鹽酸芐絲肼膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，主要涉及鹽酸芐絲肼對(duì)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)兩個(gè)重要限速受體表達(dá)的影響，從而促進(jìn)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)起到逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)已經(jīng)成為人類死亡的重要原因，其中普遍認(rèn)為高密度脂蛋白(HDL)具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其主要通過其介導(dǎo)的逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)來實(shí)現(xiàn)。
[0003]逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)，主要通過由多種途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流，并促進(jìn)ApoA-1和HDL脂化，隨后成熟的HDL被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行排泄分泌進(jìn)而阻礙動(dòng)脈粥樣硬化。其中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al (ABCAl)是主要負(fù)責(zé)巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出并形成HDL的途徑，但其他較低效率的外流途徑如被動(dòng)流出也參與其中。ABCAl促進(jìn)膽固醇和磷脂的單向流出成游離脂質(zhì)或缺脂載脂蛋白，同時(shí)ABCAl也涉及在ApoA-1的脂化形成初期高密度脂蛋白(HDL)。ABCAl與細(xì)胞膽固醇外流至HDL聯(lián)系密切，其表達(dá)降低或突變將降低血漿HDL，膽固醇，膽固醇酯在細(xì)胞積聚從而導(dǎo)致高密度脂蛋白缺乏癥，同時(shí)在小鼠巨噬細(xì)胞超表達(dá)ABCAl發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展被顯著抑制。
[0004]膽固醇外流成為游離膽固醇后再進(jìn)行酯化，轉(zhuǎn)運(yùn)最后成熟的HDL主要被肝臟SRBl攝取HDL中的膽固醇。大量數(shù)據(jù)表明SRBl是HDL代謝的一個(gè)具有決定性的調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)在SRBl基因敲除小鼠中SR-BI介導(dǎo)的肝臟攝取高密度脂蛋白膽固醇的攝取幾乎完全被阻塞，同時(shí)多篇文獻(xiàn)報(bào)道肝臟SRBl的表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抑制作用極有可能因?yàn)槠渥鳛槟婺懝檀嫁D(zhuǎn)運(yùn)最后一步的調(diào)控因子能夠潛在提高膽固醇流入肝臟。有實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠肝臟所表達(dá)的SRBl顯示了對(duì)調(diào)節(jié)RCT的重要的作用，肝臟SRBl的超表達(dá)可促進(jìn)RCT的過程進(jìn)而降低了動(dòng)脈粥樣硬化，顯著的促進(jìn)了肝臟攝取HDL膽固醇同時(shí)降低了血漿HDL膽固醇水平。
[0005]鹽酸芐絲肼為白色或類白色結(jié)晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其性質(zhì)極不穩(wěn)定，對(duì)溶劑PH、光線、溫度及濕度的變化極為敏感。鹽酸芐絲肼作為肼衍生物是一種氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)抑制劑，它可在動(dòng)脈，心臟脂肪組織及血液循環(huán)等中代謝芐胺從而可抑制SSAO活性。SSAO可將內(nèi)源性胺及外源性物質(zhì)轉(zhuǎn)換成更多的有毒代謝物，其參與發(fā)展內(nèi)皮損傷、動(dòng)脈斑塊形成等，與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管類疾病形成高度相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明采用不同濃度的鹽酸芐絲肼作用于泡沫巨噬細(xì)胞及肝細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著鹽酸芐絲肼濃度變化，逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)兩個(gè)關(guān)鍵限速受體ABCAl，SRBl表達(dá)均表現(xiàn)出濃度依賴性，尤其肝臟SRBl受體在鹽酸芐絲肼濃度為10 \ 10 8、10 9M時(shí)，表達(dá)量與模型組具有極顯著性差異，從而促進(jìn)了逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)最后一步。
[0007]下面是藥理學(xué)部分試驗(yàn)及結(jié)果:
[0008]一、建立實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型
[0009]取生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人單核細(xì)胞THPl以I X 106細(xì)胞/孔的密度均勻接種于6孔培養(yǎng)板，經(jīng)100ng/ml佛波酯(PMA)刺激72h后細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)出偽足即成功分化為人巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞分別加入不同濃度oxLDL(0，25，50，100 μ g/ml)作用24h后進(jìn)行油紅O染色及cell-based ELISA檢測(cè)。
[0010]取生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常肝細(xì)胞L02以I X 106細(xì)胞/孔的密度均勻接種于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分別加入不同濃度 oxLDL (0，25，50，100 μ g/ml)作用 24h 后進(jìn)行 cell-based ELISA 檢測(cè)。
[0011]二、給藥后巨噬細(xì)胞ABCAl進(jìn)行cell-based ELISA檢測(cè)
[0012]取生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人單核細(xì)胞THPl以I X 15細(xì)胞/孔的密度均勻接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)100ng/ml佛波酯(PMA)刺激72h后細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)出偽足即成功分化為人巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白組、模型組、藥物組。除空白組外，其余組用100 μ g/ml濃度oxldl刺激作用24h后成為泡沫巨噬細(xì)胞，藥物組分別加入不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 1、10 8、10 9、10 10、10 11UO 12、10 13M)各100 μ 1，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育24h后，棄培養(yǎng)液，洗滌干燥后進(jìn)行cell-based ELISA檢測(cè)。
[0013]三、給藥后肝細(xì)胞SRBl進(jìn)行cell-based ELISA檢測(cè)
[0014]取生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常肝細(xì)胞L02以I X 15細(xì)胞/孔的密度均勻接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為空白組、模型組、藥物組。除空白組外，其余組用100 μ g/ml濃度oxldl刺激作用24h后即成功建立動(dòng)脈粥樣硬化肝細(xì)胞模型，藥物組分別加入不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 7UO 8UO 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)各100 μ I，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育24h后，棄培養(yǎng)液，洗滌干燥后進(jìn)行 cell-based ELISA 檢測(cè)。
【附圖說明】
[0015]圖1是THPI細(xì)胞空白組油紅O染色圖。
[0016]圖2是THPl細(xì)胞加25 μ g/ml的oxLDL作用組油紅O染色圖。
[0017]圖3是THPl細(xì)胞加50 μ g/ml的oxLDL作用組油紅O染色圖。
[0018]圖4是THPl細(xì)胞加100 μ g/ml的oxLDL作用組油紅O染色圖。
[0019]圖 5 是 THPl 細(xì)胞分別加 0、25、50、100yg/ml 的 oxLDL 作用的 cell-based ELISA結(jié)果。
[0020]圖6是11)2細(xì)胞分別加0、25、50、10(^8/1111的 oxLDL 作用的 cell-based ELISA結(jié)果。
[0021]圖7是THPl細(xì)胞在100 μ g/ml的oxLDL作用造模后加不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)的 cell-based ELISA 結(jié)果。
[0022]圖8是L02細(xì)胞在100 μ g/ml的oxLDL作用造模后加不同濃度鹽酸芐絲肼(10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)的 cell-based ELISA 結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]I)油紅O染色細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌一4%多聚甲醛固定10?20min_ — PBS洗滌一油紅O染色15min —水洗脫色一顯微鏡觀察
[0024]2) cell-based ELISA 檢測(cè)
[0025]細(xì)胞孵育24h后，棄培養(yǎng)液，洗滌干燥后4%多聚甲醛固定細(xì)胞20-30min，PBS/Triton X-100 漂洗 5minX 3 次，0.6% H202/PBS/Triton χ-100 孵育 20_30min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS/Triton X-100 漂洗 5minX 3 次，10% BSA 于 37°C封閉 lh40min, 50ul5% BSA稀釋SRBl —抗4°C孵育過夜，PBS/Triton X-100漂洗5minX 3次，50ul5% BSA稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗于37°C孵育lh，PBS/Triton X-100漂洗5minX3次，PBS漂洗5minX3次，每孔加入200ulTMB顯色液于37°C避光顯色30min，加入50ul終止液IM稀H2SO4溶液終止反應(yīng)，溶液顏色由藍(lán)變黃，加入終止液15min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.鹽酸芐絲肼用于促進(jìn)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的藥物用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了鹽酸芐絲肼促進(jìn)了逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(RCT)過程從而起到防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本發(fā)明通過建立泡沫巨噬細(xì)胞及動(dòng)脈粥樣硬化條件下的肝細(xì)胞模型研究了鹽酸芐絲肼的對(duì)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)過程中兩個(gè)至關(guān)重要的限速受體(ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1，清道夫受體B1)表達(dá)的影響，尤其對(duì)肝臟SRB1具有極顯著促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)了逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)最后一步，于動(dòng)脈粥樣硬化疾病的防治作用具有極其重要的意義，此研究符合我國(guó)藥物現(xiàn)代化的發(fā)展方向，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和應(yīng)用研究領(lǐng)域內(nèi)具有重要的社會(huì)意義和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。
【IPC分類】A61P9/10, A61K31/165
【公開號(hào)】CN105267192
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510648410
【發(fā)明人】何書英, 方婷歡, 余新超
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年9月29日