枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物工業(yè)領(lǐng)域，涉及枸橘甙的醫(yī)藥新用途，具體涉及枸橘甙在制備抗 血管生成藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管生成是指在已經(jīng)形成的血管結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過芽生或套疊式的方式生成新的 血管過程，是一種動態(tài)而又協(xié)調(diào)的復(fù)雜過程。這一過程主要包括血管內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞 的增殖、迀移、分化，及后續(xù)的血管管腔化，整個血管生成的動態(tài)過程中受到多種血管生成 因子和血管生成抑制因子的聯(lián)合調(diào)控。而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，新生血管能夠為腫瘤 生長提供必需的養(yǎng)料，構(gòu)成腫瘤生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，并為腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和擴散提供必備的條 件。因此，目前臨床上，通過抑制腫瘤血管生成，從而進一步抑制腫瘤生長、擴散與轉(zhuǎn)移，目 前已成為轉(zhuǎn)移性腫瘤治療的一個重要的策略。
[0003]
[0004] 枸橘甙（Poncirin)(結(jié)構(gòu)上式所示）是中國傳統(tǒng)中藥枸橘的重要成分之一，屬于 黃酮類化合物。研究證實具有抗腫瘤、抗病毒、抗自由基等廣泛的藥理活性。。但尚未見在 異甘草苷抗腫瘤血管生成方面的研究。經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn)異甘草苷具有新生血管小 分子抑制劑的結(jié)構(gòu)特征：（1)有兩個或兩個以上的芳香基團；(2)芳香基團上有多個可以形 成氫鍵的受體或配體；（3)芳香基團間有l(wèi)inker鍵連接。因此我們推斷該化合物可能通過 抑制腫瘤血管生成而達到抗腫瘤的作用。并且通過相關(guān)實驗已初步證實。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供枸橘甙新的藥物用途，具體涉及枸橘甙在制備抗血管生成 藥物中的用途。
[0006] 枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，所述的枸橘甙其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0007]
[0008] 所述的枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，其特征在于：所述的血管生成是 腫瘤的血管生成。
[0009] 所述的枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，其特征在于：所述的用途是抑制 腫瘤生長過程中新生血管的形成。
[0010] 本發(fā)明用四甲基偶氮唑鹽（MTT)法、迀移抑制實驗及雞胚絨毛尿囊膜法（CAM法） 研究枸橘甙體外抗血管生成作用；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-RCR)方法檢測枸橘甙對腫 瘤細胞血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)mRNA表達的影響。結(jié)果顯示枸橘甙對血管內(nèi)皮細胞增 殖表現(xiàn)出良好的抑制作用，IC5。值為27. 8±0. 2ymol?L\優(yōu)于其抑制腫瘤細胞增殖的能 力（IC50彡33. 8±0.Iymol?L4 ;在體外該化合物能夠明顯抑制內(nèi)皮細胞的迀移作用，同 時體內(nèi)實驗顯示該化合物在30yg劑量濃度時能夠顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管形 成；RT-RCR實驗顯示枸橘甙在12. 5ymol?L1和25ymol?L1劑量時顯著抑制A549細胞 的VEGF-AmRNA表達。
[0011] 實驗結(jié)果證實枸橘甙具有抑制新生血管形成作用，其作用機制與抑制血管內(nèi)皮細 胞增殖以及降低腫瘤細胞表達VEGF的量有關(guān)。
[0012] 本發(fā)明所述的枸橘甙可進一步加以合適的藥學(xué)上可接受的載體制備抗腫瘤血管 生成的藥物。
【附圖說明】
[0013]圖 1 枸橘甙（A-陰性對照組；B-IOymol.L1 組；C-20ymol.L1 組；D-30ymol.L1 組）對內(nèi)皮細胞迀移的抑制作用；
[0014] 圖2枸橘甙對雞胚CAM新生血管的抑制作用；
[0015] 圖3枸橘甙對A549細胞VEGF-AmRNA表達的影響。
【具體實施方式】
[0016] 實施案例1 :枸橘甙體外抗細胞增殖作用的研究
[0017] 于對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)和腫瘤細胞（人淋巴細胞性白血病 CEM細胞、人前列腺癌PC-3細胞、人肺癌A549細胞株、人肝癌HepG2細胞株）接種于96孔板 中，接種密度約為每孔5000個細胞。接種24h后。將化合物（初始濃度為IOmmol*L4用 培養(yǎng)基分別稀釋至100、50、10、Iymol噸1。吸去96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加藥IOOyL，各 濃度平行設(shè)三個孔，并設(shè)空白孔（不加MTT顯色）和對照孔（不加藥物），繼續(xù)培養(yǎng)48h。然 后在每孔加入MTT溶液（5g噸3 20yL，37°C繼續(xù)培育4h后，棄上培養(yǎng)基，每孔加入100yL DMS0,混勻振蕩15s使甲臢充分溶解。最后用酶標儀在492nm處測定各孔OD值，記錄結(jié)果。 以細胞存活率對劑量作圖求IC5。值。
[0018] 結(jié)果計算：細胞存活率=(試驗組細胞OD值-空白組細胞OD值）八對照組細胞 OD值-空白組細胞OD值）X100%。細胞抑制率=(1-細胞存活率）X100%。半數(shù)抑制濃 度（IC50)即細胞抑制率為50%時藥物的濃度。用藥物的濃度為橫坐標，細胞抑制率為縱坐 標作圖，可求出IC5。值。
[0019] 實驗結(jié)果如表一所示。說明枸橘甙具有優(yōu)先的抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的作用。同 時這一結(jié)果也說明枸橘甙對于腫瘤細胞增殖具有一定的抑制能力。
[0020] 表一枸橘甙體外抗細胞增殖實驗結(jié)果
[0021]
[0022] 所有實驗均重復(fù)三次
[0023] 實施案例2:枸橘甙抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)迀移實驗
[0024]HUEVCs長滿單層后，0.25 %的胰酶消化，調(diào)整細胞濃度為每毫升105個，在48孔細 胞培養(yǎng)板加入內(nèi)皮細胞2X104個，置于37°C、含有5%C02的溫箱中培養(yǎng)。細胞長滿單層 后，用滅菌后的移液槍槍頭刮去一條直線。棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，每次IOOyL。將化合物 (初始濃度為IOmmol噸1)用DMEM分別稀釋至30、20、10ymol噸1。每孔加藥200yL，各 濃度平行設(shè)三個孔。同時設(shè)置三個對照孔（即不加藥物），置于37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12h， 棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次。10倍倒置顯微鏡下拍照，計算內(nèi)皮細胞由刮除邊緣細胞向刮除區(qū) 迀移到距離。
[0025] 實驗結(jié)果如圖1所示，枸橘甙在10-30ymol? 1 1時對HUVEC的迀移有一定的抑 制作用，1〇、20、30ymol?L1的枸橘甙對HUVEC迀移數(shù)目的抑制率分別為22. 4%、35. 2%、 42. 76%，不同劑量的異甘草苷組間有顯著差異。
[0026] 實施案例3:枸橘甙抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生長的實驗
[0027] 在孵化9d的雞胚氣室端開一個IcmXIcm大小的正方形窗，暴露出尿囊膜，隨后將 已制備好的含30mg枸橘甙的小紙片（5mm)放在絨毛尿囊膜血管較少的部位，用滅菌透明 膠帶封窗后繼續(xù)孵化。孵育3d后將雞蛋放入4°C冰箱凍存24h。將凍存過的雞蛋打在IOcm 直徑的細胞培養(yǎng)平皿，剝離CAM(Chickchorioallantoicmembrane)膜，以加藥濾紙片為中 心，剪取直徑3cmCAM，平鋪于干凈培養(yǎng)皿中，用數(shù)碼相機拍照。照相后，用固定液（甲醇： 丙酮，1:1)固定30min以上，烘干保存。
[0028] 試驗結(jié)果如圖2所示，枸橘甙作用9日齡雞胚尿囊膜72h后，表現(xiàn)出明顯的抑制雞 胚尿囊膜上血管生成能力。
[0029] 實施案例4 :逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)實驗
[0030] 取對數(shù)生長期的A549細胞接種于24孔板，培養(yǎng)24h，隨后加入不同劑量枸橘甙繼 續(xù)培養(yǎng)24h，抽提RNA收集并進行逆轉(zhuǎn)錄。
[0031]VEGF-A正向引物：5 ' -GCAGAATCATCACGAAGTGG-3 '；
[0032]VEGF-A逆向引物：5 ' -GCATGGTGATGITGGACTCC-3 '；
[0033] B-actin正向引物：5」AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3' ；
[0034] B-actin逆向引物：5' -GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC-3'。
[0035] PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，紫外線燈下觀測結(jié)果，計算條帶的灰度值。
[0036] 相對灰度值=(待測條帶的灰度值/B-actin的灰度值）※待測條帶的灰度值。
[0037] 實驗結(jié)果如圖3所示，枸橘甙能顯著下調(diào)人肺癌A549細胞VEGF-AmRNA的表達， 其中12. 5ymol?L1和25ymol?L1兩個劑量表現(xiàn)出良好的實驗結(jié)果。
【主權(quán)項】
1. 枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，所述的枸橘甙其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，其特征在于：所述 的血管生成是腫瘤的血管生成。3. 按權(quán)利要求1所述的枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，其特征在于：所述的 用途是抑制腫瘤生長過程中新生血管的形成。
【專利摘要】本發(fā)明涉及枸橘甙在制備抗血管生成藥物中的用途，屬于醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域。枸橘甙其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明所述的枸橘甙可進一步加以合適的藥學(xué)上可接受的載體制備抗腫瘤血管生成的藥物。
【IPC分類】A61K31/7048, A61P9/00, A61P35/00
【公開號】CN105030803
【申請?zhí)枴緾N201510397766
【發(fā)明人】孫明, 律娜, 尹宗生, 李增
【申請人】安徽醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年9月28日