刺芒柄花素的醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥食品保健品領(lǐng)域，特別是涉及一種異黃酮類化合物的用途及其相 關(guān)廣品。
【背景技術(shù)】
[0002] 皰疹病毒（Herpesviruses)是群中等小的雙股DNA病毒，有100以上成員，因代表 種--單純皰疹病毒能引起匐行性皰疹而得名。根據(jù)其理化性質(zhì)分a、PY三個(gè)亞科a 皰疹病毒(如單純皰疹病毒、水痘一帶狀皰疹病毒）增殖速度快，引起細(xì)胞病變。3皰疹病 毒(如巨細(xì)胞病毒)，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，感染細(xì)胞形成巨細(xì)胞。Y皰疹病毒(如EB病毒)，感染的靶 細(xì)胞是淋巴樣細(xì)胞，可引起淋巴增生。皰疹病毒感染的宿主范圍廣泛，可感染人類和其他脊 椎動(dòng)物。
[0003] 刺芒柄花素來源于豆科植物紅車軸草（TrifoliumPratenseL)的花序及帶花枝 葉。據(jù)報(bào)道，其具有抗癌作用，可防治乳腺癌、前列腺癌以及結(jié)腸癌；雌激素作用，能增加小 鼠等動(dòng)物子宮的重量，但作用不及同類的異黃酮染料木素(金雀異黃素）和大豆黃素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的旨在提供一種刺芒柄花素的新用途及其相關(guān)產(chǎn)品。
[0005]具體地說，本發(fā)明的第一方面是提供了刺芒柄花素在制備預(yù)防或治療皰疹病毒感 染的藥物中的應(yīng)用。
[0006] 在一優(yōu)選例中，所述的刺芒柄花素是作為唯一的活性成分應(yīng)用于預(yù)防或治療皰疹 病毒感染的藥物的制備中。
[0007] 本發(fā)明的第二方面是提供了一種防治皰疹病毒感染的藥物組合物，其特征在于， 它含有有效量的刺芒柄花素。
[0008] 本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明的問世部分是基于這樣一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)：刺芒柄花素可以顯著抑制皰疹病毒 的生長(zhǎng)。因此，刺芒柄花素有望開發(fā)成為一種可預(yù)防或者治療皰疹病毒感染的藥物。
[0010] 進(jìn)而，本發(fā)明的第一方面是提供了刺芒柄花素在制備預(yù)防或治療皰疹病毒感染的 藥物中的應(yīng)用。
[0011] 較優(yōu)選地，所述的刺芒柄花素是作為唯一的活性成分應(yīng)用于預(yù)防或治療皰疹病毒 感染的藥物的制備中。
[0012] 本發(fā)明的第二方面是提供了一種防治皰疹病毒感染的藥物組合物，它含有有效量 的刺芒柄花素。
[0013]如本發(fā)明所用，本發(fā)明的刺芒柄花素（Formononetin)別名7-羥基-4'-甲氧異黃 酮、7-羥基-3- (4-甲氧基苯基）色酮，分子式C16H1204,分子量268. 26,CAS號(hào)：485-72-3， 其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
[0015]如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，本發(fā)明的刺芒柄花素可通過商業(yè)途徑購買獲得或 通過化學(xué)方法合成（J.Agric.FoodChem. .EN; 9. 1994,42, 1869-1871)，其亦可用本領(lǐng)域的 常規(guī)方法從豆科植物紅車軸草（TrifoliumPratenseL)中提取獲得。其純度均符合藥用 標(biāo)準(zhǔn)。
[0016] 本發(fā)明的刺芒柄花素可以單獨(dú)使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包 括作為活性成分的本發(fā)明的刺芒柄花素及可藥用載體。較佳地，本發(fā)明的藥物組合物含有 0. 1~99. 9%重量百分比的作為活性成分的本發(fā)明的刺芒柄花素。"可藥用載體"不會(huì)破壞 本發(fā)明的刺芒柄花素的藥學(xué)活性，同時(shí)其有效用量，即能發(fā)揮藥物載體作用時(shí)的用量對(duì)人 體無毒。
[0017] 所述可藥用載體包括但不限于：軟磷脂、硬脂酸鋁、氧化鋁、離子交換材料、自乳化 藥物傳遞系統(tǒng)、吐溫或其他表面活化劑、血清蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、 水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅酸鎂、飽和脂肪酸 部分甘油酯混合物等。
[0018] 其他常用的藥物輔料如粘合劑(如微晶纖維素)、填充劑(如淀粉、葡萄糖、無水乳 糖和乳糖珠粒)、崩解劑(如交聯(lián)PVP、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙 基纖維素)、潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂）以及吸收促進(jìn)劑、吸附載體、香味劑、甜味劑、賦形劑、稀釋 齊II、潤(rùn)濕劑等。
[0019] 本發(fā)明的刺芒柄花素以及其藥物組合物可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備并可以通過腸 道或非腸道或局部途徑給藥。口服制劑包括膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹 齊IJ、膏劑等；非腸道給藥制劑包括注射液等；局部給藥制劑包括霜?jiǎng)①N劑、軟膏劑、噴霧劑 等。優(yōu)選為口服制劑。
[0020] 本發(fā)明的刺芒柄花素以及其藥物組合物的給藥途徑可以為口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌 肉或皮下、皮膚粘膜、靜脈、尿道、陰道等。
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按 重量計(jì)。
[0022] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0023] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0024] 實(shí)施例1刺芒柄花素的細(xì)胞毒性試驗(yàn)和病毒抑制試驗(yàn)
[0025] 1. 1.細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT法）：
[0026]【實(shí)驗(yàn)材料】
[0027] 非洲綠猴腎細(xì)胞（vero)購自ATCC公司。細(xì)胞于含10%胎牛血清（Gibco)的DMEM (Gibco)培養(yǎng)基中，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。
[0028]MTT為購自生工生物公司，DMS0購自國(guó)藥試劑公司。
[0029]【實(shí)驗(yàn)方法】
[0030] 刺芒柄花素對(duì)vero細(xì)胞毒性作用通過MTT法測(cè)得。具體步驟如下：
[0031] 1.樣品制備：將刺芒柄花素溶解于二甲亞砜中，得到濃度為50mM的溶液。
[0032] 2.細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染 色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮密度至2X105細(xì)胞/mL。
[0033] 3.在平底96孔板中，每孔加入100ill細(xì)胞，每孔中細(xì)胞總數(shù)為2X104。于37°C、 5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
[0034] 4.吸去每孔的培養(yǎng)基，每孔不同濃度的樣品，使終濃度為100、50、25、12. 5iiM。每 濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔200iU，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組，陽性藥物對(duì)照組（ACV)、DMS0溶劑組及 DMEM溶劑作為背景。
[0035] 5.將加藥的細(xì)胞在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0036] 6.每天觀察并記錄細(xì)胞毒性。培養(yǎng)72h后，每孔加入20iil5mg/mLMTT溶液，繼續(xù) 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，加入150iiLDMS0。
[0037] 在570/650nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
[0038] 8.根據(jù)光吸收值計(jì)算細(xì)胞相對(duì)抑制率。計(jì)算公式如下：
[0039] 抑制率=(A細(xì)胞組一A藥物組）/ (A細(xì)胞組一A調(diào)零組）X100%
[0040] 9.通過Excel軟件計(jì)算刺芒柄花素對(duì)細(xì)胞毒性作用的CC5(I。
[0041]【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
[0042] 刺芒柄花素對(duì)vero細(xì)胞毒性作用體外試驗(yàn)結(jié)果表明：刺芒柄花素的CC5(I>200iiM。
[0043] 1. 2.病毒抑制試驗(yàn)（MTT法）：
[0044]【實(shí)驗(yàn)材料】
[0045] 非洲綠猴腎細(xì)胞（vero)購自ATCC公司。單純皰疹I(lǐng)型（HSV-l)KOS株購自ATCC 公司。細(xì)胞于含10%胎牛血清（Gibco)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中，在371：、5%0)2條件下培 養(yǎng)。
[0046] 結(jié)晶紫購自生工生物公司，甲醇購自國(guó)藥試劑公司。
[0047]【實(shí)驗(yàn)方法】
[0048] 刺芒柄花素對(duì)vero細(xì)胞抗HSV-1抑制作用通過MTT法測(cè)得。具體步驟如下：
[0049]1.樣品制備：將刺芒柄花素分別溶解于二甲亞砜中，得到濃度為50mM的溶液。
[0050] 2.細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染 色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮密度至2X105細(xì)胞/mL。
[0051] 3.在平底96孔板中，每孔加入100iiL細(xì)胞，每孔中細(xì)胞總數(shù)為2X104。于37°C、 5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
[0052] 4.吸去每孔的培養(yǎng)基，每孔加入病毒液100TCID50/孔和不同濃度（以最大無毒濃 度下）的刺芒柄花素樣品混合后加入vero細(xì)胞中。每濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔200yL，同時(shí)設(shè) 正常細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組、陽性藥物對(duì)照組（ACV)及DMS0溶劑組。
[0053] 5.將加藥和病毒的細(xì)胞在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0054] 6.每天觀察CPE，并記錄；顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度（CPE)，以確定刺芒柄花素 對(duì)病毒的抑制作用，記錄方式：〇%細(xì)胞病變?yōu)?一"，〈25%細(xì)胞病變?yōu)? +"，25%~50%細(xì)胞 病變?yōu)?++"，50%~75%細(xì)胞病變?yōu)?+++"，>75%細(xì)胞病變?yōu)?++++"，以出現(xiàn)"一"的最小 濃度為抗病毒活性最佳。
[0055] 7.培養(yǎng)72h后，每孔加入20iiL5mg/mLMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，加入 150iiLDMS0在570/650nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
[0056] 8.根據(jù)光吸收值計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。計(jì)算公式如下：
[0057] 存活率=(藥物組一病毒感染組）/(細(xì)胞組一病毒感染組）X100%
[0058] 9.通過Excel軟件計(jì)算刺芒柄花素對(duì)HSV-1抑制作用的IC5Q。
[0059]【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
[0060] 刺芒柄花素對(duì)HSV-1抑制作用體外試驗(yàn)結(jié)果表明：刺芒柄花素的IC5Q為 16. 633 ±5. 649iiM。
[0061] 治療指數(shù)SI=CC5(I/IC5(I，SI>2表示低毒高效，1〈SI〈2表示高毒低效，SKI表示無效。
[0062]表1刺芒柄花素 CC5。（ iiM)、IC5。（ iiM)及SI值
[0064]由表1可見：刺芒柄花素的毒性較低，SI值較高，具有較好的抗皰疹病毒活性，有 望作為活性成分用于制備抗皰疹病毒藥物制劑，具有藥用前景。
[0065] 本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神 之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對(duì)其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請(qǐng) 所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 刺芒柄花素在制備預(yù)防或治療皰疹病毒感染的藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的刺芒柄花素是作為唯一的活性成分 應(yīng)用于預(yù)防或治療皰疹病毒感染的藥物的制備中。3. -種防治皰疹病毒感染的藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的刺芒柄花素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥保健品學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種刺芒柄花素的醫(yī)藥用途及其產(chǎn)品。本發(fā)明的刺芒柄花素可用于制備防治皰疹病毒感染的藥物。
【IPC分類】A61K31/352, A61P31/22
【公開號(hào)】CN104940185
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410123838
【發(fā)明人】徐宏喜, 劉猛順, 譚紅勝, 韓全斌, 吳蓉, 蔡雙璠
【申請(qǐng)人】上海中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月28日