Nonratt021972小干擾rna在制備糖尿病及并發(fā)疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于糖尿病藥物用途發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿?。―iabetesMellitus，DM)是一組代謝性臨床綜合征，隨著社會(huì)的發(fā)展和 人們生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在發(fā)達(dá)國家糖尿病患病率已達(dá)3% -7%， 成為僅次于癌癥、艾滋病、心腦血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5位 死亡主因。糖尿病分為1型（胰島素依賴性）和2型（非胰島素依賴性）糖尿病，不論是 1型（胰島素依賴性）還是2型（非胰島素依賴性）糖尿病，其最主要的癥狀便是高血糖。 高血糖是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的主要原因，據(jù)估計(jì)，全球六個(gè)人里面就有一個(gè)人處于患糖尿 病并發(fā)癥的危險(xiǎn)中。我國糖尿病人群的構(gòu)成以2型糖尿病為主，占糖尿病人群的90%以上， 嚴(yán)重影響著人民健康和社會(huì)發(fā)展。
[0003] 葡萄糖激酶（glucokinase，GK)己糖激酶家族中的一員，分子質(zhì)量為52k，由448個(gè) 氨基酸殘基構(gòu)成。GK是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，特異性地存在于胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞，可 促進(jìn)胰島素分泌和葡萄糖代謝，參與糖代謝的各條途徑。GK具有雙重的生物學(xué)功能，肝臟 GK參與葡萄糖磷酸化，加速糖原合成及葡萄糖代謝；胰腺β細(xì)胞中GK為葡萄糖敏感器，可 促進(jìn)高濃度葡萄糖狀態(tài)下胰島β細(xì)胞分泌胰島素來降低血糖。肝臟中的GK是糖酵解過程 中第一步的限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，后者在胰島素作用下經(jīng)過糖原 合成途徑合成肝糖原儲(chǔ)存起來。因此，肝臟中的GK的主要作用是促進(jìn)糖酵解，加速糖原合 成和抑制糖異生，控制肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取與利用，從而有效控制體內(nèi)血糖平衡。研究表 明，普通糖尿病患者及糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)葡萄糖激酶活性明顯降低，它可能對(duì)糖尿病的 發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響，而增加GK活性可促進(jìn)葡萄糖的磷酸化，促進(jìn)糖原合成和胰島素 釋放，從而改善糖耐量異常，提高胰島細(xì)胞功能，改善糖尿病癥狀。GK在控制血糖穩(wěn)態(tài)和代 謝中的作用主要表現(xiàn)為：一方面調(diào)節(jié)肝糖代謝，當(dāng)空腹或血糖低時(shí)，GK活性低下，肝糖輸出 增加，以保證重要器官的能量供給；餐后或血糖高時(shí)，GK活性增強(qiáng)，可促進(jìn)肝糖原合成，抑 制肝臟糖異生，以維持血糖穩(wěn)態(tài)。
[0004] 隨著基因組測(cè)序計(jì)劃的完成以及新一代深度測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中多于95%的轉(zhuǎn)錄序列為非編碼RNA(noncodingRNA，ncRNA)。非編碼RNA是一類不 編碼蛋白質(zhì)但具有生物學(xué)調(diào)控功能的RNA分子，它可通過參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯水平的調(diào) 節(jié)、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、RNA的加工和修飾以及影響染色體的結(jié)構(gòu)等機(jī)制，調(diào)控生物體的基本生 命活動(dòng)，同時(shí)與一些重要疾病的病理生理過程相關(guān)。非編碼RNA包括短非編碼RNA(包括 siRNA、miRNA、piRNA)和長非編碼RNA(longnon-codingRNA,IncRNA) 〇 長度大于 200 個(gè) 堿基（200nt)為長鏈非編碼RNA(lncRNA)。目前長度小于50個(gè)核苷酸的非編碼RNA(如 microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性進(jìn)展，但對(duì)具有功能的長非編碼RNA的 研究不多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 一個(gè)新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備降低血糖、促進(jìn)胰島素 功能的防治糖尿病及并發(fā)疾病藥物應(yīng)用、及高血糖引發(fā)的其它疾病的藥物應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 二個(gè)新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備降血脂防治高血脂引 發(fā)相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 三個(gè)新用途，即長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在制備提高肝葡萄糖激酶活 性、防治其功能異常介導(dǎo)的糖尿病及并發(fā)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核 酸在制備治療肝組織長非編碼核糖核酸N0NRATT021972功能異常相關(guān)疾病的防治藥物中 的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核 酸在制備糖尿病及其并發(fā)病、高血脂引發(fā)相關(guān)疾病、葡萄糖激酶（GK)介導(dǎo)疾病、長非編碼 核糖核酸N0NRATT021972功能異常相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明用SOLiD高通量測(cè)序并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分子生物學(xué)驗(yàn)證確定大鼠 肝臟存在長非編碼核糖核酸N0NRATT021972[http://www.noncode,org]，并發(fā)現(xiàn)糖尿病模 型大鼠肝臟長非編碼核糖核酸N0NRATT021972表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，提示肝臟的長非編 碼核糖核酸N0NRATT021972與糖尿病的病理變化有關(guān)。
[0011] 本發(fā)明通過2型糖尿病大鼠模型，觀察長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾 RNA處理后2型糖尿病大鼠空腹血糖、餐后血糖、血脂、空腹血胰島素變化，以及與肝葡萄糖 激酶（GK)表達(dá)變化的關(guān)系，為長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA用于糖尿病的 診斷、預(yù)防和治療提供幫助。
[0012] 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA在防治糖尿病及并發(fā)疾病的作用機(jī) 理涉及：提高肝組織葡萄糖激酶的表達(dá)和活性，產(chǎn)生降血糖、降血脂、促進(jìn)胰島素功能的作 用，對(duì)糖尿病及其并發(fā)疾病產(chǎn)生防治作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1實(shí)驗(yàn)第11周末各組大鼠血清中血脂的變化比較圖。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、 糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾處理組、糖尿病模型 +亂序的小干擾核糖核酸陰性對(duì)照組；2型糖尿病模型+二甲雙胍組。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用i±s表 示，每組樣本數(shù)均為8只。其中#p〈0. 01表示和正常對(duì)照組比較，##p〈0. 01表示和糖尿病模 型組比較。
[0014] 圖2實(shí)驗(yàn)第11周末各組大鼠血清中胰島素水平的變化比較圖。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì) 照組、糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾處理組、糖尿 病模型+亂序的小干擾核糖核酸陰性對(duì)照組；2型糖尿病模型+二甲雙胍組。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 表示，每組樣本數(shù)均為8只。其中**p〈0. 01表示和正常對(duì)照組比較，##p〈0. 01表示和 糖尿病模型組比較。
[0015] 圖3逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)方法檢測(cè)長非編碼核糖核酸N0NRATT021972 小干擾核糖核酸對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟葡萄糖激酶（GK)mRNA表達(dá)的影響圖。實(shí)驗(yàn)分組： 正常對(duì)照組、糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾處理 組、糖尿病模型+亂序的小干擾核糖核酸陰性（NCsi)對(duì)照組；2型糖尿病模型+二甲雙胍 組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所得數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖3(a) 為RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖3(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中\(zhòng)〈0.05，#p〈0.01表示 和正常組比較，#p〈〇. 05, ##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0016] 圖4蛋白印跡方法檢測(cè)長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾處理對(duì)2型糖尿 病大鼠肝臟葡萄糖激酶（GK)蛋白表達(dá)量的影響圖。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、糖尿病模型組、 糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾處理組、糖尿病模型+亂序的小干 擾核糖核酸陰性對(duì)照組；2型糖尿病模型+二甲雙胍組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)，所得數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖4(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖4(b)為實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中\(zhòng)〈〇. 05,wp〈0. 01表示和正常組比較，#p〈0. 05, ##p〈0. 01表示 與糖尿病模型組比較。
[0017] 圖5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核 糖核酸處理對(duì)高糖高脂大鼠肝細(xì)胞模型中GKmRNA表達(dá)的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得 數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖5(a)為RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖5(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比 較柱狀圖，其中*P〈〇. 05，#p〈0. 01表示和Ctrl組比較，#p〈0. 05，##p〈0. 01表示與高糖高脂 組比較。
[0018] 圖6蛋白印跡方法檢測(cè)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸處理對(duì)高 糖高脂大鼠肝細(xì)胞模型中GK蛋白表達(dá)的影響。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用平均值土 標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖6(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖6(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中 *p〈0. 05, #p〈0. 01表示和Ctrl組比較，#p〈0. 05, ##p〈0. 01表示與高糖高脂組比較。
[0019] 圖7逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核 酸N0NRATT021972的濃度變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的濃度較健康對(duì)照組增加。圖7 (a)為RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖7 (b)為實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中*P〈〇. 05,表示與健康