一種魚類凝集素的抗菌應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種魚類凝集素的殺菌和抗菌應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝集素（lectin)是自然界廣泛存在的一大類非免疫來(lái)源的、無(wú)酶活性的多價(jià)糖 類結(jié)合蛋白，能使細(xì)胞發(fā)生凝集。凝集素結(jié)合的糖主要有甘露糖、葡萄糖和半乳糖。凝集 素與糖以非共價(jià)鍵結(jié)合，結(jié)合力弱而且可逆，與酶和底物或抗原-抗體的反應(yīng)類似。凝集素 與互補(bǔ)大分子形成沉淀或使細(xì)胞凝集，所以每一個(gè)凝集素分子必須至少具有二個(gè)結(jié)合糖的 位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)適合一個(gè)糖或一個(gè)寡糖的幾個(gè)糖單元的互補(bǔ)分子。凝集素主要由肝臟合 成，某些凝集素可以通過(guò)結(jié)合病原微生物表面的糖基配體而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬作用和 /或通過(guò)凝集素途徑激活補(bǔ)體，在機(jī)體的天然免疫防御中發(fā)揮重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種魚類（半滑舌鰨）凝集素的抗菌應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 一種魚類凝集素的抗菌應(yīng)用，凝集素用于制備殺菌或抗細(xì)菌感染的抑制劑。
[0006] 所述凝集素用于制備魚類殺菌或抗細(xì)菌感染的抑制劑。
[0007] 所述細(xì)菌為哈氏弧菌；魚類指半滑舌鰨。
[0008] 所述凝集素為凝集素重組蛋白。
[0009] 所述凝集素重組蛋白為經(jīng)凝集素在大腸桿菌中表達(dá)獲得重組蛋白。
[0010] 所述重組凝集素蛋白為以半滑舌鰨CDNA為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)與載體pBS-T連接轉(zhuǎn)換后與載體pET259連接，獲得質(zhì)粒pEtPl 13A，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌BL21(DE3)即可表達(dá)重組凝集素。
[0011] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的凝集素能夠殺死魚類病原菌。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的凝集素重組蛋白。其中，泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)； 泳道2,凝集素。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] 凝集素 P113A的重組蛋白的制備
[0016] 1)表達(dá)凝集素 P113A重組蛋白的質(zhì)粒pEtP113A的構(gòu)建：
[0017] 本發(fā)明中的凝集素 Pl 13A的序列已報(bào)道（GenBank access ion numberXP_008316312. 1)。凝集素 P113A具有典型的甘露糖結(jié)合域（氨基酸30-38)。 pEtPl 13A的構(gòu)建如下：以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件 為：94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s，53°C 60s，72°C 60s，5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s，59°C 60s，72°C 60s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克 隆載體pBS-T (購(gòu)自于"天根生化科技有限公司"，北京）于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接混合 液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-乳糖苷和24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pBSP113A。將表達(dá)載體ρΕΤ259 (ρΕΤ259構(gòu) 建過(guò)程參見(jiàn) Hu YH, Zheng ffff, Sun L. Ident ificat ion and molecular analys is of a ferrit in subunit from red drum(Sciaenops ocellatus). Fish Shel lfish Tmmunol 2010 ;28:678-86)用限制性內(nèi)切酶SwaI酶切后回收5. 3kb，同時(shí)將pBSP113A用EcoRV酶切 回收0. 3kb片段。將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn) 化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化 子提取質(zhì)粒，即為pEtP113A。DNA測(cè)序表明pEtP113A含有編碼凝集素 P113A序列的基因。
[0018] 所述LB組成成分按重量百分比計(jì)：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化 鈉，97. 5%蒸餾水。所述 Fl 為 5' -GATATCATGAACCAGAACTCACTCAG-3' ;R1 為 5' -GATATCTTT TTTTTCAGCAGCCCA-3'。
[0019] 2)重組凝集素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0020] 將上述的質(zhì)粒pEtP113A用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自于"天根生化 科技有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小 時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pEtP113A。將BL21/pEtP113A于含有卡那霉素（50ug/ ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)；取Iml過(guò)夜后的培養(yǎng)液，加入100ml新鮮的含有卡那霉 素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至OD 6c?為0.6,加入終 濃度為ImM的IPTG，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動(dòng)培養(yǎng)4-5h，而后以5000g，4°C離心10min， 收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動(dòng)1-2小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。 將菌液以l〇〇〇〇g，4°C離心30min，回收上清。將上清中的蛋白用親和層析柱His Trap HP Columns (購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司）回收純化，將純化的蛋白懸浮于PBS緩沖液。將 純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)（8v/cm電壓下電泳25 - 30min，隨后15v/cm電壓下電泳 2 - 2.5h)，測(cè)定其分子量大?。▍⒁?jiàn)圖1)。質(zhì)譜分析證實(shí)純化的蛋白具有凝集素 P113A 的序列和典型的甘露糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0021] 所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2P04、IOmM Tris和8M尿素，pH8. 0。
[0022] 所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)：0. 8 % NaCl, 0. 02 % KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0· 024% NaH2PO4,余量為水。
[0023] 實(shí)施例2
[0024] 重組凝集素的體外應(yīng)用
[0025] 步驟1)細(xì)菌懸液制備
[0026] 在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈氏弧菌T4至006(|(|為0. 8,然后離心（5000g，4°C，IOmin)，收 集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為104cfu/ml，即為哈氏弧菌懸液。
[0027] 所述哈氏弧菌T4保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 CGMCC，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 1985,保藏日期2007. 3. 22,分類命名為哈氏弧菌（Vibrio harveyi)，保藏單位地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。
[0028] 步驟2)殺菌作用檢測(cè)
[0029] 將上述實(shí)施例1獲得的重組凝集素蛋白在PBS中稀釋至200ug/ml，即為凝集素稀 釋液。將凝集素稀釋液與上述步驟1)的細(xì)菌懸液或PBS (對(duì)照）等體積（1 :1)混合。將混 合液25°C溫育lh，隨后取IOOul混合液涂布于LB平板，28°C溫育48h。計(jì)算平板上出現(xiàn)的 細(xì)菌數(shù)。結(jié)果表明，凝集素組平板上的細(xì)菌數(shù)（97)顯著（P〈0. 01)低于對(duì)照組平板上的細(xì) 菌數(shù)（455)。說(shuō)明重組凝集素蛋白可以殺死細(xì)菌。
[0030] 實(shí)施例3
[0031] 重組凝集素的體內(nèi)應(yīng)用
[0032] 步驟1)凝集素的注射
[0033] 將上述實(shí)施例1獲得的凝集素重組蛋白在PBS中稀釋至200ug/ml，即為凝集素稀 釋液。將10條半滑舌鰨（重約11. 3g)隨機(jī)分為2組，每組5條。將這2組分別命名為A 和B。將A組的每條魚分別注射50ul凝集素稀釋液，將B組（對(duì)照組）的每條魚分別注射 50ul PBSo
[0034] 步驟2)細(xì)菌懸液制備
[0035] 在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈氏弧菌T4至006(|(|為0. 8,然后離心（5000g，4°C，IOmin)，收 集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為106cfu/ml，即為哈氏弧菌懸液。
[0036] 步驟3)攻毒感染
[0037] 在上述步驟1)注射后2h，將A和B組的每條魚注射IOOul上述步驟2)的細(xì)菌懸 液。在細(xì)菌感染后第24h，取A和B組魚腎臟和脾臟組織，在2ml PBS中勻漿，將IOOul勻 漿液涂布于LB平板。將平板置于28°C培養(yǎng)48h，計(jì)算出現(xiàn)的菌落數(shù)。結(jié)果表明A組魚腎臟 和脾臟的細(xì)菌數(shù)（分別為248和559)顯著（P〈0. 01)低于B組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)（分 別為I253和12〇9)
[0038] 這些結(jié)果表明，本發(fā)明的凝集素具有殺菌作用，能夠顯著增強(qiáng)魚類抵抗細(xì)菌侵染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種魚類凝集素的抗菌應(yīng)用，其特征在于：凝集素用于制備殺菌或抗細(xì)菌感染的抑 制劑。2. 按權(quán)利要求1所述的魚類凝集素的抗菌應(yīng)用，其特征在于：所述凝集素為凝集素重 組蛋白。3. 按權(quán)利要求2所述的魚類凝集素的抗菌應(yīng)用，其特征在于：所述凝集素重組蛋白為 經(jīng)凝集素在大腸桿菌中表達(dá)獲得重組蛋白。4. 按權(quán)利要求3所述的魚類凝集素的抗菌應(yīng)用，其特征在于：所述重組凝集素蛋白為 以半滑舌鰨cDNA為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)與載體pBS-T連 接轉(zhuǎn)換后與載體PET259連接，獲得質(zhì)粒pEtP113A，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)即可表達(dá)重組 凝集素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種魚類凝集素的殺菌和抗菌應(yīng)用。凝集素用于制備殺菌或抗細(xì)菌感染的抑制劑。所述凝集素重組蛋白為經(jīng)凝集素在大腸桿菌中表達(dá)獲得重組蛋白。本發(fā)明重組凝集素用于制備殺菌和抗菌制劑，即能顯著增強(qiáng)魚類的抗細(xì)菌能力。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/12, A61K38/36, A61P31/04
【公開號(hào)】CN104984328
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510078492
【發(fā)明人】孫黎, 劉莉
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日