化合物p7c3-a20在制備治療腦缺血疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物的新用途，具體地說(shuō)，涉及化合物P7C3-A20在制備治療腦缺血 疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] P7C3-A20屬于P7C3系列化合物的一種，CAS號(hào)為1235481-90-9,化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
[0004] 它是一種氯丙基咔唑類化合物，口服生物利用度高，可通過(guò)血腦屏障，且在有效劑 量和高劑量下均未表現(xiàn)出毒性。已有國(guó)外報(bào)道發(fā)現(xiàn)P7C3這一類化合物在抑郁癥、老年性疾 病如帕金森（PD)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS)、認(rèn)知退行性疾病、視網(wǎng)膜變性等疾病中 有保護(hù)作用。目前，尚無(wú) P7C3-A20對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供化合物P7C3-A20的新用途。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供了化合物P7C3-A20在制備防治腦缺血損傷的藥物中 的應(yīng)用。
[0007] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的防治腦缺血損傷是指提高大腦皮層神經(jīng) 元的生存率或減少腦梗死面積。
[0008] 在本發(fā)明的第二方面，提供了化合物P7C3-A20在制備藥物中的應(yīng)用，所述的藥物 用于：
[0009] a)提高缺血大腦皮層神經(jīng)元的生存率，或
[0010] b)減少腦缺血的腦梗死面積。
[0011] 在本發(fā)明的第三方面，提供了化合物P7C3-A20在制備防治腦梗死的藥物中的應(yīng) 用。
[0012] 本文中，所述的化合物P7C3-A20結(jié)構(gòu)式為：
[0013]
[0014] 本文中，所述的"腦缺血"是指包括TIA、腦梗塞和煙霧?。ǖ粌H限于此）在內(nèi) 的顱內(nèi)血管病變，其引起的主要病理變化為腦缺血損害。總的來(lái)說(shuō)，所述的"腦缺血"可能 由以下原因引起：①顱內(nèi)、外動(dòng)脈狹窄或閉塞；②腦動(dòng)脈栓塞；③血流動(dòng)力學(xué)因素；④血液 學(xué)因素等。造成腦動(dòng)脈狹窄或閉塞的主要原因是動(dòng)脈粥樣硬化。造成腦動(dòng)脈栓塞的主要 原因包括動(dòng)脈粥樣硬化，以及因患有風(fēng)濕性心瓣膜病、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、先天性心臟 病、人工瓣膜和心臟手術(shù)等形成的栓子隨血流進(jìn)入腦內(nèi)造成的栓塞。血流動(dòng)力學(xué)因素包括 短暫的低血壓引發(fā)的腦缺血，例如心肌梗死、嚴(yán)重心律失常、休克、頸動(dòng)脈竇過(guò)敏、直立性低 血壓、鎖骨下動(dòng)脈盜血綜合征等。血液學(xué)因素包括口服避孕藥物、妊娠、產(chǎn)婦、手術(shù)后和血小 板增多癥引起的血液尚凝狀態(tài)，紅細(xì)胞增多癥、鏡狀細(xì)胞貧血、巨球蛋白血癥引起的黏桐度 增尚所引起的腦缺血。
[0015] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)P7C3-A20可以提高缺氧缺糖模型 (〇⑶模型）中離體培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元的生存率，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)P7C3-A20可以 明顯降低大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的腦梗死面積，這些結(jié)果表明P7C3-A20具有腦缺血保 護(hù)作用，能夠防治腦缺血造成的腦損傷，在制備腦缺血損傷和/或腦梗死相關(guān)藥物方面具 有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明為腦缺血提供了新的藥物研發(fā)方向。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1.神經(jīng)元生存率檢測(cè)結(jié)果。*P〈0. 05vs無(wú) P7C3-A20處理組，N = 6。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] -、方法
[0020] 1、小鼠大腦皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)
[0021] (1)取孕鼠，E15-18天，脫頸椎處死，75%酒精擦拭腹部，剖腹，切取子宮。
[0022] (2)將子宮放置于含雙抗的無(wú)菌去離子水的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房?jī)?nèi)。
[0023] (3)將子宮迅速轉(zhuǎn)移至冰冷的高糖DMEM中，用眼科剪從子宮角處撕開(kāi)子宮，取出 胎鼠，剪刀斷頭，仔細(xì)剝離，取大腦；顯微鏡下分離出大腦皮層，仔細(xì)剝除腦膜和血管。
[0024] (4)將腦組織轉(zhuǎn)入新鮮冰冷的高糖DMEM中，漂洗2次后轉(zhuǎn)移至1 · 5mL EP管中，放 置冰上，用彎剪盡量剪碎腦組織。
[0025] (6)將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)移至小錐形瓶中，加入Accutase酶，錫箱紙封口，37 °C搖床 消化l〇min。
[0026] (7)消化結(jié)束后，加入ImL FBS終止消化，混勻，1000 rpm離心5min，舍棄上清液。
[0027] (8)加入5mL接種培養(yǎng)基，1000 rpm離心5min，舍棄上清液。
[0028] (9)加入少量接種培養(yǎng)基，混勻，200目細(xì)胞篩過(guò)篩，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
[0029] (10)加入接種培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，接種。
[0030] (11)接種后4-6h，根據(jù)細(xì)胞貼壁情況更換成Neurobasal生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
[0031] (12)接種36h后，半量換液，加入阿糖胞苷（終濃度為2. 5 μ g/mL)。
[0032] (13)第5天，全量換液。
[0033] (14)第7天，全量換液，加藥處理或進(jìn)行其他操作。
[0034] 其中，接種培養(yǎng)基：含10% FBS+10%馬血清的高糖DMEM ;Neurobasal生長(zhǎng)培養(yǎng) 基：2% B27添加物，1 %雙抗，25 μ M L-谷氨酸。
[0035] 2、0⑶模型在體外模擬腦缺血
[0036] 待原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元生長(zhǎng)至第7天，棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS清洗兩 次。加入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，給藥組加入溶于二甲基亞砜（DMSO)的P7C3-A20(購(gòu)于上海技毅 生物科技有限公司，CAS號(hào)為1235481-90-9)。P7C3-A20的終濃度為10mM、30mM及l(fā)OOmM， 并將溶劑DMSO的濃度控制在0. 1 %。對(duì)照組則加入0. 1 %的DMS0。將神經(jīng)元放置于三氣培 養(yǎng)箱（含1% 〇2、5% C02、94% N2)中培養(yǎng)12小時(shí)，通過(guò)制造低氧低糖環(huán)境，模擬腦缺血。培 養(yǎng)12小時(shí)后，用CCK-8方法測(cè)神經(jīng)元生存率。CCK-8細(xì)胞活力試劑盒購(gòu)于日本Dojindo公 司，是一種廣泛運(yùn)用的細(xì)胞活力及生存率的檢測(cè)試劑盒。
[0037] 二、結(jié)果
[0038] 結(jié)果見(jiàn)圖1，可以看到OGD大幅度降低了神經(jīng)元的生存率，而P7C3-A20化合物的處 理可顯著減輕OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元的生存率下降（P〈0. 05)。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 一、方法
[0041 ] 用大鼠（Sprague-Dawley大鼠，體重250g左右，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司） 制備永久性腦缺血損傷模型。過(guò)程如下：將大鼠麻醉，打開(kāi)顱骨，直接在目視下將大腦中動(dòng) 脈電凝，導(dǎo)致左側(cè)大腦中動(dòng)脈堵塞。30分鐘后給予大鼠腹腔注射P7C3-A20 (30mg/kg)。復(fù)位 顱骨，縫合皮膚，即成功制備大鼠大腦中動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致的永久性腦缺血模型。大腦中動(dòng)脈堵 塞后24小時(shí)，給予檢測(cè)腦梗死面積。腦梗死體積檢測(cè)采用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（購(gòu) 自Amersco公司）染色法，即TTC染色法。
[0042] 二、結(jié)果
[0043] 結(jié)果見(jiàn)表1，可以看到：化合物P7C3-A20明顯降低了腦梗死面積。
[0044] 表1對(duì)照組與P7C3-A20治療組的腦梗死面積對(duì)比
[0045]
[0046] 注：#*P〈0.0 Olvs對(duì)照組，N = 9-10。表格中的數(shù)字為腦梗死占全腦體積的百分 比。
[0047] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 化合物P7C3-A20在制備防治腦缺血損傷的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的防治腦缺血損傷是指提高大腦皮 層神經(jīng)元的生存率或減少腦梗死面積。3. 化合物P7C3-A20在制備藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物用于： a) 提高缺血大腦皮層神經(jīng)元的生存率，或 b) 減少腦缺血的腦梗死面積。4. 化合物P7C3-A20在制備防治腦梗死的藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的化合物P7C3-A20結(jié)構(gòu)式 為：
【專利摘要】本發(fā)明涉及化合物P7C3-A20在制備治療腦缺血疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)P7C3-A20可以提高缺氧缺糖模型中離體培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元的生存率，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)P7C3-A20可以明顯降低大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的腦梗死面積，這些結(jié)果表明P7C3-A20具有腦缺血保護(hù)作用，能夠防治腦缺血造成的腦損傷，在制備腦缺血損傷和/或腦梗死相關(guān)藥物方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P9/10, A61K31/403
【公開(kāi)號(hào)】CN104997771
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510406560
【發(fā)明人】繆朝玉, 王培 , 張賽龍, 王淑娜, 徐添穎, 管云楓
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月13日