具核梭桿菌滅活疫苗和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法及其疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 具核梭桿菌（Fusobacterium nuleatum，F(xiàn)n)是革蘭氏專性厭氧桿菌，廣泛存在于 人體及多種動物體內(nèi)的無芽胞厭氧菌屬。典型的具核梭桿菌外觀呈紡錘形，有銳利的尖端， 偶爾中間膨脹。過去一直把該菌視為人體的正常菌群之一，近年來，由于從臨床標(biāo)本中不斷 分離出該菌，具核梭桿菌引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，被視為臨床上不可忽視的細(xì)菌。大量研究 證實(shí)該菌為條件致病菌，且具有較強(qiáng)的致病力，在口腔乃至全身感染性疾病中檢出率極高， 廣泛存在于感染的牙髓、牙周和其他炎癥性病灶中。作為優(yōu)勢菌種，具核梭桿菌與臨床厭氧 菌感染的關(guān)系十分密切，并與結(jié)腸癌等消化道腫瘤發(fā)病相關(guān)。經(jīng)過檢索發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌的 疫苗尚未制備，通過本文所述的制備方法將可以彌補(bǔ)這個空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種安全有效，工藝簡單，生產(chǎn)成本低的具核梭桿菌滅活 疫苗的制備方法。
[0004] 本發(fā)明提供的這種具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法包括以下步驟：具核梭桿菌的 分離和培養(yǎng)；收集；滅活；乳化制劑；無活菌檢測；抗體效價檢驗(yàn)。
[0005] a、通過購買的標(biāo)準(zhǔn)株或者從臨床分離得到的細(xì)菌株經(jīng)過連續(xù)傳代接種于適宜平 板上，分離鑒定得到菌種后；
[0006] b、將菌種通過適宜平板上增殖細(xì)菌，用PBS稀釋液洗滌，或者將菌種接種于含適 宜培養(yǎng)基的厭氧瓶中增殖細(xì)菌，通過離心培養(yǎng)基收集細(xì)菌，直至最終菌液濃度達(dá)到本行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)。如果上述最終菌液低于本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可進(jìn)行濃縮直至最終菌液達(dá)到本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；
[0007] C、菌體滅活；
[0008] d、將滅活菌體加入佐劑，通過物理混合方法制備成疫苗；
[0009] e、將步驟d制備的滅活疫苗進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果為無菌生長，即可判定疫苗合格：
[0010] f、將步驟e判定合格的滅活疫苗接種于小白鼠，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，用步驟d制 備的疫苗進(jìn)行接種，接種療程結(jié)束后可進(jìn)行取血檢測抗體效價。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：
[0012] a、本發(fā)明的制備工藝簡單，通過制備得到了具核梭桿菌滅活疫苗，彌補(bǔ)了當(dāng)前的 空白，有長期的健康保障作用。
[0013] b、本方法制備得到的滅活疫苗的免疫原性很強(qiáng)，抗體效價很高。
【附圖說明】
[0014] 圖1示出了具核梭桿菌疫苗的一種免疫方法。
[0015] 圖2示出了具核梭桿菌疫苗免疫小鼠后，小鼠血清中抗體滴度變化。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0017] 實(shí)施例1 :具核梭桿菌的增殖培養(yǎng)
[0018] 將具核梭桿菌ATCC25586復(fù)蘇后連續(xù)3次傳代接種于厭氧血平板上，挑取菌落進(jìn) 行革蘭染色鏡檢觀察其形態(tài)及染色性初步驗(yàn)證菌株，通過對菌落進(jìn)行脫氧核糖核酸提取后 進(jìn)行PCR鑒定和全基因測序進(jìn)行菌株的最終驗(yàn)證。經(jīng)鑒定正確的菌種接種于含有BHI培養(yǎng) 基的厭氧瓶，待細(xì)菌增值到一定量后，將培養(yǎng)基離心獲得細(xì)菌，按照部頒標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng)物細(xì) 菌總數(shù)測定。
[0019] 實(shí)施例2 :具核梭桿菌的滅活
[0020] 取含菌量IOwCFUAiI以上的具核梭桿菌培養(yǎng)液經(jīng)過離心測到菌體沉淀后用生理 鹽水洗滌細(xì)菌3-4次，用PBS重懸細(xì)菌，加入福爾馬林（終含量為1 % )，置于30-40°C滅活 16-30小時，取滅活菌種接種于BHI培養(yǎng)基分別在無氧和有氧條件下培養(yǎng)48小時，均無細(xì)菌 生長方視為合格。
[0021] 實(shí)施例3 :具核梭桿菌疫苗的制備
[0022] 取滅菌液與弗氏完全佐劑比例為I : 1制備初次和末次接種疫苗；取滅菌液與弗 氏不完全佐劑比例為1:1制備中間接種疫苗。乳化方法為取細(xì)菌佐劑混合物用注射器乳 化法經(jīng)抽提60次乳化完成。
[0023] 實(shí)施例4 :抗體效價檢測
[0024] 疫苗制備成功后，選取30只8周齡昆明鼠通過皮下注射進(jìn)行疫苗接種，注射劑量 為100 μ 1，每隔2周免疫一次，總共免疫4次，初次免疫后每隔兩周進(jìn)行小鼠尾靜脈取血，通 過離心獲取小鼠血清進(jìn)行ELISA夾心檢測法測定抗體效價。免疫過程如圖1所示。4次免 疫完成后小鼠血清抗體效價在3萬以上，抗體滴度變化圖如圖2所示。
[0025] 實(shí)施例5 :具核梭桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)
[0026] 選用20只前期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行疫苗免疫的小鼠，在末次免疫后14天，提前24小時斷 食、斷水，灌喂具核梭桿菌菌液（2X 10sCfu/ml)，每只灌喂0. 5ml，上下午各一次，間隔6小 時，末次灌喂后2小時進(jìn)食。
[0027] 選擇20只并未進(jìn)行疫苗免疫的小鼠，提前24小時斷食、斷水，灌喂具核梭桿菌菌 液（2X IO8CfVml)，每只灌喂0. 5ml，上下午各一次，間隔6小時，末次灌喂后2小時進(jìn)食。
[0028] 實(shí)施例6 :具核梭桿菌疫苗的保護(hù)作用
[0029] 攻毒2周后，脫頸椎處死昆明鼠，75%酒精消毒，無菌取食管、胃、小腸組織標(biāo)本分 別進(jìn)行具核梭桿菌分離培養(yǎng)、直接涂片染色鏡檢、和PCR檢測。
[0030] 以培養(yǎng)陽性或PCR檢測陽性任意一項(xiàng)檢測結(jié)果陽性判定為具核梭桿菌陽性感染， 小鼠食管、胃、小腸有一次為陽性則認(rèn)定為具核梭桿菌陽性。免疫保護(hù)效果評價以未免疫接 種對照組的感染率> 80%為前提條件，根據(jù)公式計(jì)算各組保護(hù)率。
[0031]
[0032] 在該實(shí)驗(yàn)中，未免疫接種對照組感染率為85%，免疫接種組感染率15%，計(jì)算得 到保護(hù)率為82%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟：具核梭桿菌的分 離和培養(yǎng)；收集；滅活；乳化制劑；無活菌檢測；抗體效價檢驗(yàn)。 a、 通過購買的標(biāo)準(zhǔn)株或者從臨床分離得到的細(xì)菌株經(jīng)過連續(xù)傳代接種于適宜平板上， 分離鑒定得到菌種； b、 將菌種通過適宜平板上增殖細(xì)菌，用稀釋液洗下，或者將菌種接種于含適宜培養(yǎng)基 的厭氧瓶中增殖細(xì)菌，通過離心培養(yǎng)基收集細(xì)菌，直至最終菌液濃度達(dá)到本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。如果 上述最終菌液低于本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可進(jìn)行濃縮直至最終菌液達(dá)到本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)； c、 菌體滅活； d、 將滅活菌體加入佐劑，通過物理混合方法制備成疫苗； e、 將步驟d制備的滅活疫苗進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果為無菌生長，即可判定疫苗合格； f、 將步驟e判定合格的滅活疫苗接種于小白鼠，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，用步驟d制備的 疫苗進(jìn)行接種，接種療程結(jié)束后可進(jìn)行取血檢測抗體效價。2. 如權(quán)利要求1所述，其特征在于所述具核梭桿菌菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株不僅限于編號為 ATCC25586或者臨床分離到的具核梭桿菌菌株。3. 如權(quán)利要求1所述，其特征在于使用了固體平板和液體培養(yǎng)瓶在無氧條件下培養(yǎng)。 菌液濃縮的方法為進(jìn)行高速離心進(jìn)行菌體和液體分離。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述滅活步驟中，處理方法為以下幾種： 1 :加入福爾馬林（終含量為1% )，置于30-40°C滅活16-30小時；2 :50-80°C滅活2-30分 鐘；3 :取細(xì)菌懸液用超聲粉碎儀粉碎20-40分鐘。5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征為乳相為弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、月旨 質(zhì)體、鋁佐劑、粘膜佐劑，乳化過程可以為旋渦振蕩器乳化，組織搗碎器乳化、注射器乳化。6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述無活菌檢驗(yàn)為在無菌條件下，去lml 滅活疫苗用PBS稀釋10倍，吸取0. 2ml接種于平板上，在37°C下培養(yǎng)48h，均應(yīng)無菌生長。 反之則不合格。7. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述滅活疫苗每毫升含菌量為20 億-300億。8. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述疫苗可應(yīng)用于人體口腔、食管、胃、 大腸、小腸、結(jié)腸、直腸方面的感染及身體不適。9. 如權(quán)利要求任一項(xiàng)所述制備方法所制備的具核梭桿菌滅活疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明名稱為具核梭桿菌疫苗和制備方法。本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：具核梭桿菌的分離和培養(yǎng)；收集；滅活；乳化制劑；無活菌檢測；抗體效價檢驗(yàn)。本發(fā)明方法工藝簡單，制造成本低，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
【IPC分類】A61P31/04, A61K39/114
【公開號】CN105267959
【申請?zhí)枴緾N201510608634
【發(fā)明人】張革, 柯宏朋, 肖晗, 薛瑩
【申請人】中山大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年9月11日