下，送些制劑中含有防腐劑W防止微生物的生長(zhǎng)。
[0044]適用于注射的藥物形式包括：無(wú)菌水溶液或分散液和無(wú)菌粉（用于臨時(shí)制備無(wú)菌 注射液或分散液）。在所有情況中，送些形式必須是無(wú)菌的且必須是流體W易于注射器排出 流體。在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染和影 響。載體可W是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇、它們的適當(dāng)混合物和植物油。
[0045]本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得W詳盡描述。通過(guò)下文W及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。
[0046] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，送些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按 重量計(jì)。
[0047] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0048]本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺蒞任意組合。本專利說(shuō)明書所掲 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書中所掲示的各個(gè)特征，可W任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所掲示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0049] 實(shí)施例一、從藤黃中提取并鑒定化合物A、B、C、D和E
[0050] 1.藤黃干燥樹脂5.OKg，粉碎后用無(wú)水己醇冷浸提取（5.化X3)過(guò)濾，合并濾液 并減壓回收溶劑，得稠浸膏（277g)。取硅膠（200~300目）4.OKg裝填色譜柱，W石油 離-丙麗（100:0 - 0:100)梯度洗脫，每流分1000ml，采用薄層色譜檢測(cè)并合并相似流分， 共得7個(gè)組分（F01-F07).
[0051] 2.F02部分5.Og進(jìn)一步采用硅膠柱層析分離；取硅膠（200~300目）300g裝填 色譜柱，W石油離與己酸己醋（30:1 - 4:1)混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)并合相 似流份，共得6個(gè)組分F02a-F02f。F02d組分進(jìn)一步W半制備HPLC進(jìn)行純化，得到化合物 desoxygambogenin(化合物E，110mg)。純化方法如下：采用waters2535Series,色譜柱 甜ridgePrepC18OBDcolumn(19X250mm，5]im)，洗脫液是己膳與水按94:6的體積，流 速為16ml/min;F02f組分進(jìn)一步W半制備HPLC進(jìn)行純化，得到化合物isogambogenin(化 合物C，40mg)。純化方法如下：采用waters2535Series,色譜柱甜ridgePrepC18 0BD column(19X250mm，5ym)，洗脫液是己臘與水巧4:6,W體積計(jì)）的混合溶液，流速為16ml/ min。
[0052] 3.F05部分285g取其中200g進(jìn)一步采用硅膠柱層析分離；取硅膠（200~300 目）4.0Kg裝填色譜柱，二氯甲焼與丙麗（100:0 - 4:1)混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析 檢測(cè)并合相似流份，共得7個(gè)組分F05a-F05g。F05f組分通過(guò)Se地adexLH-20純化，并進(jìn)一 步W半制備HPLC分離，得到化合物B(8mg)。純化方法如下：采用waters2535Series,色 譜柱甜ridgePr巧C180BDcolumn(19X250mm，5ym)，洗脫液是甲醇與0.1 %甲酸水溶液 巧2:8,W體積計(jì)）的混合液，流速為16ml/min;F05g組分通過(guò)Se地adexLH-20純化，并進(jìn) 一步W半制備HPLC分離，得到化合物A化mg)。純化方法如下：采用waters2535Series, 色譜柱甜ridgePr巧C18OBDcolumn(19X250mm，5ym)，洗脫液是甲醇與0. 1%甲酸水溶 液巧0:10，W體積計(jì)）的混合液，流速為16ml/min。
[0053] 4.F06部分50g進(jìn)一步采用硅膠柱層析分離；取硅膠（200~300目）2.OKg裝填 色譜柱，W二氯甲焼與甲醇（100:0 - 4:1)混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測(cè)并合相似 流份，共得4個(gè)組分F06a-F06d。F06d組分通過(guò)Se地adexLH-20純化，并進(jìn)一步W半制備 HPLC分離，得到化合物isogambogenicacid(化合物D，200mg)。純化方法如下：采用waters 2535Series,色譜柱甜ridgePr巧C18OBDcolumn(19X250mm，5ym)，洗脫液是甲醇與 0. 1 %甲酸水溶液（86:14,W體積計(jì)）的混合液，流速為16ml/min。
[0054] 5.上述化合物通過(guò)與實(shí)驗(yàn)室已有化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和HPLC保留時(shí)間比對(duì)而確 定：
[00 巧]
[0056] 實(shí)施例二、化合物A、B、C、D和E的細(xì)胞調(diào)亡試驗(yàn)
[0057] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0058] 人腫瘤細(xì)胞株及其培養(yǎng)：肺癌細(xì)胞（NCI-H1650)購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞于含 ATCC推薦的培養(yǎng)基中，在37°C、5% 0)2條件下培養(yǎng)。
[0059] 五個(gè)化合物通過(guò)實(shí)施例提取獲得或者通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買獲得；DMS0等均為Sigma 公司產(chǎn)品。Caspase3/7Glo試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司。
[0060] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0061] 五個(gè)化合物對(duì)上述腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞調(diào)亡通過(guò)測(cè)定化spase3/7的活性測(cè)得。具 體步驟如下：
[006引1.樣品制備；將化合物分別溶解于二甲亞諷中，得到濃度為4mM的溶液；然后3倍 稀釋，共5個(gè)濃度點(diǎn)。
[0063] 2.細(xì)胞經(jīng)膜酶消化并洗涂后懸浮于含各自細(xì)胞培養(yǎng)基中，經(jīng)胎盤藍(lán)染色排除法計(jì) 活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至0. 8X1〇5細(xì)胞/ml。
[0064] 3.在平底96孔板中，每孔加入100微升細(xì)胞，每孔中細(xì)胞總數(shù)為0. 8X104。配制 兩套板，一套用于8小時(shí)，一套用于24小時(shí)，均于37°C、5%C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
[0065] 4.每孔加入0. 5微升稀釋好的樣品，化合物作用濃度分別為20,6. 66, 2. 22,0. 74， 0. 24yM，同時(shí)將相應(yīng)量的DMS0加入不加藥的細(xì)胞中作為對(duì)照，不含細(xì)胞孔作為背景。
[0066] 5.將加藥細(xì)胞在37°C、5% 0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中各自保溫8小時(shí)或24小時(shí)。
[0067] 6.取出細(xì)胞板，平衡至室溫，每孔中加入100y1化spase3/7-Glo試劑溶液，混 勻。置于搖床上W15化pm搖動(dòng)15分鐘，測(cè)定化學(xué)發(fā)光值。
[0068] 7.根據(jù)化學(xué)發(fā)光值計(jì)算化合物處理后細(xì)胞相對(duì)存活率。計(jì)算公式如下：
[0069] 細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)倍數(shù)=(藥物處理組的信號(hào)-DMS0處理組的信號(hào)）/值MS0處理組的 信號(hào)-背景值）
[0070] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0071] 檢測(cè)結(jié)果顯示：上述五個(gè)化合物在8小時(shí)和24小時(shí)，均能明顯誘導(dǎo)產(chǎn)生 Caspase3/7,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡，產(chǎn)生殺滅腫瘤細(xì)胞的作用（圖1和圖2)。
[0072] 實(shí)施例H化合物A和B體外選擇性抑制化k2和化k3酶活性試驗(yàn)
[007引 實(shí)驗(yàn)材料：
[0074]Jak家族酶（Jakl，Jak2,Jak3和Tyk。及Fam標(biāo)記的多膚底物均購(gòu)自Carna BioscienceInc.。
[00巧]化合物A和B由實(shí)施例1提取獲得或通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買獲得；ATP，DMS0等均為Sigma公司產(chǎn)品。
[0076] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0077] 化合物A和B對(duì)Jak家族酶活性的測(cè)定具體步驟如下：
[007引 1.化合物配巧h將化合物A和B分別溶解于二甲亞諷中，得到濃度為2mM 的溶液；然后用實(shí)驗(yàn)緩沖液（lOOmM肥陽(yáng)S,lOmMMgC12, 1. 5mMbetaine, 0. 015 % 81'。'，251111目-旨17061'0地03地曰16)3倍稀釋，得到5乂的工作濃度，共7個(gè)濃度點(diǎn)。
[007引 2.底物溶液的配制：將Fam標(biāo)記的多膚底物及ATP分別加于實(shí)驗(yàn)緩沖液中，得到 2. 5X的工作濃度。
[0080] 3.酶溶液的配制：將各自的激酶加入實(shí)驗(yàn)緩沖液中，得到2. 5X的工作濃度。
[0081] 4.將稀釋好的5微升化合物加入384孔板中，隨后加入10微升底物溶液，然后加 10微升酶溶液W啟動(dòng)酶反應(yīng)，化合物作用濃度分別為40, 20,10, 5, 2. 5,1. 25,0. 625yM。室 溫反應(yīng)1小時(shí)后，加入25微升終止液巧OOmM邸TA)終止酶反應(yīng)。
[0082] 5.在CaliperL油ChipEZreader(美國(guó)）讀板器讀取信號(hào)。
[0083] 6.根據(jù)信號(hào)值計(jì)算抑制百分率及IC50值。計(jì)算公式如下：
[0084] 抑制百分率=100X值MS0處理組的信號(hào)-藥物處理組的信號(hào)）/值MS0處理組的 信號(hào)-背景值），然后通過(guò)Xliit軟件計(jì)算化