液中（20mM，pH7. 0)。純化的Si02NP與50yL的硫 醇化寡核苷酸（(l)，lmM)反應(yīng)，且將所得的溶液震搖2小時。修飾后，通過如前所述的二氧 化硅NP沉淀除去過量的DNA。通過UV-vis光譜完成的剩下的RNA定量為38nmol，其相應(yīng)于 1. 2ymol/gSi02NP。然后，將純化的顆粒溶解于900yL包含500mMNaCl的HEPES緩沖 液（20mM，pH7. 0)，向其加入100yL染料（lmMMB+、Th+或多柔比星），且將所得的溶液震 搖過夜。負載染料后，溶液與50yL互補DNA(分別ImM的DNA⑷、（5)、（6)、（7)或（8))溫 育，且將所得的混合物震搖2h。通過該過程獲得的DNA加帽的介孔Si02NP使用包含500mM NaCl的HEPES緩沖液（20mM，pH7. 0)洗滌八次直到實現(xiàn)低背景，以從Si02顆粒的表面除 去任何物理吸附的染料。洗滌步驟在過程中通過染料的吸收光譜進行監(jiān)測。MB+或Th+在 Mg2+或Zn2+依賴性DNA核酶修飾的Si02NP中的負載量概略地計算分別為6. 3ymol/g或 7. 5ymol/gSi02NP〇
[0171] 染料的釋放
[0172] 為了監(jiān)測在Mg2+或Zn2+離子的存在下染料從介孔Si02NP中的釋放過程，將顆粒 懸浮于lmL包含500mMNaCl的HEPES緩沖液（20mM,pH7. 0)中，并分為五個190yL等份。 以不同濃度將不同的離子加入這些樣品，并對于Mg2+或Zn2+分別震搖1小時或40分鐘。 沉淀后記錄樣品的熒光光譜。為了測試染料在ATP-或Hg2+刺激的DNA核酶依賴性Si02 NP中的釋放過程，將介孔Si02NP溶解于lmL包含500mMNaCl和20mMMg2+或10mMZn2+ 的HEPES緩沖液（20mM，pH7. 0)中，將其分為五個190yL樣品。然后Si02NP與10yL的 ATP(2mM)或Hg2+離子（20yM)反應(yīng)。所得的溶液對于ATP或Hg2+離子分別震搖90分鐘 或1小時。這隨后是在沉淀Si02NP后，測量樣品的熒光光譜。
[0173] 實施例II-使用DNA或分子標志物作為觸發(fā)刺激底物從核酸加帽的介孔Si02的 擴大的生物催化釋放
[0174] 材料
[0175] 原硅酸四乙酯（TE0S)、（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES)和羅丹明B(RhB) 購自Aldrich。N_(e-馬來酰亞胺己酸）硫代琥泊酰亞胺酯（硫代-EMCS)購自Pierce Biotechnologies。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)和4-(2-羥乙基）哌嗪-1-乙磺酸鈉鹽 (HEPES)購自Sigma。外切核酸酶III(ExoIII)、NE緩沖液1、切口酶Nb.BbvCI和NE緩沖 液2購自NewEnglandBiolabs。喜樹堿（CPT)、寡霉素、腺苷5' -三磷酸（ATP)、尿苷5' -三 磷酸（UTP)、胞苷5'-三磷酸（CTP)和鳥苷5'-三磷酸（GTP)購自Sigma-Aldrich。所用的 所有其他化學品均為分析純，并按收貨那樣時使用而沒有任何進一步純化。貫穿實驗，使用 來自NANOpureDiamond(BarnsteadInt.，Dubuque,IA)的超純水。所有DNA寡核苷酸序列 購自IntegratedDNATechnologieslnc. (Coralville，IA)。寡核苷酸按所提供的使用，并 在水性溶液中稀釋。
[0176]Nb.BbvCI切口酶的識別位點如下。
[0177] 5' ? ? ?CCTCAGC. ? ? 3'
[0178] 3' ? ? ?GGAGT▲CG…3'
[0179] 寡聚物的序列如下：
[0180] (1)5,-SH(CH2)6CAAGGGCAGAAGTCTTCACTGCCCTTGCACACT-3'Tm= 67. 3°C(SEQ.NO. 7)
[0181] (2)5'-AGTGTGCAAGGGCAGTGAAGACTTGATTGT-3'（SEQ.NO. 8)
[0182] (3)5,-AGTGTGCAAGAGCAGTGAAGACTTGATTGT-3'（SEQ.NO. 9)
[0183] (4)5,-AGTGTGCTAGAGCAGTGAAGACTTGATTGT-3'（SEQ.NO. 10)
[0184] (5)5,-AGTGTGCTAGAGCAGTTAAGACTTGATTGT-3'（SEQ.NO. 11)
[0185] (6)5, -SH(CH2)6AACGAAGCTGAGGATGTGTTCGTT-3'Tm= 58. 9°C(SEQ.NO. 12)
[0186] (7)5,-ATCCTCAGCTTCG-3'（SEQ.NO. 13)
[0187] (8)5,-ATCCTGAGCTTCG-3'（SEQ.NO. 14)
[0188] (9)5,-ATCATGAGCTTCG-3'（SEQ.NO. 15)
[0189] (10)5,-ATCATGAGCGTCG-3'（SEQ.NO. 16)
[0190] (11) 5'-SH(CH2)6CCTCCGCTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTA-3'Tm= 69. 8°C(SEQ. NO. 17)
[0191] (12) 5 '-sh(ch2) 6cctccgcaatactccgctgaggcctgggggagtattgcggaggaaggcctcagc-3?Tm= 74. 9°C(SEQ.NO. 18)
[0192] 儀器
[0193] 使用CaryEclipse設(shè)備（Varianlnc.)進行焚光測量。在554nm的波長下激發(fā)羅 丹明B(RhB)。用ShimadzuUV-2401分光光度計記錄UV-vis吸收光譜。TEM圖像使用200kV 的加速電壓在TecnaiF20G2(FEICo.)上記錄。使用Nova1200eBET儀表（Quantachrome Instruments，USA)通過在液氮的溫度下的氮氣吸附/解吸確定表面面積。
[0194] 介孔二氧化硅納米顆粒（MP_Si02NP)的合成
[0195] 根據(jù)先前報道的過程制備氨基功能化MP-Si02NP。30收集的Si02NP用大體積 的蒸餾水和乙醇以8000rpm離心3min進行洗滌。為了除去N-將十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，Si02NP在包含HC1 (37%，1.00ml)和乙醇（80.00ml)的溶液中回流16h。獲得的 NP用蒸餾水和乙醇徹底洗滌。最后，為了從孔除去剩余的溶劑，將所得的無CTAB的氨基-功 能化MP-Si02NP在75°C下在真空中放置12h。
[0196] 染料的負載和孔的加帽
[0197] 為了制備單分散的MP-Si02NP溶液，將10mg的二氧化硅NP放置進950y1的 HEPES緩沖液（20mM,pH7. 0)中并超聲處理30min。溶液與50y1的硫代-EMCS(10mg/mL)反 應(yīng)，并將混合物混合30min。為了除去過量的EMCS，使用以8000rpm離心3min收集MP-Si02 NP，并將其再溶解于950yl的HEPES緩沖液（20mM，pH7. 0)中。純化的Si02NP與新鮮還 原并純化的硫醇化寡核苷酸（1)、（6)、（11)、（12) (80iil，lmM)反應(yīng)，且將所得的溶液混合 2h，將過量的DNA通過沉淀從NP溶液中除去。剩下的過量的DNA的定量通過UV-vis光譜 在DNA/ExoIII或DNA/切口酶系統(tǒng)中完成為61nmol或8nmol，其相應(yīng)于DNA的量分別固定 為 1. 9ymol/g或 2. 2ymol/gSi02NP。
[0198] 使用水?。?0°C)對孔負載染料，以為了打開連接的DNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。將純化的 MP-Si02NP溶解于 900y1 的HEPES緩沖液（20mM，pH7. 0,包含 50mMNaCl)中，將 100y1 的 RhB或CPT(lOmM)加入進該溶液，且在連續(xù)攪拌下使用水浴分別將反應(yīng)混合物加熱至90°C 或75 °C持續(xù)2h。然后，在退火過程中在連續(xù)攪拌下將樣品分別在75 °C、50 °C和25 °C下浸漬 在水浴中持續(xù)20min。最后，使用蒸餾水洗滌MP-Si02NP至少七次，直到實現(xiàn)低背景，以從 Si02顆粒的表面除去物理吸附的染料。RhB在DNA/ExoIII或DNA/切口酶系統(tǒng)中的負載 量概略地計算分別為 37.8ymol/g或 31.3ymol/gSi02NP。CPT在DNA/ExoIII或DNA/ 切口酶系統(tǒng)中的負載量計算分別為34.5ymol/g或28.6ymol/gSi02NP。
[0199] 染料的釋放
[0200] 為了監(jiān)測染料在兩種不同系統(tǒng)DNA/ExoIII或DNA/切口酶中的釋放，將以上提及 的MP-Si02NP懸浮于850yl蒸餾水中，并分為五個樣品，各自包含160yl溶液。然后，將 20y1緩沖液1和10y1不同濃度的ExoIII，或20y1緩沖液2和10y1不同濃度的切口 酶分別加入進所得的溶液，并輕輕震搖。最后，將10y1不同濃度的DNA加入進該混合物并 震搖lh，且然后在沉淀后測量樣品的發(fā)射的熒光光譜。
[0201] 為了測試染料在ATP刺激的ExoIII或切口酶系統(tǒng)中的釋放，將洗滌的MP_Si02 NP溶解于850y1蒸餾水中，并分為五個樣品，各160y1。Si02NP分別與20y1緩沖液1 和10y1不同濃度的ExoIII，或20y1緩沖液2和10y1不同濃度的切口酶孵育。然后， 加入10y1不同濃度的ATP，將獲得的溶液震搖90min，并然后在沉淀后測量熒光光譜。
[0202] CPT對MDA-MB-231 (乳腺癌細胞）和MCF-10a(正常乳腺細胞）細胞的死亡的效應(yīng)
[0203]MDA-MB-231 (乳腺癌細胞）、MCF-10a(正常乳腺細胞）細胞以每孔27000個細胞 密度種植在24孔組織培養(yǎng)板。過夜后，先將細胞與寡霉素（25yg/ml)預(yù)孵育lh，然后負 載MP-Si02(150yg/ml)兩次（每次負載持續(xù)3h)。在負載細胞之間用新鮮生長培養(yǎng)基洗滌 并然后重新負載。將細胞進一步培養(yǎng)過夜。為確定細胞存活力，將10yl阿爾瑪藍溶解加 入至板的每個孔，并將細胞在C02保溫箱中再孵育lh。在板閱讀器（TECAN)中檢查阿爾瑪 藍的熒光。細胞被培養(yǎng)在玻璃底顯微鏡皿中，并通過由共聚焦（質(zhì)量當量）〇pti_grid設(shè)備 (配備恒溫階段和HamamatsuOrca-EraCO)照相機的NikonTE2000顯微鏡）輔助，并通 過用于圖像數(shù)據(jù)采集和分析的Volocity4操作系統(tǒng)（Improvision，Coventry，UK)驅(qū)動的 epi-熒光顯微鏡來分析。NP的攝取和CPT從顆粒的釋放用FITC-標記的（eX:519nm)和負 載CPT(ex:423nm)的NP通過顯微鏡來測量。
【主權(quán)項】
1. 一種多孔基材，所述多孔基材包含被截留在所述基材的所述孔中的至少一種活性 劑； 其中，當所述至少一種活性劑被截留在所述孔中時，所述孔被具有鎖定構(gòu)象的至少一 種核酸序列加帽； 在與至少一種第一分析物締合后，所述加帽核酸序列能夠形成易于切割的構(gòu)象；從而 促使所述加帽核酸序列能夠被切割，并允許釋放所述嵌入的至少一種活性劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔基材，其中所述孔通過至少兩種獨立的核酸序列被加 帽。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多孔基材，其中所述加帽核酸序列是單鏈的或雙鏈的。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的多孔基材，其中所述加帽核酸序列包含DNA核酶 序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多孔基材，其中，所述DNA核酶序列被擴展有具有游離構(gòu)象和 在與至少一種第二分析物締合后的活性構(gòu)象的異質(zhì)核苷酸結(jié)構(gòu)域；其中所述DNA核酶序列 的所述活性構(gòu)象能夠在與所述至少一種第一分析物締合后形成易于切割的構(gòu)象，從而使得 能夠切割所述加帽核酸序列，并允許釋放所述嵌入的至少一種活性劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔基材，其中所述加帽至少一種核酸序列是發(fā)卡環(huán)序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多孔基材，其中所述至少兩種獨立的核酸序列是至少兩種獨 立的發(fā)卡環(huán)序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多孔基材，其中所述加帽至少一種核酸發(fā)卡環(huán)序列在與至少 一種分析物核酸鏈偶聯(lián)締合后形成易于切割的構(gòu)象。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的多孔基材，其中所述至少一種分析物核酸鏈是至少一種病痛 或狀況的生物標志物。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多孔基材，其中所述發(fā)夾環(huán)序列包含核苷酸結(jié)構(gòu)域，所述核 苷酸結(jié)構(gòu)域在與至少一種分析物締合后促使所述易于切割的構(gòu)象的能夠形成。11. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多孔基材，其中所述發(fā)夾環(huán)序列還包含核苷酸結(jié)構(gòu)域，所述 核苷酸結(jié)構(gòu)域具有游離構(gòu)象和在與至少一種第二分析物締合后的活性構(gòu)象。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的多孔基材，其中所述加帽序列包含切口酶特異 性核苷酸。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的多孔基材，其中所述切割通過生物催化劑來進 行。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的多孔基材，其中所述生物催化劑是外切核酸酶或內(nèi)切核酸 酶。15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的多孔基材，其中所述生物催化劑是切口酶。16. 根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的多孔基材，其中所述基材是半金屬氧化物納米 顆粒。17. 根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的多孔基材，其中所述基材是介孔二氧化硅納米 顆粒。18. -種向需要其的患者施用活性劑的方法，所述活性劑的釋放是狀況依賴性的，所述 方法包括向所述患者施用多孔基材，所述多孔基材包含被嵌入在所述基材的所述孔內(nèi)的至 少一種活性劑；其中當所述至少一種活性劑被截留在所述孔中時所述孔被具有鎖定構(gòu)象的 至少一種核酸序列加帽；所述加帽核酸序列能夠在與與所述狀況相關(guān)的至少一種第一生物 標志物締合后形成易于切割的構(gòu)象；從而促使所述加帽核酸序列能夠被切割并允許釋放所 述嵌入的至少一種活性劑。19. 一種診斷患者的狀況或病痛的方法，所述方法包括向所述患者施用多孔基材，所述 多孔基材包含被嵌入所述基材的所述孔內(nèi)的至少一種試劑；其中所述孔由具有鎖定構(gòu)象的 至少一種核酸序列加帽，其中所述至少一種試劑被截留在所述孔中；所述加帽核酸序列能 夠在與所述狀況或病痛的至少一種第一生物標志物締合后形成易于切割的構(gòu)象；從而促使 所述加帽核酸序列能夠被切割并允許向所述患者的體液釋放所述嵌入的至少一種試劑；以 及在所述患者的所述液體中檢測所述至少一種試劑。20. -種制備權(quán)利要求1所述的多孔質(zhì)基材的方法，所述方法包括以下步驟：(a)連接 多孔基材與至少一種第一單鏈核酸序列，從而形成功能化基材；(b)使所述功能化多孔基 材與至少一種活性劑接觸，從而將所述試劑嵌入所述基材的孔中；（c)使所述嵌入的功能 化與互補的第二單鏈核酸序列接觸，從而用所述加帽序列加帽所述多孔基材的所述孔，并 將所述至少一種活性劑截留在所述孔中；其中所述加帽序列能夠在與至少一種第一分析物 締合后形成易于切割的構(gòu)象。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第二互補單鏈核酸序列包含具有游離構(gòu)象 和在與至少一種第二分析物締合后的活性構(gòu)象的核苷酸結(jié)構(gòu)域；其中所述第二鏈的活性構(gòu) 象促使所述加帽序列能夠在與至少一種第一分析物締合后形成易于切割的構(gòu)象。22. -種制備權(quán)利要求6的多孔質(zhì)基材的方法，所述方法包括以下步驟：(a)連接多孔 基材與至少一種發(fā)卡單鏈核酸序列，從而形成功能化基材；(b)使所述功能化多孔基材與 至少一種活性劑在其中所述發(fā)卡序列呈不規(guī)則構(gòu)象的溫度下接觸；從而將所述試劑嵌入所 述基材的孔中；（c)降低所述功能化嵌入的基材的溫度，從而形成所述發(fā)卡構(gòu)象，并加帽所 述多孔基材的所述孔，且所述至少一種活性劑截留在所述孔中；其中所述加帽序列能夠在 與至少一種第一分析物締合后形成易于切割的構(gòu)象。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述至少一種發(fā)卡序列包含具有游離構(gòu)象和在 與至少一種第二分析物締合后的活性構(gòu)象的核苷酸結(jié)構(gòu)域；其中活性構(gòu)象促使所述加帽序 列能夠在與至少一種第一分析物締合后形成易于切割的構(gòu)象。24. 根據(jù)權(quán)利要求20 - 23的任一項所述的方法，其中所述加帽序列包含切口酶特異性 核苷酸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及物質(zhì)從多孔基材(諸如介孔二氧化硅納米顆粒)的控釋。顆粒包含被截留在所述基材的孔內(nèi)的客體(guest)分子(例如藥物試劑或造影劑)。通過至少一種核酸序列加帽孔且通過用所述加帽序列與至少一種分析物(生物標志物)的觸發(fā)的反應(yīng)從而允許所述加帽被從所述孔切割而釋放試劑。加帽劑可以是DNA核酶，其切割它的底物并在與分析物結(jié)合后釋放客體分子。可選擇地，加帽劑可以是發(fā)卡寡核苷酸，其在與互補核酸分析物雜交后被核酸酶消化。本發(fā)明還涉及制造所述基材的方法，其用于在患者中控制施用活性劑及診斷狀況的用途。
【IPC分類】A61K9/00, C12Q1/68, B82Y5/00
【公開號】CN105025879
【申請?zhí)枴緾N201380072307
【發(fā)明人】I·韋勒爾, 張·占俠, 多拉·巴洛格
【申請人】耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發(fā)展有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2013年12月5日
【公告號】CA2898393A1, EP2928453A1, US20150344941, WO2014087410A1