H2O2作用于PC12細(xì)胞4h，可明顯降低SOD和GSH-Px活力，增加 MDA 含量（如圖7,8,9)，不同濃度的麥飯石濃縮液預(yù)孵育PC12細(xì)胞12h后，再加入100 μ M H2O2 共同作用24h，可顯著提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量（如圖7,8,9)。因此，高濃度 硒的麥飯石濃縮液可以有效的拮抗H 2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1不同濃度H2O2作用PC12細(xì)胞24h量效圖，n = 5,與ΟμΜ H2O2比較， *Ρ < 0. 05)
[0011] 圖210(^]?!1202處理？(：12細(xì)胞存活率時(shí)效圖（1±^，11 = 5，與011比較，樸<0.05)
[0012] 圖3麥飯石對(duì)H2O2 (100 μ M，24h)損傷PC12細(xì)胞存活率的影響（[±5, η = 5,與對(duì) 照組比較*Ρ < 0· 01，與H2O2組比較#P < 0· 05)
[0013] 圖4不同濃度H2O2作用PC12細(xì)胞24h量效圖G±s，n = 5,與OyM H2O2比較， *Ρ < 0. 05
[0014] 圖5100μΜ H2O2對(duì)PC12細(xì)胞LDH釋放量時(shí)效圖（?±_?，η = 5,與Oh比較，*Ρ < 0. 05)
[0015] 圖6麥飯石對(duì)H202100 yM，24h損傷PC12細(xì)胞LDH釋放量的影響G±_y，n = 5,與 對(duì)照組比較*P < 〇· 01，與H2O2組比較#P < 0· 05)
[0016] 圖7麥飯石對(duì)!1202 (10(^厘，411)損傷的？(：12細(xì)胞300的影響（[±:?，11 = 5，與對(duì) 照組比較*P < 0· 01，與H2O2組比較#P < 0· 05)
[0017] 圖8麥飯石對(duì)H202(100 yM，4h)損傷的PC12細(xì)胞GSH-Px的影響（[±_?，η = 5,與 對(duì)照組比較*Ρ < 0· 01，與H2O2組比較#P < 0· 05)
[0018] 圖9麥飯石對(duì)!1202 (10(^厘，411)損傷的？(：12細(xì)胞1^的影響（[±1?,11 = 5，與對(duì) 照組比較*Ρ < 0· 01，與H2O2組比較#P < 0· 05)
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為從細(xì)胞水平進(jìn)一步研究麥飯石防治AD的物質(zhì)基礎(chǔ)，我們借助正交設(shè)計(jì)助手II V3. 1軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以Se含量為麥飯石溶出性能指標(biāo)，以粒度、濃度、常溫浸泡時(shí)間、加熱 溫度、加熱時(shí)間及PH值等六個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，研究了麥飯石最佳溶出條件。并以過(guò)氧 化氫（H 2O2)為工具藥，建立AD的氧化應(yīng)激模型。觀察高硒麥飯石濃縮液的保護(hù)作用。具體 實(shí)施方式如下：
[0020] (1)以Se含量為麥飯石溶出性能指標(biāo)，研究麥飯石最佳溶出條件：
[0021] 用電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP-AES)法測(cè)定麥飯石水浸液中Se含量。以Se含 量為麥飯石溶出性能指標(biāo)，以粒度、濃度、常溫浸泡時(shí)間、加熱溫度、加熱時(shí)間及PH值等六 個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。溶出介質(zhì)為由三重蒸餾水所制備的二次去離子水。借助正交設(shè)計(jì)助 手IIV3. 1軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，正交表選用L25-5-6,即5水平6因素，需做25個(gè)實(shí)驗(yàn)。輸入每個(gè) 實(shí)驗(yàn)的Se含量后，便可得到最佳實(shí)驗(yàn)條件。測(cè)定此條件下麥飯石水浸液中Fe、Cu、Ζη、Μη、 Se和Al含量。本實(shí)驗(yàn)的因素水平表如下：
[0022]
[0023] (2)用不同濃度（25、50、100、200、400μΜ)的 H2O2 處理 PC12 細(xì)胞 24h，100ymol/L H2O2處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間（3、6、12、24及48h)，建立細(xì)胞損傷模型。用低濃度（原高硒 麥飯石濃縮液稀釋100倍）、中濃度（原高硒麥飯石濃縮液稀釋10倍）、高濃度（原高硒麥 飯石濃縮液）的麥飯石濃縮液預(yù)孵育PC12細(xì)胞12h后，再加入100 μ mol/L H2O2共同作用 24h以探討麥飯石的保護(hù)作用。用MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率，用 乳酸脫氫酶（LDH)測(cè)試盒檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH)漏出率；用超氧化物歧化酶（SOD)測(cè)試盒 測(cè)定SOD活力，用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX)測(cè)試盒測(cè)定GSH-PX活力，用丙二醛（MDA) 測(cè)試盒測(cè)定MDA含量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法及其抗氧化作用，其特征在于：以Se含量為 麥飯石溶出性能指標(biāo)，以粒度、濃度、常溫浸泡時(shí)間、加熱溫度、加熱時(shí)間及PH值等六個(gè)因 素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)；得到最佳實(shí)驗(yàn)條件為：麥飯石粒度10目，濃度15 (以麥飯石質(zhì)量除以水 的質(zhì)量表示），常溫浸泡時(shí)間60min，加熱溫度70°C，加熱時(shí)間20min，pH值6. 00 ;此條件下 各元素的濃度（ppm)為：Fe0? 099,Cu0.035，Mn0.051，Zn0.019,Se0.028,Al0?000;并 研究了此麥飯石濃縮液對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示不同濃度的麥飯石濃 縮液可明顯提高細(xì)胞存活率，并降低LDH釋放量；可顯著提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA 含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法，其特征在于所用的麥飯 石采自廣西桂平市西山鎮(zhèn)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法，其特征在于充分考慮多 因素對(duì)麥飯石微量元素溶出的影響，包括麥飯石粒度、濃度、常溫浸泡時(shí)間、加熱溫度、加熱 時(shí)間及PH值等六個(gè)因素。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法，其特征在于采用正交設(shè) 計(jì)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，正交表選用L25-5-6,即5水平6因素，需做25個(gè)實(shí)驗(yàn)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法，其特征在于Se的最佳 溶出條件為：麥飯石粒度10目，濃度15 (以麥飯石質(zhì)量除以水的質(zhì)量表示），常溫浸泡時(shí)間 60min，加熱溫度70°C，加熱時(shí)間20min，pH值6. 00 ;此條件下各元素的濃度（ppm)如下：Fe 0. 099,Cu0. 035,Mn0. 051,Zn0. 019,Se0. 028,Al0.000。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法，其特征在于各元素的濃 度利用ICP-AES分析儀進(jìn)行測(cè)定。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用， 其特征在于用MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率，用乳酸脫氫酶（LDH) 測(cè)試盒檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH)漏出率；用超氧化物歧化酶（SOD)測(cè)試盒測(cè)定SOD活力，用谷 胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX)測(cè)試盒測(cè)定GSH-PX活力，用丙二醛（MDA)測(cè)試盒測(cè)定MDA含 量。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用， 其特征在于不同濃度的麥飯石濃縮液可明顯提高細(xì)胞存活率，并降低LDH釋放量；可顯著 提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高濃度硒麥飯石濃縮液對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用， 其特征在于高濃度硒的麥飯石濃縮液可有效地拮抗H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高濃度硒麥飯石濃縮液的提取方法及其抗氧化作用，屬于化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域。為提高麥飯石濃縮液中硒的濃度，采用正交實(shí)驗(yàn)得到了最佳實(shí)驗(yàn)條件：粒度10目，濃度15(以麥飯石質(zhì)量除以水的質(zhì)量表示)，常溫浸泡時(shí)間60min，加熱溫度70℃，加熱時(shí)間20min，pH值6。此條件下濃縮液各元素濃度(ppm)為：Fe 0.099，Cu0.035，Mn 0.051，Zn 0.019，Se 0.028，Al 0.000。此濃縮液可明顯提高PC12細(xì)胞存活率，降低LDH釋放量；并可顯著提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量。此濃縮液對(duì)PC12細(xì)胞具有抗氧化作用。
【IPC分類】A61K33/04, A61K33/34, A61P39/06, C12Q1/02, A61P25/28
【公開號(hào)】CN104922150
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410106738
【發(fā)明人】蔣凌風(fēng), 廖海琳
【申請(qǐng)人】廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2014年3月21日