珍珠母蛋白n16在制備促成骨活性藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及珍珠母蛋白N16在制備骨科藥物中的一種新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 成骨細胞分化、成熟能力不足，是骨發(fā)育不全、骨質(zhì)疏松、骨折愈合緩慢等疾病的 一個重要病理因素。目前，臨床上針對促進成骨活性的藥物較少，因此，骨發(fā)育不全、骨質(zhì)疏 松、骨折愈合緩慢的防治亟需安全有效的藥物。
[0003] 珍珠母蛋白N16是屬于珍珠母蛋白，分子量為16kDa，在1999年由Samata等人在 珍珠母不溶于水的組分中發(fā)現(xiàn)。研究表明，珍珠母蛋白N16能影響碳酸鈣結(jié)晶的形狀。但 珍珠母蛋白N16的促成骨活性，尚未見文獻報道。
[0004] 在國內(nèi)外，珍珠母粉被認為是一種良好的骨組織替代材料。珍珠母移植或透皮注 射到動物體內(nèi)無免疫排斥反應(yīng)或明顯毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為制備促成骨活性藥物提供一種新途徑，即公開珍珠母蛋白N16 在制備促成骨活性藥物中的應(yīng)用。
[0006] 所述促成骨活性藥物可以制備成目前適于人用的藥物制劑，如片劑、膠囊劑、顆粒 劑、注射劑等。
[0007] 本發(fā)明的有益效果是：
[0008] 本發(fā)明首次證明珍珠母蛋白N16具有顯著的促成骨活性，為目前促成骨活性提供 了一種全新的選擇和思路。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明中基因重組的珍珠母蛋白N16 15% SDS-PAGE圖。
[0010] 圖2為前體成骨細胞MC3T3-E1增殖實驗結(jié)果示意圖。
[0011] 圖3為成骨細胞標(biāo)志性酶ALP活性測定實驗結(jié)果示意圖。
[0012] 圖4為礦化結(jié)節(jié)實驗結(jié)果示意圖。
[0013] 圖5為AR-S含量測定結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0015] 各實施例中所涉及的固體混合物中之固體，液體中之液體，以及液體中之固體的 百分比分別是以wt/wt、vol/vol、wt/vol計算，除非另有說明。
[0016] 實施例1:珍珠母蛋白N16的制備
[0017] 珍珠母蛋白N16的制備方法，具體包括以下步驟：
[0018] 從馬氏珠母貝Pinctada fucata中提取總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生單鏈cDNA。根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫珍珠母蛋白N16的基因序列，設(shè)計引物珍珠母蛋白N16F(5'-GGAATTC￡flHg GCTGT CCAT TATAAGTGC-3'）和珍珠母蛋白 N16R(5' -CG GGATCC TTAATTGTCAAACCGTTC-3,), 其中下劃線部位堿基分別為Ndel和BamHI限制性內(nèi)切酶位點。利用PCR法擴增珍珠母 蛋白N16基因，反應(yīng)程序設(shè)為95 °C 1分鐘，50 °C 20秒，72 °C 1分鐘，共25個循環(huán)，最后 72°C 10分鐘。擴增所得珍珠母蛋白N16基因連接到表達載體pET3a上，并導(dǎo)入BL21(DE3) plysS competent Escherichia coli，用于表達 N16 蛋白。當(dāng) BL21 (DE3)plysS competent Escherichia coli生長到對數(shù)期，加入0.4mM IPTG，37°C誘導(dǎo)珍珠母蛋白N16的表達。16h 后，收集菌體。
[0019] 珍珠母蛋白N16的純化：將表達菌體分散在20mM Tris-HCl(pH 7. 0)中，超 聲破碎，離心，棄上清。不溶物以 washing buffer (2M urea, 20mM Tris, 0.1 % Tween 20, pH 7.0)超聲溶解。離心，收集不溶物，再以 solubilizing buffer(8M urea, 20mM Tris，40mM beta_mercaptoethanol，pH 7.0)室溫溶解過夜。離心，取上清，0.45iim 濾 膜過濾。以DEAE柱子對N16進行初步純化以及濃縮，其中，上樣緩沖液為8M urea，20mM Tris，40mM beta-mercaptoethanol，pH 7.0，洗脫液為 8M urea，20mM Tris，40mM beta-mercaptoethanol, 1M NaCl，pH 7.0,洗脫方式為梯度洗脫。15% SDS-PAGE 檢測珍珠 母蛋白N16。收集含珍珠母蛋白N16的洗脫液，超濾濃縮，以Superdex 75柱子進行凝膠排 阻層析，分離純化珍珠母蛋白N16。15% SDS-PAGE檢測珍珠母蛋白N16的純度。
[0020] 結(jié)果見圖1。重組表達所得到的珍珠母蛋白N16,分子量約為16kDa，與預(yù)測結(jié)果相 吻合。純度高，無明顯可見雜蛋白條帶，可用于后續(xù)實驗。
[0021] 實施例2 :珍珠母蛋白N16對成骨細胞增殖的影響
[0022] 采用小鼠前體成骨細胞MC3T3-E1，于100U/mL青霉素，100g/mL鏈霉素的a -MEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞置于37°C、飽和濕度5% 0)2濃度下，2~3天換液1次。取對數(shù)生 長期生長狀態(tài)良好的細胞以3~5 X 103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 y 1。37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中孵育24小時。細胞貼壁生長后，實驗組加入不同濃度的珍珠母蛋白N16,每個 濃度設(shè)4個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48、72、96小時。結(jié)果見圖2。圖示標(biāo)注解析：0ne-wayAN0VA， *:P〈0. 05, **:P〈0. 01，***:P〈0. 001，與陰性對照組（N16 = 0 yM)比較。
[0023] MTT法檢測細胞增殖情況，結(jié)果見圖2,珍珠母蛋白N16作用48、72、96小時，對 MC3T3-E1細胞的增殖沒有顯著影響，說明珍珠母蛋白N16對MC3T3-E1細胞沒有毒性。
[0024] 實施例3 :珍珠母蛋白N16提高成骨細胞標(biāo)志性酶堿性磷酸酶活性
[0025] 取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞以5X 103個/孔接種于96孔培養(yǎng) 板，每孔180 y 1。37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育24小時。細胞貼壁生長后，培養(yǎng)基更換為分 化培養(yǎng)基（含50 y g/ml維生素C和lOmMP -甘油磷酸鈉）。加入不同濃度的珍珠母蛋白 N16,每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)96小時。堿性磷酸酶測定試劑盒測定每組ALP活性， BCA法測定蛋白濃度。以測得的ALP活性除以各自的蛋白濃度和反應(yīng)時間，得到酶的單位。 比較各組酶活力單位的差異。
[0026] 結(jié)果見圖3。堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期標(biāo)志。珍珠母蛋白N16作用96 小時，能提高MC3T3-E1細胞ALP活性。其中，0. 6、1. 25和2. 5 y M珍珠母蛋白N16分別使 MC3T3-E1細胞ALP活性提高了 18. 5%、20. 5%和26. 4%，表明珍珠母蛋白N16能促進成骨 細胞分化。
[0027] 實施例4 :珍珠母蛋白N16促進成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生
[0028] 取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞以5X 104個/孔接種于24孔培養(yǎng) 板，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育24小時。細胞貼壁生長后，培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基（含 50μg/ml維生素C和lOmMP-甘油磷酸鈉）。加入不同濃度的珍珠母蛋白N16,每個濃度 設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)21天，每3天換一次液。第21天，茜素紅（AR-S)染色，檢測礦化結(jié) 節(jié)。拍照后，采用10% (wt/vol)西吡氯銨溶解與鈣離子特異性結(jié)合的茜素紅染料，分光光 度法測定其含量，比較各組茜素紅染料的差異，以此代表各組礦化結(jié)節(jié)程度的差異。
[0029] 結(jié)果見圖4及圖5。礦化結(jié)節(jié)是成骨細胞分化的最終階段的標(biāo)志，能和茜素紅染 料結(jié)合形成紅色斑點。紅色顏色越深，代表形成的礦化結(jié)節(jié)越多，成骨細胞越成熟，功能越 強。從圖4可見，珍珠母蛋白N16能促進成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的形成。圖5顯示，珍珠母蛋 白N16對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成具有促進作用。1. 25、2. 5和5 y M珍珠母蛋白N16分別使 MC3T3-E1細胞礦化程度提高了 2. 4、4. 2和3倍。結(jié)果表明，珍珠母蛋白N16能促進成骨細 胞分化成熟，增強成骨細胞的礦化功能。
[0030] 實施例5 :珍珠母蛋白N16促進成骨細胞分化相關(guān)基因的表達
[0031] 采用對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞，以3~5 X 104個/孔接種于6孔 培養(yǎng)板，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育24小時。細胞貼壁生長后，培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基 (含50μg/ml維生素C和10mM 甘油磷酸鈉）。加入不同濃度的珍珠母蛋白N16。繼 續(xù)培養(yǎng)72h，棄去原培養(yǎng)基，Trizol法提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，實時定量PCR法（qPCR) 測定成骨細胞分化相關(guān)基因的表達情況。
[0032] 表1所用到的引物
[0033]
[0034] 在成骨分化過程中，成骨細胞標(biāo)志基因的表達量會顯著升高。本實驗測定了成骨 細胞分化相關(guān)基因0PN、0CN和Runx2的表達量。表2中數(shù)據(jù)為陰性對照組相應(yīng)基因表達量 的倍數(shù)。當(dāng)基因表達量的改變大于2倍時，表示基因的表達量有改變。從表2可知，珍珠母 蛋白N16在1.25yM和2. 5yM濃度下，促進了 MC3T3-E1細胞0PN、0CN和Runx2的表達，表 明珍珠母蛋白N16對成骨細胞的分化成熟具有促進作用。
[0035] 表2珍珠母蛋白N16對成骨細胞分化相關(guān)基因的表達影響（mean土 SD)
[0036]
【主權(quán)項】
1. 珍珠母蛋白N16在制備促成骨活性藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物劑型是片劑、膠囊劑、顆粒劑、注 射劑或鼻吸入劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種珍珠母蛋白N16在制備促成骨活性藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)珍珠母蛋白N16具有促成骨活性。本發(fā)明為目前骨發(fā)育不全、骨質(zhì)疏松、骨折的治療提供了一種全新的選擇和思路，也為該技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展做出了貢獻。
【IPC分類】A61P19/08, A61K38/17, A61P19/10
【公開號】CN105056209
【申請?zhí)枴緾N201510420588
【發(fā)明人】蘇薇薇, 李沛波, 邵鵬柱, 王永剛, 彭維, 馬結(jié)儀, 吳忠
【申請人】中山大學(xué)深圳研究院, 中山大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月16日